德诺维转录组测序和基因表达分析揭示了鸽子树中种子流产的潜在机制（戴维娅涉及招牌。）

背景

鸽子树（戴维娅涉及扑克。）是一种罕见和濒危的物种。由于其低繁殖力，鸠树的自然繁殖极其困难。严重的种子流产是限制其性繁殖的关键因素之一。了解种子堕胎的诱惑对于解决后代生产问题以及这种濒危物种的生存性至关重要。然而，缺乏关于木质植物种子流产的分子机制的研究，并且鸽子树的基因组资源的缺乏限制了进一步的研究。

结果

在这项研究中，我们使用Illumina平台德诺维鸽子树果实和种子的转录组测序。共分离到149099个转录本，组装成72885个unigenes。随后，筛选了正常种子和败育种子之间的差异表达基因(DEGs)。胁迫反应、激素信号转导、细胞程序性死亡、木质素生物合成和次生细胞壁生物发生等相关基因在正常种子和败育种子中表达水平存在显著差异。

结论

综合结果表明，败育种子处于逆境胁迫下，应由母株控制。由母体控制的包皮发育被认为是堕胎调控的一个关键过程。MYB和WRKY转录因子、受体激酶和漆酶被认为是种子败育的重要调控因子。此外，大量的序列数据有助于进一步的分子研究，这一独特的物种。

戴维娅涉及招招。，也称为鸽子树或手帕树，是大学的遗物物种[1]．戴维娅是北美古生物的许多景点的植物群的主要部分。但是，今天对中国进行了暴力[1那2]．大多数研究人员认为是属的唯一成员戴维娅家庭的Davidiaceae[3.]．鸽子树的最特殊特征是其头部花序和迷人的白色苞片。戴维娅也是濒危物种，已被列为中国的一级国家保护植物[2]．目前，自然的分布戴维娅人口罕见并分散，主要是由于其严谨的生态化需求和低繁殖力。在中国，自然鸽子树种群的分销领域不断下降，大多数自然人种群呈现“倒金字塔”结构，表明人口抑郁症[4.]．用于鸽子树资源保护，引入和人工育种技术戴维娅自1979年以来一直在中国研究过[5.]．但是，研究没有进展顺利戴维娅性繁殖严重受到极长的休眠期和种子的高流产率[5.]．一般来说，种子发育良好的品种只有1-3个戴维娅水果。通过观察发现了种子败育的方式戴维娅与温度、降水、年际周期和基因型无关。此外，种子败育在其他濒危树种中也有发生Caryocar brasiliense[6.]，玉兰剥夺了[7.),鹅掌楸研究方面[8.]，暗示在这些稀有物种中存在的种子流产的保守机制。

花卉，水果和种子流产在植物王国普遍存在。许多植物种类，特别是多年生植物，比种子比水果更多的花朵更远，比种子更多9.]．低种子和胚珠和果实对花卉比率导致一些长生树种的繁殖力差[10]．进化假说认为，这种“花或胚珠过剩”是一种对冲策略，可以解释多变和不可预测的环境。11]．人们提出了多种解释来解释这一现象背后的机制，包括资源限制[12那13，花粉缺乏[14那15，手足之争[16]和基因负荷[10那17那18]．种子败育可能发生在胚的不同发育阶段，原因有基因型、活力低、位置低或病原菌侵染[19]．流产被认为是一种潜在的有益机制，可以提高后代的质量[11]．最近的报告表明，种子败育是一种复杂的植物行为，由内部和外部条件提示触发[20.]．然而，对于濒危物种来说，这种堕胎机制严重限制了增殖，培养和保护。

尽管对种子流产的众多研究，但大多数都集中在生理和形态学而不是分子水平。这部分是由于具有严重种子流产的物种通常是非模型植物，导致缺乏基因组数据。最近的研究专注于龙眼种子流产的基因和蛋白质[21)、花生(22]，菊花[23]和榛子[24]使用转录组和蛋白质组分析。

揭示败育种子中发生的分子事件戴维娅，我们使用了Illumina平台和德诺维测序转录组以建立第一个Unigene水果和种子库戴维娅．此外，我们鉴定了正常和流动的种子之间的差异表达基因（DEGS）。发现涉及细胞增殖，DNA复制，营养储层活性和淀粉和蔗糖代谢的基因在正常种子中具有显着更高的表达。相反，发现响应应力，氧化还原酶活性，次生代谢物生物合成和程序死亡的基因被发现在流产种子中均匀地上调。编码转录因子，受体激酶，蛋白酶和漆酶的DEGS被认为是种子流产中的临界调节因子。这些调查结果将为木质多年生植物中种子流产的分子调节机制带来有价值的见解。

种子流产戴维娅

为了解广西种子败育情况戴维娅，我们从十多个单独的树木中收集了大约400个水果，并记录了它们中正常和中产种子的数量。果实戴维娅具8心皮结构(有时1-2心皮由雌蕊发育退化)。在大多数果实中，正常种子的数量为1-3个。因此，超过一半的种子流产了。1）.统计分析了果实重与败育率、果实长宽比与败育率的相关关系。结果表明，种子败育发生在发育早期，与果实发育无关。1 b和c）.我们发现果实的正常种子数为1-8，表明所有胚珠都具有良好的效力（图。2C-I.）.与某些豆科植物不同的是，柱头和每颗胚珠之间的距离大致相等戴维娅所以所有的卵子都有平等的营养吸收机会。位置效应，一些豆类植物中种子流产的关键原因，可以消除戴维娅．此外，观察到堕胎发生在连续或间隔的心皮中，这意味着兄弟姐妹之间没有明显的竞争（图。2 d - h）.出现外观，良好的种子是纺锤形的，白色的白色和富含脂肪的，而中止的种子明显较小，并且含有棕褐色的种子涂层（图。2 j-m）.

通过显微观察，研究了正常种子和败育种子的微观结构差异。石蜡切片显示正常种子的胚囊堆积良好，胚完整。相反，在同一果实的败种中，胚囊空而平，卵器完全退化，说明败种发生在胚发育的早期(图2)。3.）.

概述了戴维娅转录组

一个果实样本，三个正常种子样本和三个流产种子样本戴维娅用于构建用于高通量测序的混合库。每个样品的RNA质量由RNA完整性数（rin）表示为9.6（DI-1 N），9.1（DI-1A），9.5（DI-2 N），9.0（DI-2A），9.1（DI-3 N），9.1（DI-3A）和10.0（DI-F）。将不同样品的RNA与相等的量混合以构建cDNA文库。总共制备了6,472,538,761（6.47g）原始数据，illumina Hiseq 2500产生了89.2％的Q30碱基（序列率<0.1％的序列百分比<0.1％）。

使用三位一体德诺维组装程序，短读序列组装成149,099转录物，平均长度为1,056.57 bp。使用加入号SRP058736沉积在NCBI短读取档案（SRA）中沉积了序列原始数据。然后对转录物进行簇和组装分析。最后，我们收获了总共72,885个ungenes，N50长度为1150，平均长度为656.61 bp（附加文件1）.表中显示了组装contigs和unigenes的概述1．

使用BLAST算法搜索所有73,885个组装的Unigenes，并使用BLAST算法搜索NR，Swiss-Prot，Go，Cog和Kegg数据库（E-Value <1E^-5） （桌子2）.完全，提交了33,725（45.6％）unigenes（附加档案2）.Nr数据库查询显示戴维娅序列与序列紧密相匹配葡萄（46.5％），Theobroma可可(11.2%),Prunus Persica(6.9%),Populus Trichocarpa.(6.1%),茄属植物lycopersicum（5.7％）和萝藦（5.1％）（图。4.）.为了保证注释的准确性，将装配好的单基因在基因组数据库中进行搜索拟南芥那葡萄那Theobroma可可那Populus Trichocarpa.那桉树祖母和另一种遗物物种，Amborella trichopoda.．34.2% - 39.9%戴维娅这些物种的基因组数据注释了unigenes(附加文件)3.）.

在注释的unigenes中，24,834个unigenes在去数据库中匹配并分为3个功能类别：分子功能（13,386,53.9％），生物过程（4918,19.8％）和细胞组分（6530,26.3％）。“结合”，“催化活性”和“转运活性”是分子功能最大的阶段。“代谢过程”，“蜂窝过程”和“刺激响应”是最大的生物过程术语。“细胞部分”，“细胞”和“细胞器”是细胞组分的最大阶段。Kegg途径分析显示，在数据库中匹配6257个unigenes，并分配到116 kegg路径。含有最大数量的底人的途径包括“核糖体”，“植物激素信号转导”，“抗体组”，“内质网的蛋白质加工”，“RNA转运”，“氧化磷酸化”，“嘌呤代谢”，“糖酵解/葡糖生成“，”淀粉和蔗糖代谢“和”植物 - 病原体相互作用“。

正常和中产种子之间的次数

通过RNA-SEQ产生总共61.27米的读数，包括312克原料数据。高质量的读数与已建立的一致戴维娅unigene库和映射读的比例从74.3%到77.9%(表3.）.利用所有基因的RPKM值分析两个样本之间的相关性。正常种子间的相关系数均大于0.82(除2 N对3 N的相关系数为0.78)，流产种子间的相关系数均大于0.94，说明生物重复间的差异较小。各正常种子样本与流产种子样本之间的相关系数均小于0.10，表明存在显著的表达差异(附加文件4.）.

总共在正常和流产种子之间发现了2770次。其中，上调978个基因，下调1792个基因（图。5.，附加文件5.）.通过Nr、Swiss-Prot或其他物种的基因组数据注释了2631个DEGs。前30个下调和上调基因见表4.和5.， 分别。通过GO共注释共1630个基因。与Unigene库相比，发现了显着富集的GO术语，例如“蛋白质激酶结合”，“吲哚-3-乙酸酰胺合成酶活性”和“分子功能”类别中的“过氧化物酶活性”。“通过细胞板形成的细胞因子”，“DNA复制调节”和“细胞增殖”在“生物过程”类别中发现。在“细胞组分”类别中发现了“核心”，“染色体”和“微管相关复合物”。（图。6.）.deg的前50个GO项如图所示。7.．

然后将DEG对齐至KEGG数据库并分配到79个路径。其中，大量基因涉及与代谢相关的途径，例如“淀粉和蔗糖代谢”，“半胱氨酸和蛋氨酸代谢”，“丙酮酸代谢”，“嘧啶代谢”，“嘌呤代谢”和“苯丙氨酸”代谢”。涉及许多富集的致遗传信息处理的途径，例如“核糖体”，“DNA复制”和“剪切物”。另一部大群在生物合成的途径中富集，包括“苯丙烷化生物合成”，“脂肪酸生物合成”，“类固醇生物合成”，“Terpenoid骨架生物合成”和“扎丁蛋白生物合成”。这些结果与正常和流产种子的状态一致，这些种子在营养积累，细胞增殖，组织发育和次生新陈代谢中完全不同。值得注意的是，在“植物激素信号转导”，“植物 - 病原体相互作用”，“内吞作用”和“吞噬体”的途径中富集了许多基因，这被推测在种子流动调节中起着关键作用（图。8.）.

在COG数据库中匹配一千七十四只数。类似于Go和Kegg分析的结果，COG分析表明，在生物过程中富集了几种DEG，例如“转录”，“复制，重组和修复”，“信号转导机制”和“碳水化合物运输和代谢”。相反，最少的含量富集在“细胞运动中”，“细胞内贩运，分泌和凹凸转运”和“核苷酸输送和代谢”中。与所有ungenes的Cog分析相比，在“细胞周期控制，细胞分裂，染色体分配”，“脂质运输和代谢”和“次次代谢物生物合成，运输和分解代谢”中，DEGs显着富集，同时富集“翻译，核糖体结构和生物发生”，“后期改性，蛋白质周转，伴侣”和“细胞内运输，分泌，分泌物和凹凸转运”（图。9.）.

DNA复制和细胞增殖严重受损种子受损

在DEG中，编码DNA聚合酶α催化亚基的所有基因，DNA复制牌照因子，ATP依赖性DNA螺旋酶，DNA拓扑异构酶，DNA错配修复蛋白和凝结素复合亚基在流入的种子中显着降低了转录性丰度。始终如一地，编码组蛋白，染色质组装因子，染色体蛋白质和迷你染色体维持复合结合蛋白的结构维持的基因显示出均匀下降的种子表达均匀下降。

参与细胞因子和微管细胞骨架组织的基因，包括Kinesin样蛋白，125kDa Kinesin相关蛋白，早期的Nodulin样蛋白，65-KDA微管相关蛋白，微管相关蛋白RP / EB系列DNA（胞嘧啶-5） - 甲基转移酶，高迁移率B蛋白，MAR结合丝状蛋白质，核糖合成酶，硫蛋白样蛋白和小管蛋白显示出中产种子的表达显着降低。

结果表明，9个编码细胞周期蛋白的基因、4个编码G2/有丝分裂特异性细胞周期蛋白的基因、2个编码细胞周期蛋白依赖性激酶的基因和8个编码形式蛋白的基因在败育种子中均出现了较大程度的下调，从而干扰了败育种子的细胞周期。

脂肪酸，淀粉和蔗糖代谢处于低级种子的低水平

脂肪酸含量在正常种子和流产种子之间有显著差异(未发表的数据)。正常脂肪酸含量高戴维娅种子或许可以解释它是如何在第三纪存活下来的。参与脂肪酸生物合成的基因，包括乙酰辅酶A羧化酶羧转移酶、羟基酰基- acp脱水酶、脂加氧酶、酰基载体蛋白、长链酰基- coa合成酶和蛋白质ECERIFERUM(正常种子中高表达)在流产种子中均下调。此外，参与不饱和脂肪酸生物合成过程的基因编码产物，如环artenol合酶、二氢脂酰赖氨酸残基乙酰转移酶、过氧酶、酰基-[酰基载体蛋白]去饱和酶、omega-3脂肪酸去饱和酶和omega-6脂肪酸去饱和酶在流产种子中均持续下调(图)。10）.

果糖激酶、α -木糖苷酶、颗粒结合淀粉合成酶、过氧化氢酶和β -淀粉酶等参与淀粉生物合成和分解代谢的基因的转录本丰度一致降低，表明败育种子中淀粉水平较低。在蔗糖合成方面，3个编码蔗糖合酶的基因在败育种子中显著下调。

营养和离子转运可能限制在流产的种子中。编码双向糖转运蛋白的三个基因，编码阳离子氨基酸转运蛋白的三个基因和编码硝酸盐转运蛋白的三个基因被显着下调。此外，分别编码铜，多元醇，硼，锌，硫酸盐和钾转运蛋白的各种基因也在不同的水平下下调。此外，编码Aquaporin的三种基因被下调到中断种子的未被检测的水平。这些结果表明，基本的营养供应在流产种子中大大受损。

营养水库和种子发育受到流产种子的约束

几乎所有编码种子贮藏蛋白的基因，如球蛋白、白蛋白、富硫种子贮藏蛋白和豆类蛋白，在DEGs中均出现了最大程度的下调。胚胎发育关键调控基因如B3结构域蛋白、ZF-HD同源盒蛋白、LOB结构域蛋白和锌指CCCH结构域蛋白在败育种子中均显著下调。这些基因的显著低表达证实了败育种子的发育缺陷。

值得注意的是，两个编码透明TESTA 12蛋白的基因表达量显著下降，该蛋白是表皮细胞伸长所必需的。另一方面，6个编码类受体蛋白激酶HAIKU2的基因(除haku2外)表达增加，这6个基因控制胚乳生长和调节被毛细胞伸长。

正常和流产种子之间的植物激素信号转导的差异

在DEGS中发现编码吲哚-3-乙酸-AMIDO合成酶的七种基因，其中5种显示出表达下降，其中两种表达增加。发现了编码毒素响应因子的七种基因;其中五个被下调，其中两个是上调的。发现了编码毒素响应蛋白的三种基因;其中两个表达下降。编码植物素流出载体组分的两个基因进行了下调。上调编码在根培养物中编码肿瘤蛋白诱导的两种基因。

上调编码胃泌素受体的三个基因。在编码赤霉素3-β-二氧化根酶的基因下，调节编码胃酸蛋白2-Beta-DiOxygenase的三种基因进行了上调。在流产种子中未检测到编码胃蛋白素20氧化酶的两种基因。对嗜酸甘油蛋白的许多基因反应，例如编码单母酸二酰基甘油甘油合酶的两个基因，编码转录因子Hb29的基因，编码转录因子Rax2和编码转录因子Tcp15的两个基因显示出血液中转种子的表达增加。

在DEGS中发现了编码细胞素蛋白脱氢酶/氧化酶的五个基因;其中三种表现出增加的表达，其中两种表达表达下降。发现了编码乙烯响应转录因子的九种基因，其中八个表达了含量增加。编码脱落酸受体的基因和编码脱落应激成熟蛋白的两个基因显示出增加的表达。

参与应激反应和活性氧清除的基因

对生物和非生物胁迫反应的基因包括7个蛋白磷酸酶2C编码基因、16个WRKY转录因子编码基因、3个糖转运蛋白编码基因、7个MYB转录因子编码基因(除外)、7个LRR类受体丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶编码基因、其中6个基因编码锌指蛋白ZAT, 4个基因编码重金属相关的异戊二烯基植物蛋白，在败育种子中显示出较高的转录本丰度。这些结果表明败育种子处于逆境胁迫下。这些上调的基因，包括各种转录因子和蛋白激酶，可能启动了相应的途径来抑制种子的生长。

生物和非生物胁迫往往诱导植物体内活性氧(ROS)的含量升高。活性氧清除酶基因包括一个阳离子过氧化物酶基因、四个呼吸暴发氧化酶同源蛋白基因和两个网状氧化酶样蛋白基因，在败育种子中表达量增加。其中有11个基因编码过氧化物酶;其中8例表达增加，3例表达减少。

钙在流产调节中可能是一个重要的第二信使

在DEGs中发现了大量钙相关基因。4个编码钙结合蛋白CML的基因、2个编码钙调素样蛋白的基因、3个编码阳离子/钙交换器的基因和1个编码自抑制钙atp酶的基因表达增加。2个编码cbl相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶14的基因表达增加，1个编码cbl相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶7的基因表达减少。另一方面，一个编码钙依赖蛋白激酶的基因、一个编码钙调素结合转录激活因子的基因和三个编码钙调素的基因表达量下降。这些结果表明钙在流产调节中起重要作用。

败育种子的细胞凋亡与程序性细胞死亡

一些与细胞凋亡相关的基因，如编码BAG家族分子伴侣调节蛋白的基因和编码casp样蛋白的9个基因(除了一个例外)在流产种子中表达增加。同时还发现了10个可能参与细胞凋亡过程的F-box蛋白编码基因。6例表达增加，4例表达减少。

参与编程细胞死亡的基因，包括编码天冬氨酸蛋白酶的六个基因，编码富含半胱氨酸的受体样蛋白激酶的四种基因，编码富含富氨酸的重复受体样蛋白激酶PXL2和编码NAC转录因子的两个基因在流产种子中显着上调。值得注意的是，编码半胱氨酸蛋白酶的基因显示出表达降低，而编码半胱氨酸蛋白酶抑制剂的三个基因显着降低表达，表明半胱氨酸蛋白酶活性调节中的细微机制。

木质素生物合成与次生细胞壁生物发生

木质素生物合成相关的基因包括漆酶7个基因、咖啡酰辅酶a o -甲基转移酶1个基因、肉桂醇脱氢酶1个基因、shikimate o -羟基肉桂酰转移酶1个基因和coba样蛋白1个基因。另一方面，与次生细胞壁生物发生相关的多个基因表达一致增加，包括编码纤维素合成酶A催化亚基的5个基因、编码次生细胞壁相关糖基转移酶的1个基因、编码IRX15-like蛋白的1个基因、一个基因编码udp -葡萄糖醛酸:木聚糖-葡萄糖醛酸转移酶和两个基因编码含NAC结构域蛋白。之前描述的一些基因，如编码COBRA-like蛋白、MYB转录因子和漆酶的基因，也参与了次级细胞壁的生物发生。漆酶家族也参与氧化还原过程。我们比较了所有被识别的表达Davidia漆酶结果表明，这些基因在败育种子中表达显著上调(图。11）.此外，我们发现8个编码壁相关受体激酶的基因在败育种子中一致上调。这些结果表明，败育种子木质素的积累和细胞壁组织发生了变化，对种子发育的调控有重要影响。

QPCR验证差异表达基因

为了确认RNA-Seq结果的准确性和重现性，19个基因(详细信息见附加文件)3.选择在正常和败育种子中表达谱不同的种子进行qPCR验证。通过qPCR检测所选基因在正常和流产种子中的表达水平(附文件)6.）.RNA-SEQ结果（RPKM）和QPCR结果之间的相关性（2^-ΔΔct)使用对数倍变化测量来生成散点图。结果表明，qPCR结果具有显著的相似性(R.² = 0.55) with the RNA-Seq data (Fig.12）.

戴维娅转录组

作为一种古老的遗物物种，戴维娅其果实、种子和苞片具有独特的特征。胚乳正常的胚乳达瓦迪亚种子含有丰富的脂肪酸和贮藏蛋白，营养丰富，耐寒。在果实发育过程中，木质素在果实内果皮中迅速积累。这一过程使内果皮极其坚硬，内果皮和种子之间的空间几乎连续(图。2）.这些特性被认为是重要的原因达瓦达能够在第四纪时期存活[1]．戴维娅转录组分析显示，参与脂肪酸代谢和木质素生物合成的相关基因高表达。从相关基因的表达水平来看，苯丙类、黄酮类、萜烯类、甾类等次生代谢产物的生物合成活性较高，提示其存在多种次生代谢产物戴维娅．与的基因组数据相比拟南芥那葡萄那Theobroma可可那Populus Trichocarpa.那桉树祖母和Amborella trichopoda.那戴维娅序列显示与它们相对较低（附加文件4.表S2)，表明其在被子植物进化中的独特地位。只有45.6%的转录本被注释，这是相对较低的水平，表明有大量的新基因(应该包括与果实和种子的独特表型密切相关的基因)戴维娅)是由我们的资料发现的。此外，约0.2%的序列与藻类、细菌、真菌和酵母同源，表明发生了遗传整合事件，或存在多种内源微生物戴维娅．

种子败育的可能诱因戴维娅

严重的种子流产达瓦达我们的调查再次证实了这一点。鸽树的繁育系统为异交型和部分自亲和型。它在繁殖期间产生过多的花朵和花粉，授粉率非常高[25]．未见配子发生或雌雄配子发育异常[26]．因此，近亲繁殖抑制被认为是流产的一个重要原因。鉴定出的下调基因涉及能量和代谢途径，证实了败育种子活力和竞争能力较低，这可能是近亲繁殖造成的遗传负荷所致。

植物激素水平的改变是流产种子的重要迹象。从我们的结果，显着下调主要吲哚-3-乙酸 - 氨基合成酶基因和肿瘤响应因子基因。相反，全局上调乙烯响应转录因子基因和赤霉素受体基因。这些结果暗示植物素水平降低，而赤霉素，乙烯和ABA水平含流量的种子。赤霉素是植物开发中的必需调节因素。豌豆GA 2-氧化酶2 cDNA的异位表达诱导嗜酸甘油蛋白缺乏，导致拟南芥种子流产[27]．还有人报道，高水平的胃蛋白可能导致种子流产[28]．同样，高水平的乙烯可以诱导小麦中籽粒堕胎和抑制谷物成熟[29]．然而，由于不同植物物种中观察到的不同结果，赤霉素和乙烯在种子形成和萌发中的作用保持争议[30.]．ABA水平与植物对逆境的响应密切相关，在玉米和菊花的流产种子中ABA水平的升高已经被描述[23那31]．

信号转导消息涉及种子流产

母性植物识别“坏后代”并选择性地抑制其生长是至关重要的。这些信息是如何在种子和母植物之间交换的还不清楚。根据我们的数据，我们推断钙离子是流产途径的重要信使。随着阳离子/钙交换剂表达量的增加，钙离子含量也会发生变化^２＋种子中的水平并调节CA的活动^２＋- 依赖蛋白激酶，随后控制种子的发展[32]．

在种子发展中起着关键作用的蔗糖被认为是堕胎调节中的另一个分子使者。抑制蔗糖合成酶棉花的基因表达抑制胚乳和胚的发育，并阻止相邻的种子皮转移细胞的形成[33]．棉花棉花蔗糖合成酶基因的过度表达改善早期种子发育和降低种子流产[34]．我们鉴定了3个编码蔗糖合酶的基因，它们在败育的种子中表达量下降了100倍以上，表明蔗糖合酶活性的缺乏是败育的关键戴维娅．

流产种子中的程序性细胞死亡

编程的细胞死亡（PCD）与植物的植物人和生殖发展密切相关[35]．半胱氨酸和天冬氨酸蛋白酶是参与PCD的必需蛋白酶[36]．我们发现5个编码天冬氨酸蛋白酶的基因在败育种子中一致上调，表明该基因家族在败育种子中的调控作用。在龙眼种子败育的蛋白质组学比较分析中也有类似的结果，污染后50 d，败育种子中有3种半胱氨酸蛋白酶蛋白大量积累，说明PCD是不同种属种子败育的共同机制[21]．有趣的是，我们发现了一个半胱氨酸蛋白酶在流产种子中下调的基因半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因在流产的种子中急剧下调。该发现表明，半胱氨酸蛋白酶活性通过其抑制剂巧妙地调节戴维娅．

木质素生物合成和种子整容发展

我们鉴定了一系列与二次细胞壁生物发生和木质素生物合成相关的基因，所述木质素生物合成在中断的种子中显着上调。漆酶基因是发现均匀改善的中断种子的表达水平均有显着的参数（图。11）.漆酶是一种多功能酶，可诱导黄酮氧化氧化，这也是对生物和非生物胁迫的阻力机制[37]．Lignin聚合的过氧化物酶对漆酶的功能无余余期[38),最过氧化物酶基因在流产种子中也显着上调。编码纤维素合酶的基因家族也涉及木质素生物合成途径的催化亚基，在流产种子中均匀上调。值得注意的是，一些漆酶和纤维素合酶在种子内部特别表达[37那39]．在拟南芥中，母系控制被毛细胞伸长被验证以确定种子大小[40]．蛋白质透明试验的表达显着降低表明，整数的发展受到流产种子的影响。完全，我们假设堕胎种子的生长通过种子整数通过母体植物控制。木质素或纤维素的快速积累可能已经发生在种子环境中，从而形成紧凑且坚硬的结构，这将抑制胚乳的发展。

种子流产中的候选监管机构

对于转录因子，大多数应激反应转录因子，如AP2、MYB和WRKY转录因子的表达均一致增加。大多数发育相关转录因子，如含B3结构域的转录因子，在败育种子中表达量下降。

MYB结构域蛋白被报道为原花青素积累的关键决定因素[41]．相关基因，包括编码花青素调节C1蛋白的三种基因也显示出增加的表达。花青蛋白积累参与拟南芥的种子整木发展[42]．一些MYB转录因子也参与了木质化和次生细胞壁的形成[43那44]．

两个拟南芥的基因,Minaseed3.（mini3.） 和haku2.（IKU2.），被证明是种子大小的监管机构[45]．MINISEED 3编码拟南芥AtWRKY10WRKY10突变体产生明显较小的种子。haku2.编码蛋白激酶，然后三行俳句诗突变体产生尺寸减小的种子，这是由于胚乳和母体种子整数之间的沟通受损。有趣的是，几乎所有WRKY基因和六个haku2.在我们的DEG数据中的基因，大多数基因显示出增加的表达。只有一个haku2.基因表达降低。这些发现暗示了不同的调节机制戴维娅．

值得注意的是，大多数壁相关的受体激酶，这是细胞膨胀和抗病性所必需的[46，在败育种子中表现一致增加的表达。该基因家族是否参与流产的信号转导还有待进一步研究。

遗传转化体系戴维娅不可用;因此，进一步研究候选基因的功能，特别是上调的转录因子和基因家族，应在拟南芥等其他物种中进行。另一方面，我们的数据表明有限的营养和植物激素调节对流产是必要的。因此，外源营养和外源激素的施加可能是缓解流产的有效方法。如果种子败育戴维娅可以减轻，它将带来繁殖和保护树的巨大优势。

德诺维转录组测序的戴维娅涉及Baill。在本研究中使用Illumina配对结束测序技术进行。总共72,885个从水果和种子的ungenes戴维娅被孤立。专注于严重种子流产的监管机制戴维娅，分析了正常和中动种子之间的差异表达基因。我们提出遗传负荷，资源限制和植物激素调节是关键决定因素戴维娅种子堕胎。根据基因表达谱分析，应激反应、淀粉和蔗糖代谢、PCD、次生细胞壁生物发生和木质素生物合成等生物过程是调控流产的关键。我们假设母亲控制的皮肤发育是堕胎调控的一个关键过程。钙和蔗糖被认为是流产途径中的重要信使。MYB和WRKY转录因子、受体激酶和漆酶被鉴定为种子败育的候选调控因子。基因组数据戴维娅将促进进一步研究这种濒危和低繁殖物种，为保护和利用这些珍贵资源提供理论依据。

植物材料

果实和种子戴维娅是采自三棵自然分布的开花树戴维娅湖南省Sangzhi County Badagong Moutain自然保护区人口（110°5'30“E，28°46'60”，1383米高度）。为了消除遗传方差，我们在1983年的同时选择了三棵树。用于接枝的相同植物，被称为“鸽子之王”，是中国最古老的鸽子树（近似年龄是400年）。水果于2014年7月14日收集，大约1个月后苞片脱落后，这代表了种子的艰巨年龄，或60至90天。通过立即将果实分解在收集后获得的种子。堕胎比率由n计算_一种/ N_T.．(N_一种，水果中的流产种子数量;N_T.即果实中种子的总数)。将果实的正常种子、败育种子等部分分离，用液氮快速冷冻，在−80℃下保存。另一组采集的种子立即固定在福尔马林-醋酸醇(FAA)中进行显微镜观察。采集每棵树的3个果实进行种子样品制备。将同一果实的全部正常种子(3-5粒)和全部败育种子(15-20粒)分别混合制成单个样品。种子样本名叫Di-1 N(混合正常种子从果实的树1),Di-1A(混合流产种子从相同的水果树1),Di-2 N(混合正常种子从果实的树2),Di-2A(混合流产种子从相同的水果树2),Di-3 N(混合正常种子从果实的树3),和Di-3A(从树3相同果实中混合的败育种子)。所有采集的果实样本(去除种子)混合命名为Di-F。

显微镜观察

在解剖后立即固定在FAA（50％醇：乙酸：甲甲酸溶液= 89：6）中固定正常和流动的种子并在室温下储存。将样品用50％醇洗涤，使用乙醇系列脱水，在二甲苯中清除并嵌入石蜡蜡中。将标本缩为8μm的厚度。将切片用苏木精染色，使用奥林巴斯BX-51显微镜检查并拍照。

RNA提取，量化和资格

使用E.Z.N.A提取总RNA。植物RNA套件（OMEGA，R6827-01）。在1％琼脂糖凝胶上监测RNA降解和污染。使用Nanophotometer®分光光度计（Upplen，Ca，USA）检查RNA纯度。使用Qubit®2.0叶片（Life Technologies，CA，USA）中使用Qubit®RNA测定试剂盒测量RNA浓度。使用Agilent BioAnalyzer 2100系统（Agilent Technologies，CA，USA）的RNA纳米6000测定试剂盒评估RNA完整性。

图书馆建设和RNA-SEQ

文库和RNA-Seq的构建由Biomarker Biotechnology Corporation (Beijing, China)完成。将果实、正常种子和败育种子的RNA按等量组合，形成一个大的RNA库。根据制造商的建议，使用Illumina®(NEB，美国)的NEBNext®Ultra™RNA文库准备试剂盒生成测序库。简单地说，用聚t寡聚磁珠从总RNA中纯化mRNA。用二价阳离子在高温下在NEBNext第一链合成反应缓冲液(5X)中进行裂解。用随机六聚体引物和M-MuLV逆转录酶(RNase H)合成第一链cDNA，然后用DNA聚合酶I和RNase H合成第二链cDNA。剩余的悬空部分通过外切酶/聚合酶活性转化为钝端。将DNA片段3 '端腺苷化后，连接具有发夹环结构的NEBNext Adaptor，制备杂交材料。利用AMPure XP系统(Beckman Coulter, Beverly, USA)对文库片段进行纯化，筛选优先长度为150 ~ 200 bp的cDNA片段。然后用3 μl USER Enzyme (NEB, USA)与大小选择的适配器连接的cDNA在37℃下连接15 min，然后在95℃下连接5 min，然后进行PCR。采用Phusion高保真DNA聚合酶、通用PCR引物和Index (X)引物进行PCR。 At last, PCR products were purified (AMPure XP system) and library quality was assessed on the Agilent Bioanalyzer 2100 system. The cDNA library was sequenced on Illumina HiSeq™ 2500 using paired-end technology in a single run.

序列分析和德诺维集会

通过删除包含适配器的读取来获得清洁数据，读取包含PLOY-N和低质量从原始数据读取的读取。使用Trinity方法组装清洁读入Contigs，该方法在广泛的表达水平上恢复更多的全长转录物，灵敏度类似于依赖于基因组对准的方法[47]．我们采用Trinity方法，优化的k-mer长度为25德诺维集会。随后，根据序列的成对结束信息将CONTIG链接到转录物中。然后基于核苷酸序列同一性聚集转录物。簇单元中的最长转录物被认为是未固体以消除冗余序列，然后将unigenes合并以产生用于注释的最终组件。

基因功能辅助

搜索所有组装的未完成的未列原人（NCBI非冗余蛋白序列）数据库，以识别使用BLAST算法识别推定的mRNA函数[48]带有10的电子值截止^-5．BLAST算法还用于将唯一序列与NT（NCBI非冗余核苷酸序列）和瑞士 - PROL（手动注释和审查的蛋白质序列数据库）对齐。另外，为了提高注释的准确性，组装的unigenes与几种物种的可用基因组数据对齐，包括拟南芥（http://www.arabidopsis.org/），Populus Trichocarpa.那葡萄那Theobroma可可那桉树祖母和Amborella trichopoda.（http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）.

使用BLAST2GO计划从从BLASTX获得的最佳点击中提取（基因本体论）术语[49]．COG（蛋白质群体的簇）和KO（Kegg Ortholog数据库[50) (e值的临界值为10^-5进行分析以预测可能的功能分类和分子途径。

差异基因表达分析

通过Tophat Bowtie软件映射来自三个正常种子样本和三个流动的种子样本的读数到非还原参考转录组上[51]量化成绩的丰富。基于RPKM值的比率计算样品之间的Uni-agscript丰度差异[52，以及错误发现率(FDR)。使用DESeq R包(1.10.1)对正常和流产种子进行差异表达分析。DESeq提供了使用基于负二项分布的模型来确定数字基因表达数据中的差异表达的统计程序。结果P值使用Benjamini和Hochberg的方法进行调整，以控制错误发现率。基因的调整P.-Value <0.05通过DESEQ发现被分配为差异表达。具有LOG2比率≥2的绝对值的UNI-转录物和FDR显着性评分<0.001用于后续分析。使用“基因功能注释”部分中描述的方法，通过GO，KEGG和COG分析进行所识别的DEG。使用纠正的术语和kegg路径P.- 鉴定为差异表达的差异<0.05（由参与的基因的RPKM计算）。

qPCR分析

使用primescript将种子样品的提取的RNA转化为cDNA^TMOne Step RT-PCR Kit Ver. 2 (Takara，日本)。然后将cDNA稀释10倍，作为模板进行qPCR。采用2 × SYBR Green qPCR Master Mix (Biotool, USA)对ABI StepOne进行qPCR反应^TM．每个样品采用2个独立的生物学重复和3个技术重复进行qPCR分析。一种戴维娅的基因,亚霉素，作为数据归一化的内参基因。qPCR所用引物见附加文件7.．每个样品的相对表达折叠通过其C计算_T.值标准化为c_T.参考基因的价值使用2^-ΔΔct由Livak和Schmittgen描述的方法，2001 [53]．通过LOG2计算相对表达和RPKM值的归一化值，并且使用该值来分析QPCR和RNA-SEQ结果之间的相关性。

伦理

负责Davidia资源的部门是八大公山自然保护区管理处，他们为我们的科学研究提供了采集样本的许可。

同意发布

不适用。

使用加入号SRP058736沉积在NCBI短读取档案（SRA）中沉积了序列原始数据。BioSample加入是SAMN03733273，Bioproject ID为Prjna284915。数据将在2018-5-24栏中释放。

戴维娅：

戴维娅涉及Baill。

DEG：

差异表达基因

纤毛运动:

程序性细胞死亡

感谢庄先生和廖先生的样品收集。因为树上结满了果实，所以爬20米以上的树既困难又危险。感谢Axios Review提供的宝贵意见和专业服务，极大地完善了本文。湖南省“百人计划”专项基金(no . 112-0991);中南林业科技大学青年基金(no . QJ201512)。关键词:岩石力学，边坡稳定性，边坡稳定性

从属关系

1. 非木材森林树木，教育部，生命科学与技术学院栽培与保护重点实验室;中南林业大学，中华人民共和国长沙

   孟丽，徐杰东，九庆鹏，文旭，瑞仁，简刘，福新曹＆zhim

2. 东新墨西哥大学生物系，新墨西哥州，88130，美国

   简刘志明刘

相应的作者

对应到FUXIANG CAO.或刘志平．

利益争夺

提交人声明他们没有竞争利益。

作者的贡献

ML、FC和ZL构思和设计了实验。ML和XD进行了实验。ML、XD、JP对数据进行分析。WX和XD提供了显微组织数据。ML和RR提供qPCR数据。ML写了这篇论文。ML, FC, ZL和JL的修改和批准。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

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重印和权限