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脱落酸转录组信号因葡萄器官而异

BMC植物生物学体积16、物品编号:72（2016）引用本文

摘要

背景

脱落酸(ABA)在短时间(如小时或天)和长时间(如月或季节)内调节各种发育过程和应激反应。为了阐明葡萄(葡萄)对ABA有响应的葡萄各器官(果实、茎尖、叶片、根和细胞培养物)在10 μM (年代NimbleGen全基因组微阵列葡萄测定ABA对器官特异性mRNA表达模式的影响。

结果

转录组学分析显示，在ABA处理下，839个基因的转录丰度在特定器官中发生显著变化。在ABA的作用下，没有单个基因在所有器官中表现出相同的转录丰度变化。利用带有BiNGO插件软件的Cytoscape程序对ABA影响的生化途径进行鉴定。结果表明，这839个基因参与了黄酮类代谢、活性氧响应、光响应和温度响应等生物学过程。ABA影响离子和水的转运，特别是在根中。蛋白质氨基酸磷酸化过程在ABA处理的茎尖和根中有显著的过度表现。ABA影响基因mRNA丰度(CYP707As ugt,和PP2Cs)与ABA降解、偶联和ABA信号通路相关。ABA还显著影响了AP2/ERF、MYC/MYB和bZIP/AREB等转录因子的表达。根中差异表达基因最多，其次是细胞培养，其次是叶片、果实和茎尖。每个器官对ABA都有一组独特的基因反应。

结论

本研究考察了ABA对葡萄不同器官的短期影响。每个器官的反应都是独特的，这表明ABA信号因器官而异。以器官特异性的方式了解ABA的反应对于充分理解激素的作用和植物对水分缺乏的反应至关重要。

背景

水资源的减少和全球变暖的加剧有可能在未来减少粮食产量[1，2]。干旱、寒冷和盐度等非生物胁迫对植物生长和发育产生重大影响，导致产量损失和作物质量下降，每年造成数亿美元的损失。气候变化导致干旱发生的频率和程度增加，这将增加作物对灌溉的依赖，以保持生产力。

小道消息(葡萄是受非生物胁迫影响最重要的经济水果作物之一。葡萄对经济有数十亿美元的影响，而且对健康有好处，比如提供营养和抗氧化剂。3.]。赤霞珠(Cabernet Sauvignon)是世界上最著名的红葡萄酒葡萄之一，广泛种植在世界上水资源有限的地区(如加利福尼亚、智利和南澳大利亚)，这些地区的生产高度依赖灌溉。葡萄产量受植物水分状况的影响，水分胁迫会导致葡萄产量下降，影响葡萄酒品质[j]。4，5]。

植物激素脱落酸(ABA)在应对干旱、盐度和低温胁迫等多种环境胁迫中起着至关重要的作用[j]。1，6]，在植物生长发育过程中具有重要的功能，包括种子萌发、种子休眠和芽休眠[7- - - - - -9]。ABA在营养组织中具有关闭气孔、减少叶表面积等保持水分流失的重要作用。在葡萄叶片、木质部汁液和浆果中，ABA的增加是对水分缺乏的反应[10，11]，水分亏缺会影响大量参与ABA代谢的转录物[10- - - - - -13]。

近年来，ABA信号转导在分子水平上得到了广泛的研究[6，14- - - - - -17]。因此，许多与ABA信号相关的次级信使，如钙(Ca2 +)、活性氧(ROS)和一氧化氮(NO)。提出并验证了利用PYR/PYL/RCAR受体、2C型蛋白磷酸酶(PP2C)和蔗糖非发酵1 (SNF1)相关蛋白激酶2 (SnRK2)的ABA作用模型[18- - - - - -20.]。可溶性PYR/PYL/RCAR受体位于负调控通路的顶端，直接调控PP2C，进而负调控SnRK2。SnRK2是自动磷酸化的，然后磷酸化其他转录因子(TF)，如bZIP/ABRE, NAC, MYC/MYB和AP2/ERF TF家族的成员。然而，它们在ABA信号网络框架中的相互作用仍有待阐明。

的第一步新创ABA的生物合成是对刺激的反应，发生在质体中，在最后一步，ABA醛在细胞质中转化为ABA [21]。ABA由ABA 8′-羟化酶分解代谢，并由ABA糖基转移酶偶联。叶片中aba -葡萄糖酯(ABA-GE)水平在正常条件下相对稳定，在干旱胁迫下显著增加[22]。ABA- ge是ABA的一种运输和储存形式，对ABA稳态至关重要[j]。23，24]。至少有两种不同的质膜定位ABA转运体;atp结合盒G25 (ABCG25)是ABA从维管组织外排的转运体[25]和ABCG40负责ABA转运到保护细胞拟南芥［26]。

植物在不同的发育阶段和逆境反应中具有不同的生理功能和独特的基因表达模式。例如，叶子专门负责光合作用，根专门负责离子和水的运输。ABA对种子和幼苗基因表达的影响不同拟南芥［7];然而，我们对其他器官知之甚少，尤其是像葡萄藤这样的多年生木本水果作物。不同器官和细胞类型对ABA的生理反应不同，如根、芽和保护细胞。我们假设ABA信号在不同的器官中也会有所不同。对不同器官中ABA信号的研究将有助于我们更好地理解植物对渗透胁迫的反应和植物的发育。

本研究以ABA信号为重点，研究了ABA在不同器官中的下游转录基因表达:根尖、成熟叶、果实和细胞培养(分生组织样细胞)。本文阐述了ABA对葡萄不同器官中ABA生物合成、降解、结合、转运、信号通路和代谢通路相关基因转录的影响。

结果

葡萄的转录组学分析显示ABA对器官特异性的影响

赤霞珠(Cabernet Sauvignon)的5个不同器官(浆果、茎尖、叶片、根和细胞培养物)直接暴露于10 μM ABA中2 h，除了叶片样品，这些样品来自于根经气培处理的葡萄藤。虽然解剖学上不正确，我们指的是细胞培养作为人工器官代表分生组织样功能在本文中。罗氏的葡萄属我们利用全基因组微阵列来验证我们的假设，即不同器官有不同的ABA信号反应。双因素方差分析发现545个基因治疗效果有统计学意义，644个基因ABA治疗和器官相互作用有统计学意义(调整后)p值与p经假发现率调整后≤0.05;(附加文件1)。在本文中，术语“显著(ly)”是指p值等于或低于0.05的“统计显著”。进行了事后Tukey检验，以确定每个器官之间的显著治疗效果;有839例(p≤0.05)差异表达基因(DEGs)基于Tukey事后检验在对照组和ABA处理之间至少一个器官(附加文件2)。从事后测试来看，根有538个基因，是ABA响应基因数量最多的，而茎尖有39个基因，数量最少(图2)。1)。为了显示对照和ABA处理在果实、茎尖、叶、根和细胞培养物中的deg分布，我们创建了一个五向维恩图(图1)。1 b)。根和细胞培养有74个对ABA有共同反应的基因重叠最多。我们的假设得到了证实，没有一个基因的转录丰度在所有器官中都发生了变化;对ABA的反应是器官特异性的。进一步支持我们的假设，主成分分析(PCA)揭示了转录组数据中不同器官和治疗之间的显著差异(图2)。1 c)。主成分1和主成分2(分别为82.5%和6%)显示了转录表达值的总体方差。葡萄各器官在第一主成分上明显分离;然而，在第二个主成分中，浆果和茎尖与叶子以及细胞培养物和根分离。

图1
图1

对照和ABA处理植株的基因表达。一个ABA诱导显著差异表达基因的数量。b维恩图显示了在浆果、芽、根、叶和细胞培养中，对照和ABA处理之间显著差异表达基因的重叠。c浆果(B)、茎尖(S)、叶片(L)、根(R)和细胞培养物(CC)的主成分分析。C =控制;A =经ABA处理。以下数字为实验重复样本

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ABA影响ABA的生物合成、降解、结合、运输、信号传导和代谢途径

ABA对ABA代谢相关基因的转录丰度有显著影响(图2)。2;基因注释和表达值的附加细节在附加文件中提供3.)。类胡萝卜素是ABA生物合成的前体。ABA的生物合成通常由限速步骤，9顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)控制[27，28]。的转录丰度VviNCED3[EnsemblPlants:VIT_19s0093g00550]细胞培养显著增加。注意这个基因最初被命名为VvNCED1［10]，但根据国际葡萄基因组计划命名委员会的建议[29，我们已经将这种基因命名为VviNCED3因为它在拟南芥中最接近的同源物是AtNCED3。

图2
图2

ABA的生物合成、降解和偶联。日志的概要文件2与ABA代谢途径中每种酶相匹配的基因(问题集)的转录物丰度比率(ABA/Control)以热图形式在方框中显示。盒子从左到右分别是浆果(B)、茎尖(S)、叶子(L)、根(R)和细胞培养物(C)。EC编号和所有缩写为:1.13.11.51 (NCED: 9 -顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶)，1.1.1.288(黄氧素脱氢酶)，1.2.3.14 (AAO3:脱落醛氧化酶)，1.14.13.93 (ABAHase: ABA 8 ' -羟化酶)，2.4.1.263 (ABA- ugt:脱落β-葡萄糖基转移酶)，3.2.1.175 (β- d -葡萄糖基脱落β-葡萄糖苷酶)，ABA- ge: ABA-葡萄糖酯，ABCG: atp结合卡体亚家族g3.是:= EnsemblPlants: VIT_19s0093g00550, b = EnsemblPlants: VIT_10s0003g03750, c = EnsemblPlants: VIT_05s0051g00670, d = EnsemblPlants: VIT_13s0019g01010, e = EnsemblPlants: VIT_06s0009g00770, f = EnsemblPlants: VIT_06s0004g05050, g = EnsemblPlants: VIT_03s0063g00380, h = EnsemblPlants: VIT_02s0087g00710, i = EnsemblPlants: VIT_06s0004g01430, j = EnsemblPlants: VIT_01s0011g00760, k = EnsemblPlants: VIT_17s0000g02680, l = EnsemblPlants: VIT_12s0034g00160, m = EnsemblPlants: VIT_12s0055g00020,n = EnsemblPlants:VIT_12s0055g00030, o = EnsemblPlants:VIT_03s0063g00040, p = EnsemblPlants:VIT_18s0072g01220, q = EnsemblPlants:VIT_09s0002g05400, r = EnsemblPlants:VIT_18s0166g00080。*表示Tukey Post-Hoc试验的显著基因(p≤0.05)

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在大多数器官中，ABA生物合成途径编码酶的基因在限速步骤前的转录丰度对外源ABA的响应没有显著变化;唯一的例外是细胞培养中β-胡萝卜素羟化酶转录物丰度显著增加[EnsemblPlants:VIT_16s0050g01090]3.)。外源ABA对NCED后叶黄素脱氢酶和脱落醛氧化酶基因转录丰度的影响不显著。

细胞中的ABA水平受到降解和偶联过程的高度调节。ABA通过ABA 8′-羟化酶(ABAHase)代谢为8′-羟基脱落酸，并通过ABA- ugt偶联为ABA- ge。ABA分解代谢相关基因的相对表达量;CYP707As[EnsemblPlants:VIT_06s0004g05050和EnsemblPlants:VIT_03s0063g00380] [30.]在根和细胞培养中显著增加。对于ABA偶联，转录物丰度UGT基因在茎尖和根中减少，而在细胞培养中增加。ABA转运体的转录丰度，VviABCG40[EnsemblPlants:VIT_09s0002g05560]，根系显著降低。另一个被注释为ABC转运蛋白G成员22的转录物[EnsemblPlants:VIT_18s0166g00080]也可能参与ABA转运，因为它是ABA的平行体葡萄属ortholog [EnsemblPlants:VIT_08s0032g00790] ofAtABCG22(At5g06530);在ABA的作用下，其转录本丰度显著增加。

显示经典ABA信号通路核心组分(PYR/PYL/RCAR、PP2C、SnRK2和ABA响应元件结合转录因子)基因表达谱的热图如图所示。3.和附加文件3.。编码PYL12/RCAR6 [EnsemblPlants:VIT_13s0067g01940]和PYL4/RCAR10 [EnsemblPlants:VIT_08s0058g00470]的基因在ABA存在下的根和细胞培养中转录丰度显著降低。相比之下，pp2c基因在根[EnsemblPlants:VIT_16s0050g02570和EnsemblPlants:VIT_06s0004g06840]和细胞培养[EnsemblPlants:VIT_13s0019g02200和EnsemblPlants:VIT_06s0004g05460]中的相对表达量在ABA的作用下显著增加。暴露于ABA后，SnRK2s基因表达无明显变化。的转录物丰度显著增加VviABF2[EnsemblPlants:VIT_18s0001g10450]在根中被发现。

图3
图3

ABA信号通路。日志的概要文件2与ABA信号通路中每种酶相匹配的基因(探针组)的转录物丰度的比值(ABA/Control)在方框中以热图表示。盒子从左到右分别是浆果(B)、茎尖(S)、叶子(L)、根(R)和细胞培养物(C)。所有缩写为:PYR/PYL/RCAR: pyrabactin抗性/PYR样/ ABA受体调控组分，PP2C:蛋白磷酸酶2C, SnRK2:蔗糖非发酵1相关蛋白激酶2,AREB/ABF: ABA响应元件结合蛋白/ABRE结合因子，ABRE: ABA响应元件。在附加文件中找到的a-m的所有当前V1 id3.是:= EnsemblPlants: VIT_08s0058g00470, b = EnsemblPlants: VIT_13s0067g01940, c = EnsemblPlants: VIT_04s0008g00890, d = EnsemblPlants: VIT_11s0016g03180, e = EnsemblPlants: VIT_16s0050g02570, f = EnsemblPlants: VIT_06s0004g06840, g = EnsemblPlants: VIT_16s0050g02680, h = EnsemblPlants: VIT_00s0179g00140, i = EnsemblPlants: VIT_13s0019g02200, j = EnsemblPlants: VIT_06s0004g05460, k = EnsemblPlants: VIT_07s0197g00080, l = EnsemblPlants: VIT_03s0063g01080, m = EnsemblPlants: VIT_18s0001g10450,n = EnsemblPlants:VIT_07s0005g05400。*表示Tukey Post-Hoc试验的显著基因(p≤0.05)

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ABA依赖性和非依赖性转录因子，如AP2/ERF、NAC、bZIP/ABRE和MYC/MYB家族的成员都受到ABA的影响(图2)。4;额外的文件3.)。有趣的是，转录因子的转录丰度变化最大的是AP2/ERF家族，有20个成员的转录丰度变化具有统计学意义。ABA诱导AP2/ERF - TF超家族转录物丰度增加最多的是VviDREB2H[EnsemblPlants: VIT_13s0067g01960];的反应VviDREB2H是根特定的。在NAC TF家族中，有18个deg。编码同源基因的转录本VviNAC1[EnsemblPlants:VIT_19s0027g00230]在叶片中转录物丰度显著增加。bZIP/ABRE TF家族的7个成员的转录本丰度略有变化。bZIP/ABRE TF家族1度为VviGBF3[EnsemblPlants:VIT_02s0025g01020]，在根和细胞培养中被发现显著上调。该基因在拟南芥中没有同源性;它的功能是未知的。对于MYC/MYB TF家族，有10个度。最值得注意的是,VviMYB121[EnsemblPlants:VIT_14s0083g01060]在根中表现出最显著的转录本丰度增加。

图4
图4

ABA影响的转录因子。日志的概要文件2与ABA信号通路中每个转录因子相匹配的基因(探针集)的转录丰度之比(ABA/Control)在方框中以热图表示。盒子从左到右分别是浆果(B)、茎尖(S)、叶子(L)、根(R)和细胞培养物(C)。*表示Tukey Post-Hoc试验的显著基因(p≤0.05)

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外源ABA影响了几种代谢途径中基因的转录丰度，尤其是类黄酮生物合成途径(图2)。5;额外的文件3.)。二苯乙烯合成酶编码基因[STS: EnsemblPlants: vit_16s00100g00860和EnsemblPlants:VIT_10s0042g00870]在ABA处理下显著增加了浆果的转录丰度，但在根和细胞培养中却降低了转录丰度。相反，黄酮醇合成酶[EnsemblPlants:VIT_18s0001g03510]和类黄酮3′-羟化酶[EnsemblPlants:VIT_17s0000g07200]的基因在ABA的作用下显著增加。有趣的是，许多编码花青素3- o -葡萄糖基转移酶的基因的转录丰度仅在根中响应ABA显著增加，而其他器官的mRNA丰度则下降或保持不变。

图5
图5

类黄酮生物合成途径。与类黄酮生物合成途径中每种酶相匹配的基因(探针组)转录物丰度的log2比值(ABA/Control)曲线在方框中以热图的形式显示。盒子从左到右分别是浆果(B)、茎尖(S)、叶子(L)、根(R)和细胞培养物(C)。EC值分别为:2.3.1.95(二苯乙烯合酶)、6.2.1.12(4-香豆酸-辅酶a连接酶2)、1.14.13.21(类黄酮3′，5′-羟化酶)、1.14.13.88(类黄酮3′，5′-羟化酶)、1.14.11.23(黄酮醇合酶)、2.4.1.115(花青素3- o -葡萄糖基转移酶)。a-r的所有当前V1 id都在附加文件中找到3.是:= [EnsemblPlants VIT_16s0100g00860): b = [EnsemblPlants: VIT_10s0042g00910], c = [EnsemblPlants: VIT_10s0042g00870], d = [EnsemblPlants: VIT_17s0000g01790], e = [EnsemblPlants VIT_17s0000g07200): f = [EnsemblPlants: VIT_05s0094g01190], g = (EnsemblPlants: VIT_07s0031g01570), h = [EnsemblPlants VIT_18s0001g00590):, i = [EnsemblPlants: VIT_18s0001g03510], j = [EnsemblPlants: VIT_12s0034g00030], k = [EnsemblPlants: VIT_12s0034g00060], l = [EnsemblPlants VIT_12s0034g00130):m = [EnsemblPlants:VIT_12s0034g00140]， n = [EnsemblPlants:VIT_12s0034g01120]， o = [EnsemblPlants:VIT_12s0055g00290]， p = [EnsemblPlants:VIT_17s0000g04750]， q = [EnsemblPlants:VIT_17s0000g04760]， r = [EnsemblPlants:VIT_17s0000g07100. p = [EnsemblPlants:VIT_17s0000g04760]。*表示Tukey Post-Hoc试验的显著基因(p≤0.05)

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器官对ABA的差异基因表达反应

ABA影响了基因本体(GO)功能范畴的许多生物学过程;具有统计学意义的deg参与蛋白质折叠和对热、过氧化氢、强光和温度的反应(附加文件)4)。然而，不同的植物器官对ABA的反应不同。各器官的个别反应总结如下:

浆果

浆果中有33个基因对ABA表现出器官特异性的基因表达应答(图2)。1 b;额外的文件2)。ABA转录丰度增加最多的基因是VviABCG22-like[EnsemblPlants: VIT_18s0166g00080];而转录物丰度下降幅度最大的是编码富含甘氨酸的细胞壁结构蛋白的基因[EnsemblPlants:VIT_05s0077g00900]。编码转录因子(TF)的基因在浆果中对ABA的响应中转录丰度最高脱落酸不敏感的3样［VviABI3: EnsemblPlants: VIT_07s0005g05400]。ABI3是一个b3结构域转录因子，是核心ABA信号网络的一部分[31]。a的转录丰度过氧化物酶参与卟啉和叶绿素代谢的基因[EnsemblPlants:VIT_04s0008g07040]对ABA的响应显著降低。另一个转录物丰度显著增加的转运体是液泡氨基酸转运体[EnsemblPlants:VIT_19s0027g01870]。a的转录丰度GABAT(γ-氨基丁酸转氨酶)基因[EnsemblPlants:VIT_03s0017g01720]显著升高，而AST[天冬氨酸转氨酶:EnsemblPlants:VIT_05s0020g03410]显著降低，这可能导致琥珀酸盐升高，随后苹果酸盐升高。编码类黄酮生物合成酶的基因的转录丰度，如STS[EnsemblPlants: vit_16s00100g00860和EnsemblPlants:VIT_10s0042g00870]仅在浆果中显著增加。

茎尖

在过度代表氧化石墨烯类别的茎尖ABA处理中，转录物丰度显著降低的基因与蛋白质氨基酸磷酸化有关(附加文件)4)如clavata1样受体激酶[VviCLV1;受体激酶同源物LRK14-like [EnsemblPlants:VIT_16s0098g00080]和malectin/receptor-like protein kinase-like [EnsemblPlants:VIT_16s0039g01260]。有17个基因对ABA表现出器官特异性的基因表达应答(图2)。1 b;额外的文件2)。ABA应答中表达量最高的基因是AP2/ERF TF家族的基因。一个VviDDF2[EnsemblPlants:VIT_02s0025g04460]是转录丰度增加最多的基因，在茎尖上发生了显著变化。一个VviORA47[EnsemblPlants:VIT_11s0016g00670]对ABA的响应也显著增加。受ABA影响，转录物丰度下降幅度最大的基因与次级细胞壁生物合成有关[法西克林样阿拉伯半乳聚糖蛋白基因:VviFLA11;EnsemblPlants: VIT_08s0040g01990]。另一个同样参与细胞壁生物合成的基因[木糖基转移酶:EnsemblPlants:VIT_14s0060g01670]在ABA的作用下转录丰度显著降低。这一结果表明，外源ABA可能对幼苗生长有抑制作用。

叶

有33个基因在ABA作用下表现出叶片器官特异性基因表达(图2)。1 b;额外的文件2)。TFs转录物丰度增加最多的是VviNAC1[EnsemblPlants: VIT_19s0027g00230]。受ABA的影响，转录丰度下降幅度最大的基因是一个编码异-共alyl二磷酸合成酶的基因[EnsemblPlants:VIT_07s0151g01070]，该基因参与赤霉素(gibberellic acid, GA)的生物合成。对t-copalyl二磷酸合成酶(At4G02780)的转录物丰度进行了分析拟南芥对ABA的反应也有所下降[32]。叶片中转录物丰度显著增加的基因大多与蛋白质折叠有关。编码(E,E)- α -法尼烯合成酶的基因[EnsemblPlants:VIT_00s0361g00060和EnsemblPlants:VIT_00s0392g00030]在ABA作用下，叶片转录丰度显著增加，而茎尖转录丰度显著降低。(E,E)- α -法尼烯合成酶参与萜类生物合成。一些转录物丰度显著降低的基因，如表皮模式因子样蛋白[EnsemblPlants: VIT_09s0002g01700]毯1[EnsemblPlants:VIT_01s0137g00030]在叶片形态发生和苞片形成中起作用。此外，还有与转运相关的转录物丰度显著降低的基因，如水通道蛋白GAMMA-TIP3[EnsemblPlants:VIT_06s0061g00730]和ABC转运子成员5的同源物，AtMRP5[EnsemblPlants:VIT_07s0005g04460]，它是一种肌醇六磷酸转运体，参与ABA信号传导和保护细胞的调节[j]。33]。

根

根具有最多数量的对ABA有反应的基因，并且有许多氧化石墨烯类别显着过度代表(附加文件)4)。在ABA的刺激下，根中转录丰度显著增加的基因的主要生物过程GO类别是对光、热和活性氧等刺激的反应。(+)-脱落酸8′-羟化酶活性的分子功能在ABA响应显著增加的基因中被显著过度代表。对于ABA转录丰度显著降低的基因，其中许多与蛋白质氨基酸磷酸化有关。的转录丰度VviMYB121[EnsemblPlants: VIT_14s0083g01060]VviDREB2H[EnsemblPlants:VIT_13s0067g01960]仅在根中显著上调2)。这两个转录因子已被发现对非生物胁迫有反应。qPCR结果也证实了VviMYB121和VviDREB2H对ABA的响应增加(附加文件)5)。在根中响应ABA的转录物丰度下降最大的基因是两个果胶酯酶[EnsemblPlants:VIT_06s0009g02560和EnsemblPlants:VIT_06s0009g02570](附加文件)2)，参与细胞壁代谢的果胶降解酶。许多热休克蛋白基因的转录丰度在根中增加。葡萄糖基转移酶编码基因[EnsemblPlants:VIT_05s0062g00310, EnsemblPlants:VIT_05s0062g00300，和EnsemblPlants:VIT_05s0062g00340]的转录本丰度在根中被ABA显著下调。有趣的是，有生长素-、花青素-和细胞分裂素-葡萄糖基转移酶，它们的转录丰度仅在根中被ABA降低。几个参与运输的基因在根中显著增加，如VviABCG33[EnsemblPlants:VIT_14s0060g00470]一个同源物AtPDR5水通道蛋白GAMMA-TIP3[EnsemblPlants:VIT_06s0061g00730]和硫酸盐转运体[EnsemblPlants:VIT_05s0020g03970]。注意，同样的水通道蛋白在叶片中被ABA下调(见上文)。

细胞培养

在细胞培养中，响应ABA的上调基因中显著过度代表的氧化石墨烯类别涉及激素刺激(附加文件)4)。此外，还有大量转录本丰富度增加的与木糖基转移酶活性相关的基因，如EnsemblPlants:VIT_11S0052G01190、EnsemblPlants:VIT_11S0052G01330、EnsemblPlants:VIT_11S0052G01220和EnsemblPlants:VIT_11S0052G01300。在细胞培养中，响应ABA的转录物丰度增加最多的TF是一个同源基因[EnsemblPlants:VIT_18s0001g05850;无花果。4)AtERF022，参与体细胞胚胎发生和乙烯信号传导[34]。在ABA的作用下，转录丰度下降幅度最大的基因是ABA受体PYL12 / RCAR6[EnsemblPlants:VIT_13s0067g01940][附加文件5)。这一结果与a的高表达一致PP2C[EnsemblPlants:VIT_06s0004g05460]，这是ABA信号通路负反馈回路的一部分。ABA也降低了木质素形成阴离子过氧化物酶基因的转录丰度[EnsemblPlants:VIT_01s0010g01920, EnsemblPlants:VIT_01s0010g02000和EnsemblPlants:VIT_01s0010g02020]。阴离子过氧化物酶的下调改变木质素的含量和组成[j]35]。转录本丰度增加最多的基因是aU-box结构域蛋白[EnsemblPlants:VIT_17s0000g08080]可能具有U-box型E3泛素连接酶功能5)。

讨论

水分缺乏改变了植物的代谢稳态[11，36- - - - - -38]。植物通过关闭气孔和减少光合作用来减少水分流失，这一过程可由ABA触发[13]。ABA可以在所有细胞和器官中合成[39]。根器官感知土壤水分的有效性，进行合成新创在轻度水分亏缺条件下，ABA和通过木质部运输ABA [j]40]。但是，有多少ABA通过木质部汁液从根部运输到植物的不同部位，又有多少ABA直接在叶片或保护细胞中合成，从而导致气孔关闭，目前尚不清楚[8，9，40]。

ABA信号因器官而异

我们的微阵列数据清楚地支持我们的假设，即不同的器官有不同的ABA信号反应。所有器官中没有单一DEG以相同的方式受到影响。在我们的研究中，在各器官上施用相同浓度的ABA(除了叶片，叶片只响应来自根部的ABA运输);在根中发现的基因表达变化较大(图2)。1)可能是由于根部对ABA的敏感性较高，然而，我们不能排除器官对ABA的吸收存在差异的可能性。此外，随着时间的推移或ABA浓度的升高，更多的基因可能具有相似的表达模式。然而，结果支持ABA敏感性和信号传导的差异。

另一个影响ABA反应变化的因素可能是其他相互作用信号或表观遗传调控的存在[41，42]。已知ABA与其他植物激素和营养物质(如糖)相互作用或相互作用[1，6，31]。包括种子萌发、果实发育、根和芽生长在内的关键过程已经被用来了解激素串扰在蛋白质活性和基因表达中的作用。破译基因表达调控中这些复杂的多重信号是一个重大挑战。我们的数据提供了ABA作用从一个器官到另一个不同的直接转录证据。这表明其他“信号伙伴”与ABA一起参与协调基因表达是必不可少的。未来的实验将需要确定哪些主要因素可能与ABA相互作用，以解释ABA在这里研究的器官中的不同反应。

ABA对ABA代谢的影响

我们的数据表明，ABA触发了ABA代谢和信号的反馈回路，这些反应在器官之间是不同的。多项研究表明，数控干旱胁迫对9 -顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶基因的诱导作用较强;拟南芥、玉米、番茄、豆类、豇豆和鳄梨[10，12，43- - - - - -47]。在我们的研究中，VviNCED3在细胞培养中显著增加，但在其他器官中没有。参与ABA降解和偶联的基因转录丰度大大增加(图2)。2)。这与几项研究的证据一致，即ABA通过激活分解代谢酶对自身的积累进行负性调节[8，48，49]。在ABA信号通路中，转录物丰度为PYR /所有/ RCAR的转录物丰度显著降低PP2Cs在根和细胞培养中显著增加(图2)。3.)。胁迫条件下高浓度的ABA可诱导PP2Cs［50］。对于ABA的运输，发现一种ABC转运体能够将ABA从细胞质运输到液泡中，从而控制胞浆中ABA的水平[24]。的相对高的表达VviABCG22-like表明ABA可能会转运到细胞中[51]。相比之下，转录物丰度显著降低VviABCG40在细胞培养中可以降低细胞中的ABA水平，这对应于在细胞培养中发现的负反馈反应。总的来说，这些结果表明，ABA浓度的增加存在一个负反馈循环，以平衡ABA的作用[52]。

ABA对浆果成熟的生化影响

在植物生长发育过程中，ABA水平随着葡萄果实的成熟而增加;可能与渗透胁迫无关[11，53，54]。葡萄果实成熟过程包括:果实软化、糖积累、有机酸还原、钾水平和酚类化合物的增加[55]。我们的研究与这些研究一致，ABA参与葡萄果实成熟过程。的转录物丰度显著增加VviABI3在浆果成熟的滞后阶段被发现[56表明ABA与葡萄成熟之间的关系。在我们的微阵列分析中发现了一种富含甘氨酸的蛋白质，其同源物参与细胞壁的生物发生和降解拟南芥(At3g17050)。这一结果与ABA调控果实成熟过程中细胞壁修饰基因的假设是一致的。参与苹果酸盐生物合成的基因的相对表达，如GABAT和AST增加了。GABA代谢能够通过SSADH活性产生琥珀酸盐和NADH，从而促进TCA循环和呼吸电子传递链的活性。这与天冬氨酸转氨酶基因的低表达一致，该基因催化草酰乙酸转化为天冬氨酸，导致苹果酸水平升高。此外，ABA还能促进苯乙烯和花青素等酚类化合物的生成[54，57，58]，这与本研究中浆果中二苯乙烯合成酶和花青素糖基转移酶基因的上调非常吻合(图2)。5)。

ABA在水分亏缺期的节能和抗氧化防御作用

ABA是一种防御激素，有助于保护植物免受水分缺乏。植物对水分缺乏非常敏感，当气孔关闭和光合作用被抑制时，维持足够的能量水平是困难的。在能量有限的条件下，植物通过减少生长和蛋白质合成来优先考虑支持能量保存的代谢途径，并利用保存的能量进行防御，如抗氧化防御[qh]37]。

由于在应激过程中能量守恒，代谢通量可以从细胞壁生产中转移，这是一个能量密集型过程。在这里，转录本丰度下降VviFLA11发现仅在茎尖处受ABA处理可能与抑制茎的生长有关。之前的一项研究表明fla1在离体芽诱导试验中，突变体再生芽的能力降低拟南芥［59]。AtFLA11和AtFLA12在拟南芥都参与细胞壁的组成，导致细胞壁结构的改变[60]。这种情况也发生在叶片中，其中一个参与GA生物合成的基因的转录物丰度降低。GA调节细胞从分裂到扩张的转变，从而控制器官的生长和大小。因此，在胁迫下，GA水平可能会降低，以限制叶面积表面积，从而通过减少水分流失来帮助植物[61]。此外，其他细胞壁酶的转录丰度也受到影响，如根中的果胶酯酶和细胞培养中的细胞壁过氧化物酶。

参与黄酮醇和花青素生物合成的基因过表达增加了植物的抗逆性[62]。此外，玉米的不同器官(根和芽)在缺水时产生不同形式的萜类抗氧化剂，而根特有的萜类使植物具有耐旱性[63]。花青素的生物合成受到ABA的影响，ABA具有抗氧化和保护UV-B的作用[j]。64，65]。此外，叶片中的萜烯在应对非生物胁迫时增加，并可作为防御或保护反应[66]。

与这些观察结果一致，在我们的研究中，ABA增加了参与抗氧化防御的基因的转录丰度。黄酮类和萜类代谢相关基因的表达存在差异。黄酮类化合物生物合成的不同步骤在不同器官中受到影响(图2)。5)。(E,E)- α -法尼烯合成酶基因(TPS47)在叶片中增加。(E,E)- α -法尼烯合成酶属于TPS-bCabernet Sauvignon中可以产生单萜烯的一科植物[67]。萜烯可以在非生物胁迫中作为抗氧化剂，例如通过氢或电子的转移和单线态氧的猝灭[68]。

ABA对转录的影响

多个tf由ABA触发，以启动或抑制下游信号。在我们的研究中，转录物丰度变化最大的tf属于AP2/ERF超家族(图2)。4)。DREB是AP2/ERF TFs的一个亚家族，调节植物对非生物胁迫条件的反应[69，70]。AP2/ERF TFs可与乙烯、赤霉素、水杨酸等激素发生串扰。在每种情况下，哪些特定的dreb充当传感器知之甚少。我们的结果显示了一个独特的和高表达VviDDF2茎尖的基因，VviDREB2H特别是根，和VviERF022在细胞培养中对ABA的反应过度表达AtDDF2在拟南芥由于GA的减少，导致了矮化表型，这与我们在叶片中的结果一致，在叶片中，参与GA生物合成的基因在ABA的作用下被下调[71]。

其他tf家族如bZIP/ABRE、NAC和MYC/MYB在基因表达上也有差异变化。转录丰度VviMYB121在ABA的作用下，在根中特异地增加。这一结果与a拟南芥的表达AtMYB121ABA处理增加，且仅在根中增加;在渗透胁迫下，转录物丰度的变化也最大[72]。在叶片中，aVviNAC1在ABA作用下，所有TF的转录物丰度增加最多。这个基因的同源物拟南芥只在衰老叶片中高表达[73]，一些NAC TFs被发现是ABA诱导叶片衰老的一部分[74]。VviNAC1对ABA和其他防御相关激素有反应;当它在拟南芥中过度表达时，它会赋予胁迫耐受性[75]。有趣的是，在浆果中转录物丰度最高的TF是VviABI3。这个基因的近亲拟南芥被发现对种子成熟至关重要，是ABA信号网络的一部分[31]。这些TFs是研究葡萄对ABA的器官特异性反应调控的良好候选基因。

ABA对蛋白质修饰的影响

在我们的研究中，参与蛋白质修饰和代谢的基因受到ABA的影响。翻译后修饰如磷酸化、泛素化和亚硝基化已被发现参与ABA信号通路[6]。磷酸化是ABA触发下游靶标的关键过程。PP2C是通过去磷酸化负调控SnRK2s的关键蛋白。当SnRK2s被磷酸化时，它们是活跃的，导致下游激活因子和抑制蛋白的磷酸化。pp2c通过增加转录物丰度来减缓外源ABA量快速增加所导致的ABA信号通路的激活。这些转录本属于氧化石墨烯的蛋白质氨基酸磷酸化过程的范畴，在茎尖、根和细胞培养中被发现减少(附加文件)4)。

泛素化是一种快速的翻译后修饰，响应各种环境胁迫导致蛋白质降解。在我们的研究中，我们发现细胞培养和根中含有植物U-box结构域蛋白19 (PUB19)的转录丰度在ABA的作用下大幅增加。之前的一项研究发现AtPUB19(AT1G60190.1)基因在ABA和干旱诱导下表达，具有E3连接酶活性[76]。PUB19是aba介导的干旱胁迫响应的负调控因子;的atpub19突变体对ABA更敏感，对干旱胁迫的耐受性增强[77]。

结论

我们的转录组学分析揭示了ABA在葡萄不同器官中的独特作用。支持我们的假设，即对轻度ABA水平的反应是复杂的，依赖于所涉及的器官。虽然在所有器官中没有任何基因对ABA有共同的反应，但有一些共同的途径或基因本体受到ABA的影响，包括转录因子活性、ABA代谢和信号传导以及类黄酮代谢。本研究提供了葡萄各器官中aba应答的候选基因。确定葡萄各器官中调控ABA反应的基因表达差异，对于全面了解激素的作用和整个植株对水分亏缺的生理反应至关重要。最终，这些知识可以用来操纵ABA在不同器官中的作用，以达到理想的结果，如增强抗旱性和葡萄品质。

方法

样品收集

2010年，加州大学戴维斯分校收集了茎尖和浆果样本;2010年在俄勒冈州立大学对细胞培养样本进行了取样;根和叶子样本是2011年在内华达大学里诺分校采集的。

自有根的藤蔓葡萄(l)的简历。在加州大学戴维斯分校(UC Davis)，赤霞珠(Cabernet Sauvignon)被用于芽尖和浆果(在vvac之前)的检测。这些葡萄藤从休眠开始生长在4升的树盆中，其中装满1/3泥炭，1/3沙子，1/3红木堆肥，2.4 kg m−2温室白云石石灰(30/20℃±3℃;40/ 70%±10% rh;自然光，日最大可达1200 μmol m−2年代−1票面价值)。将藤蔓修剪成两枝，枝条垂直培养至~1.5 m。每天4次(06.00,09.00,14.00,18.00)在7.57 L h下滴灌4分钟−1(2)−1)，用pH为5.5至6.0的稀营养液(90 ppm钙、24 ppm镁、124 ppm钾、6 ppm氮铵、96 ppm氮硝、26 ppm磷酸盐、16 ppm硫酸盐、1.6 ppm铁、0.27 ppm锰、0.16 ppm铜、0.12 ppm锌、0.26 ppm硼和0.016 ppm钼)配制。

俄勒冈州立大学(Oregon State University)细胞悬浮培养(CS4)在~68 μmol m的连续荧光灯下维持−2年代−1)在25°C的轨道激振器(120转/分)。悬浮培养每周在含有50 mL细胞悬液的250 mL Erlenmeyer瓶中传代，B5培养基中添加20 g L−1蔗糖，250毫克升−1酪蛋白水解物，0.5 mg L−11-萘乙酸和0.12 mg L−1以1/5 (v/v)的比例将细胞接种到新鲜培养基中。实验将7天龄的细胞悬液接种于新鲜培养基(3:7)中，培养3天后进行处理。

在UNR温室的气培系统中，由叶片插枝繁殖的幼藤生长。赤霞珠的根插枝在生长室内生长2至3周，然后小心地转移到气培系统中。每个容器(43.2 cm (L) × 27.9 cm (W) × 20.3 cm (H))有自己的气控雾化器，每个实验重复的雾头尺寸为直径3.8 cm × 4.4 cm高(3个容器为对照，3个容器为ABA处理)。每个容器的盖子上都有小洞，大到足以让有根的植物通过。吉伯特解[78]在气培雾中为葡萄藤提供常量和微量元素。溶液的pH保持在6.0。根和叶样品在处理前在该体系中生长3个月。

ABA处理

首先溶解ABA ([+]-ABA, A.G. Scientific, Inc.;http://www.agscientific.com)在100%乙醇中稀释至500 mM，然后在含有0.05%佐剂的水中稀释至10 μM (Latron-B, DOW AgroSciences LLC，http://www.dowagro.com)。对照喷雾溶液为含有0.05%佐剂和0.002%乙醇的去离子水。茎尖、浆果簇和细胞培养液喷10 μM ABA处理，直至脱落。将10 μM ABA添加到雾化器周围的营养液中，在气培体系中处理根2 h;收获根处理过的葡萄藤的根和叶。样品在-80°C保存前快速冲洗并在液氮中快速冷冻。收集了三个独立的实验(和生物学)重复，以比较aba处理和未处理的样品。

RNA提取和微阵列

采用基于十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)的方法分离总RNA [79]和RNeasy植物迷你试剂盒(Quiagen)，遵循制造商的协议。总RNA用RNAse-free DNAse I (Qiagen)处理以消除任何基因组DNA污染，然后用Nanodrop分光光度计(Thermo Scientific Nanodrop 2000c)定量。根据制造商的说明，使用Agilent 2100生物分析仪使用RNA LabChip®分析每个RNA样品的等同物。NimbleGen全基因组微阵列(090818 Vitis exp HX12 (Roche, NimbleGen Inc.， Madison, WI, USA))包含29,550个基因序列葡萄用于测定基因表达。总RNA (10 μg)采用SuperScript III First Strand System (Invitrogen)制备cDNAnd利用随机引物和klenow外显酶(NEB)生成dna链。利用生物分析仪对cDNA进行分析和定量。使用NimbleGen单色DNA标记试剂盒(NimbleGen)按照制造商的方案进行样品标记。如前所述，用分光光度法对纯化的标记RNA进行定量。根据制造商的建议，将标记RNA的3 μg样本杂交到阵列上。

微阵列数据分析

所有NimbleGen定制的寡核苷酸阵列图像首先以原始数据格式进行视觉检查，以确定由于纤维或气泡引起的总体空间变化。所有原始阵列数据首先通过鲁棒多阵列平均(RMA)进行处理和归一化[80]使用R包affy [81]。具体而言，通过应用完美匹配探针特异性校正的RMA模型计算表达值。然后通过分位数归一化对处理后的探针值进行归一化，并应用中位数抛光从所有探针值中计算一个表达式度量。每种生物状态的三种表达测量分别对阵列上的每个元素进行检查，如[82]。在这一点上进行了额外的质量控制步骤[83- - - - - -85]。

在88,650组重复中，14%的重复变异系数大于50%。任何显示变异系数大于0.5，并且包含一个或多个距离平均值超过1个标准差的重复测量的重复组都被仔细审查。该数据集中三个重复的最大标准差为1.15;观察到的所有测量值中有33%与其组重复的平均值相差大于1个标准差。在本实验测量的886,500个表达值中，有11,671个(1.31%)被排除为单个异常值。经校正后，仍有171组三重复变异系数仍大于0.75，完全排除在进一步分析之外。其余874,316(98.6%)个值的平均变异系数为0.157，低于UNR生物信息学中心处理的微阵列实验的典型值[83- - - - - -85]。

对清洗后的归一化数据进行简单的双向方差分析，以检验具有统计学意义的治疗效果、器官效应以及治疗和器官相互作用效应的问题集。应用多重测试校正来调整p-方差分析值[86]。对具有显著治疗作用的基因和治疗x器官相互作用项(调整后)应用Tukey事后检验p-value≤0.05)。与事后检验有统计学显著差异的基因被用于创建图中的维恩图。1 b。

主成分分析(PCA)应用于质量控制的表达数据，使用协方差矩阵来可视化表达数据中的任何趋势。受ABA影响的代谢途径通过使用EnsemblPlants BioMart创建的基因本体(GO)文件确定[87]葡萄和BiNGO分析[88[v. 2.44]http://apps.cytoscape.org/apps/bingo)与细胞壁[89[v. 2.8.3，http://www.cytoscape.org/)。在Benjamini和Hochberg错误发现率校正后，使用显著性阈值为0.05的超几何检验确定过度代表的类别。

qPCR

对10个差异表达基因进行qPCR阵列验证(附加文件)6)。决定系数(r)2)，与qPCR比较为0.69;P< 0.0001。总RNA的提取与上述用于微阵列分析的方法相同。用iScript逆转录酶混合物(Bio-Rad)按说明书将1 μg RNA逆转录为cDNA。采用SsoAdvanced SYBR Green Supermix (Bio-Rad)进行实时定量RT-PCR (qPCR)实验。PCR引物采用NCBI Primer-blast软件设计。引物序列和PCR效率见附加文件6。反应在BioRad实时热循环器CFX96上进行。所有PCR实验均采用两步热循环:95°C 30 s;40个循环，95°C 10秒，59°C 15秒，95°C 10秒。在每个循环结束时捕获荧光信号，并在53°C至95°C范围内进行熔化曲线分析，以确定扩增产物的特异性。利用NimbleGen葡萄全基因组微阵列29 K 090918-MD，从所有实验中变异系数较低的基因中选择一个内参基因。GAPDH[EnsemblPlants: VIT_17s0000g10430],EIF4F[EnsemblPlants: VIT_04s0008g06770]EF1alpha[EnsemblPlants:VIT_06s0004g03220]为本实验寻找合适可靠的内参基因。一个GAPDH由于通过微阵列分析mRNA的变异系数低，因此在分析中选择基因作为归一化所有数据变化的内部控制。根据Pfaffl方程计算相对表达比值[90]。

支持数据的可用性

所有微阵列表达数据均可在基因表达综合数据库(Gene expression Omnibus, GEO) [91]，登记号为GSE78798。

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下载参考

致谢

这项研究得到了美国农业部国家粮食和农业研究所哈奇基金(ne00345项目)的支持;多州项目(NE1020)的一部分:酿酒葡萄品种和无性系的多州评价。细胞培养工作得到了葡萄研究协调网络向RG提供的奖学金的支持，该奖学金是国家科学基金会拨款号的一部分。DBI 0741876。微阵列数据分析得到了美国国家普通医学科学研究所(P20GM103440)的资助。

作者信息

从属关系

  1. 美国内华达大学生物化学与分子生物学系，内华达州里诺89557

    Supakan Rattanakon, Ryan Ghan, Karen A. Schlauch和Grant R. Cramer

  2. 波尔多农业科学院，葡萄与葡萄酒科学研究所(ISVV)， EGFV, UMR 1287, F-33140，法国Villenave d 'Ornon

    Gregory A. Gambetta

  3. 美国俄勒冈州立大学园艺系，美国俄勒冈州科瓦利斯97331

    洛朗·g·德鲁克

作者
  1. Supakan Rattanakon
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  2. 瑞安甘”
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  3. Gregory A. Gambetta
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  4. 洛朗·g·德鲁克
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  5. Karen A. Schlauch
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  6. 格兰特·r·克莱默
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相应的作者

对应到格兰特·r·克莱默。

额外的信息

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

作者的贡献

SR设计并进行了根和叶的实验，分析了所有的数据，并撰写了论文的主体;RG和LGD设计并进行细胞培养实验;GAG和GRC设计并进行了浆果和茎尖试验;KAS进行微阵列数据处理和统计分析。GRC监督项目的各个方面。所有作者都审阅、编辑并批准了手稿的最终版本。

附加文件

附加文件1:

赤霞珠不同器官的NimbleGen葡萄全基因组芯片上所有基因的注释、转录物丰度值和统计数据。的意思p- FDR校正后的值在0.05水平。记录值是平均对数2为每个处理设置的每个探头的值。(xls16032kb)

附加文件2:

双因素方差分析(adtrt和adtrt *Organ withp≤0.05)，进一步采用Tukey Post-Hoc检验。值是来自Tukey Post-Hoc测试和日志的概率2各器官经ABA处理的转录本与对照处理的转录本之比。Post-Hoc检测中显著下调的基因和显著上调的基因分别用蓝色和红色标注。(xls353kb)

附加文件3:

日志的概要文件2涉及ABA生物合成、降解与偶联、转运、ABA信号、转录因子和类黄酮生物合成的基因(probesets)的转录丰度比值(ABA/Control)。(xls59kb)

附加文件4:

通过Tukey Post-Hoc测试(Tukey Post-Hoc test)，获得了所有显著基因、茎尖和根中下调基因、根和细胞培养物中上调基因在氧化石墨烯生物过程功能类别(p≤0.05)。(xls1139kb)

附加文件5:

qPCR验证微阵列数据、内参基因和靶基因的引物序列和引物效率。(xls188kb)

附加文件6:

10个差异表达基因的qPCR阵列验证。散点图显示了微阵列(y轴)和qPCR (x轴)测量的10个差异表达基因的基因表达之间的相关性。日志2绘制了处理组与对照组的折数变化。Pearson相关检验:R2＝0.6868,P <0.0001。(xls165kb)

权利和权限

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引用本文

Rattanakon, S.， Ghan, R.， Gambetta, ga .et al。脱落酸转录组信号因葡萄器官而异。BMC Plant Biol16，72(2016)。https://doi.org/10.1186/s12870-016-0763-y

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  • 脱落酸信号
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BMC植物生物学

ISSN: 1471 - 2229

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