DUF-246家族糖基转移酶样基因影响男性生育能力和果胶阿拉伯半乳聚糖的生物合成gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

果胶是一类结构复杂的植物细胞壁多糖，其生物合成和功能尚不清楚。果胶多糖鼠李糖半乳聚糖- i (RG-I)具有两种类型的阿拉伯半乳聚糖侧链，i型和ii型阿拉伯半乳聚糖。迄今为止，参与果胶生物合成的酶很少被描述。在这里，我们报告了一个高度保守的糖基转移酶编码基因的鉴定，gydF4y2Ba果胶阿拉伯半乳聚糖合成相关gydF4y2Ba（gydF4y2BaPAGRgydF4y2Ba)，影响RG-I arabin半乳聚糖的生物合成，对花粉管生长至关重要。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

T-DNA插入gydF4y2BaPAGRgydF4y2Ba在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba发现杂合子与野生型的比例为1:1。我们无法分离纯合子gydF4y2BapagrgydF4y2Ba突变体的gydF4y2BapagrgydF4y2Ba突变等位基因不通过花粉传播。gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba花粉萌发试验表明，花粉花粉管形成率降低gydF4y2BapagrgydF4y2Ba杂合子。描述功能丧失的表现型gydF4y2BaPAGR,gydF4y2Ba的gydF4y2Ba烟草benthamianagydF4y2Ba直接同源,gydF4y2BaNbPAGR-AgydF4y2Ba而且gydF4y2BaB,gydF4y2Ba使用病毒诱导基因沉默进行短暂沉默。gydF4y2BaNbPAGR -gydF4y2Ba沉默植株节间和叶柄扩张减少。细胞壁材料gydF4y2BaNbPAGRgydF4y2Ba与对照组相比，-沉默植物的半乳糖含量降低了。免疫和连锁分析支持RG-I减少了i型阿拉伯半乳聚糖含量，并减少了RG-I主干的分支gydF4y2BaNbPAGR -gydF4y2Ba沉默的植物。过表达PAGR的拟南芥表现出多向发育表型，顶端优势的丧失以及RG-I型- ii型阿拉伯半乳聚糖含量的增加。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

这些结果共同支持for的函数gydF4y2BaPAGRgydF4y2Ba在RG-I阿拉伯半乳聚糖的生物合成中，并说明了这些多糖在营养和生殖植物生长中的重要作用。gydF4y2Ba

果胶是植物结构细胞壁中重要的一类多糖，是原代细胞壁的主要成分。果胶也是许多食品和食品产品的重要组成部分。果胶与半纤维素一起，形成了一种嵌入纤维素微原纤维的基质。果胶由几种类型的酸性多糖结构域组成:均半乳糖醛酸、木糖半乳糖醛酸、鼠李半乳糖醛酸i (RG-I)和鼠李半乳糖醛酸ii (RG-II)，这些结构域可以相互连接，也可以与其他多糖和糖蛋白相互连接，包括半纤维素和阿拉伯半乳糖蛋白(AGPs) [gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．均半乳糖醛酸由线性链组成gydF4y2BaαgydF4y2Ba1-4-linkedgydF4y2BadgydF4y2Ba-半乳糖醛酸残留，可占果胶的60%以上。半乳糖醛酸残基甲基酯化程度不同，在均半乳糖醛酸和RG-I中均可在O-2或O-3位点乙酰化。在某些植物或组织中，均半乳糖醛酸被木糖或松茸糖取代，分别生成木半乳糖醛酸和偏半乳糖醛酸。RG-I(如图所示)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)是一种独特的果胶多糖，其主干由重复的[−α-]组成gydF4y2BadgydF4y2Ba加gydF4y2BapgydF4y2Baa - 1, 2 -αgydF4y2BalgydF4y2Ba-RhagydF4y2BapgydF4y2Ba-1,4-]双糖单位[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．大约一半的鼠李糖残基是在4位侧链上进行修饰的，包括β-1,4-链gydF4y2BadgydF4y2Ba加gydF4y2BapgydF4y2Ba链,α-(1、5)有关gydF4y2BalgydF4y2BaaragydF4y2BafgydF4y2Ba链以及I型和ii型阿拉伯半乳聚糖。i型阿拉伯半乳聚糖由β-1,4连接组成gydF4y2BadgydF4y2Ba加gydF4y2BapgydF4y2Ba而ii型阿拉伯半乳聚糖的主链为β-1,3-， β-1,6-和β-1,3,6-连接gydF4y2BadgydF4y2Ba加gydF4y2BapgydF4y2Ba类似于agp的阿拉伯半乳聚糖。鼠李糖半乳糖醛酸- ii是一种均半乳糖醛酸的形式，被四种特征类型的精细侧链取代，这些侧链具有独特的结构，由13种不同类型的单糖组成，含有稀有糖gydF4y2BalgydF4y2Ba-Aceric酸,gydF4y2BadgydF4y2Ba芹菜糖,2-keto-3-deoxy -gydF4y2BadgydF4y2Ba- lyxo -七氯沙酸(Dha)和2-酮-3-脱氧gydF4y2BadgydF4y2Ba-曼诺-八氢酸[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．RG-II通过硼二酯键形成二聚体，是植物细胞壁的普遍成分，突出了其重要性。考虑到其结构的复杂性，多达67种不同的转移酶活性被认为是生物合成果胶所必需的[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

植物细胞壁多糖主要由糖基转移酶合成，这种酶将单糖从活化的供体底物(通常是核苷酸糖)转移到受体分子上，形成糖苷键。大多数糖基转移酶对供体糖和受体底物有很强的选择性[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．糖基转移酶被分类为“倒置”或“保留”酶，这取决于糖基化是在供体底物的异构碳原子上发生立体化学的保留还是倒置。在碳水化合物活性酶数据库(CAZy)中，这些酶已根据氨基酸序列的相似性进一步划分为不同的家族[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．拟南芥基因组包含463个基因，可分为41个不同的糖基转移酶基因家族，另有100个糖基转移酶样基因与特征酶相似度不足，可归入CAZy基因家族。gydF4y2Ba

迄今为止，只有少数几种参与果胶生物合成的酶被鉴定出来。其中包括GAUT1，它是糖基转移酶(GT)家族中的一种半乳糖醛酸半乳糖醛基转移酶8 [gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．另一个GT家族8成员，GATL5，已被证明参与合成gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba种皮粘液，主要由RG-I组成，尽管其在粘液生物合成中的确切作用尚未确定[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．在GT家族77中发现的木糖基转移酶，RhamnoGalacturonan-II XylosylTransferase-1 (RGXT1)， RGXT2和RGXT3已被证明可用于木糖酰化gydF4y2BalgydF4y2Ba-专注于RG-II的a链[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．ARAD1和2属于GT家族47，参与RG-I上arabinans的生物合成;然而，它们的催化活性尚未得到证实[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．XGD1也属于GT家族47，是一种木糖基转移酶，将木糖添加到均半乳糖醛酸中，形成木质半乳糖醛酸[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．GT家族92中最近发现的半乳聚糖合成酶GALS1延伸果胶β-1,4-半乳聚糖[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．GALS1至少需要半乳糖四糖寡糖作为底物，这表明它扩展但不启动RG-I半乳聚糖的生物合成。因此，RG-I的初始分支显然需要额外的未知酶。最近的一项研究表明，至少有一些RG-I可能作为附着在agp多糖上的蛋白聚糖而产生[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

果胶的结构和成分在生长发育过程中发生变化，并对变化的条件作出反应。RG-I在许多植物器官和组织中具有特定的作用，并存在于所有原代植物细胞壁中[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．RG-I可能存在于所有维管植物的细胞壁中，并已在基性陆生植物的细胞壁中检测到，如gydF4y2BaPhyscomitrella金属盘gydF4y2Ba以及船藻的内细胞壁gydF4y2BaPenium magaritaceumgydF4y2Ba［gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．均半乳糖醛酸在根毛和花粉管等尖端生长细胞的细胞壁中起着至关重要的作用，生长尖端边缘的均半乳糖醛酸的去甲基酯化和交联被认为可以固化新生细胞壁[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．RG-I阿拉伯半乳聚糖也是花粉管细胞壁的关键成分。在橄榄植物中，果胶半乳聚糖在花粉管从花粉粒中冒出来的孔周围形成一个环[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．果胶阿拉伯胶可能以侧链的形式出现在RG-I上，是花粉细胞壁的重要组成部分[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

更好地理解果胶的生物合成和加工对于阐明这类神秘的聚合物如何调节植物细胞壁的特性至关重要。果胶多糖的生物合成需要许多未鉴定的GT活性。在这里，我们报告了一个影响花粉管生长的新基因的鉴定，并提供了证据，该基因参与了附着在RG-I上的果胶阿拉伯半乳聚糖的生物合成。我们已经命名了拟南芥基因，gydF4y2BaAt3g26370gydF4y2Ba，gydF4y2Ba果胶阿拉伯半乳聚糖合成相关(PAGR)gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

PAGR是一种高度保守的DUF-246结构域蛋白gydF4y2Ba

陆地植物有一个扩展的基因组，编码与GT家族65相关的蛋白质，拟南芥中gt65样蛋白的DUF246家族有39个成员[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．哺乳动物GT家族65蛋白POFUT1聚焦于表皮生长因子重复序列中的丝氨酸/苏氨酸[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．由于含有DUF246结构域的基因在植物中是一个扩大的家族，其中一些可能参与植物特异性的过程[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．此前唯一研究过的植物duf246编码基因是gydF4y2BaMSR1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaMSR2gydF4y2Ba影响拟南芥甘露聚糖的产生和分泌;然而，它们在甘露聚糖生物合成中的具体作用仍然难以捉摸[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．在检查含有duf246的植物蛋白质的预测氨基酸序列时，我们发现了一个基因，gydF4y2BaAt3g26370gydF4y2Ba（gydF4y2BaPAGRgydF4y2Ba)，编码一种在陆地植物中比其他含有DUF246的蛋白质更高度保守的蛋白质。的gydF4y2Ba卷柏moellendorffiigydF4y2Ba而且gydF4y2BaPhyscomitrella金属盘gydF4y2BaPAGR的同源物与拟南芥蛋白的同源物分别为76.0%和70.9%(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1)。其他拟南芥DUF246蛋白具有基础陆生植物同源性，氨基酸对同源性在45%至67.7%之间。在拟南芥含蛋白DUF246的系统发育分析中，可以观察到PAGR在整个陆生植物中的强保护性，即PAGR支系内的分支长度较短，gydF4y2Ba卷柏gydF4y2Ba而且gydF4y2BaPhyscomitrellagydF4y2Ba(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S2)。gydF4y2BaPAGRgydF4y2Ba预测编码的ii型膜蛋白具有n端无序结构域、跨膜结构域和高度保守的DUF246结构域(图2)。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

PAGRgydF4y2Ba无处不在gydF4y2Ba

我们检查了的表达模式gydF4y2BaPAGRgydF4y2Ba在拟南芥中，采用定量RT-PCR方法对不同组织制备的RNA进行定量分析(图;gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba)．gydF4y2BaPAGRgydF4y2Ba在所有测试组织中均有表达，在生殖组织和根中检测到较高水平的转录本。在表达量最高(花)和表达量最低(成熟叶)的组织之间，转录水平的差异小于7倍。这一结果与公开的微阵列数据相一致gydF4y2BaPAGRgydF4y2Ba整个工厂(附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba:图S3) [gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

PAGRgydF4y2Ba突变的等位基因不会通过花粉传播gydF4y2Ba

的编码序列中发现了两个独立的T-DNA插入gydF4y2BaPAGRgydF4y2Ba，gydF4y2Bapagr-1gydF4y2Ba在第11外显子和gydF4y2Bapagr-2gydF4y2Ba在第7外显子(图;gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)．在两种突变等位基因杂合的植物子代中均未分离到纯合突变苗。gydF4y2Bapagr-1gydF4y2Ba而且gydF4y2Bapagr-2gydF4y2Ba杂合亲本后代遗传突变等位基因的比例分别为41%和44%gydF4y2BapagrgydF4y2Ba突变等位基因不通过雄配子体或雌配子体传播gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．χgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba对这些分离比的测试均支持这两点gydF4y2BapagrgydF4y2Ba如果突变等位基因不通过雄配子体或雌配子体传递，则突变等位基因以纯合突变体与杂合子与野生型的0:1:1的比例遗传。然后我们进行相互交叉gydF4y2Bapagr-1gydF4y2Ba而且gydF4y2Bapagr-2gydF4y2Ba杂合子和野生型进行传输性检验gydF4y2BapagrgydF4y2Ba突变的等位基因。在杂交中，野生型柱头与花粉受精gydF4y2Bapagr-1gydF4y2Ba或gydF4y2Bapagr -gydF4y2Ba2杂合的,gydF4y2BapagrgydF4y2Ba在F1子代中未检测到突变等位基因gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．当gydF4y2Bapagr-1gydF4y2Ba或gydF4y2Bapagr -gydF4y2Ba2个杂合子与野生型花粉受精，突变等位基因约50%的F1后代遗传。χgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba测试否定了假设gydF4y2BapagrgydF4y2Ba突变等位基因通过花粉传播，但接受突变等位基因在雌配子体中以预期的1:1比例传播的假设。因此,gydF4y2BapagrgydF4y2Ba突变等位基因不通过花粉传播，而通过雌性配子体正常传播。gydF4y2Ba

因此，我们测试了影响花粉的表型gydF4y2BapagrgydF4y2Ba杂合子。用亚历山大染色法分离野生型和野生型花粉，测定花粉粒活力gydF4y2BapagrgydF4y2Ba杂合植物[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．花粉粒95%以上来自gydF4y2Bapagr-1 / PAGR pagr-2 / PAGRgydF4y2Ba而且gydF4y2BaPAGR / PAGRgydF4y2Ba用亚历山大染色剂染成紫色的植物(图。gydF4y2Ba2模拟gydF4y2Ba)表示发育正常进行gydF4y2BapagrgydF4y2Ba开花前的花粉gydF4y2Ba

花粉来自野生型，而来自gydF4y2Bapagr-1 / PAGRgydF4y2Ba而且gydF4y2Bapagr-2 / PAGRgydF4y2Ba杂合子萌发gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba以确定花粉萌发或花粉管生长是否受到PAGR的影响。我们观察到在离体花粉管产生的花粉粒比例大约减少了50%gydF4y2Bapagr-1gydF4y2Ba而且gydF4y2Bapagr-2gydF4y2Ba杂合子(表gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．这表明gydF4y2BapagrgydF4y2Ba离体花粉不能萌发或产生花粉管。花粉产生的花粉管形态无明显变化gydF4y2BapagrgydF4y2Ba杂合植物(图;gydF4y2Ba2gydF4y2Bae-g &附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba:图S4)。的突变gydF4y2BaPAGRgydF4y2Ba干扰花粉萌发，但不影响花粉萌发前的发育。gydF4y2Ba

PAGR局限于高尔基体和小点状结构gydF4y2Ba

PAGR蛋白被预测为ii型膜蛋白(图。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)，并通过LC-MS/MS在拟南芥悬浮细胞培养纯化的高尔基蛋白组中检测到[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．为了确认PAGR的定位，我们暂时共表达PAGR- cfpgydF4y2Ban benthamianagydF4y2Baα-甘露糖苷酶-1融合到mCherry作为高尔基标记[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．在一些细胞中，PAGR与α-甘露糖苷酶-1共定位(图。gydF4y2Ba3得了gydF4y2Ba)．然而，在大多数细胞中，PAGR-CFP也定位于α-甘露糖苷酶-1不存在的小点状结构(图2)。gydF4y2Ba3 d-fgydF4y2Ba)．这种对高尔基体和较小的非高尔基亚细胞室的定位模式与AtGALT31A、AtGALT29A和AtGlcAT14A的定位相似[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．AtGALT31A和AtGALT29A是参与AGP - ii型阿拉伯半乳聚糖生物合成的半乳糖基转移酶[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]，而AtGlcAT14A是一种葡萄糖醛酸基转移酶，也参与ii型阿拉伯半乳聚糖的生物合成[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．据报道，Galt29A与EXO70E2部分共定位在小的亚细胞区室中，被认为参与了一种被称为EXPOs的非常规分泌途径[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba];然而，我们一直无法复制这一结果。gydF4y2Ba

沉默的gydF4y2BaPAGRgydF4y2Ba在gydF4y2Ba烟草benthamianagydF4y2Ba影响果胶生物合成gydF4y2Ba

因为我们无法分离纯合子拟南芥gydF4y2BapagrgydF4y2Ba变种人，我们暂时让gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba直接同源的gydF4y2BaPAGRgydF4y2Ba, (gydF4y2BaNbPAGRgydF4y2Ba)采用基于烟草摇铃病毒的病毒诱导基因沉默[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba］．VIGS是一种快速而可靠的下调感兴趣基因的方法，已被证明是研究植物细胞壁形成和GT功能的有效系统[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba］．我们确定了两个gydF4y2BaPAGRgydF4y2Ba基因组中的同源物gydF4y2BaN. benthamiana, NbPAGR-AgydF4y2Ba而且gydF4y2BaNbPAGR-BgydF4y2Ba［gydF4y2Ba37gydF4y2Ba］．gydF4y2BaNbPAGR-AgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba- bgydF4y2Ba编码与拟南芥PAGR同源性分别为80.2%和80.6%的蛋白质(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1)，这些序列的系统发育分析显示与PAGR及其基础陆生植物同源性很强(附加文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba:图S5)。gydF4y2BaNbPAGR-AgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba- bgydF4y2Ba97.2%彼此相同，足够的相似性可以有效地用一个结构沉默两个正交正交。一个片段gydF4y2BaNbPAGR-AgydF4y2Ba克隆到pTRV2载体以诱导两者沉默gydF4y2BaN. benthamiana PAGRgydF4y2Ba直接同源gydF4y2Ba．n benthamianagydF4y2Ba用TRV-VIGS病毒侵染植物gydF4y2Ba农杆菌属gydF4y2Ba包含gydF4y2BaNbPAGRgydF4y2Ba并控制trv2质粒。gydF4y2BaNbPAGRgydF4y2Ba-沉默植株由于节间和叶柄扩张的停止而具有结实的表型(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．叶子gydF4y2BaNbPAGRgydF4y2Ba沉默植株紧密地簇生在茎尖分生组织周围。这种表型让人联想到，由于沉默的udp - apose / udp -木糖合酶gydF4y2Ban . benthamianagydF4y2Ba导致RG-II缺乏[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba］．我们还观察到根生长的变化gydF4y2BaNbPAGR -gydF4y2Ba沉默的植物，包括减少总根长度和变色(附加文件gydF4y2Ba6gydF4y2Ba:图S6)。我们用特异性引物进行实时RT-PCR，评估基因沉默的特异性和有效性gydF4y2BaNbPAGR-AgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba- bgydF4y2Ba．水平的gydF4y2BaNbPAGR-AgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba- bgydF4y2Ba在沉默的植物中，转录本分别减少了34%和26%。gydF4y2Ba4 fgydF4y2Ba)．虽然这种转录水平的降低相对较小，但这些结果是一致的，具有统计学意义，并且可能是由显著沉默的组织生长停止所解释的。gydF4y2Ba

作为gydF4y2BaPAGRgydF4y2Ba被预测参与植物细胞壁多糖的产生，我们从细胞壁材料中分析了单糖的组成gydF4y2BaNbPAGR -gydF4y2Ba沉默和病毒感染的非沉默对照植物。gydF4y2BaNbPAGRgydF4y2Ba-沉默的植物表现出显著改变单糖组成，包括半乳糖含量减少33%，葡萄糖醛酸含量小幅下降，半乳糖醛酸含量增加(图2)。gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba)．连续提取细胞壁材料表明，从果胶中提取的半乳糖和阿拉伯糖较少gydF4y2BaNbPAGRgydF4y2Ba-用螯合剂环己烷二胺四乙酸(CDTA)和碳酸钠(附加文件)沉默细胞壁gydF4y2Ba7gydF4y2Ba:图S7)。提取果胶多糖后残留的细胞壁材料在沉默和病毒感染对照植物之间没有表现出成分上的差异。gydF4y2Ba

为了确定观察到的果胶半乳糖含量的变化是否由β-1,4-半乳糖聚糖的减少引起的，细胞壁材料用endo-1,4-β-半乳糖酶消化gydF4y2BaAspergillius尼日尔gydF4y2Ba并对溶出物和残留物进行了分析。经1,4-β-半乳糖酶处理后，小鼠细胞壁释放的半乳糖减少68.9%gydF4y2BaNbPAGR -gydF4y2Ba沉默植株比对照植株的细胞壁上提取的要多(图2)。gydF4y2Ba4 d egydF4y2Ba)，表明总半乳糖含量的降低与果胶半乳聚糖含量和/或酶可及性的显著降低有关。有趣的是，β-1,4半乳糖酶处理后，阿拉伯糖的释放较少gydF4y2BaNbPAGR -gydF4y2Ba以及沉默的细胞壁材料，这表明i型阿拉伯半乳聚糖受到gydF4y2BaNbPAGR -gydF4y2Ba沉默除β-1,4-半乳聚糖。半乳糖酶消化后的残馀物质组成相似gydF4y2BaNbPAGRgydF4y2Ba-沉默和控制细胞壁(图;gydF4y2Ba4 egydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

过度的gydF4y2BaPAGRgydF4y2Ba导致异位表型gydF4y2Ba

为了研究PAGR过表达的影响gydF4y2BaPAGR-YFPgydF4y2Ba花椰菜花叶病毒35S启动子控制下的拟南芥。选择两条独立的35S::PAGR-YFP系进行进一步分析。幼苗overexpressinggydF4y2BaPAGRgydF4y2Ba具有略矮的表型，与玫瑰结生长比野生型更慢(图。gydF4y2Ba5 a - cgydF4y2Ba)．在短日照条件下生长时gydF4y2BaPAGRgydF4y2Ba过度表达的植物失去了顶端的优势，形成了多个缠结的叶片莲座。gydF4y2Ba5 d-fgydF4y2Ba)．在长日照条件下，很少观察到顶端优势的丧失。35S::PAGR-YFP植株的花序具有不同的多效表型，每个表型都表现在独立的转化子中，包括缠绕、分枝增加、半透明花梗肿胀和节间扩张不足(图2)。gydF4y2Ba5 h lgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

对35S::PAGR-YFP三个独立株系的总细胞壁材料的分析显示，总阿拉伯糖含量略有增加，而焦粒、鼠李糖和葡萄糖醛酸含量略有下降(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．从过表达pagr的植物中依次提取细胞壁材料后，我们发现CDTA细胞壁提取物含有增加的阿拉伯糖含量，而随后的4 M KOH提取物和残留材料与野生型相比，单糖组成没有差异(附加文件)gydF4y2Ba8gydF4y2Ba:图S8)。免疫印迹法证实了PAGR-YFP融合蛋白在转基因植物中的表达(图2)。gydF4y2Ba6 bgydF4y2Ba)．在所有转基因株系中检测到PAGR-YFP的分子质量约为110 kDa，略大于预测的92.3 kDa，并且PAGR-YFP中存在针对AttB2连接肽的抗体。gydF4y2Ba

NbPAGRgydF4y2Ba沉默细胞壁含有缺乏阿拉伯半乳聚糖的鼠李糖半乳聚糖igydF4y2Ba

进一步表征改变的细胞壁阿拉伯半乳聚糖含量gydF4y2BaNbPAGR -gydF4y2Ba我们分析了沉默植物RGI的分子质量和组成。通过聚半乳糖醛酸酶和果胶甲基酯酶的消化，RG-I可与RG-II一起从细胞壁材料中溶解[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba］．在Superdex 200 10/300色谱柱上，通过尺寸排除色谱法将酶促处理释放的RG-I与RG-II分离。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)．RG-I从gydF4y2BaNbPAGRgydF4y2Ba-沉默植物比对照植物的RG-I洗脱晚。与葡聚糖分子质量标准洗脱次数相比，从沉默植物中提取的RG-I的平均分子质量计算为91.2 kDa，而对照植物为118.6 kDa。采用粒径排除色谱法收集RG-I组分，并对所收集材料的单糖组成进行分析。RG-I的阿拉伯糖和半乳糖含量由对照植物的21.9%和50.5%降低到对照植物的20.3%和44.4%gydF4y2BaNbPAGR -gydF4y2Ba沉默的植物。相反，RG-I骨架单糖鼠李糖和半乳糖醛酸的含量从对照的13.3%鼠李糖和11.5%半乳糖醛酸增加到沉默植物的16.6%鼠李糖和15.6%半乳糖醛酸(表2)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

然后，我们有兴趣确定RG-I的分子质量是否降低gydF4y2BaNbPAGR -gydF4y2Ba沉默的植物是由于阿拉伯半乳聚糖含量减少或RG-I主干被截断。从分离的RG-I的近似质量和单糖组成，可以估计组成RG-I分子的每个单糖的近似质量贡献。首先计算出RG-I组分中每种单糖的近似质量百分比(质量%)，方法是将检测到的每种单糖的mol%与其残基分子质量相乘(假设每个残基平均有一个糖苷键)，然后除以每个样品的这些值的总和。然后将每个残留物的质量%乘以RG-I部分的估计总分子质量(附加文件)gydF4y2Ba9gydF4y2Ba:表S1)。分析表明，鼠李糖和半乳糖醛酸的残留量gydF4y2BaNbPAGR -gydF4y2Ba沉默的RG-I几乎与对照相同，对照组鼠李糖14.9 kDa，半乳糖醛酸残基15.5 kDa，而对照鼠李糖14.3 kDa, RG-I半乳糖醛酸残基16.1 kDagydF4y2BaNbPAGR -gydF4y2Ba沉默的植物。阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖醛酸的残留量从对照植物的22.1 kDa阿拉伯糖、62.6 kDa半乳糖和2.6 kDa葡萄糖醛酸下降到沉默植物的RG-I的15.7 kDa阿拉伯糖、42.2 kDa半乳糖和1.8 kDa葡萄糖醛酸。这些数据支持了RG-I分子质量的降低gydF4y2BaNbPAGRgydF4y2Ba-沉默植物是由于多糖中阿拉伯半乳聚糖含量的降低，而不是由于RG-I主链聚合度的降低。该分析还允许我们通过将RG-I中每种类型的残基的计算分子质量贡献除以单糖残基的分子质量来估计组成RG-I的每个分子的残基数量gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．这一计算产生了一个相当一致的估计，在沉默和对照植物中，由RG-I主干组成的鼠李糖-半乳糖醛酸双糖有90到100个。gydF4y2Ba

PAGRgydF4y2Ba过表达增加鼠李糖乳苷- i arabinan含量gydF4y2Ba

从35S::PAGR-YFP转基因拟南芥幼苗中提取RG-I，采用与转基因拟南芥相同的方法进行分析gydF4y2BaNbPAGR -gydF4y2Ba沉默gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba植物。用酶法从细胞壁材料中提取RG-I，然后用尺寸排除色谱法进行分析。在行中过度表达gydF4y2BaPAGR-YFP,gydF4y2BaRG-I洗脱的保留时间为20.9分钟和20.8分钟，而野生型幼苗的保留时间为21.3分钟。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)，相对于葡聚糖分子质量标准的保留时间，RG-I的分子质量从平均98.4 kDa增加到106.8 kDa和108.3 kDa。我们收集了这些RG-I馏分并分析了单糖组成。在gydF4y2BaPAGRgydF4y2Ba我们观察到，在过表达的植物中，阿拉伯糖的mol%从野生型的24.1%增加到35S::PAGR-YFP系的30.2%和33.6%(表2)gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．每种单糖对RG-I总质量的贡献计算为RG-IgydF4y2BaNbPAGRgydF4y2Ba-沉默植物(附加文件gydF4y2Ba10gydF4y2Ba:表S2)。这一分析表明，阿拉伯糖残留量从野生型的20.2 kDa增加到pagr过表达系的27.9和31.8 kDa。葡醛酸含量也从野生型的1.2 kDa下降到过表达系的1.0 kDa和0.8 kDa，聚焦量也从野生型的1.0 kDa增加到1.3和1.4 kDagydF4y2BaPAGRgydF4y2Baoverexpressing线。RG-I中鼠李糖、半乳糖和半乳糖醛酸的含量gydF4y2BaPAGRgydF4y2Ba过度表达者与野生型相似。接下来，我们计算了组成RG-I馏分的每个单糖残渣的大致数量。同样，鼠李糖和半乳糖醛酸双糖组成RG-I主链的数量在过表达和对照植物的90到100之间gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

PAGRgydF4y2Ba影响纯化鼠李乳糖醛酸- i中阿拉伯半乳聚糖和鼠李乳糖醛酸- i骨架表位的丰度gydF4y2Ba

为了更好地了解改变引起的RG-I成分的变化gydF4y2BaPAGRgydF4y2Ba经尺寸排除层析纯化的RG-I样品的表位组成gydF4y2BaNbPAGR -gydF4y2Ba静音和控制gydF4y2Ba烟草benthaminagydF4y2Ba利用一套综合的植物甘氨酸定向抗体，采用ELISA方法对植物、pagr过表达拟南芥和野生型拟南芥进行分析[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba(图。gydF4y2Ba7 cgydF4y2Ba，附加文件gydF4y2Ba11gydF4y2Ba:表S3)。这些RG-I制剂几乎只被针对果胶骨架和阿拉伯半乳聚糖表位的抗体识别。在所有植物系的RG-I制剂中都观察到抗去酯化均半乳糖醛酸(HG)表位抗体的弱结合，考虑到用于生成RG-I的方法，这与预期一致。RG-I从gydF4y2BaNbPAGRgydF4y2Ba与对照组的RG-I相比，-沉默的植物产生了更强的识别非分支RG-I骨干表位的抗体信号。来自沉默植物的RG-I也表现出与阿拉伯半乳聚糖表位结合的抗体信号强度的改变。来自沉默植物的RG-I对识别不同阿拉伯半乳聚糖表位的AG-2、- 3和- 4抗体组的一些抗体产生减少的信号，对许多属于AG-I组的抗体产生微妙的增强信号。RG-I从gydF4y2BaPAGR -gydF4y2Ba过表达拟南芥植株中识别RG-I或HG骨干表位的抗体信号没有变化。属于AG-1组的抗体从过表达pagr的植物(第6和第9行)产生更强的RG-I信号，AG-3和- 4组的一些抗体针对其他阿拉伯半乳糖表位。因此，ELISA分析支持结论gydF4y2BaNbPAGRgydF4y2Ba-沉默影响RG-I主干的分支和RG-I的整体阿拉伯半乳聚糖组成。来自35S::PAGR-YFP系的RG-I的ELISA结果也支持这一结论，即这些系中RG-I的阿拉伯半乳聚糖取代发生了改变。gydF4y2Ba

鼠李糖乳糖醛酸- i组分糖苷连锁分析gydF4y2Ba

RG-I具有不同类型的阿拉伯半乳聚糖侧链，具有不同的半乳聚糖主链;i型阿拉伯半乳聚糖的主链为线性β-1,4-gydF4y2BadgydF4y2Ba加gydF4y2BapgydF4y2Ba而ii型阿拉伯半乳聚糖具有β-1,3-， β-1,6和β-1,3,6连接gydF4y2BadgydF4y2Ba加gydF4y2Bap。gydF4y2Ba为了进一步研究在沉默和过表达植物中观察到的RG-I组成的变化，我们通过分析从纯化的RG-I馏分中产生的部分甲基化和部分乙酰化的糖糖醇衍生物进行了糖苷连锁分析gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．在RG-I中gydF4y2BaNbPAGR -gydF4y2Ba沉默植株的4-半乳糖摩尔百分比由对照的47.9%降至42.0%。RG-I中2-鼠李糖的量gydF4y2BaNbPAGR -gydF4y2Ba沉默植株从对照组的6.2%增加到8.9%。2-鼠李糖与2,4-鼠李糖的比例由对照的0.78:1提高到~1:1gydF4y2BaNbPAGR -gydF4y2Ba这与RG-I主干分支较少的免疫学证据相一致gydF4y2BaNbPAGR -gydF4y2Ba沉默的植物。在RG-I中也检测到3,5-阿拉伯糖和6-半乳糖的少量增加gydF4y2BaNbPAGR -gydF4y2Ba沉默的植物。在RG-I中gydF4y2BaPAGRgydF4y2Ba在-过表达的拟南芥植株中，除了3,6-取代己糖(假设为半乳糖，因为在这些部分的HPAEC糖基组成分析中没有检测到葡萄糖)的增加外，还检测到3-和6-连接半乳糖的数量显著增加。4-半乳糖的含量从野生型RG-I的19.4%降低到野生型RG-I的16.0%和14.7%gydF4y2Ba35 s:: PAGR-YFPgydF4y2Ba行。这些数据共同支持的结论，ii型阿拉伯半乳聚糖的量是增加的gydF4y2BaPAGRgydF4y2Ba-过表达系和i型阿拉伯半乳聚糖的数量略有减少。为了进行连锁分析，需要大量细胞壁材料，因此拟南芥莲丛叶被用作源材料，而不是在液体培养中生长的年轻幼苗，在这些幼苗中单糖成分表型最为明显gydF4y2Ba35 s:: PAGR-YFPgydF4y2Ba行。这可能是在从年轻幼苗中纯化的RG-I中检测到的RG-I阿拉伯糖含量的变化在用于连锁分析的较老的土壤生长材料中没有观察到的原因。gydF4y2Ba

这里报告的结果表明gydF4y2BaPAGRgydF4y2Ba在拟南芥中过表达时，对ii型阿拉伯半乳聚糖的生物合成有积极影响gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba直接同源,gydF4y2BaNbPAGRgydF4y2Ba，减少了RG-I与i型阿拉伯半乳聚糖的替代，减少了RG-I主干的分支。为PAGR的糖基转移酶活性提出一个简单的假设来解释这些不一致的结果是具有挑战性的。许多不同的阿拉伯半乳聚糖侧链结构已被检测到作为RG-I骨架上的分支[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba］．RG-I主链上这些取代的模式尚未被描述。gydF4y2Ba

在葡萄糖醛基氧基聚糖和木葡聚糖的生物合成中，糖基转移酶表现出很强的受体底物特异性。在glucuronoxylan的生物合成过程中，GUX1表现出强烈的葡萄糖醛酸添加到平均间隔约8个残基的木聚糖残基上，而GUX2则表现出强烈的葡萄糖醛酸添加间隔在5 - 7个残基之间，不偏好偶数或奇数间隔[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba］．这两种葡萄糖醛酸基转移酶的活性在同一分子中产生不同的木聚糖结构域，具有不同的取代模式。在木葡聚糖的生物合成过程中，XLT2和MUR3专门将半乳糖添加到每个木葡聚糖亚基中的不同木糖残基[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44gydF4y2Ba］．我们推测，通过改变RG-I主链的取代，PAGR可能通过酶合成i型和ii型阿拉伯半乳聚糖来影响RG-I主链的识别。另外，PAGR可能主要影响最丰富的RG-I阿拉伯半乳聚糖侧链的取代。我们观察到gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba，那里沉默的gydF4y2BaNbPAGRgydF4y2Ba主要影响RG-I与i型阿拉伯半乳聚糖的取代，这些是最丰富的侧链。在拟南芥RG-I中，ii型arabin半乳聚糖明显更丰富。gydF4y2Ba

生产果胶多糖的整体生物合成过程仍有争议[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．提出了两种主要的果胶生物合成模型;连续GT模型和域综合模型。在连续的GT模型中，GTs在通过高尔基体移动时，依次从核苷酸-糖中添加糖到正在生长的果胶多糖上。在结构域合成模型中，低聚或多糖引物由核苷酸糖或脂联糖合成，并延长成果胶糖聚糖结构域。这些果胶结构域然后转移到一个正在生长的果胶分子上。我们的数据也可能支持PAGR参与了一个生物合成步骤，在糖苷或低聚糖转移到新生的RG-I，从而影响多种类型的RG-I侧链的生产。PAGR的这种可能功能类似于甘露聚糖合酶相关(MSR)-1和- 2的假设作用[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．MSRs是含有DUF246结构域的高尔基定位gt样蛋白，参与甘露聚糖生物合成(见附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S2)。在gydF4y2Bamsr1 msr2gydF4y2Ba双突变体甘露聚糖水平降低约50%，甘露聚糖合酶活性降低。Wang等人(2012)假设MSR蛋白可能在甘露聚糖合成低聚糖引物的生产或甘露聚糖合成酶的稳定中起作用。gydF4y2Ba

那gydF4y2BaPAGRgydF4y2Ba似乎是花粉管生长所必需的，但不是花粉发育所必需的gydF4y2BaPAGRgydF4y2Ba在花粉管细胞壁中多糖的产生中有作用。马铃薯中能够消化果胶多糖的酶的转基因表达实验表明，这些多糖对花粉的活力至关重要[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．在表达消化RG-I主干酶的马铃薯系或果胶arabinans中观察到花粉表型塌陷和雄性育性下降。守恒的存在gydF4y2BaPAGRgydF4y2Ba直接同源的gydF4y2BaPhyscomitrellagydF4y2Ba而且gydF4y2Ba卷柏gydF4y2Ba支持其作用在陆地植物的进化过程中一直被保留。PAGR参与关键多糖结构的生产，例如RG-I阿拉伯半乳聚糖侧链中的早期键，可以推动如此高水平的保存。gydF4y2Ba

PAGR和NbPAGR过表达和沉默诱导的形态表型为果胶阿拉伯半乳聚糖在调节植物细胞壁延伸方面的作用提供了证据。多向形态表型仅在PAGR过表达者的特定器官中表现出来，这表明仅在特定组织中过表达PAGR会显著改变RG-I的关键特性。茎尖分生组织中细胞壁的弹性被认为在调节器官形成中起关键作用[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba］．果胶甲基酯化影响细胞壁的弹性，并在茎尖分生组织中受到高度调控，在茎尖分生组织中，去甲基酯化的区域是新的外侧器官原基的基础[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba］．果胶甲基酯化在茎尖分生组织中的改变也影响细胞壁的弹性和新器官的产生[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba］．35S::PAGR-YFP植株的层状结构和迷恋性的改变可能是由于茎尖分生组织细胞壁的延伸性的改变。在gydF4y2BaNbPAGR -gydF4y2Ba沉默植株节间扩张减少和根缩短可能是由于细胞壁延展性下降。如果PAGR在RG-I阿拉伯半乳糖侧链的生物合成中起作用，那么PAGR过表达的生化和形态表型可能取决于特定组织中通常存在的RG-I取代的程度。例如，在年轻人中gydF4y2BaPAGRgydF4y2Ba我们观察到RG-I的阿拉伯聚糖含量显著增加，而莲座叶RG-I的类似连锁分析没有显示阿拉伯聚糖的变化gydF4y2BaPAGRgydF4y2Ba-overexpressors。gydF4y2Ba

总之，这里提出的结果支持这一点gydF4y2BaPAGRgydF4y2Ba在RG-I阿拉伯半乳聚糖的生物合成中的功能，并说明了这些多糖在营养和生殖植物生长中的重要作用。需要更多的研究来了解RG-I的详细结构，特别是关于分支的模式和性质，以及RG-I在植物中产生的生物合成过程。这样的研究将更好地努力确定PAGR在RG-I阿拉伯半乳聚糖侧链生物合成中的特定生化作用。gydF4y2Ba

植物材料gydF4y2Ba

拟南芥gydF4y2Ba海恩。(L)哥伦比亚0号种子来自Lehle seeds (Round Rock, Texas)。拟南芥植株在22℃、90 μmol m光照周期为10 h的条件下生长gydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}年代gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}白天的照明。4周后，将植株移栽到光照周期为16小时的环境中诱导开花。gydF4y2Ba烟草benthamianagydF4y2Ba种子是由Dinesh-Kumar实验室(加州大学戴维斯分校)提供的。gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba在25℃、60%湿度、200 μmol m条件下，光周期为16 hgydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}年代gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}白天的照明。拟南芥T-DNA系CS836448 (gydF4y2Bapagr-1gydF4y2Ba)和SALK_064738C (gydF4y2Bapagr-2gydF4y2Ba)来自拟南芥生物资源中心(ABRC, Ohio State University)。采用基因组引物Cs836448F 5′-TCTTCCAGAGATAGAGCAGATGGCTG-3′和Cs836448R 5′-TGCGCTTCTGCAAGGCGAGC-3′对T-DNA系进行PCR分型gydF4y2Bapagr-1gydF4y2Ba和S_64738F 5 ' -TGGCGTCACTGGGTGCTCCT-3 '和S_64738R 5 ' - tcagccatctgctctctggag -3 'gydF4y2Bapagr-2。gydF4y2Ba使用正向基因组引物和适当的左缘T-DNA引物pDAP101-Lb1 5′- gccttcagaaatggataaatagccttgcttcc -3′检测T-DNAgydF4y2Bapagr-1gydF4y2Ba和LB1 5 ' -TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG-3 'gydF4y2Bapagr-2。在体外gydF4y2Ba花粉萌发试验按所述进行[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba］．对流产花粉粒进行鉴别染色，如所述[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba并使用徕卡db4000b显微镜成像。gydF4y2Ba

病毒诱导基因沉默gydF4y2Ba

NbPAGR-AgydF4y2Ba（gydF4y2BaNiben101Scf07590g07020gydF4y2Ba),gydF4y2BaNbPAGR-BgydF4y2Ba（gydF4y2BaNiben101Scf35628g00005gydF4y2Ba)在Sol基因组网络数据库[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba]作为PAGR中对等的最佳BLAST命中gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba基因组。NbPAGR预测的氨基酸序列与拟南芥DUF246家族蛋白的比对和系统发育分析表明，NbPAGR- a和-B是拟南芥PAGR的密切同源物(附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S2)。的gydF4y2BaNbPAGR-AgydF4y2Ba用于诱导VIGS的序列从total中扩增gydF4y2Ban benthamianagydF4y2BacDNA使用引物5 ' -TTATCTAGACGATGACGATTACCGTGGCCGT-3 '和5 ' -TTATCTAGAGCTGGTTTAGACCACCCTCAGCG-3 '。随后，该片段被克隆到pYL156的Xba1位点[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]即pTRV2，生成pYL156-NbPAGR。作为一种非沉默的对照质粒，pYL156含有一段基因片段gydF4y2Ba格斯gydF4y2Ba使用基因(pYC1) [gydF4y2Ba50gydF4y2Ba］．pYC1和pYL156-NbPAGR分别转化为gydF4y2Ba根癌土壤杆菌gydF4y2Ba应变GV3101。2 ~ 3周龄诱导病毒诱导的基因沉默gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba根据标准协议的植物[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba］．在感染后14天收集组织进行所有分析。序列比对在geneous 4.6.5 (Biomatters，新西兰)中进行gydF4y2Bahttp://www.phylogeny.frgydF4y2Ba［gydF4y2Ba51gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

PAGRgydF4y2Ba过表达与定位gydF4y2Ba

的编码序列gydF4y2BaAt3g26370gydF4y2Ba（gydF4y2BaPAGRgydF4y2Ba使用Phusion高保真DNA聚合酶(New England Biolabs)和引物5 ' - caccatggcagagttacggcactcgagctcttc -3 '和5 ' -TCCAGCTTTACACATGCATGGAGTGAGAGG-3 '从拟南芥cDNA中扩增得到。PCR产物克隆到pENTR-D-Topo (Invitrogen)中。根据制造商的协议(Invitrogen)进行Gateway LR重组反应，以转移的编码序列gydF4y2BaPAGRgydF4y2Ba进入pGWB41 [gydF4y2Ba52gydF4y2Ba生产gydF4y2Ba35 s:: PAGR-YFPgydF4y2Ba用于生产转基因拟南芥植物。这个结构被改造成gydF4y2Ba农gydF4y2Ba利用花浸法对菌株GV3101和拟南芥Columbia-0生态型植株进行转化[gydF4y2Ba53gydF4y2Ba］gydF4y2Ba．gydF4y2Ba用于总细胞壁和RG-I单糖组成的分析gydF4y2Ba35 s:: PAGR-YFPgydF4y2BaT3幼苗在22℃液体培养中培养14 d。为了进行定位研究，将PAGR编码序列重组为pGWB44，得到35S::PAGR- cfp。gydF4y2BaPAGR-CFPgydF4y2Ba与α-甘露糖苷酶-1瞬时共表达[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba] 4周大gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba按照所述程序离开[gydF4y2Ba54gydF4y2Ba除了100mm2 -(N-morpholino)乙烷磺酸，100mmmgclgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba，以10 μM乙酰丁香酮为浸润介质。表达gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba表皮细胞用蔡司710共聚焦激光扫描显微镜(卡尔蔡司)成像。gydF4y2Ba

免疫印迹gydF4y2Ba

在100mm Tris pH 7.5、1mm EDTA、1% (v/v) Triton X-100、10% (v/v)甘油、1mm苯甲基磺酰氟中研磨，从1周龄拟南芥幼苗中提取总蛋白。细胞碎片在16000 x下离心成粒gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C下放置15分钟。用Bradford法定量提取蛋白[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba］．电泳时，40 μg蛋白通过SDS-PAGE分离，电转移到PVDF膜上，并与AttB2位点“通用”一抗和抗兔二抗孵育，如[gydF4y2Ba56gydF4y2Ba]，除了在TBS-T中使用5% w/v BSA (Sigma)作为阻断剂，并用通用抗体以1:3000稀释培养膜外。gydF4y2Ba

定量rt - pcrgydF4y2Ba

从拟南芥中提取RNAgydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba组织使用RNEasy植物迷你试剂盒(Qiagen)。为了克隆目的，RNA是从gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba组织使用Trizol试剂(Invitrogen)。用上标- iii逆转录酶(Invitrogen)合成cDNA。定量RT-PCR采用StepOne-Plus Real-Time PCR系统(Applied BioSystems)， Syber-Select Real-Time PCR试剂(Invitrogen)。gydF4y2BaPAGRgydF4y2Ba引物At3g26370 q1F 5 ' -GAGGTCGTCGCAGATCTTCAGGTTCATGT-3 '和At3g26370 q1R 5 ' -GGCTCCCACTGTTCTTCTTCATCAGGCTT-3 '检测到。MONENSIN敏感性1,At2g28390，一个具有异常转录水平稳定性的基因[gydF4y2Ba57gydF4y2Ba]，以引物5 ' - aactcattgcagcatttgatccact -3 '和5 ' -TGATTGCATATCTTTATCGCCATC-3 '作为内参基因进行分析。资料采用比较Ct法进行分析。用于定量的实时RT-PCR分析gydF4y2BaNbPAGRgydF4y2Ba沉默，数据分析使用三个内参基因的几何平均值作为共同参考，如所述[gydF4y2Ba58gydF4y2Ba］．为gydF4y2BaNbPAGR-AgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba- b,gydF4y2Ba引物gydF4y2BaNbPAGR-AgydF4y2BaqF 5“-CTACGCCACTCAAGCTCGATCGGAAA-3”,gydF4y2BaNbPAGR-AgydF4y2BaqR 5“-GCCACGGTAATCGTCATCGTCATCGTCAA-3”,gydF4y2BaNbPAGR-BgydF4y2BaqF 5 ' -CTACGCCACTCAAGCTCGATCGGAAG-3 '和gydF4y2BaNbPAGR-BgydF4y2Ba使用qR 5 ' -GCCACGGTAATCGTCATCGTCATCGTCAT-3 '。以延伸因子1A、肌动蛋白2和泛素3为内参基因，引物NbEF1qF 5 ' -AGGGTCCAACCCTCCTTGAGGC-3 '和NbEF1qR 5 ' -GCCCCTTTGGCTGGGTCGTC-3 ';Actin-2引物ACT2F 5 ' -TTGAGACTTTTAATACCCCAGC-3 '和ACT2R 5 ' - aacatgattacaacatccagaagg -3 '和UBQ3R 5 ' - tgaagtacagcgagcttaac -3 '。gydF4y2Ba

细胞壁分离及单糖组成分析gydF4y2Ba

醇不溶性残渣(AIR)的制备方法如下[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．将冻干的空气在2 M三氟乙酸中在120℃下水解1小时，并使用高性能阴离子交换色谱(HPAEC)进行分析，如[gydF4y2Ba59gydF4y2Ba］．由于残留淀粉的存在，总细胞壁材料样品的葡萄糖未被测定。空气的顺序提取基本上如下所述[gydF4y2Ba60gydF4y2Ba，但从gydF4y2BaPAGRgydF4y2Ba-过表达蛋白在4 M KOH提取前未用1 M KOH提取。gydF4y2Ba

Endo -β1,4-galactanase消化gydF4y2Ba

用内do-β-1,4-半乳糖酶酶切法进一步分析了VIGS植物的细胞壁制剂gydF4y2Ba黑曲霉gydF4y2Ba在银染色凝胶(Megazyme，产品代码E-EGALN)上纯化成单一条带。将空气(2毫克)溶解在0.1 mL的1 M KOH中，并用2 mL的100 mM乙酸调整到pH值4.7。加入半乳糖酶，样品在40°C下孵育1小时。孵卵后，加入含有10 mM EDTA的冷乙醇至终浓度为70% (v/v)，样品在14000 x下离心5分钟gydF4y2BaggydF4y2Ba4°C。上清液和球团按上述方法分离、水解、高效液相电泳分析。gydF4y2Ba

Rhamnogalacturonan-I净化gydF4y2Ba

鼠李糖乳苷- i的分离主要由[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba］．简单地说，用3U果胶甲基酯酶(Novoshape Pure PME, Novozymes)和20U内聚半乳糖醛酸酶M2 (Megazyme，产品代码E-PGALUSP)在37℃下，在1 ml 50 mM草酸铵(pH 5.0)中消化15 mg AIR。消化后，不溶性物质通过离心去除，然后通过0.2 μm自旋过滤器过滤。通过在10kda分子量截断自旋过滤器(Amicon)上用无菌水清洗溶解的多糖来去除寡糖和消化缓冲液。样品从水中的自旋浓缩器中洗脱，并在50 mM甲酸铵(pH5.0)中使用Superdex 200 10/300GL色谱柱进行尺寸排除色谱分离(GE Healthcare bio sciences)。gydF4y2Bahttp://www.gelifesciences.com/gydF4y2Ba)，流速为0.5 ml/min。用Shodex RI-101折射率检测器(Shodex，gydF4y2Bahttp://www.shodex.comgydF4y2Ba)．按上述方法手动收集各组分，进行冻干、水解和HPAEC分析。RG-I的MW估计是参考葡聚糖MW标准(Sigma-Aldrich)的保留时间做出的。每种单糖在RG-I馏分中的相对质量百分比是通过首先计算每种单糖的质量比来确定的，方法是用每种单糖的摩尔质量和摩尔质量的乘积除以每种单糖的摩尔质量和摩尔质量的乘积的总和。然后，我们将单糖质量比乘以RG-I部分的估计分子量。gydF4y2Ba

纯化鼠李糖乳苷聚糖i制剂的ELISA筛选gydF4y2Ba

纯化后的RG-I样品溶于水，并涂覆在ELISA板上[384孔透明平底聚苯乙烯高结合微孔板(产品编号:;3700)，康宁生命科学]，以等重(重量)每井为基础(0.5 μg/井)。然后，用一套细胞壁甘聚糖定向单克隆抗体对样品进行ELISA筛选，基本上如上所述[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba61gydF4y2Ba］．ELISA筛选分析使用机器人系统(Thermo Scientific)进行，该系统包括一个Orbitor RS机械臂(Thermo Scientific)，可访问以下组件:旋转盘存储/培养(Thermo Scientific)， EON平板阅读器(Biotek)， EL406 ELISA洗盘机(Biotek)， Multiflo分配器(Biotek)和Precision XS液体分配器(Biotek)。整个系统由实验室自动化软件Momentum 3.2.7 (Thermo Scientific)操作。水被用作空白，这些背景值从样品的ELISA反应中减去。酶联免疫吸附试验采用技术重复，数据代表重复的平均值。细胞壁甘聚糖定向抗体来自复杂碳水化合物研究中心的实验室库存(CCRC, JIM和MAC系列)(可通过CarboSource Services获得;gydF4y2Bahttp://www.carbosource.netgydF4y2Ba)或通过BioSupplies(澳大利亚)(BG1, LAMP)。gydF4y2Ba

鼠李糖乳苷- i连锁分析gydF4y2Ba

通过GC/MS分析其部分甲基化的糖醇乙酸酯，对RG-I进行糖苷连锁分析[gydF4y2Ba62gydF4y2Ba］．纯化的RG-I样品gydF4y2BaOgydF4y2Ba在二甲基亚砜中使用液态氢氧化钠甲基化，并通过三氟乙酸水解、还原和每-甲基化进一步衍生成相应的部分甲基化的糖糖醇乙酸酯gydF4y2BaOgydF4y2Ba乙酰化作用。使用气相色谱仪(Agilent 7890A, Agilent Technologies, Agilent Technologies，gydF4y2Bawww.agilent.comgydF4y2Ba)，配备Supelco SP2380色谱柱(Sigma-Aldrich)及质谱仪(Agilent 5975C)，其温度梯度如所述[gydF4y2Ba60gydF4y2Ba］．根据与标准相比较的保留时间及其离子破碎模式，确定了洗脱化合物。gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

支持本文结果的数据集包含在本文及其附加文件中。核苷酸序列和生物材料，包括拟南芥种子、质粒和细菌菌株，可在以下网址获得:gydF4y2Bahttps://registry.jbei.orggydF4y2Ba)．支持本研究系统发育分析的资料载于(gydF4y2Bahttp://purl.org/phylo/treebase/phylows/study/TB2:S19106gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

这项工作由美国能源部、科学办公室、生物和环境研究办公室通过劳伦斯伯克利国家实验室和美国能源部之间的DE-AC02-05CH11231合同支持。部分工作得到了丹麦战略研究委员会(Set4Future 11-116795)的支持。本工作用于ELISA筛选的植物细胞壁甘氨酸定向单克隆抗体CCRC系列的生成得到了美国国家科学基金会植物基因组计划(DBI-0421683 and IOS-0923992)的支持。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 联合生物能源研究所和生物系统与工程，劳伦斯伯克利国家实验室，加州伯克利，94720，美国gydF4y2Ba

   Solomon Stonebloom, Berit Ebert, Devon Birdseye, Jeemeng Lao, Joshua L. Heazlewood和Henrik Vibe SchellergydF4y2Ba

2. 哥本哈根大学理学院植物与环境科学系，c1871，哥本哈根，丹麦gydF4y2Ba

   所罗门·斯通布鲁姆和贝瑞特·艾伯特gydF4y2Ba

3. 加州大学伯克利分校能源生物科学研究所，加州94720，美国gydF4y2Ba

   熊广彦和马库斯保利gydF4y2Ba

4. 加州大学伯克利分校植物与微生物生物学系，加州，94720，美国gydF4y2Ba

   熊广彦，Markus Pauly和Henrik Vibe SchellergydF4y2Ba

5. 佐治亚大学复杂碳水化合物研究中心，雅典，佐治亚州，30602-4712，美国gydF4y2Ba

   Sivakumar Pattathil和Michael G. HahngydF4y2Ba

6. 佐治亚大学生物能源科学中心，美国佐治亚州雅典30602-4712gydF4y2Ba

   Sivakumar Pattathil和Michael G. HahngydF4y2Ba

7. 佐治亚大学植物生物学系，雅典，GA, 30602-4712，美国gydF4y2Ba

   迈克尔·g·哈恩gydF4y2Ba

8. ARC植物细胞壁卓越研究中心，墨尔本大学植物学院，3010，墨尔本，维多利亚，澳大利亚gydF4y2Ba

   Joshua L. HeazlewoodgydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaHenrik Vibe SchellergydF4y2Ba．gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者宣称他们之间没有利益冲突。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

SS参与了实验设计，完成了实验并撰写了初稿。BE、GX、SP、DB、JL和MGH进行了实验，并对数据进行了分析。MP和JLH参与了实验设计和手稿的撰写。HVS和SS构思了这项研究，参与了实验设计，协调了实验，并准备了最后一个版本的手稿。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文根据创作共用属性4.0国际许可协议(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba)，允许在任何媒介上不受限制地使用、分发和复制，前提是您对原作者和来源给予适当的赞扬，提供到创作共用许可证的链接，并注明是否进行了更改。创作共用公共领域奉献弃权书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)除另有说明外，适用于本条所提供的资料。gydF4y2Ba

转载及权限gydF4y2Ba