NBS-LRR介导的抗蚜虫触发：病毒不太适应;蚜虫通过不同的机制适应

背景

蚜虫是严重危害农作物的害虫。通过它们的茎鞘，它们与植物相互作用，它们传播病毒当它们到达韧皮部时，它们开始连续地摄入。许多植物已经发现了对蚜虫的抗性，其中一些已经被使用。然而，已经观察到一些抵抗力的破坏。在甜瓜中，一种能抵抗蚜虫的基因已经被应用于一些甜瓜产区，蚜虫群体在甜瓜上的发展增值税在某些农业系统中已经观察到携带-的植物。这增值税基因是NBS-LRR基因到蚜虫的抗性棉蚜并表现出不寻常的特性，即当蚜虫接种时，也能对非持续性传播的病毒产生抗性。因此，我们利用蚜虫多样性研究了其对蚜虫和病毒的抗性模式，并探讨了蚜虫和病毒可能的适应机制增值税基因。

结果

使用一个增值税- 在易感背景中构建的转发线，我们描述了增值税- 使用一组六个蚜虫抗蚜虫的抗性和抗病毒的抗性A. Gossypii.生物型。这两个耐药表型之间的差异表明，蚜虫适应增值税-介导的抗性不仅通过毒力因子改变发生，还通过对诱导防御的适应发生。在实验中，三种病毒被蚜虫连续接种增值税植物，病毒没有进化规避增值税介导的抗性。

我们选择了13份甜瓜的自然多样性材料，通过对每个蚜虫的生物型进行测试，证实了两种抗性表型之间的差异。遗传研究表明，蚜虫对病毒的抗性模式是由不同的等位基因控制的增值税位点和至少另一个位于较短遗传距离的位点。因此，对由蚜虫引发的病毒的抗性是由一个基因簇控制的。

结论

下的身姿模型，在无毒基因的变化确定病原体，以克服由植物基因赋予的抗性的能力。这增值税基因属于拟合这种害虫/病原体植物相互作用的抗性基因系列，并且我们揭示了蚜虫适应的另一种机制，其可能存在于植物和害虫或病原体之间的其他相互作用中。

在全球4000只已知蚜虫，大约一百已经利用农业环境，以及他们的能力迅速殖民统治作物蚜虫品牌虫害严重[1］.一旦蚜虫沉淀作物，它同时喂养和再现。蚜虫通过植物组织层推动其枪手以到达韧皮肌。从表皮到韧皮的路径是细胞间的，并且在沿着该路径移动的同时持续蚜虫，促进植物防御保护鞘。当它的Stylets在韧皮柱中插入韧皮孔时，蚜虫开始通过连续的液体摄取来除去光学碱基，导致植物的直接损坏。在作物中，蚜虫繁殖主要是单性生殖，伸缩代是一种在单一季节的作物上导致多一代。对植物的蚜虫增殖可引起静音，严重的叶卷曲和植物死亡。此外，沿着韧皮柱的路径探测细胞中的短暂探测允许采集/传输非持久性病毒[2］.当管心针到达韧皮部，可发生的持续性病毒的收集/传输[3.］.

蚜虫侵染作物的管理显然是具有挑战性的。农药喷雾主要用于打击蚜虫。自20世纪80年代以来，许多物种对杀虫剂的抗性产生了抗性，特别是两个多铝和多斑蚜虫，myzus persicae.（SULZ）和棉蚜（格洛弗）[4.］.通过筛选植物抗性种质，发现了几种对不同蚜虫品种表现出抗性的作物品种。然而，植物对蚜虫的抗性来源是有限和罕见的[5.]，在某些物种中发现的相对较多的抗性材料不应掩盖这样一个事实:对蚜虫的抗性通常是由少数具有少数抗性等位基因的基因产生的。在实践中，抗蚜虫的植物基因主要被引入到谷物、果树和蔬菜的栽培品种中，一些抗蚜虫的品种已经大规模应用[5.］.从生物型证据（IE。能够生存，再现和/或对培养植物造成耐受的植物损伤的克隆表明，一些蚜虫物种可以适应植物抗性基因。基因ag1.，它提供了抵抗Amphorophora agathonica在树莓被广泛使用五十年一阻力，突破型烟粉虱出现之前[6.］.抵抗力Nasonovia ribisnigri被赋予的NR基因莴苣，击穿该阻力发生10年基因的广泛部署后[7.］.俄罗斯小麦蚜虫Diuraphis Noxia克服了抗性基因Dn4该基因在小麦品种中释放后不到10年[8.］.采用生物型的麦二叉蚜，在部署小麦的一些抗性之前观察到[9.］.我们的目的是探讨蚜虫适应于植物抗性和蚜虫多样性的系统中的植物抗性，其特征在于：Cucumis Melo.和A. Gossypii.．

Cucumis Melo.，来自亚洲的[10.的主要物种之一葫芦科家庭。C. Melo.在世界各地被发现，在栽培和野生基因型[参展相当的遗传多样性11.］.瓜类只能通过殖民A. Gossypii.一种世界性蚜虫。迄今为止，在甜瓜植株上发现的多位点基因型(MLGs)还不到20个[12.-15.］.自20世纪70年代以来，自20世纪70年代以来已经大大描述了抗性瓜类。他们源于东部和远东亚洲，欧洲，非洲，美国[16.］.早期开放式研究表明，对美国东南部的蚜虫的瓜子抗性对西南部的生物型无效[17] 和反之亦然．[18］.以同样的方式，低阻力水平A. Gossypii.来自西班牙在瓜种质实验室biotests即表现出电阻的高水平法语观察A. Gossypii.[19］.因此改编克隆A. Gossypii.已经观察到，在一些地区的甜瓜作物部署抗性之前。最近，Thomas等人[20.]证明了A. Gossypii.生物型可以与MLGS相关。共享相同MLG的克隆在一组甜瓜附加方面表现出类似的验收（低接受植物抗性表型）。尽管如此，共享相同MLG的克隆的适应性表现出一些变化。A. Gossypii.是以非持久性方式传输的病毒的有效载体，例如黄瓜马赛克病毒（CMV），西葫芦黄色马赛克病毒(ZYMV),西瓜马赛克病毒（WMV）和木瓜ringspot病毒（PRSV）和一个有效的向量瓜蚜传黄病毒(CABYV)以持续的方式传播。

1987年，在法国目录，玛戈甜瓜'，被宣布为蚜虫，第一次耐。该电阻已使用两个特征A. Gossypii.克隆，NM1和C9。它由主要基因控制，增值税，和几个数量性状位点已经在瓜基因组被定位[21］.这增值税基因编码一种卷曲螺旋（CC）核苷酸的结合位点（NBS） - 亮氨酸 - 丰富的重复（LRR）蛋白[22］.属于该家族的抗性基因被广泛地涉及对病原体和害虫效应的具体识别以及植物防御反应的激活[23］.最近，这种抵抗力的疗效在法国东南部遭到危及，并在较小的安妥尔斯（Thomas S，Vanlerberghe-Masutti F，Mistral P，Loiseau A，Boissot N：深入了解了演示 - 遗传学研究的持久性耐久性的棉蚜甜瓜作物的种群。提交。）。

完全是，这提出了两个问题：（1）威胁的宽度宽泛增值税基因在面对A. Gossypii.多样性？（2）除了以外提供更广泛的抵抗力增值税- 遗传多样化的甜瓜之间的抗性？使用一组蚜虫克隆，我们揭示了一个有限的频谱增值税抗性，我们鉴定了由至少另一个连接的轨迹控制的较大光谱的甜瓜探索增值税基因。

此外，甜瓜植物含有抵抗力增值税当机械地或使用其他蚜虫物种作为载体时，基因易受病毒的影响[24),但这些增值税当接种NM1和C9时，植物对非持久性病毒抵抗力A. Gossypii.生物型[20.那24］.换句话说，在发送非持久性病毒时，NM1和C9至生物型这些病毒触发电阻[22］.因此，两个额外的问题被提出：（1）是否所有的蚜虫生物型，不管他们的能力，以规避增值税介导的抗性，触发对病毒的抗性？（2）是能够适应的病毒增值税介导的抗性？我们表明克隆能力殖民增值税-植物并不是缺乏激发抗病毒能力的预测因子。我们也证明了病毒无法适应增值税介导的抗性。

在a中观察到的抗性模式增值税- 与九个墨隆的线和13个甜瓜A. Gossypii.在附加文件克隆（数据组1）

我们观察到125种植物 - 蚜虫病毒相互作用，13根甜瓜线与9个蚜虫克隆相互作用，两条转基因系与6或2个克隆相互作用。这些相互作用的特征在于三个特征，'对CMV'的植物反应被蚜虫，“接受”和“殖民化”引发的蚜虫。从2004年到2015年进行了生物节.Margot和Védrantais被列入所有测试中，用作标准化结果的参考资料。

两个参考线Védrantais和Margot的评分

表现出症状CMV接种后由蚜虫克隆植物的百分率是数量性状（图1）.然后，védrantais和margot /蚜虫克隆相互作用被得分（易感）或r（用于抗性）。Védrantais易受所有克隆接种的CMV，除C4外，除C6外，MARGOT耐受所有克隆的CMV接种。

“接受”被估计为残留在小植株通过10名成人侵染三天后只蚜虫成虫的数量和范围从2.4至9.0为基准线（图1 b）.这个特质是定量的，“接受度”得分如下所示。因为在玛戈特上观察到的NM1的最低“接受度”是1分。分数+2，IE。3、与NM1/Margot交互中表现出最接近显著不同的“接受度”的交互，IE。CUCU3 / MARGOT互动。评分为5次互动，从CUCU3 / MARGOT相互作用中表现出最接近的互动显着不同的“验收”，IE。cucu3 /védrantais，等等。当差异不显着时，给出中间分数。'验收'得分范围为1到8。

“定殖”是由侵染7天后植株上的若虫和成虫的数量来计算的。该性状的数量范围也从1.3到7.8(图1)。1 c）.分数1给出对于最低“殖民”观察到的（NM1 /玛戈）。观察到（C9 /玛戈）下一个结果，这是显著并在很大程度上大于第一结果被赋予的分数3，IE。4.遵循相同的程序，遵循“验收”（+2在差异很大时给出）。'殖民化'得分范围为1到10。

在分析以下相互作用时，这些分数被用作参考。

在增值税转基因线上定义的增压电阻谱

这增值税阻力谱到6个克隆A. Gossypii.建立使用增值税基于上述三个参数的转基因品系TR3。每个组合(转基因株系/蚜虫无性系)与参考株系/蚜虫无性系各组合的分数进行比较。

当接种C9，GWD2和NM1克隆时，TR3线对CMV进行耐药，证明基因是在Védrantais中插入的基因有效（表1）.当接种C6，CUC1和GWD克隆接种时，TR3易于CMV。为了确认TR3中对CMV的易感性不是由于插入效果，CMV通过NM1和GWD接种到另一个转基因线TR4。根据在TR3上获得的结果，当接种NM1时TR4耐抗CMV并且当接种GWD时易于CMV。

品系TR3被C9和NM1克隆接受较差，定殖较差或中等(见表1)2）当将两个克隆接种CMV进入TR3线时，从耐药表型观察到的预期（表1）.TR3线被C6，CUC1，GWD和GWD2克隆适度接受并完全殖民（表2），此结果与由这些蚜虫克隆接种的CMV接种的TR3易感性，除了触发到CMV的阻力（表1）.因此，C6、CUC1、GWD和GWD2克隆对介导的抗性具有适应性增值税基因。

耐蚜虫和抗在天然瓜多样性蚜虫触发病毒

以13份甜瓜品种为材料，分别侵染9份甜瓜，建立了甜瓜抗性谱A. Gossypii.克隆。与每个组合的“参考线/蚜虫克隆”给出的分数相比，给予三个参数的分数（转基因系/蚜虫克隆）。

结果表明，在甜瓜品种中，蚜虫对巨细胞病毒的抗性有8种模式(表中用空白株系分隔)1）.当由C4，甚至Védrantais，这通常被认为是易感对照接种所有瓜种质是耐CMV。要检查是否C4是CMV的有效载体，我们观察到了一组通过使用C4 CMV接种瓜类的。几个瓜线，西葫芦，黄瓜表现出症状（附加文件2）证明C4能够传递CMV。其他蚜虫克隆能够将CMV接种到Védrantais，证明其向量能力。百分之六十的相互作用（甜瓜附加/蚜虫）表现出抗性植物反应。令人惊讶的是，PI 161375，用于隔离的加入增值税转基因TR3对巨细胞病毒的抗性不明显。以同样的方式，没有线条放大的标记从增值税基因(Z1431)对巨细胞病毒的抗性与TR3相同。所有克隆均接种CMV后，只有PI 482398对CMV产生抗性。

“验收”和“殖民化”分别从-1到9和1到12分别被评分，但除了所有蚜虫克隆的殖民群体不受欢迎和殖民群体不佳：IE。对蚜虫无明显抗性2）.事实上，几个克隆大量殖民地殖民放大了增值税基因（C6，CUC6，GWD2和C4）然后分别适应于增值税-反抗。最少的殖民地化的加入是AM51，表现出5分的中位数，而Margot和PI 161375展出了6分的中位数殖民评分。所有其他换乘和TR3线呈现出更高的中位数分数。

在我们研究的123个甜瓜附加/蚜虫克隆相互作用中，观察到由蚜虫引发的74例抗CMV。在其中，49例表现出低验收（接受得分≤4，图。2）仅27种表现出低聚度（定植评分≤5，图。2 b）.对于C4无性系，所有材料的高定殖与该无性系引发的所有材料对巨细胞病毒的抗性不一致。因此抵抗病毒引发的蚜虫与抗蚜虫脱钩:“接受”是一个可怜的预测低抵抗病毒引发的蚜虫(49/74的收敛结果)和较低的“殖民”不是一个预测抵抗病毒引发的蚜虫,反之亦然(27/74的收敛结果)。

病毒能力适应蚜虫触发的阻力

这可能是病毒可以克服增值税- 通过逃离由造成的防御机制来介绍A. Gossypii.并在连续传播事件发生后发生全身感染增值税植物。为了验证这一假设，病毒从受感染者处依次传播增值税-carrying玛戈植物健康玛戈植物使用NM1建立或C9蚜虫克隆与三种病毒，巨细胞病毒，ZYMV和WMV。无病毒响应性进化由NM1或C9（图触发。3.）.

第一次用NM1病毒接种Margot时，120株受检植株中未发现WMV感染植株，139株受检植株中有1株ZYMV感染植株，113株受检植株中有1株CMV感染植株。从玛戈特回接到两株受感染植株的玛戈特后，无论测试的病毒是什么，植株受感染的百分比都没有增加(图)。3.）.

通过C9克隆获得更多感染的植物而不是通过NM1克隆接种后，从而允许更容易接种。再次，即使在第四个背部接种之后，我们也没有观察感染植物百分比的增加（图。3.）.

在所有已知的植物基因中赋予蚜虫的抗性[5.]， 这增值税基因的独特之处在于，当被蚜虫接种时，它也能抵抗病毒[22］.该电阻被限制为A. Gossypii.物种 [25]但它对大型多样性的功效A. Gossypii.尚不清楚。此外，在等位基因变异增值税诱导表型变异的遗迹仅为假设到目前为止。鉴于蚜虫触发的病毒抗性被证明是定性的，这种特质可用于描述生物型A. Gossypii.物种。根据Smith (2005) [26]，生物型，揭示在一组品种的，各自具有不同的电阻的基因或基因组合，其差异反应，以一个给定的生物型。基于由9个蚜克隆13个瓜国家加入CMV接种植物反应，IE。117个相互作用，我们认识6个蚜虫生物型。第一生物型是由C6表示，并且以4个种质触发抗CMV。第二生物型由C9和CUC1（和推定CUC6）和触发抗CMV 8份种质的。第三生物型，它由CUCU3和推定GWD的，在同一组种质与先前生物型的触发电阻，以及安苏77.第四和第五生物型分别由GWD2和NM1，表示，并且触发抗CMV在9个种质（一些常见的和一些不同）。第六生物型由C4表示，并且在13个种质触发抗CMV。

CMV的不同抗性模式是由同一个位点控制的吗增值税轨迹？

我们揭示了一种意想不到的抗性模式增值税基因。这增值税克隆NM1-Lab [22］.最近在农业系统级别的研究表明增值税基因赋予抵抗大量A. Gossypii.克隆[15.］.关于PI 161375，评估的九个克隆中的八个引发了当用作载体时对CMV的抵抗力，再次表明大量A. Gossypii.克隆触发到CMV的抵抗力增值税植物。为了证实这一结果，我们在a增值税转基因线。在PI 161375的5个克隆中，只有3个克隆对CMV产生了高水平的抗性。这些数据表明，在PI 161375中至少有一个附加的位点参与了蚜虫触发的CMV抗性。

在此基础上，我们建议重命名增值税轨迹VAT-1。这Vat-1通过特异性标记Z1431扩增出PI 161375的等位基因，经C9、GWD2、NM1和C4接种后均对CMV产生抗性。我们提议Vat-2PI 161375中存在的附加基因座。该等位基因在接种GWD时至少赋予CMV抗性。Vat-2很紧密挂钩Vat-1在PI 161375，因为它与共分离Vat-1用于构建玛戈特当蚜虫抗性基因渗入，并在使用该NM1克隆每一代选择的育种程序中。此外，该位点在准等基因系仍然明显，（数据未示出）之后15背杂交和选择用于使用NM1克隆电阻获得。这种准等基因系，以CMV接种抵抗由NM1和GWD股其基因组中的99.99％与易感轮回亲本，因此，0.01％的剩余载Vat-1和Vat-2．作为易感控制的Védrantais令人惊讶地抵抗C4接种的CMV（表1)，因为Védrantais两者都不包含Vat-1也不Vat-2在PI 161375中检测到的等位基因中，其他的位点或等位基因可能与C4接种时对巨细胞病毒的抗性有关。同样，Smith Perfect、Canton和HSD2455在接种NM1时对CMV具有共同的敏感性，因此不携带CMVVat-1在PI 161375中检测到等位基因，并且当接种C6时对CMV的抗性，既不引发Vat-1也不由Vat-2在PI 161375检测。

包含1 MB的区域Vat-1表现出甜瓜基因组中发现的最高浓度的存在/不存在基因变异多态性[27]，和这种类型的多态性通常与表型多样性在抗病原体。该区域还表现出抗性基因在基因组中瓜最高密度[28］.NBS-LRR家族的23个基因已在这个1-Mb区域被鉴定[29，可能对应的是小于20厘米，这些基因是候选基因Vat-2．一个同源际Vat-1在90625年，在DNA水平上共享93.8％的同一性，蛋白质水平为92.3％Vat-1源自PI 161375 [30.］.该地区的许多重复性使得精确测序困难，因此分子和表型数据之间的全面交叉是必要的，以充分了解蚜虫引发的蚜虫和抗病抗性的遗传控制。转基因线的使用将显然有助于破译该集群中每个基因座的作用。

我们到底从由介导的多效性学会增值税基因？

最近，植物/蚜虫互作已被纳入植物免疫系统的总体框架，为植物/病原体互作[31］.鉴于这一点Vat-1基因编码一种NBS-LRR蛋白，这种蛋白与许多抗病原体的基因相似，抗药可能是由蚜虫效应蛋白的特异性识别引起的[22］.识别激活信号级联;植物抗蚜虫的唯一NBS-LRR基因控制级联是激活的水杨酸信号通路宏峰偏见大戟在MI-1-tomato植物[32那33］.该途径也引发了对病毒的抵抗力[34］.在增值税- 级联，级联引发植物防御蚜虫和病毒。生理反应A. Gossypii.饲养部位包括细胞壁中的胼unes和木质素的早期沉积物，过氧化物酶活性，酚合成和微氧化裂缝增加[35那36］.这些生理反应构成的叶组织的显微过敏反应增值税植物出没的A. Gossypii.．期间蚜虫侵染中的早期阶段，在转录后水平调节基因表达的一些miRNA已被证明是上调增值税在易感植物[抗性植物和下调37］.

观察到一些表型增值税转基因线与上述框架一致。抗性由蚜虫效应体的特异性识别启动，该效应体激活信号级联，引发植物对蚜虫和病毒的防御(图)。4A）.具有匹配该方案中NM1和C9的克隆观察到的表型：以CMV两个克隆触发电阻均无法充分拓殖增值税转基因线。考虑到蚜虫和低接受触发的病毒的抵抗力，在自然多样性中研究的117之间的52个相互作用也与此方案相匹配。当没有识别蚜虫效应子时，植物防御蚜虫和病毒的植物防御物（图。4C）.C6克隆和GWD克隆观察到的表型与该方案相匹配，因为这些克隆没有介导对CMV的抗性，并完全定殖CMV增值税转基因线。考虑到由蚜虫触发的病毒和低接受的病毒，在自然多样性中研究的117间相互作用也与此方案相匹配。没有描述NBS-LRR抗性蛋白特异性识别的蚜虫效应器迄今已描述;然而，已经在植物病原体中鉴定了几十个无流动基因，例如细菌，真菌和卵霉菌。这些无流动基因似乎受到高速多样化选择的影响[38]，这种现象也可能是蚜虫中的aairulence基因的真实。

第三组表型增值税- 转变线不适合框架。GWD2克隆触发对CMV的抗性，因此必须发生引发植物防御的信令级联的GWD2级数的特定识别，但GWD2殖民地增值税转基因线。我们假设，从病毒性抗蚜的去耦是由于蚜虫适应，从而使蚜虫，甚至定居植物时植物防御中引起（图4B.）.克隆CUC1部分符合这一方案。这个克隆全面殖民统治的转基因线，但似乎偶尔调解抗CMV（少数植物没有表现出症状）。CUC1可能会产生其无毒执行器的低量，和接收所述病毒颗粒而不效应细胞（并且因此该植物）允许病毒蔓延全身。然而，同时接受病毒颗粒与效应细胞的所有植物都不允许病毒增殖。

在自然多样性中，蚜虫对蚜虫的敏感性的表型“抗病患者致频繁。在蚜虫克隆触发的74例抗CMV患者中，我们观察到26例接受分数≥5且仍然更多的情况，47，定植评分≥6。C6，CUC6和C4克隆殖民化所有甜瓜摘录，它们触发到CMV的抗性。CUC1和GWD2克隆殖民化所有甜瓜附口，但它们引发了一个抗CMV的一个。从验收，日常繁殖，繁殖期和克隆死亡率产生的“殖民化”在共享相同MLG的克隆中表现出定量变异，并被假设由几个蚜虫基因控制[20.］.适应植物抗性可能由多态性和/或这些基因的调节产生。蚜虫饲养的比较分析增值税和非增值税植物揭示了microrna在抗性和易感的相互作用中受到不同的调控[39］.的丰度的Piwi相互作用RNA样序列喂食蚜虫（从基因组中的重复元件始发）增值税植物对蚜虫的反应提出了疑问增值税介导的抗性。在俄罗斯小麦蚜虫（d . noxia)，在蚜虫唾液腺中编码蛋白质和酶的四个基因的DNA甲基化水平的差异，以及高水平的多态性，在两个对寄主植物表现出不同毒性的克隆之间被注意到[40］.

病毒是否能够适应增值税阻力触发蚜虫？

可能会出现第四个假定的方案(图。4D.），IE。病毒适应防御触发的防御A. Gossypii.探讨增值税植物。预期的表型对病毒的易感性，当不能殖民化的蚜虫克隆时增值税植物'。在转基因系中从未观察到这种双表型，表明未发生病毒适应。然而，这种双表型在天然瓜中观察到两次;这两个实例都涉及ANSO 77和克隆C9和CUC1。这是否意味着两个克隆都触发了ANSO的阻力，但CMV-I17F隔离的抵抗力适应这种阻力？这是鉴于通过NM1，C4，GWD2，GWD或CUCU3触发的电阻，ANSO 77对CMV具有高度抗性的不太可能的说明。C9和CUC1对ANSO 77的抗性抗性最有可能被除外的基因赋予增值税基因;该其他基因仅针对蚜虫作用，类似于作物中描述的所有其他抗性基因。无能为力，以适应穿刺触发的防御增值税植物的A. Gossypii.通过实验进化biotests证实其中CMV，以及ZYMV，面对失败蚜虫探测触发植物防御时演变。因此，对于病毒，增值税- 与病毒的抗对比出现了耐用的病毒的耐受性，例如TM-2或者Sw-5。这些基因的实际用途是有限的，因为通过基因赋予的电阻可以通过天然存在的菌株来克服[41那42］.虽然常见的NBS-LRR抗性由AVR病毒蛋白触发[43]，在识别的不存在病毒的参与增值税通过这个事实明确建立了蛋白质增值税当病毒被机械式地传递或传输的植物系统侵染m . persicae[25］.这种现象可以确保增值税防止非持续传播病毒的耐用性。克服增值税介导性，病毒应该朝后快的细胞 - 细胞运动发展A. Gossypii.接种的穿刺，逃避抗抵抗机制A. Gossypii.效应器。在我们的实验演化生物最具生物中尚未观察到这种进化。

对甜瓜赋予瓜子的病毒的抵抗力A. Gossypii.穿刺出现耐用，并且该电阻由至少两个基因座控制，Vat-1和Vat-2，紧紧挂钩。在接种特定的蚜虫克隆时，不同的等位基因可能会促进对病毒的抵抗力。不幸的是，由于许多蚜虫物种将病毒传递给瓜作物，增值税抗性并不总是显着减少甜瓜领域的病毒流行病[44］.

抵抗力A. Gossypii.在甜瓜植物中仅出现一个克隆，NM1和其他克隆的部分或零点非常强。建立对蚜虫的复杂抗性需要使用蚜虫生物型基础策略更好地了解遗传控制。

考虑“验收”和蚜虫引起的病毒抵抗力，97％的自然多样性相互作用适合我们提出的三个方案。这些方案表明，蚜虫克隆适应植物阻力，因为它们的无流动因子没有触发阻力，或者因为它们可以在植物引发防御时殖民地殖民。如果后者是植物抵抗/蚜虫相互作用的一般机制，它将鉴定挑战的鉴定，鉴于适应和未适应的克隆可以共享相同的无与伦比的克隆（直接或间接地）与阻力编码的蛋白质相互作用基因。

蚜虫克隆

A. Gossypii.克隆侵扰甜瓜属于一家专门从事葫芦群的宿主种族集团[12.］.在此研究中使用的9个克隆收集在法国（C4，C9，CUC1，CUC6，CUCU3，NM1）或更小的安的列斯（C6，GWD，GWD2）上瓜类：C4上Ecballium Elaterium.，NM1上Cucurbita.Maxima，以及甜瓜上的所有其他克隆。1978年由Labonne G收集NM1，并用于初始描述增值税[24那25]，它已被保存在我们作为参考实验室克隆。其他克隆或者收集INRA（PACA和安的列斯群岛，法属圭亚那）的试验点，或CEFEL的试验点（中心德宫实验水果等豆类）和迪瑞特种子公司与他们的许可。在9个克隆，使用DNA扩增在8微卫星基因座特有的特征A. Gossypii.基因组[12.那45］.在每个基因座上等位基因大小的鉴定通过使用所述软件的GeneMapper V3.7（Applied Biosystems公司，福斯特城，加利福尼亚州，美国），和多位点基因型（MLG），然后分配给每个蚜虫克隆的分子大小标准品比较（附加文件3.）.为了简化，克隆根据整个研究他们的MLGs命名。

8小时光照：18℃的16小时下：克隆通过同步质量在24℃下对甜瓜Védrantais饲养维持。五至七日龄蚜虫被用来侵扰在两叶期的小植株在相同的气候条件进行biotests。

病毒材料

使用了三种病毒，均通过蚜虫传播。巨细胞病毒是植物病毒属Cucumovirus的类型成员。我们用1975年在番茄上采集的属于IA组(登录号为HE793683, HE793684, Y18137)的I17F分离株。ZYMV和WMV都属于potyvirus属。利用1979年法国分离的ZYMV-E15(登录号为JN861005和AY189003)和2000年法国分离的WMV-FMF00-LL2(登录号为EU660578)在甜瓜上分离。这些病毒分离物是法国的参考分离物，是按照国家规定收集和保存的。

植物材料

两个增值税转基因素（TR3和TR4）和13个甜瓜品种或涂层用于生物试验中。从两个独立事件获得TR3和TR4农杆菌属由包括在一个11-kb的基因组DNA序列的插入上Védrantais瓜介导的转化增值税等位基因在其自身启动子的控制下，从PI 161375中分离出[21］.

瓜加入或线具有不同的地理来源：Védrantais，玛戈和安苏77是来自欧洲;90625，PI 161375，PI 164723，AM51，广州和圣方索是来自亚洲;PI 482398，PI 224770和HSD 2455来自非洲，和史密斯完美是来自美国。有些线路的选择都是因为他们的抵抗力A. Gossypii.[20.那46］.特别地，玛戈是夏朗德品种，其中耐A. Gossypii.从PI 161375，Kanro Makuwa和人参Makuwa被渗入。PI 482398，玛戈，AM51，PI 161375和圣方索放大从发达国家的特异性标志物增值税基因，Z1431在其他文件中描述4.，其它种质没有。

所有种子都由UR 1052-InRA的蔬菜遗传资源中心提供。小植物在防虫温室中生长，直到它们开发了一种或两片叶子，随后用于生物测试。

作为初步实验，我们检查了所有摘录对机械接种的病毒的易感性，如[47］.用CMV接种所有涂抹或线的10种植物，并用ZYMV和WMW接种10种MARGOT和Védrantais的Plantlet。所有Plantlets在接种后7-10天表现出马赛克症状，因此易于测试的病毒。

甜瓜系和梳理中蚜虫和病毒的抗性评估

从2004年至2015年使用不同甜瓜线和锯齿的九个蚜虫克隆进行了两种测试。第一次测试在接种时表征了对CMV的抵抗力A. Gossypii.克隆，而第二次测试表征了植物接受A. Gossypii.克隆体以及克隆体在植物上定居的能力。

以病毒性的评定时由棉蚜克隆接种

从大规模饲养的蚜虫被转移到CMV（分离物I17F） - Védrantais甜瓜植物的摄取叶10分钟的病毒采集。随后沉积10个蚜虫的批量沉积在来自不同涂层的小植物上进行病毒接种。15分钟后，除去蚜虫。将植物用吡米菌（NM1克隆）或硫丹（所有其他克隆）喷洒，并置于防虫玻璃室中。通过视觉评估症状接种后20天测定感染植物的数量。每次测试用一个蚜虫克隆进行一组锯齿。至少9种植物的每次加入和20种植物增值税对转基因株系进行检测。对于蚜虫无性系/甜瓜组合表现出中间感染植株百分比，进行了新的试验以获得准确的置信区间，进行了全效50次试验。观察到的每个组合的苗数在附加文件中5.．为了比较所有的组合(甜瓜嫁接/蚜虫克隆)，我们遵循了[20.］.所有的试验都包括了两个参考系Védrantais(易感)和Margot(以携带对NM1和C9克隆接种的巨细胞病毒的抗性而闻名)，并将获得的数据汇集起来，用于确定参考系。采用蒙特卡罗精确检验和χ²统计和，考虑所执行的比较数，α= 0.0003。对每个参考组合给予“对CMV”分数的“植物反应。然后，将每个胶质克隆对每个甜瓜附加过程触发的植物反应与在同一测试中的两个参考线上观察到的CMV的植物响应进行比较，并且被评为Margot，Védranta或中间体。

棉蚜无性系抗性评价

为了评估牙龈接受和殖民甜瓜植物的能力，将10个成年蚜虫沉积在植物上。三天后，留在植物上留下的蚜虫数量被记录为“验收”参数。Seven days after aphid deposition, the adults were counted, and the density of nymphs was estimated on a scale of 0 to 6. The ‘Colonization’ parameter at 7 days was calculated as [density of nymphs + ln(number of adults + 0.001)]. The ‘Acceptance’ and ‘Colonization’ parameters were collected for at least 8 plantlets of each melon accession and 20 of the增值税转基因TR3。每次测试用一个蚜虫克隆进行，在甜瓜附加的子套件上。当“接受”或“殖民化”参数的准确性不满意组合蚜虫克隆/甜瓜附加过程时，再次测试该组合以获得准确的置信间隔。全功化46个测试。观察到的每个组合的苗数在附加文件中5.．要比较所有组合（瓜旋属/蚜虫），我们遵循相同的程序为“植物响应CMV”，IE。Védrantais和margot被列入所有测试并用作参考。因为“验收”和“殖民化”参数是定量的，因此该过程基于对数据的非参数分析（钢 - DWASS-Critchlow-Proigner分析与Bonferroni校正）。

所有统计分析都是用XLSTAT软件（addinsoft，巴黎，法国）进行的。

评估病毒的适应能力增值税介导的抗性

以评估病毒的适应能力增值税介导性，我们进行了连续的病毒传输增值税- 用CMV，ZYMV和WMV烧焦Margot植物，NM1A. Gossypii.克隆。初始接种进行了以下上述用于植物饲养和病毒来源与ZYMV除外，它使用西葫芦植物（CV钻石）作为病毒源的过程。在大规模的后脚站起收集NM1蚜虫饥饿2小时，然后转移到Védrantais瓜的CMV-感染叶3分钟病毒采集。首先，10只蚜虫批次转移至玛戈植物2小时接种期间。在下面的测试中，我们一倍向量的数目或所使用的C9克隆作为载体。当获得感染的玛戈的植物，它们被用来进行连续玛戈到玛戈传输实验。Védrantais植物包括在每个测试对照。

支持本文结果的数据集包含在文章及其附加文件中。

CABYV：

瓜蚜传黄病毒

CMV：

黄瓜马赛克病毒

MLG：

多位基因型

NBS-LRR：

核苷酸结合位点（NBS） - 富含富含的重复（LRR）

PRSV：

木瓜ringspot病毒

WMV：

西瓜马赛克病毒

ZYMV:

西葫芦黄色马赛克病毒

我们感谢Pascale Mistral，Virginie Chareyron，Nathalie Giovinazzo，Vincent Rittener和Pauline Millot为他们出色的技术援助。我们对与Michel Pitrat的这项工作进行了非常有价值的讨论，并且善有乔尔Chadīuf，非常有效地审查了稿件。我们感谢MoreDea LaSélection（CTPS，农业部，合约C06 / 02）和Seed Companies Gautier Chemwards，Rijk Zwaan，Asl，Takii和De Ruiter进行了技术参与本研究。这项工作是由法国农业部（合同（C06 / 02））和Agence Nationale de La Recherche（ANR）的项目Viraphid的支持。Sophie Thomas获得了由InRA和Région普罗旺斯 - 阿尔卑斯 - 科特迪尔（法国）资助的博士奖学金。

隶属关系

1. Institut National de La Recherche Agronomique（Inra），Ur 1052，UnitédénétiqueetAméliorationStemélioratiaEtLégumes，Domaine St Medex，CS 60094，F-84143，Montfavet Cedex，France

   Nathalie Boissot, Sophie Thomas & Véronique Chovelon

2. 国家农业研究院（INRA），UR452，团结德PathologieVégétale，了Domaine圣莫里斯 - 德ALLEEChênes酒店，CS 60094，F-84143，蒙特法韦CEDEX，法国

   勒科克埃尔韦

通讯作者

对应于Nathalie Boissot.．

利益争夺

提交人声明他们没有竞争利益。

作者的贡献

NB构思研究，进行统计分析和撰写文章。ST参与研究的设计，执行蚜虫的分子遗传学研究，部分表型瓜加入/蚜虫克隆相互作用和协助起草了手稿。VC表型转基因品系/蚜虫克隆相互作用和协助起草了手稿。HL进行病毒进化实验。所有作者阅读并认可的终稿。

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