基因组分析识别小多烯型杀虫白蛋白1种家族内的功能的增益和损失/变化Medicago Truncatula.

背景

白蛋白1b肽（A1b）是豆科植物（又称豆科）产生的二硫键结杀虫小肽。到目前为止，通过生物化学和PCR方法对其多样性进行了研究。对几种豆科植物提供了高质量的基因组资源，其中模式种占优势Medicago Truncatula.（地铁），允许对旨在的这种蛋白质家庭进行基因组分析我)揭示了A1b蛋白的进化历史及其与A1b-nodulins(一种参与根瘤信号传导的非杀虫二硫键短肽)的联系（二）探索新的生物活性分子A1b的功能多样性。

结果

调查这一点地铁基因组中白蛋白1 (A1)基因主要通过串联复制而显著扩增，在基因和蛋白质水平上几乎保留了所有相同的典型结构。系统发育分析表明，该祖先分子很可能是除其它外产生a1b -nodulin的杀虫分子。表达荟萃分析显示，许多A1b编码基因是沉默的，并且A1转录本/肽在植物器官中广泛分布。进化率分析突出了具有积极选择签名的分支和位点，包括两个对杀虫活性至关重要的位点。采用化学方法合成了7种多肽，并对其进行了体外折叠，测定了其生物活性。其中，AG41 (又名MtrA1013由孤儿Ta24778 Contig编码的同种型。），显示出意外的高杀虫活性。该研究突出了A1肽内的独特爆发Medicago.与其他有完整基因组的分类群比较的属：在中国没有A1成员莲花，或红三叶草迄今为止，只有少数存在于鹰嘴豆，大豆或木豆基因组。

结论

的A1族的扩展Medicago.在同一种类中发现的另一个富含二硫化性富含肽家族（Nodule特异性半胱氨酸的“（NCR）描述的情况，使本体感到复杂。从苏菲描述中描述了最古老的杀虫剂A1B毒素，使这个种子防御功能的诞生超过5800万年，并使这种植物/昆虫毒素/受体（A1B /昆虫V-ATPase）成为最古老的模型已知。

豆类（Fabaceae）是重要的经济作物，可提供食物，牲畜与饲料和工业，原料[1]. 谷类豆科植物，包括豌豆(豌豆），常见的豆（phoudolusulus vulgaris.）和扁豆（镜头culinaris)占人类膳食蛋白质的33%以上。其他豆类，包括三叶草(三叶草以及医生(Medicago.，广泛用作动物饲料[2］．在民间医学中使用了许多豆类，表明他们的生物活性化学多样性[3.那4.]. 由于它们在氮循环中的地位，在自然农业和森林生态系统中发挥着关键作用[5.］．由于这种节点生态位置，害虫作为限氮的取食者，是制约豆科植物生产的主要因素。因此，它们与豆科植物展开了一场进化军备竞赛，豆科植物通过一系列广泛的化学防御，包括含氮生物碱、非蛋白氨基酸和抗营养肽来保护自己和种子[6.］．从储藏蔬菜和作物中分离出的豆科多肽对害虫有急性毒性，而对其他类群无毒[7.]，扩大了防御武器库，因此，我们保护谷物的可能性[8.那9.］．

在植物和动物中，蛋白（A）被早期的生物化学家定义为水溶性、中等盐溶性和热变性的球状蛋白。植物蛋白1（A1）是豆科植物种子蛋白质中的一种盐溶性组分，随后被证明仅限于豆科植物，在豆科植物中，它们构成硫氨基酸的主要供应[10］．在豌豆种子中，A1基因由两个外显子和一个内含子组成，被转录为一个编码豌豆白蛋白1 (pea Albumin 1, PA1)分泌多肽的mRNA。后者的复合成熟最终导致两种肽的释放，即PA1b (4kd)和PA1a (6kd)(图)。1)．到目前为止，没有将任何功能分配给PA1a。PA1b于1998年发现对象鼻虫有毒性[8.]随后延伸到许多其他昆虫[11］．与大多数动物毒液不同的是，它通过摄入而活跃，与肠道结合位点相互作用[12]，最近被识别为V-ATPASE质子泵[13］．PA1B由37个氨基酸组成，其中具有六个半胱氨酸，参与三种二硫键，确保毒素的紧凑且稳定的结构[8.那14]，并属于录音结构组[15[最初通过HIGGINS等人的工作提出了同一物种内PA1B肽的多样性。[16]鉴定了存在于豌豆基因组中并在豌豆种子中表达的四个功能基因。目前在豌豆中已分离出7种PA1b亚型，并对其进行了生化鉴定[8.那11-14]，表明这些肽属于一个多基因家族，其成员略有分化[17］．最近，在分布于3个主要豆科的80多个物种的广泛筛选中，发现有20个类似pa1的基因来自众多凤蝶亚科，但没有一个来自Caesalpinioideae或mimoideae [18］．因此，到目前为止，PA1b家族似乎被严格限制在一些豆科植物的种子中，并且是20多个已鉴定的富含半胱氨酸的家族中唯一分布如此狭窄的一个[19]. 这表明该科可能是高氮种子抗虫的重要防线。最近，一个有趣的案件横向转移到寄生扫帚强奸已被记录，但并没有改变整体情况[20.］．

虽然豆科植物不是第一批进行基因组测序的植物，但现在已被纳入基因组研究，特别是大豆(最大甘氨酸，菜豆科）和桶医(Medicago Truncatula.，Trifolieae）基因组项目。完全分析了Medicago.根瘤菌共生的基因组特征突出了这一成就[21］．最近发布了一个非常有明显改善的基因组组装，促使我们对豆类内的PA1B同源物进行了基因组探索，主要目的是破译蛋白质素的进化历史1并发现具有特定生物活跃的新A1B变体。该研究主要致力于六种植物物种，其全基因组测序/大会已完成和公开可用[截至2014年底：Medicago truncatula(地铁, Trifolieae）[21]，大豆(Gma，phopsoleae.）[22]，日本莲, Loteae）[23]，Cajanus Cajan（CCA，phopsoleae.）[24]中投arietinum(汽车，菊科）[25] 和菜豆(Pvu，phopsoleae.）[26]，加上Trifolium Praatense（TPR, Trifolieae）[27]，仍然不完全可用。在模型豆类上绘制了特定的焦点m . truncatula[21那28]. 在这个物种中，尽管在种子中没有检测到PA1b肽，但我们先前已经确定了其基因组中存在高杀虫毒性和同源基因[18］．

A1b家族的具体扩展

调查Medicago Truncatula.基因组（版本4.0v1组装）导致52个A1基因同源物的鉴定。44个基因定位在一个m . truncatula染色体（1至8），因此标记为MedtrNG.， 8个基因未组装(4个来自新的V4.0版本:Medtr0093s0090、Medtr0112s0040、Medtr0112s0050和Medtr 0416 s0030, 3个来自旧的V3.5版本:AC146565_12.1;AC146565_18.1;AC146565_34.1，加上单基因AJ574790.1 [18];这些瞬时位于虚拟染色体零染色体上（图。2，附加文件1：表S2）。一种匹配表达序列标签的检测方法地铁数据库（JCVI和哈佛DANA FARBER存储库）表达了22个基因（参见§表达分析）。最后，对PA1的一个EST序列（TA24778 @ TIGR植物转录物组件）不能与任何PA1基因相关联，因此仍然是孤儿，将总A1基因家族带到53个成员。为A1A和A1B系列（PROM系列PDA1L0K4和PD015795）构建HMM型材。对蛋白质数据库的敏感性搜索与这些核磁类有关没有透露这些家庭在外面的重要关系蝶形花科。即使是具有类似半胱氨酸拓扑结构（包括CXC基序，见PFAM:PF03784）的紧密相关的环肽结构家族，也不能与蛋白I系统发育相关。

基因组的组织和结构地铁下一步将研究A1基因。在物理图上，44个A1编码基因m . truncatula分布在8条染色体中的7条上，分布不均匀(每条染色体1 ~ 21个基因;无花果。2). 所有这些基因的长度在470到1636bp之间。几乎所有的基因（50/53）都有一个典型的组织，有两个外显子和一个内含子。后者被系统地定位在信号肽的编码序列中，其长度在87-1199bp之间变化（附加文件）1:表S2)。在53个成员中，6种形式似乎没有被分泌(没有预测信号肽，附加文件1:表S2)。Medtr8g056800.1是唯一单独携带c端A1a亚基的基因，因此也没有信号肽。没有发现/发表过该基因的表达，质疑其功能。

的结构特征Medicago Truncatula.肽序列

在额外的文件中提出了53A1候选物（包括A1B肽长度，分子量和理论等电点）的特征。除了6m . truncatula预测肽呈现一个长22-29个氨基酸的信号肽，可能引导成熟蛋白通过分泌/蛋白体途径。PA1蛋白的多重比对显示，与A1b相比，A1a亚单位的整体保守性更高（系统发育切片和附加文件）2:表S5)。

PA1b结构支架中涉及的半胱氨酸残基的位置是全局保守的(附加文件3.：表S3）。更确切地说，观察到四种不同的半胱氨酸组织。典型A1b打结器(http://knottin.cbs.cnrs.fr.,(29])以六个半胱氨酸残基为特征，具有一个倒数第二个C_4.XC._5.主题。42.地铁A1b显示了这一特征，而6个A1b同源物观察到了不同的模式（附加文件）3.:表S3)。在Medtr3g436120编码的肽段中缺失Cys6, Medtr6g082060和Medtr3g067830的A1b含有7个半胱氨酸，而Medtr3g067430和Medtr3g067445在Cys6之后还有两个半胱氨酸残基。

系统发育分析Medicago Truncatula.A1BS.

贝叶斯（BI）和最大似然（ML）无根系统发育树的53地铁PA1的核苷酸序列是一致的，并揭示了标记为1-6的六个良好的群（后概率（PP）≥0.98和自举值（BV）≥75％。3.)．蛋白质序列的分析提供了类似的结果（未示出）。因为这些树仅包含地铁PA1基因扩增后，PA1基因的表达量明显增加m . truncatula在这种谱系中特别发生，或者在Papilionoidae中更古老（植物的三个基础植物的三个基础植物的唯一可获得的血管曲线）[18]). 为了解决这个问题，我们在其他具有代表性的豆科植物中寻找同源物，这些同源物的基因组数据是可用的。这项调查从不同的凤蝶科获得了38个额外的A1b序列：7个来自不同的凤蝶科木豆（phougholeae），3来自最大甘氨酸（phougholeae），21来自phoudolusulus vulgaris.（phableoleae）和6来自豌豆(Fabeae)。有趣的是，在基因组中未检测到A1b序列莲藕(Loteae)和Trifolium praatense.(三叶草科)，且仅在菊苣(Cicereae)，来自槐属的有毒A1b序列Styphnolobium日本血吸虫，以同源PCR为特征[18]，尚未发表（C. Royer Pers。Comm。），被包含在分析中;这菊苣由于基因组覆盖的不确定性，序列未被纳入系统发生[25］．97个PA1核苷酸序列的BI树和ML树是一致的，但由于可以保留更多的位置来进行分析，比仅基于Mtr序列的BI树和ML树分辨率低。然而，它们与目前公认的凤蝶科分类学是一致的[30.]（图。4.)．更准确地说，来自Phaseoleae的A1b序列(最大甘氨酸那木豆和phoudolusulus vulgaris.）形成单独的簇（PP = 1.00和BV = 96％），而豌豆和Medicago Truncatula.序列组合在一起（第 = 0.98和BV = 60 %). 在菜豆科中，来自phoudolusulus vulgaris.形成一个单系群（PP = 1.00和BV = 96%），表明PA1在该谱系中可能通过连续的复制事件进行了特异性扩增。相反，在实验中观察到PA1的多个拷贝之间的关系最大甘氨酸和木豆没有显着支持（大多数PP <0.95和BV <80％），排除了关于这两种相位谱系中的大量基因重复事件的结论。关于Medicago Truncatula.，之前确定的6个聚类都得到了恢复，除聚类1外的所有聚类都得到了很好的支持(图1)。4.)．这豌豆毒素形成了一个强大的单系群(PP = 1.00, BV = 100%)地铁(PP = 0.98, BV = 60%)地铁群集没有得到显着支持。蛋白质序列的分析提供了类似的树木（未示出）。

总之，这两个系统发育分析表明Medicago Truncatula.i） 簇1（位于染色体6和8上）可能来自豆类毒素祖先；ii）A1b结瘤蛋白形成一个独特的群（簇3），位于染色体3和5的两个不同区域(ca。3G438000和5G464000），III）A1B在染色体3上的大规模扩增由特定的连续重复和IV）根据文献中可获得的功能数据和本研究（见下文），A1B同源物的系统发育表明毒素活动是祖先的m . truncatula谱系，以及在该基因家族的多样化期间出现的非毒素A1b（例如结核蛋白），V）大豆leginsulin位于由此组成的未解决的群体中甘氨酸和卡亚努斯序列。

合成肽的生物活性

从我们的系统发育分析开始，考虑到生物活性的分子要求[31]，我们选择并化学合成了八个肽序列，包括参考分子豌豆白蛋白1b。我们选择了属于簇1的两个序列（Medtr6g017150和Medtr017170，分别称为AS37和DS37）。这些被选为典型的CRC（AS37中的R72）与非标准CYC基序（DS37）。此外，我们还选择了几种异构体（TA247783880和Medtr3g436100，分别称为AG41和EG41，在聚类2中；AC14656512在集群3中称为GL44；Medtr7g056817（在聚类5中称为QT41）和Medtr3g067510（在聚类6中称为AS40）散布在整棵树上，但具有典型的CRC模式（图。3.和额外的文件3.:表S3)。

评估肽的活性对PA1B结合位点的亲和力，然后在培养的情况下进行CL50（致死浓度50％）SF9昆虫细胞[32］．肽活性见表1，表明一些序列没有毒性，而另一些则表现出较高的毒性。更准确地说，DS37、QT41和GL44肽不具有结合和毒性，而AS37、AG41、EG41和AS40序列具有结合和毒性。4个多肽(AS37, AG41, QT41和DS37)的折叠效率足以产生标准所需的mg量Sitophilus死亡率测定[17]并显示预期的毒性（AG41剧毒，AS37毒性和QT41 / DS37无毒;数据未显示）。有趣的是，DS37中CXC基序中的酪氨酸（Y）代替CXC基序中的规范精氨酸R的存在与不存在结合和毒性。序列AS37导致与豌豆序列类似的生物学性质。Ag41序列显示出非常高的毒性，近十倍于原始豌豆白蛋白1b（表1)．毒性结果在SF9培养的细胞证实了通过结合亲和力获得的细胞，两种测定之间总体上具有良好的相关性。

AG41是昆虫细胞膜电流的有效阻滞剂

我们通过对AG41进行电生理实验，进一步研究了其生物活性SF9为了检查其细胞膜离子传输改变是否与PA1B的蛋白肽的差异不同[13］．数字5.结果表明，AG41(上迹)和PA1b(下迹)浓度的增加对SF.9记录细胞膜电流，以响应1.5 s持续时间的电压斜坡，从−100至90毫伏。在35nm处，AG41使+50mV处测得的斜坡电流幅度降低了约35%（从68pA降至44pA），而类似浓度的37.5nM PA1b没有影响（在3.5nm处，AG41的痕量甚至与对照组不同）。浓度-效应关系符合Hill方程，得到EC₅₀值14.6±0.4 nM (NG.ydF4y2Ba= 9，希尔系数1.4±0.1)和415.3±75.6 nM (NG.ydF4y2Ba = 8，希尔系数1.7 ± 0.2）分别适用于AG41和PA1b（图。5.)．本实验从本质上说明了AG41比PA1b更能有效地阻断坡道膜电流SF.9细胞（图。5a级)两种分子/分析的希尔数没有显著差异(P.= 0.14, Wilcoxon检验)。

AG41 (MtrA1b-013亚型)的分子建模

AG41蛋白的三维结构模型（表1）根据材料和方法部分中描述的程序构建。正如预期的那样，AG41的建模3D结构采用典型的PA1B典型曲线[14]（图。6b条). 为了扩大我们的比较，我们计算了在蛋白质的Connolly表面的亲脂性电位。三维结构提供了这些与蛋白质功能相关的分子特征。AG41分子表面的疏水性表现为典型的两亲结构（图。6摄氏度那E.). 实际上，AG41表面显示出一个大的疏水表面，它由疏水环L2的残基Val25、Leu27、Val28和Ile29形成，也由L1的表面残基Phe10形成。在分子的另一极，N端和C端以及L1的一部分用极性残基Ser2、Asn4、Thr17、Ser18、Asn34和Ser36定义亲水表面。当使用相同的疏水标度计算疏水势时，AG41的表面（图。6天那F）主要出现疏水性，疏水性面积明显大于PA1B的疏水性面积（图。6天，蓝色箭头），主要是由于庞大的芳族残留物TRP29，PHE32，PHE33仅存在AG41序列（表1)．AG41的疏水性增强，疏水极处出现明显的狭缝(图5)。6天，绿色箭头），可能与其杀虫活性的增加有关，因为至少极点的疏水性被指出是杀虫活性的关键决定因素[31］．

选择压力Medicago Truncatula.白蛋白I序列

用PAML软件包对实验中6个已鉴定的簇进行了选择压力分析Medicago Truncatula. 分支模型不允许识别在整个蛋白质中具有显著不同进化率的分支（表1）2)．但是，站点和分支机构模型使我们能够在正面选择下确认先前识别的网站，甚至可以识别一些新的。

簇2,4和5（缺乏统计力量的最小型材）没有显示出阳性选择的任何签名。相比之下，在深度分支集群1中，站点模型在正面选择下标识了两个站点（请参阅附加文件2：表S5（位置编号），位于杀虫活性的三个关键“点”之一的位置83[31]， 179位点位于PA1a c端附近。值得一提的是，83位点位于PA1b的重要疏水环，并且该位点(a - >f)对AS37和DS37这两个被测亚型存在显著的取代。这与随着大量残留物的改变而失去杀虫活性密切相关(表1). 此外，在迄今测试的所有杀虫毒素中，180（L）残基对杀虫活性至关重要[31[其邻近的179个残留物是保守的甘氨酸（微小）残留物。现有/疏水约束似乎对该位置至关重要。因此，该集群中最奇怪的特征是没有几乎任何表达痕迹。

在集群3中，位置27是正选择的重要点。它没有位于蛋白质的A1B /毒素部分，而是在信号肽内含子的精确位置。这聚集了所谓的A1B-结节蛋白，IE。显示结节诱导的表达[33那34]; 基因调控部分的变化，包括基因的典型内含子。正选择下的另一个位点位于82位，同样位于暴露环中（见图。6.)，在整个结瘤蛋白组内不再疏水。这与GL44中观察到的杀虫活性丧失相对应，并与亚型AG41和EG41(疏水环保守)中该活性的基本保守相对照。在该聚类的分支位点分析中，最后检测到的位置是74号，这个位置几乎与位于位置(75-77)的关键CXC位点相邻。电荷在这个中心(几乎被埋没)区域的分布似乎是其活动的一个重要组成部分。事实上，在这一簇中，74/76位置的电荷/残基之间似乎存在相关性，这可能与结节蛋白的亚功能化压力及其信号传导特性有关。

最后，最大和晚期的新出现的簇6（染色体3串联重复膨胀）也具有许多似乎对阳性选择的位点：位置120,128和183落入PA1A部分的三个其他保守区域（W128和K / R128落在定义PFAM中的白蛋白I家族的HMM-MOTIF内。位置43在两个子簇中的一个中针对A1B肽的N-末端定位，而第92-94位将A1B的最后半胱氨酸的周围残留物标记在另一个子簇中。两个位置都是分子的亲水部分，其并不涉及杀虫活性。最后，阳性选择的最引人注目的特征是残留物76，包括所有簇6.该残余物位于超保守的CXC基序中，精氨酸残基对杀虫活性至关重要（图。6.)．在整个群集中，在该位置的同义代表上的非同义的非同义的比率给出了阳性选择的明确信号，这可能是由新功能化的正在进行的过程中产生的。与这种解释一致，表达模式的变化（图。3.和7.）是该肽组的明显特征。有趣的是，两个序列仅保留在该位置（R和Q）的大阳性残留物，其中一个鉴定其杀虫活性（AS40，图。3.)．无论这是回归还是保护，祖先功能都需要进一步分析。

A1基因家族的表达分析

est数据

Medicago.Expressed序列标签存储库仔细搜索所有53地铁A1基因。结果摘要见附加文件4.:表S4，映射于图。3.．

形成每个TA的EST数量从2到108变化（附加文件4.：表S4）。所有这些EST都根据叶子，根，种子或其他人的表达进行分类。几乎所有A1基因都以根（包括结节）（占所有EST的50％）表达。因此，根似乎是该分子家庭表达的特权部位Medicago.. 相反，种子表达异常（占所有est的4%）。另外，16%在叶片中表达，28%在其他组织器官中表达。一些基因（Medtr 3g067430，簇6；medtr3g436100，簇3）普遍表达，而其他的则是器官特异性的（Medtr3g463570，簇6，在种子中）。在种子中表达的5个基因中，CXC基序的多样性尤为重要，其中典型的杀虫精氨酸残基被I、E或F取代，表明这些肽丧失了杀虫能力。

微阵列数据

该物种的大量微阵列数据Medicago Truncatula.在基因表达图谱MtGEA位点(http://mtgea.noble.org/v3/). 我们检索了所有关于可用A1b基因的数据，结果得到25个 × 920表（25个探针组代表20个不同的基因；920个模式来自加利福尼亚州．43实验）。将实验分类为13组织分类方案，并且所有数据均在混合云/热映射轮廓上映射，如图2所示。7.．EST和微阵列数据之间的相关性通常是良好的，尽管注意到一些差异（5G464350,5G464590和AC146565_12在根表达标签中鉴定但不存在于微阵列中; MEDTR3G067430普遍存在于EST数据中，但在EST数据中普遍存在，但几乎不可检测微阵列数据）。统计伪影具有低填充的地图细胞（毛状根，花或营养芽），但与茎或细胞悬浮液相比，似乎主要的全局特征出现了，确认了较高的根表达（在根/毛状根中的平均20-25×表达;未显示双向基因X器官ANOVA）。多探针基因显示出相干模式。此外，在密切相关的基因之间出现了一些表达相关性，具有显着的例外：Medtr7G044920和MedtR7G044980显示出非常明显的轮廓，Medtr3G067437可以容易地与邻居区分。两种后基因（根）与Medtr3G436100（营养芽）的最高表达（图。7.)．有趣的是，Medtr7g044980位于Cluster 2的较短分支上，不应该具有杀虫性，Medtr3g067437位于Cluster 6的一个分离的长分支上，而Medtr3g436100编码一个杀虫肽，基本位于Cluster 3的分支上(EG41 isoform)。后者的EST表达证实了一个大的组织分布，但根表达量低。因此，主要的三种A1b表达基因可能会显示出非常不同的功能m . truncatula其中只有一种保留了其祖先的杀虫功能。A1b结节蛋白在我们的热图中没有被标绘（不是所有的都被白蛋白I关键词检索到），并且它们是低/条件表达，这与它们提出的信号功能一致。

最后，根据相似的组织表达谱对基因进行分组，得到如下组织（图。7.)传导性器官（茎、茎、叶柄、芽、荚）和花的3个基因表达极为相似，其中Medtr3g436100（EG41，杀虫）是典型的。种子表达载体，如Medtr7g029540（簇4）或一对Medtr3g067nn基因（簇6），所有编码的肽都缺乏杀虫活性所必需的带正电荷的大量残基（R，最终K）。种子表达也将在下一节（蛋白质组学）中重点介绍。根系表达菌数量较多，通常不具有杀虫活性，但medtr3g067510（AS40）除外。一般来说，根瘤表达者与根系表达者相似，但孤儿表达标签TA24778是一个明显的例外，它也是少数在叶片中表达的A1b亚型之一。它的高杀虫活性（见后面的AG41）与这种非典型表达谱有关（尽管在根est中也发现了低水平的表达谱）。

蛋白质组学数据

以前的数据地铁种子蛋白质组学[17那18]未能揭示首次从该物种中鉴定出的两个基因的任何表达。我们目前的数据阐明了这些结果，这两个基因通过同源性鉴定（基因组PCR；Medtr8g022430和AJ574790）被证明是沉默的或仅在非常低的水平表达，尽管相当保守（图。3.，聚集1）。另一方面，我们的原始蛋白质组学数据与现在可用的转录组和基因组数据重新分析（附加文件5.：表S8），这导致在种子提取物中检测到大多数被鉴定为种子表达物的A1b亚型。疏水肽组分，通常含有标准豆科蛋白A1b，只含有少量的Medtr3g067540表达[17]，而极性肽级分[18含有来自v4的新鉴定的肽地铁组装，分布在酸性极性分数（基因，MEDTR3G067270集群6和MEDTR3G067540 Cluster6）和基本极性分数（基因MEDTR3G067270集群6，MEDTR3G067540集群6，MEDTR3G436100集群2和/或MEDTR3G067280集群6和MEDTR3G463570集群6)．

我的蛋白更多样化Medicago Truncatula.而不是在任何其他豆类中

地铁-A1肽（图。1）由多粒家庭编码，目前包括53个成员，其中八个除其中之一除了Medicago Truncatula.染色体。虽然以前A1bs没有料到，但这种复杂性似乎是由于一个谱系特异性的基因扩展，可能从染色体6或8上的位点开始，通过连续几轮的重复。在植物基因组中，通过复制富集基因是很常见的，就像黄瓜中的ERF转录因子一样[35]，主要是由于多倍化，节段性和串联重复。一个例子是小麦的非特异性脂质转移蛋白（NS-LTP）与大米和拟南芥[36]. 最近，这种机制也被发现与驯化过程有关[37]. 在染色体3和5上重复发生串联重复事件（图。2和3.)．重复性的模式还指向序列中留在不同染色体的序列中的进化链路：染色体6和8（簇1），染色体6和7（簇3）和染色体7和8（簇5）。表达模式和选择性压力分析表明，在A1BS的多样化过程中发生了许多子和新功能化过程m . truncatula．这对已经涉及三个独立的生物功能/靶标的单个小分子，即昆虫植物相互作用，植物信号传导/磷酸化，这并不令人惊讶38-41]和调节哺乳动物中的血糖症[42.］．

在其它植物谱系中未发现亲本肽家族

到目前为止，A1基因家族被限制在豆科植物。这种同意A1BS是唯一富含半胱氨酸的肽家族，在30多个其他已知的家庭中，这些家庭不存在于任何一个拟南芥还有水稻基因组[19]. 有趣的是Clitoria(Fabaceae: Phaseoleae)最近发现了一种新型的环肽，被鉴定为c端PA1a和n端环肽的嵌合组合[43那44]. 然而，这种嵌合分子的进化史尚不清楚，但它强烈地表明重组事件已经影响了存在于菜豆科祖先中的PA1编码基因，导致阴蒂谱系中的环肽结构域取代PA1b结构域。另一个有趣的情况是最近发现了一个通过基因水平转移获得的A1b基因phelipanche aegyptiaca.和相关物种(Lamiales, Orobanchaceae)，这些物种不包括在我们的数据集中，它们可能保持了杀虫功能[20.］．所有这些例子都说明了两个A1功能模块(A1a和A1b)的重组特性，以及它们各自的特征在重组事件发生后很长一段时间内能够在受体生物体或基因组环境中持续存在的进化稳定性。

昆虫毒素功能似乎是豆科植物A1b进化的先祖

PA1家族的系统发育分析强烈建议，研究尖锐藻祖先存在的原始豆科基因编码，用于毒素免受昆虫保护种子的毒素。S日本血吸虫是最古老和基础的Papilionoideae物种，其A1b肽存在的实验数据最初是通过质谱和生物学数据获得的[18]，现在通过序列信息。披风的思工，S日本血吸虫属于豆科，是一个基部豆科树种群，位于凤蝶科的基部，靠近凤蝶科和凤蝶科[45]，是所谓的50kb倒置组(质体基因组重排)的姐妹组，包括大多数常见凤蝶科。因此,S日本血吸虫(syn。Sophora japonica到目前为止，我所知道的白蛋白种类更多。因此，一致的豆科系统发育可以追溯到A1b家族的祖先S日本血吸虫以及所有其他已知的含有这种肽的科，特别是genistoid分支-属Lupinus；UNIPROT Q96474 [46]，估计为56-58.5 My/古新世晚期[47］．

值得注意的是，在菜豆科和蚕豆科的多样化过程中，通过连续的基因复制，PA1家族发生了多重扩增。而在某些物种（如。豌豆[16那17] 和phoudolusulus vulgaris.[48那49)所产生的类似物保持了祖先的杀虫功能，在Medicago Truncatula.和在最大甘氨酸发生功能多样化（高于地铁，低GMA)．可以注意到昆虫 - 毒素本身可能不是单官能的：PA1B的杀虫同源物G最大值（Glyma13g26330图4.)，又名leg胰岛素，最初因其在大豆种子中的激素和信号转导功能而被研究[38-41］．

A1b在乳腺癌中的多种表达及功能Medicago.:不再是种子毒素

这项基因组调查最引人注目的结果之一是，到目前为止所研究的所有其他豆类中普遍存在的标准情况，即白蛋白是有毒的种子贮藏蛋白，在大豆中并不正确Medicago Truncatula.．相反，预计将出现种子表达（转录物或肽）的大多数基因不作为昆虫毒素，除了EG41 / MEDTR3G436100簇3.此外，我们无法检测到有毒肽m . truncatula利用我们最初的基于同源性的基因组PCR策略[17]，它导致群体失去了表达的成员。关于他们表达出种子的转变，Medicago.A1bs获得了极其多样化的组织分布，主要由根表达控制，这占了阵列检测到的近一半转录物的存在（图。7.)．这种新出现的模式似乎是一种与表达重定向有关的失去/获得和功能保护的交替。目前分子的两个“功能热点”上都有正向选择痕迹[31]是发生离散的逐步功能变化的明确指示。然而，这一假设需要通过功能研究进行实验验证。

结节蛋白和3号染色体的扩增是最近新功能化的爆发

根瘤蛋白被定义为在豆科根瘤菌相关根瘤中特异表达的基因[34那50]. 在这个过程的早期，在鉴定了许多运输相关的膜蛋白之后，一些参与信号传导的小蛋白被鉴定出来（ENOD肽，用于早期结瘤蛋白）[34］．在这一研究过程中，共鉴定出3种结核分枝杆菌MtN11 (AC146565 cluster3)、16种(Medtr0093s0090 cluster3)和17种(Medtr5g464590 cluster3) [34]这些事情恰好是少数和短同源物的1，但它们的功能未进一步调查。我们的工作揭开了一组14个同源物到第三组（图。3.)，它们都是短的，主要是6-半胱氨酸肽（仅A1b，见附加文件中的校准）2：表S5）。它们被分组在簇3中，并且基本上与一组三个更典型的序列相关，其中两个很容易杀虫（AG41，EG41）。因此，所谓的“结节蛋白”簇是由明显的标准毒素产生的，这些毒素失去了PA1a部分，随后发生了显著的序列变化，尽管保留了半胱氨酸支架（3个非常短的成员除外）。在每个结节蛋白亚组的基底分支检测到选择的痕迹，即分离的外组Medtr5g464490和PAML分析定义的两个亚组3a和3b。除了结果部分讨论的位点特征外，有趣的是，PA1a结构域的缺失与显著的序列变化相关，包括典型疏水环的缺失和杀虫活性的完全丧失，即使保留了典型CRC延伸（MtN11） = GL44，图。3.和额外的文件2:表S5)。在这个假定的“nodulin”集群中,很可能系多肽折叠的结构性限制释放,这将符合缺乏PA1a一半,现在这个领域是作为伴侣的强烈怀疑大多数规范PA1b辅助co-translational折叠肽(51]. 因为打结器并不都很难折叠[52]侧链前肽伴侣的存在，可能有助于A1bs探索的构象空间的有限部分Medicago Truncatula.. 大多数环磷酰胺也不需要伴侣[53］．

毕竟是昆虫毒素:一个灭绝，两个活跃?

最终问题涉及昆虫毒性的表达Medicago Truncatula.组织。我们很清楚，我们的实验数据（7/53）是极不完整的，但我们现在确信，序列信息对杀虫活性的预测能力相对较好。第一个问题涉及到第1类基因，对于这些基因的表达数据几乎是不存在的。对数据进行了两个基因的检测，并与NGS数据进行了验证；Medtr6g017150（AS37）和Medtr6g017170（DS37）基因没有表达（Pascal-Gamas，pers。通信）。作为对照，我们还检查了来自“结节蛋白”簇的另外两个EST孤儿基因：它们在结节中被显示为表达和诱导（Medtr5g464350显著表达，而Medtr3g438170样信号在结节中也非常微弱）。因此，我们确信簇1是由沉默基因组成的，尽管其中一个（AS37）保持了杀虫活性。

除了这个沉默的基因集，我们的研究还发现了另外两个具有有趣杀虫活性的簇：与结瘤蛋白相关的簇3（图。3.和7.，Ag41和eg41）和含有染色体3膨胀簇的含Crc成员6.这两组在根和结节中表达，但Ag41显示了结节中有趣和强烈的有条件表达（图。7.)，也是一个很好的表达方式。从生态学的角度来看，在高价值氮源器官中表达一种非常强效的杀虫分子并非偶然，这表明结节特异性(适应性)昆虫似乎没有受体结合位点，因此对a1型毒素敏感[7.那11］．

当把我们的调查看作是在一个特定分类单元(即豆科植物)中寻找蛋白质创新时，人们可能会问，A1b在这方面有多不寻常?一个屏幕Interpro公司[54] 和Pfam公司[55]蛋白质领域家族的分类学界限数据库仅检索三个仅限于（并因此发明的）的三个家族：清蛋白1那结核特异性甘氨酸富含蛋白质，和晚nodulin家庭．可以将NCR扩展添加到此列表[56那57]，它不是由单个蛋白质家族捕获的，并且与A1不同（例如通过半胱氨酸拓扑结构）。许多其他根瘤特异蛋白随后在其他植物类群中被回收，例如enod.激素，甚至是典型的结节状血红蛋白，与非常古老的血红素结合珠蛋白家族有关。毫不奇怪，这些主要的蛋白质新特性与根瘤菌共生（a1通过结瘤蛋白）有关，但也与小蛋白质有关。这可能说明蛋白质模块是如何通过先前存在的支架的新功能化过程（例如，来自古代杀虫A1b组的结瘤蛋白，可能来自尚未发现的富含半胱氨酸的家族）衍生出来的。

总之，对多粒杀虫白蛋白1家族的研究感兴趣的豆科特异性蛋白质家族的进化史以及新的生物活性分子发现。我们的结果探索可能最终在新的生物农药导线（例如AG41）中，用于控制大量昆虫害虫[7.］．

可用基因组中A1基因的鉴定Fabaceae.

我们的工作最初基于版本Mtr_3.5_v5Medicago Truncatula.基因组组装与翻译(http://www.jcvi.org/cgi-bin/medicago/download.cgi）），它进一步扩展到2013年3月15日由JCVI团队的请求（MT4RC1_PRODEINSEQ_20130326_1624.FASTA）请求由JCVI团队要求提供的第4版。爆炸[58]是第一次用Medicago Truncatula.(例如文件Mt4RC1_ProteinSeq_20130326_1624。F一种sta of the 84,993 proteins of v 4) with the two seed sequences corresponding to published pea and barrel medic albumins 1 (uniprot.P62931和G7L8D8)，使用默认设置。这检索到一组47个编码序列，显示了白蛋白1的规范倒数第二CXC拓扑，它可以被分配到白蛋白1家族。有了这一套，第二轮blast随着放松的参数运行，检索一组50个蛋白质命中。其中两种被排除为Blast False阳性（富含COBRA样半胱氨酸的蛋白质MEDTR3G438140，以及载有6个半胱氨酸的一个逆转录酶锌结合蛋白，MEDTR7G071493）。因此，由第二次爆炸回合仅添加一种新的编码序列，表明A1次蛋白基本上是一种独特的孤立的蛋白质家族，与其他家庭的序列相似度非常低Medicago Truncatula.基因组。

LEGoo平台还用于获取v3.5（整合豆科生物学的生物信息学网关：www.legoo.org). 同样地木豆和最大甘氨酸a1分别在LEGoo和Genbank数据库中发现。这个莲藕基因组中也搜索了乐高的A1序列，但没有发现。这个phoudolusulus vulgaris.基因组在植物血统网站上筛选出爆炸（http://www.phytozome.net.)．这Cicer Arietum.和Trifolium praatense.基因组也被搜索到A1序列通过http://cicar.comparative-legumes.org/那http://www.nipgr.res.in/ctdb.html.， 和http://www.plantgdb.org/But.只为小鸡豌豆产生一个击中（附加文件3.：表S3），未用于系统发育。我们的物种选择方案在附加文件中进行了总结6.：表S1和图S1中所用的6个优质组装基因组。4.. 最后，我们用了所有的豌豆2014年初在Uniprot发表的序列。该Styphnolobium日本血吸虫序列(EMBL登录号:LN854577)通过我们原始的同源性基因组PCR策略获得[17］．

为了扩展白蛋白1家族，我们进行了敏感的基于hmm的同源性搜索。从ProDom2010.1家族PDA1L0K4和PD015795的多个比对中构建了特定的HMM剖面[59]分别对应于白蛋白A1a和A1b家族。使用HMMER3将这些HMM剖面与UniProt数据库中的所有序列进行比较[60]. 根据低于0.01的“独立”E值考虑匹配。或者，使用jackhmmer程序执行递归同源搜索，使用与查询相同的ProDom族的一致序列和相同的独立E值截止值。

Medicago Truncatula.EST数据库搜索

一种blast，使用与基因组搜索相同的种子序列，在Medicago Truncatula.基因指数（MTGI，版本11：http://compbio.dfci.harvard.edu)在TIGR植物转录本上(http://plantta.jcvi.org.)．同样的两步爆炸策略被用于基因组搜索，检索到50个转录家族，如前所述检查假阳性。首先排除了眼镜蛇样和PR10家族成员，以及4个NCR(结节半胱氨酸丰富肽)，它们没有显示典型的倒数第二CXC白蛋白拓扑结构。共保留了33条表达序列，并通过局部blast与V4基因匹配。只有一个EST是孤儿，所有的Medicago.a1 -家族unigenes在附加文件中1：表S2，以及数据库和装配版本之间的标识同义词。

在确定TIGR和MTGI数据库上鉴定的转录物的组织特异性时，考虑了以下聚类术语：种子（S），叶，根等。包括“其他”类别包括：幼苗，小植物，子叶，茎，花，结节和分离的腺毛状体。

氨基酸序列分析

使用signalp4.0程序分析从所有A1序列的开放阅读框翻译的前体蛋白是否存在潜在的信号肽裂解位点[61[并收集预测统计数据以进一步分析。在使用Expasy的PI / MW工具（http://web.expasy.org/protparam/) [62]. 所有这些信息在附加文件中进行了总结1．

外显子/蛋白质的系统发育分析

53 A1蛋白序列Medicago.使用mafftv7与林西允许精确对齐重建的选项[63］．用SeaView V4.2手动控制和调整对准质量[5.］．第二次比对包括38个同源物豌豆，菜豆，菜豆和最大甘氨酸是按照同样的策略构建的。以这两个多重比对为指导，对相应的核苷酸序列进行比对。用SeaView中实现的Gblocks版本（不太严格的参数）去除蛋白质比对可疑的区域，并手动调整。相应的区域被从核苷酸序列中移除。所有对齐都在其他文件中给出7.和8.．

用phymlv3.1推导最大似然树和贝叶斯树[64]和MrBayes v3.2 [23]， 分别。用GTR模型进行核苷酸对齐的系统发育分析。包括具有四个类别网站的伽玛分布，以考虑网站进化率的异质性（估计的alpha参数）。虽然使用Le和Gascuel模型推断出蛋白质序列的最大似然性系统序列[65[混合模型用于贝叶斯推论。对于PHYM1，NNI + SCH选项用于最大似然推断的树空间探测，并且使用参数引导过程评估最大似然树的鲁棒性（原始数据集的100次复制）。对于MRBAYES，四个连锁店并行运行1,000,000代。前一代世代被丢弃为烧伤。每100代采样剩余的树木以建立共识树并计算后验概率。

进化率（PAML）分析

为了研究驱动白蛋白家族进化的选择压力，不同的模型允许dN/dS比值(ω，IE。非同义对同义替代率比率)的变化，使用PAML4软件的codeml程序进行测试[66］．我们使用了三种模型:“场地”模型，其中dN/dS比值允许在不同场地之间变化;允许dN/dS比值在分支之间变化的“分支”模型;和“分支-站点”模型，其中dN/dS比值允许在分支和站点之间变化。测试是在自制的python脚本中实现的，依赖于egglib包[67］．

模型在簇1到簇6上进行测试，对于每个簇，子树的拓扑结构保持在一般树中（图。3.)．对于“位点”模型，近中性模型(M8a)假定密码子的进化要么是中性的，要么是在纯化选择下。正选择模型(M8)假设除中性选择和纯化选择的密码子外，有一定比例的密码子是正选择的(ω >1)。进行了似然比检验(LRTs)，以比较M8和M8a，从而检测包含阳性选择的模型比不包含阳性选择的模型更有可能的聚类。在正选择进化的聚类中，使用Bayes经验方法计算每个密码子的后验概率，并检测正选择的后验概率(IE。后验概率为dN/dS >1大于95%的)。在密码子水平上检测到的正选择位点是人工筛选的，以保证比对的质量和可靠性。我们非常严格，因为蛋白质的某些部分似乎进化得非常快。在蛋白质的这些部分中，阳性选择的位点只有在它们被保守位点包围并且在考虑的簇自身对齐中没有indels时才被宣布为真阳性。

对于“分支”和“分支机构”模型，需要定义分支分区先验的所以我们使用Mapnh中实现的方法[68]，它对分支执行替换映射。请注意，在站点模型分析期间，codeml计算了每个对齐的非同义和同义站点的总数。我们使用这些信息来定义分区：我们选择了带有dN/dS的分支 >1.4并测试这些分支具有不同dN/dS的“分支”模型是否比所有分支具有相同dN/dS的模型更可能。由于此方法隐含多重测试，我们修正了P.-值，该值使用可为每个群集测试的分支分区总数。注意，对于不包含同义或非同义突变或根本不包含突变的分支，dN/dS不能由mapNH正确计算。因此，这些分支始终被视为背景分支。

使用“分支站点”模型测试的分支分区与使用“分支”模型测试的分支分区相同。dN/dS分支 >1.4定义为前景分支和dN/dS分支 <1.4作为背景分支。然后比较了两种模型：空模型（A0），即在相同的选择压力（净化或中性）下，前枝和背景枝上的位点进化，包括正选择模型（model a），其中前景分支上的一些位点在正选择下进化，而背景分支上的位点仍然在纯化选择或中性下进化。同样，最有可能的模型是由LRT推断出来的，在密码子水平上被检测到正选择的位点是为比对质量和可靠性手工策划的。

构造序列比对与对比建模

序列比对（表1）使用Clustal Omega1进行[69]. 使用SYBYL-X 2.0软件包（密苏里州圣路易斯市TRIPOS公司）中的ORCHESTRAR同源建模程序进行比较建模。以PA1b核磁共振结构（PDB编码：1P8b）为模板，建立了AG41的三维结构模型。用SYBYL-x2.0软件包的MOLCAD选项计算和表示亲脂性电位。

化学合成，氧化重折叠和肽纯化

PA1b亚型的粗肽来自Proteogenix（法国斯特拉斯堡）。然后按照生产合成PA1b的优化程序折叠[70］．通过半制备型RP-HPLC纯化同种型。使用RP-HPLC和基质辅助激光解吸电离 - 飞行时间（MALDI-TOF）质谱法评估肽的纯度。通过在210nm处测量其RP-HPLC峰面积来测定肽的浓度，参考用作标准的已知量的纯肽。

生物材料和毒性试验

所有合成肽已被测试过甜菜夜蛾SF9细胞系亲切地提供由Martine Cerutti，蒙彼利埃大学，法国。SF.9个细胞系在27°C的Lonza培养基中生长，添加5%胎牛血清（FBS）和0.1%庆大霉素。SF9在实验前24小时（15000个细胞/孔）将细胞接种在96孔板中，并暴露于浓度增加的合成肽中。24小时后，根据制造商的说明，使用CellTiter Blue活力测定法（Promega）测定细胞活力。添加染料后，将细胞在27℃下培养4小时。然后使用微孔板读取器（MR 7000，美国Dynatech Laboratories Inc.）测量570和600 nm处的吸光度。

结合试验

合成肽对PA1b结合位点的亲和力用配体结合法测定¹²⁵I-毒素[12］．

电生理学

电流记录在室温下进行，下电压夹采用贴片技术的全电池配置。使用PcLamp软件（Axon Instruments，Foster City，Ca，USA）进行指令电压和数据采集。保持潜力为-80 mV。每10秒诱发膜电流，每10秒，持续时间为1.5秒，从-100升至90 mV，以300 Hz过滤，并用模拟到数字转换器采样1 kHz（Labmaster TM 40，Scientific Solutions Inc。，Solon哦，美国）。含有的外部溶液（以mm）：135 NaCl，4 KCl，2 MgCl₂，10氯化钙₂10mes，用氢氧化钠调至pH 6.4。内溶液包含(以mM为单位):140 k -天冬氨酸，1 MgCl₂，3 k₂-ATP、5个EGTA和5个Hepes，用KOH调节至ph7.2。盐从西格玛·奥尔德里奇处购买，肽制备为60%(v / v)如前所述[13］．

统计

在JMP V11软件（SAS Institute）下进行所有统计分析和相关图形显示（例如Heatmap）。生物学结果表示为平均值±s.e.m.，NG.ydF4y2Ba指示的数量SF9学习（电生理学）的细胞。在95％的置信水平下使用Mann-Whitney U或Wilcoxon测试进行统计比较。

数据和材料的可用性

支持本文结论的数据集包含在本文及其附加文件中。

A1B：

白蛋白1B肽

商务智能：

贝叶斯

BV：

引导值

车：

菊苣

Cca公司：

木豆

半数有效浓度：

有效concentration50

Enod：

early-NODulins

GMA：

最大甘氨酸

LC50：

致死浓度50%

LJA.：

莲花japonicas.

服务:

可能性比率测试

ml：

最大似然

地铁：

Medicago Truncatula.

NCR：

结核特异性半胱氨酸丰富

第1页：

豌豆蛋白1

PAML：

最大似然法的系统发育分析

页:

后概率

PVU：

phoudolusulus vulgaris.

SF9：

甜菜夜蛾9

Tpr：

Trifolium praatense.

我们要感谢Chris Town和他在JCVI的团队做出的贡献Medicago.在公开发布之前提供基因组组件V4（JCVI.MEDTR.V4.20130313.fasta）。

我们还感谢Pascal Gamas（LIPM，CNRS Toulouse）从LIPM数据库为我们提供了特定的表达信息Medicago Truncatula.门店数据。

非常感谢CNRSL/AUF授予LK博士论文。CNRSL Cèdre对CR也表示欢迎。C. Brochier-Armanet受到avenir投资基金(ANR-10-BINF-01-01)的支持，是法国大学研究所的成员。

从属关系

1. INRA，UMR0203 BF2I，Biologie Fonctionnelle昆虫与相互作用，F-69621，Villerbanne，法国

   L. Karaki，P. Da Silva，V.Syraud，F. Gressent，C. Sivignon，I. Rahioui，Y.Rahbé＆C. Royer

2. Insa里昂，UMR0203 BF2I，F-69621，维勒班恩，法国

   L. Karaki，P. Da Silva，V.Syraud，F. Gressent，C. Sivignon，I. Rahioui，Y.Rahbé＆C. Royer

3. ER030-EDST;黎巴嫩大学生命与地球科学系，黎巴嫩，黎巴嫩

   L. Karaki和F. Rizk

4. Université de Lyon, F-69000，法国里昂

   L. Karaki，P.Da Silva，C. Chouabe，V.Seyraud，F. Gressent，C. Sivignon，I. Rahioui，D.Kahn，C. Brochier-Armanet，Y.Rahbé＆C. Royer

5. Inra，UMR1334 AGAP，2 Place Pierre Viala，34060，Montpellier，法国

   N. Chantret.

6. 法国蒙彼利埃，皮埃尔维亚拉广场2号，34060

   N. Chantret.

7. Ucbl，Carmen实验室，Inserm UMR-1060，心脏保护团队，BacultédeMédecine，Univ Lyon-1，UniversitéCleonBernard Lyon1,8 Avenue Rockefeller，69373，Lyon Cedex 08，法国

   C. Chouabe.

8. 里昂伯纳德大学1；CNRS公司；印度卢比；UMR5558，生物与生物进化实验室，里昂大学，43 boulevard du 11 Novenbre 1918，F-69622，Villerbanen，France

   D. Kahn＆C. Brochier-Armanet

通讯作者

对应于Y拉贝．

利益争夺

作者声明他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

LK分析了数据，写了纸张，并进行了大多数潮湿的实验;Cr构思了湿凳实验;Cr和Yr构思了这篇作品并写了这篇论文;nc执行了paml分析;PDS做了合成肽的折叠和建模，构思了该工作并写了这篇论文;CC执行了贴片钳实验;CB-A参与了系统发育分析并写了这篇论文;IR，CS，VE进行了昆虫和昆虫的实验;DK进行了基于HMM的蛋白质系列分析;FG和FR参与了湿凳实验并写了这篇论文。 All the authors have read and approved the final version of the manuscript.

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