一些壁相关激酶正、负参与了稻瘟病菌的基础防御

背景

众所周知的受体样激酶在疾病抵抗力中发挥关键作用。其中，壁相关的激酶（Waks）已被证明是几种植物物种中真菌疾病抗性的正调节剂。瓦克基因在感染过程中经常受到转录调控，但参与这一调控的途径尚不清楚。在水稻,OsWAK与拟南芥相比，基因家族显著扩增。可能有几个WAKS.以不同的方式参与基础防御还没有得到解决。此外，直接需要大米奥斯瓦克规范防御的基因尚未探讨。

结果

这里我们用大米(栽培稻）四种选定的功能突变体OsWAK对稻瘟病的数量抗性需要单独的OsWAKs基因，麦格纳波特青铜币。OsWAK14、OsWAK91和OsWAK92对数量抗性有正向调节作用，而OsWAK112d则对稻瘟病抗性有负向调节作用。此外，我们还证明了水稻的早期转录调控OsWAK基因被几丁酸触发，并且部分在Chitin受体CeBip的控制下。最后，我们表明H需要奥斯卡赫91_2.O_2.生产和足以增强感染期间的防御基因表达。

结论

我们得出结论，大米OsWAK所研究的基因是基底防御反应的一部分，可能由小蛋白从真菌细胞壁介导。这项工作也表明了一些OsWAKs，就像OsWAK112d，可作为抗病的负调节因子。

植物已经进化了通过植物细胞表面局部化的图案识别受体（PRR）检测潜在致病微生物的能力[1.］．PRR蛋白识别病原体相关分子模式(PAMPs)，这是病原体中保守的基序，损伤相关分子模式(DAMPs)来自病原体侵入造成的损伤[2.］．通过PRRS触发病原体的检测触发PAMP触发的免疫（PTI，也称为基础防御），其伴随着快速生产的活性氧物质（ROS），激活丝裂剂活化的蛋白激酶（MAPK）和免疫相关表达的变化基因[2.］．

目前已鉴定出8种细菌、4种真菌PAMPs和20种prr[3.］．在植物中研究最好的PAMP识别系统是被识别的细菌鞭毛蛋白拟南芥蒂利亚纳FLS2受体与CEBiP受体识别的真菌几丁质[1.］．FLS2蛋白属于受体样激酶（RLK）基因家族。RLK的典型结构是识别PAMP分子，跨膜结构域和细胞内激酶结构域的细胞外受体结构域[4.］．CeBip蛋白由锚定的膜锚定的细胞型溶液组成，但不含任何激酶结构域[5.]. FLS2和CEBiP分别与拟南芥中的BAK1和水稻中的CERK1等RLK蛋白有关[1.］．FLS2和CERK1是基础防御的正调节因子，因为这些基因的突变会导致拟南芥抗性的降低[6.,7.]或在水稻中减少基础防御[8.］．与PAMP相比，我们对潮湿检测的了解得多，迄今为止已经确定了三对PRR和潮湿[3.］．其中之一是拟南芥壁相关激酶1 (AtWAK1)和低聚半乳糖醛酸(OGs)之间的PRR/DAMP配对[9]来源于大多数植物细胞壁中的果胶[10］．

壁相关激酶的特征是由一个或几个重复的表皮生长因子(EGF)结构域组成的胞外结构域。在动物中，已知EGF结构域可以结合非常大范围的小肽，并在钙结合时二聚[11］．含EGF的蛋白质可以在动物中的配体结合后形成同源和异二聚体[12］．基于拟南芥中5种WAKs激酶结构域的同源性[13]在拟南芥和水稻中分别鉴定了21个WAK样蛋白基因和125个WAK样蛋白基因，揭示了WAK家族在单子叶植物中的扩展[14,15]. 为了简单起见，并遵循以前的水稻命名法[15，这种类似WAKs的蛋白质被称为WAKs。在这些稻谷中，有67个有一个善意表皮生长因子胞外区。只有少数来自拟南芥或水稻的wak具有激酶活性[16,17］．类似地，只有少数WAK已经局限于拟南芥中的血浆膜[18]或大米（OsWAK1）[17]，（OsDEES1/OsWAK91）[19］．最近，玉米ZmWAK被证明定位于质膜[20］．此外，WAKs似乎存在于未知成分的大膜蛋白复合物中[21］．尚不清楚wak是否与其他rlks关联以确保与其他几个rlk一样适当的函数[22］．

在植物中，显示几种配体粘合Wak蛋白的细胞外结构域。例如，AtgP3蛋白与Atwak1结合[21]果胶和OGs结合AtWAK1和AtWAK2[23–25]. 结果表明，在果胶处理后，AtWAK2激活有丝分裂原激活激酶MPK3和MPK6，并且AtWAK2的TAP标记（串联亲和纯化）版本组成性地激活ROS产生和防御基因表达[26］．然而，没有指示本机WAK可以触发ROS，并且在感染期间只有非常有限的防御基因表达信息[20］．

怪人参与植物的发育[27]. 例如，细胞壁扩张需要AtWAK1和AtWAK2[28]. 因此，WAK突变体在其发育过程中经常受到影响。在水稻中，植物沉默了一段时间OsDEES1/奥斯瓦克91显示的生育缺陷[19]这归因于胚胎发育的缺陷。植物沉默米籼稻奥西瓦克1基因被暂停了[29]在拟南芥中，沉默AtWAK1和AtWAK2是致命的[28］．

WAK在植物抗病中的作用最初来自WAK突变体在触发防御相关反应中受到影响的间接证据[18］．后来，几项研究提供了直接证据瓦克基因参与抵抗。首先，表明了RFO1 / WAKL22基因负责定量抗性镰刀菌素[30),Verticilium.[31］．最近，两种不同的玉米壁相关激酶被证明是一个主要的抗土传真菌QTLSporisorium Reilianum.(ZmWAK) [20]并且一个对抗叶面真菌病原体绿脓杆菌(Htn) [32］．其次，几个突变分析瓦克基因为其参与抗病性而提供了证据。过度表达AtWAK1导致抵抗力增强Botrytis.[9]和过度表达OsWAK1增强抵抗力稻瘟病菌[17］．另一方面，沉默SlWAK1番茄对细菌病原菌的敏感性增强假单胞菌光伏番茄[33］．尽管相应的蛋白缺失一个EGF结构域(奥斯卡克25.) [34]或激酶结构域（At5g50290）[35］．因此，一些WAK突变体似乎作为抗病真菌和细菌的积极调节因子，而没有可见的发育表型。然而，目前还没有迹象表明PTI在这些突变体中受到影响。

WAKS与疾病反应有关的另一个迹象来自观察瓦克基因通常通过拟南芥中的细菌感染来调节[33]和通过稻瘟病感染[36,37］．非常有趣的是，有两种病原体通过表达小RNA干扰其RNA来操纵WAK基因的表达[35]或者通过一种未知的机制[33]. 因此，WAKs是病原体试图抑制的基础防御的重要组成部分。PAMPs还可以直接调控基因的表达瓦克基因[38］．鞭毛素诱导几个瓦克拟南芥的基因[39]和番茄[33］．几丁质诱导奥斯瓦克91在细胞培养物中以CEBIP依赖性方式在水稻中[5.)和ATWAKL10拟南芥基因[40]. 然而，全球监管瓦克PTI中的基因还不清楚。

在这里，我们报告了几个米饭瓦克基因是上调的OsWAK112d在水稻中真菌感染下调。该转录控制的一部分可能是由于甲壳素受体CeBip的几丁质检测。我们提供了证据，即奥卡克14，奥卡克91和奥斯卡赫92作为定量阻力的正稳压器，而奥斯卡克112则作为负调节器。通过学习奥斯瓦克91突变体，我们证明，该WAK显着参与感染过程中的ROS生产和防御基因表达。

OsWAK表达受冲击波感染的影响

以前的转录组分析确定了五个OsWAK感染后差异表达的基因M. Oryzae.在米(附加文件1.)．系统发育分析显示，除OsWAK1外，所有稻瘟病应答WAKs都来自一个主要的水稻WAKs分支，即WAKb，它们属于四个不同的、明显不同的WAKb亚分支(附加文件2.)．

为了进一步研究这些对冲击波有反应的WAK，在感染早期和晚期（感染后1至24小时（hpi）和48至96小时（hpi）），分别使用分离株FR13和CL367测定它们在相容和不相容相互作用中的表达谱（图。1a级). 全部OsWAKs在感染期间在至少一种时间点和表达变化中差异表达转录物在相容和不相容的相互作用中相似。在晚期感染阶段，除了OsWAK112d， 全部OsWAK基因的诱导和表达在感病植物中往往比在抗性植物中更明显。在感染早期(2和4 hpi)，表达奥斯瓦克90和奥斯瓦克91被诱发了。相比之下，OsWAK112d抄本，而且程度更低奥斯瓦克14，被压抑的早期。因此，在各种转录变化中发现的测试OsWAKs，大多数是在感染期间诱导，有时甚至在真菌渗透（<24HPi）和一个之前，OsWAK112d被压抑了。

几丁质触发了OsWAK基因表达

早期和非隔离特异性差异表达OsWAK基因(图。1b级）建议，这些隔离物共用的PAMP是触发器OsWAK早期感染的基因调控。几丁质在所有真菌中都是常见的，在一些生物系统中已被证明是重要的PAMP [7.,41]包括大米[5.,42］．测试甲壳素的作用OsWAK基因表达，用几丁质寡聚体喷洒植物及表达OsWAKs是确定。几丁质强烈且快速地诱导了胚诱导基因的表达。1b级)奥斯瓦克91和奥斯瓦克90（1小时后两个基因的诱导率几乎是20倍）而冲击波抑制OsWAK112d被甲壳素处理下调(8倍)。的表达OsWAK14和奥斯瓦克92通过甲壳素治疗诱导程度更低。因此，我们得出结论OsWAK几丁质处理后的基因表现出相似的表达趋势。1b级）在爆炸感染的早期阶段（图。1a级)．

为了检测甲壳素是否具有调节作用OsWAKs以受体依赖的方式，OsWAK对水稻中主要几丁质受体CEBiP缺失突变株的基因表达进行分析[5.,42,43]. 几丁质寡聚物喷洒在cebip公司功能丧失突变植物[44[处理后，测量基因表达直至2小时（图。1摄氏度)．突变体CEBiP已经显示出转录反应减少OsWAKs几丁质低聚物[43］．为了奥斯瓦克90和OsWAK91,触发引发的基因表达明显减少cebip公司突变体（图。1摄氏度)．相比之下，对方响应的诱导响应OsWAK基因和抑制OsWAK112d只有轻微的影响cebip公司突变。这支持我们的假设，即CEBIP受体需要适当的激活和抑制几个OsWAK几丁质治疗的基因。

不同的要求OsWAKs对稻瘟病的定量抗性

阐明爆破和几丁质反应的作用WAKS.在抗病性方面，从水稻突变体库中寻找突变体[45,46］．两个等位基因线OsWAK14(wak14-1和wak14-2)，每一行各写一行奥斯瓦克91,奥斯瓦克92和OsWAK112d被确定（附加文件3.A).插入行包含TOS17反转录转座子插入到相应基因的编码序列中OsWAK基因。对于每一条插入线，我们分离出一条纯合子线TOS17元素（突变体）和一个没有的姐妹线TOS17元素（后来称为Null-Segregant：NS）。我们确认了目标的表达OsWAK与空白分离系相比，每个突变系的基因减少(附加文件3.b）。突变线没有显示出任何明显的生长表型（未显示数据），包括全部生育能力wak91突变体尽管先前的报告显示该基因的RNAi导致无菌[19］．

以确定wak突变可能影响R基因介导的抗性，我们测试了无毒M. Oryzae.隔离CL367 On.wak突变体和零偏析线。用隔离CL367接种后，我们没有观察到之间的任何差异wak突变体及其各自的零偏析（数据未显示）。

为了检测WAK突变对基础抗性的影响，我们接种了wak突变体与毒性M. Oryzae.孤立FR13。这个wak14-1,wak14-2,wak91和wak92突变体易于分离FR13而不是它们各自的含氟分离对照（图。2a，b）并显示出孢子状病变的数量增加（更多为1.6倍wak14-1, 2.3倍wak14-2，2.5倍wak91和1.8倍wak92). 相反地，wak112d突变植物更耐药疾病。这表现为疾病病变数的1.6倍降低。因此wak突变体对稻瘟病的敏感性受到影响，表明相应的OsWAK基因是基础抗病的重要组成部分。

过度表达的影响奥斯瓦克91和OsWAK112d基础抗性的基因抗真菌

为了进一步研究其作用OsWAKs在抗抗抗抗抗抗性，我们决定生产过于快递的水稻植物奥斯瓦克91和OsWAK112d．我们关注这两个基因，因为它们代表了感染后最显著的表达模式(图。1.)，以及相应功能缺失突变体中最强的疾病表型(图。2.)．

在用毒性菌株FR13感染后，所有10T0植物都在表达奥斯瓦克91与用空向量转换的植物相比，症状减少（附加文件4.a，b）。相比之下，过度表达OsWAK112d与空载体相比，基因易感性增加(附加文件4.C、 （D）。为了进一步分析这些抗病表型，选择了单位点插入系。在T1代，没有T-DNA的植株和有T-DNA的姊妹植株被鉴定，它们的种子被扩增，分别产生纯合的空分体（NS）和过表达系（OE）（图。3 a, b). OE和NS系接种中等毒力菌株M. Oryzae.孤立GY11。我们观察到OE的病变号减少Wak91.植物（60%；图。3C，E.）增加了OE-wak112d.植物（264％;图。3D，F.)．因此，似乎过度表达奥斯瓦克91或者OsWAK112d改变了基础抗性，这两个基因对数量抗性的影响相反，与功能缺失突变体的表型一致。

防御诱导in.奥斯瓦克91突变体行

进一步研究OE-部分耐药增加的特征Wak91.通过显微镜（附加文件）检查线、单个相互作用位点5.). 感染后第2天，侵入水稻表皮细胞的菌丝数仅在OE中略有减少-Wak91.在接种后3天，强烈减少了侵入多个细胞的真菌菌丝的比例。这些数据表明奥斯瓦克91过表达增强抗真菌渗透和影响在车前爆炸真菌的生长和/或侵袭新细胞。

进一步了解如何奥斯瓦克91基因影响基础抗性，我们测定了几种基础抗性的分子标记奥斯瓦克91行(无花果。4.)接种后两天，真菌生长仅出现微小差异（补充文件5.)．我们首先测试了氧化爆发，最早对真菌侵犯的反应之一受到影响。接种后两天，生产的生产_2.O_2.DAB染色结果显示，OE的阳性率是对照组的2倍-Wak91.线和两倍低的ko-Wak91.线与各自的对照相比（图。4A). 利用qRT-PCR检测防御标记基因，评价感染前后防御是否增强。接种前未检测到防御标记基因的表达有显著差异-Wak91.与控制线相比（图。4B.)．相比之下，检测的一些标记物明显诱导OE-水平升高Wak91.植物48小时后接种（图。4B.)．因此，我们可以将抗性的抗性水平增加 -Wak91.在3 dpi时可见，H增加_2.O_2.2 dpi时产生和防卫基因的诱导。

的表达OsWAK几丁质在CEBiP受体的调控下诱导基因表达

以前的几份报告表明OsWAKs基因是在中调的转录环境M. Oryzae.感染[36］．通过调查法规OsWAKs在早期感染步骤期间，在渗透之前M. Oryzae.，在耐药和易感植物中，我们确认五个选定OsWAK病毒的强毒株和非强毒株感染后基因表达差异M. Oryzae.（图。1a级). 我们发现OsWAK总体而言，数量抗性(与FR13分离株亲和性互作)的基因强度高于完全抗性(与CL367分离株不亲和性互作)。这与报告形成了鲜明对比OsWAK1基因在抗性植物中比在易感植物中更诱导[17］．很有趣的是,OsWAK1基因属于另一种系统发育组OsWAKs此处测试（附加文件2.)．这可以解释这些转录规则的这些差异。

这个奥斯瓦克91和OsWAK112d基因的特征在于在接种后早期的差异表达（2 HPI，渗透前）。这也与观察结果相比OsWAK1感染后诱导基因（16-24 HPI）[17］．很明显的是,OsWAK112d在感染早期基因表达下调（图。1a级）和Vergne等人所预期的。[37]24h后轻度诱导。触发一些OsWAKs真菌穿透前的表达(< 24 hpi)表明真菌中存在的一个组成分子可以诱导这种表达。几丁质，一种已知能引起水稻防御的分子[5.)进行了测试。几丁质单独触发诱导奥斯瓦克90和奥斯瓦克91基因和抑制OsWAK112d基因(图。1b级)，从而模拟感染期间观察到的事件(图。1a级)．使用cebip公司突变后，我们发现几丁质对奥斯瓦克90和奥斯瓦克91，另一个较小的范围OsWAK测试，由CEBIP控制。因此OsWAK甲壳素的基因调节部分受到的影响cebip公司突变。测试Cerk1 [8.lyp4和lyp6 [47]需要突变体来确定这些其他几丁质受体是否参与触发OsWAKs表达式。AtWAK1和AtWAK2基因由FLG22略微下调[9,38]而AtWAKL基因被上调[39]. 同样，转录组分析表明ATWAKL10基因是由几丁质触发的[40］．因此瓦克PAMPs基因调控似乎是植物的一个共同特征。

OsWAK水稻稻瘟病菌数量抗性的基因是必需的

现在有六份报告瓦克基因参与抗病性。在Dicots，几项研究报告了Wak在抗病抵抗中的作用：RFO1 / WAKL22[30,31]，AtWAK1[9]，SlWAK1[33］．在大米方面，只有一种报道认为过度表达了OsWAK1基因增强了抵抗力M. Oryzae.[17］．最近，两种QTL用于玉米的真菌疾病的抗抵抗力编码瓦克基因[20,32］．我们的研究显示了四种因素的参与OsWAK稻瘟病抗性的基因显着延长了这份清单，并加强了这些受体样激酶在基底抗性中起核心作用的观点。实际上，我们表明三个功能突变体OsWAK14,奥斯瓦克91和奥斯瓦克92对稻瘟病真菌的毒性分离物具有降低的基础抗性（图。2.)．两个独立的突变等位基因OsWAK14基因显示了类似的表型，表明，尽管缺乏互补分析，但OsWAK14是抗抗抗抗抗抗震稳定剂。事实如此奥斯瓦克91功能丧失表现为抵抗力降低，再加上奥斯瓦克91基因导致抗性增强（图。3 a, c, e）表明该基因也是抗抗抗性的正调节因子。无论奥斯瓦克92也是基础抗性的正向调节因子，有待进一步的遗传论证。

相当惊人，突变体OsWAK112d基因和过表达OsWAK112d基因分别导致抗性和敏感性增加。在感染时被抑制该基因的观察结果（图。1a级)，这表示OsWAK112d是在感染期间压制水稻植物的基底抗性的负调节因子。同样，拟南芥LRR-RLKFERONIA基因被证明负调控参与基础防御的信号通路[48］．因此，我们的结果延长了观察结果，即信号通路RLK的负调节可能是植物中的共同趋势。

迄今为止，大多数参与抗病的RLK的激酶结构域属于非RD组[4.]， 包括OsWAK1．这是值得注意的OsWAKs在本研究中测试属于WAKb子组（附加文件2.）其特征在于RD类型的激酶结构域[49]，就像所有已知的拟南芥都一样。因此，这项工作表明了几个OsWAK来自该WakB / RD激酶子组的基因也是水稻中爆炸真菌的定量抗性的调节因子。

奥斯瓦克91参与植物防御响应

测量H._2.O_2.生产(图。4A)以及防御基因的表达（图。4B.)在奥斯瓦克91突变线表明该基因涉及对病原体的反应。这与在过度表达植物中观察到的增强的基底抗性水平一致（图。3 a, c, e)．特别是植物的过度表达奥斯瓦克91显示增强型H._2.O_2.生产和防御相关的基因表达。只有有限的证据表明WAK可以直接或间接调节防御 - 基因表达。的确，在他们的研究中，Zuo等人。[20]提供了一些证据表明(NPR1,PR5型和LOX1.)六个受试者中有一个在感染后被ZmWAK略微上调。我们的结果与这些微小的修改是一致的。与Zuo等人相比[20]，我们没有观察到任何防御标记基因在接种前由过表达触发的表达增强奥斯瓦克91. 因此怪人可能有不同的方式来激活防御。

由他人提议[33]，我们的数据支持这样一个模型，在这个模型中，识别像几丁质这样的PAMPs会导致OsWAKs以及质膜上OsWAK受体的增加。随后，病原体侵入产生的湿气可被OsWAK91识别，从而触发增强的免疫反应。该模型还需要进一步的实验来验证，例如对导弹防御反应进行广泛的时程分析wak91突变体。

我们已经证明了OsWAK水稻对稻瘟病数量抗性所需的基因M. Oryzae.．更重要的是，我们展示了四个OsWAK基因功能分析，一个是负调控。在拟南芥中，果胶可以结合AtWAK1和AtWAK2并激活信号转导[25］．果胶是否需要测试在水稻中的类似作用。更一般地，现在通过使用本研究中描述的突变线，现在可以鉴定这些蛋白质蛋白识别的分子信号。

鉴定wak突变体

鉴定了插入突变体和相应的空分离突变体（野生型）OsWAK在Nipponbare背景中的oryzatagline突变体系列中的基因[45,46］．对每个插入株系，用PCR方法选择T2分离家族中的零突变株(纯合子系的同胞)和纯合子突变株。使用的引物在附加文件中给出6.．将这些植物允许自我，并且通过PCR在T3产生中通过PCR证实基因型。

过度表达工厂的生产

完整的Lengh cDNA奥斯瓦克91和OsWAK112d通过使用从感染和未感染的Nipponbare植物的混合物中获得的cDNA（额外文件中的引物的CDNA通过RT-PCR扩增6.)．PCR产物在PCAMBIA 2300OX中连接（由JC Breitler，Cirad）向量下的控制泛素促进剂，使用BP反应（网关）。在转换之前测序相应的矢量的插入物农杆菌肿瘤术（菌株EHA105）。将所得的Pubi :: Wak构建体转化为Nipponbare的水稻胚胎愈伤组织，并在含有200mg / L谷物蛋白的平板上选择转基因植物，400mg / L头孢噻吩和100mg / L万古霉素。将初级转化体（T0植物）移植到土壤中并使其自动。从T0植物中萃取来自T0植物的DNA，用于Southern印迹杂交以进行单一插入管线的筛选。通过PCR筛选得到的T1单次插入线以鉴定选择/不存在选择标记以鉴定呈现T-DNA的零偏析和兄弟姐妹。使这些T1植物自身，并将得到的纯合T2幼苗用于表型上M. Oryzae.感染。

真菌分离株，感染测定和脑蛋白处理

水稻和真菌的生长如Berruyer等人所述[50.]在28 - 30℃的光照条件下，进行12小时的光照处理。栽培稻L.）和三个分离株FR13、GY11和CL367(稻瘟病菌)被利用了。分离物CL367与日本血吸虫不相容，分离物FR13和GY11与日本血吸虫相容[44］．对于疾病表型，典型的重复由4个突变体和4次含有4个含有的含有1L罐中的旁边生长的植物;通过喷涂25×10进行接种^3.conidia / ml fr13或gy11分离物M. Oryzae.(相容菌株)而表达分析采用2 × 10^5.分生孢子/mL的FR13和CL367分生孢子悬浮液，在4周老植株底部的第4片叶子上(最后一片完全展开)。所有处理后的幼苗均置于相对湿度100%的黑暗中，在20-24℃下放置24 h。为了进行突变体表型分析，在感染后5天采集第4片叶片进行扫描，以观察和定量病变。我们通过灰色中心的存在或不存在来区分易感病变和耐药病变，这表明有孢子形成。

对于甲壳素治疗，用0.02％Tween 20（模拟），100μg/ ml或1000μg/ ml溶酶以0.02％吐温20喷洒3周龄Nipponbare植物（显示出三个完全扩张的叶子）。重复实验四次。这只甲壳素含有2至8种寡糖（YSK，Yaizu Suisankagaku工业）。第三，在治疗基因表达量化后，收获第三次，在液氮中冷冻在液氮中，在不同的时间点。

H_2.O_2.测量和基因表达分析

对于H._2.O_2.测量，叶片片段在Vergne等人中被治疗。[37]使用DAB染色。将二氨基联苯胺（Sigma D-8001）溶解于1 mg/ml水中，将切下的叶子浸泡过夜（在黑暗中），并在室温下用乙醇/氯仿（4:1）清除组织过夜。对于定量RT-PCR应用，冷冻组织在液氮中研磨。取样在生长室中进行（在最初的24小时内，在接种暗室中以弱光进行）。每一个重复都是由至少4株同一基因型的植物组成的，并且这个设计被重复3到4次。然后按建议用1毫升TRIZOL（Invitrogen）处理约500微升粉末。DNA酶处理（Euromedex）后，RNA样品（5μg）在65℃下用oligo-dT变性5分钟₁₈（3.5μm）和dntp（1.5μm）。然后在适当的缓冲液中用200μl，在37℃下在37℃下进行60分钟的逆转录转录60分钟。在适当的缓冲液中，200μl。然后使用两种微溶剂cDNA（稀释1/10）用于定量RT-PCR。定量RT-PCR混合物含有PCR缓冲液，DNTP（0.25mm），MgCl_2.（2.5毫米），正向和反向引物（150,300或600nm最终浓度），1 u的热杆间聚合酶和Sybr Green PCR混合，根据制造商的建议（Eurogentec，比利时）。放大如下进行：95℃10分钟;40℃，95℃，62℃，1分钟，72℃为30秒;然后95℃持续1分钟，55℃持续30秒。使用MX3000P机（Stratagene）进行定量RT-PCR反应，并使用MX3000P软件提取数据。使用肌动蛋白（OS03G50890）作为内部对照标准化每个样品中的植物RNA的量。使用vergne等人所述的每个基因的测量效率进行基因表达。[37］．使用的引物列表在附加文件中提供6.．

潮湿：

损伤相关的分子模式

表皮生长因子：

表皮生长因子

地图：

丝裂原激活蛋白激酶

奥格：

oligogalacturonide.

PAMP时:

病原体相关分子模式

PRR:

模式识别受体

PTI：

PAMP触发的免疫力

RLK：

受体样激酶

活性氧：

活性氧物种

WAK：

壁相关激酶

我们感谢Loïc Fontaine对这些植物的照顾，感谢Delphine Mieulet提供来自OryzaTagLine库的突变种子。AD的研究得到了CIRAD和Région Languedoc-Roussillon的博士资助。EG得到了INRA- bap部门INRA博士后奖学金的支持。这项工作得到了来自Génoplante计划的IRMA赠款(ANR-07-GPLA-007)和来自ANR-Génomique计划的谷物防御赠款(ANR-09-GENM-106)的支持。

隶属关系

1. Cirad，UMR BGPI Inra / Cirad / Supagro，Campus International de Baillarguet，TA A 54 / K，34398，Montpellier，法国

   Amandine Delteil.

2. INRA，UMR BGPI INRA/CIRAD/SupAgro，法国蒙彼利埃，TA A 54/K，34398，拜拉盖国际校区

   Amandine Delteil，Enrico Gobbato，Bastien Cayrol，Joan Estevan，Corinne Michel-Romiti，Thomas Kroj＆J.-b。莫雷利

3. 法国蒙彼利埃市阿格波利大道34398号，民主行党INRA UMR /CIRAD/SupAgro

   安妮·迪瓦特

通讯作者

对应到J.-B.莫雷利．

相互竞争的利益

提交人声明没有竞争利益。

作者的贡献

A.Delteil：表达，突变产生和表型，数据分析；例如：表达数据；BC：表达，ROS数据；JE：突变分析，表达；厘米；突变产生；Dievart：系统发育分析；TK：数据分析；JBM：实验设计，数据分析。所有作者都阅读并批准了手稿的最终版本。

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