长期平衡选择在磷饥饿耐受1（PSTOL1）野外，驯养和杂草米饭的基因座（选用）

背景

在世界上许多地区，特别是在热带地区，能够在缺磷的土壤中生长是水稻种植的一个重要特性。这磷饥饿耐受1（PSTOL1)基因已被鉴定为某些水稻品种在低磷条件下生长能力的潜在基因;然而，这种基因在其他品种中却不存在。我们评估PSTOL1在不同地理位置的野生、驯化和杂草水稻样本中的存在/缺失，并对存在该基因的样本进行测序。

结果

我们发现存在/缺席多态性跨越牧草，杂草和野生亚洲群组。对于携带的样本子集PSTOL1，单倍型序列表明了功能等位基因的长期选择性维持，但通过过早的止动件和架构突变重复演变。多种稻米种类和栽培水稻品种，函数丧失的等位基因已经趋于演变。低磷条件下的植物生长的温室评估并没有透露重大关联PSTOL1基因型变异;然而，在该基因座在此基因座的平衡选择的签名表明，进一步的表型特征PSTOL1有必要的等位基因变异，可能有助于作物改善。

结论

这些发现建议平衡功能性和非功能性的选择PSTOL1预测和超越亚洲米驯化的等位基因，一种可以反映与土壤磷含量的地理变异相关的适应性权衡的模式。

非生物胁迫，如干旱，高盐度和低土壤营养水平，在全球产生负面影响的作物生产，并预计由于气候变化，未来几十年的增加[1那2]．许多工作都集中在确定植物抗非生物胁迫的分子机制上，目的是培育更耐受性的作物[3.那4.]．然而，植物适应非生物胁迫的遗传基础仍然知之甚少，即使在基因组模式物种，如水稻。对耐受性基因的鉴定通常局限于突变系或用于定位群体的相对少数的个体，而且在栽培和野生群体中更广泛地分析自然等位变异是罕见的(但参见[5.-7.])。

一种可能塑造非生物应激适应的演变的因素是对比环境的健身折衷，其中可以耐用的基因型显示出在更有利的条件下生长时的竞争力或产量降低。在遗传水平上，拮抗性胸膜复制描述了一种环境中适应性的基因型，但对另一个环境产生负面影响[8.那9.]．适应性与耐受性的权衡对水稻(oryza sativa），耕种品种的耕种品种对其农业生态适应巨大变化。在水稻中，这个范围包括高地，耐旱品种;在季风淹水田地生长的深水品种;短季，冷适应品种高海拔和纬度;对盐度和营养较差的土壤具有高耐受性的品种[10.]．

大米是世界上三分之一以上人口的主要主食。11.，水稻种植遍及六大洲80多个国家[10.]．不同水稻产区的土壤磷(P)有效性差异很大。大部分作物品种是在贫磷土壤中种植的，特别是在亚洲热带高地地区[12.那13.]．与此同时，水稻也被广泛种植在富含磷或磷补充的土壤中，在这些条件下生长的品种通常是高产的，但不耐受营养剥夺。这种模式表明了与营养不良土壤的耐受性相关的潜在适应性权衡。在遗传水平上，如果土壤磷有效性的空间异质性选择了低磷和不耐磷的基因型，那么这种适应性变异的基因有望在平衡选择下进化，以维持两个等位基因类。在一定程度上，土壤养分异质性也影响到水稻的野生和杂草近亲，非栽培选用人口也可能受到低P耐受性的平衡选择。

亚洲栽培稻(o.苜蓿）由两个主要的亚种组成，japonica.和籼稻是由野生稻驯化而来的，o. rufipogon，大约从8000年前开始[14.]．这籼稻亚种包括籼稻和啊品种，和japonica.亚种包括热带粳稻那温带粳稻， 和芳香品种。所有五种栽培品种都可以从遗传上加以区分[15.]．除了归国外，亚洲米还经历了脱矿，导致侵犯杂草田地的缺乏症状。已经描述了几种基因不同的杂草稻种群，包括稻草杂草源于籼稻作物祖细胞[16.]，黑色的美国杂草啊祖细胞[16.]，韩国杂草来自籼稻祖细胞[17.]，韩国杂草来自japonica.祖细胞[17.和马来西亚杂草来自籼稻祖细胞[18.]．在非洲，大约3500年前开始的一场独立的驯化活动导致非洲种植水稻(O. Glaberrima.），其来自野生非洲物种oryza barthii.[19.那20.]．亚洲和非洲驯养的大米都属于AA基因组选用物种思工，除了野生祖种类外，还包括南美物种o. glumaepatula.，澳大利亚物种o .南方猛犸和非洲物种O. longistaminata.[21.]．

磷饥饿耐受1（PSTOL1最近已被确定为水稻低P耐受性的主要遗传决定蛋白[22.]．该基因编码具有磷饥饿耐受能力的蛋白激酶，被鉴定为低磷耐受基因啊水稻品种卡萨拉斯[23.]．有趣的是,PSTOL1被发现不存在水稻参考基因组（Nipponbare，a温带粳稻品种），它落入染色体12的〜90 kB插入缺失多态性（Indel）内。在功能表征之前PSTOL1Gamuyao等人鉴定该~ 90kb indel在亚洲水稻品种中具有广泛的多态性;插入与生长在贫瘠土壤条件下的旱稻有关，缺失与生长在良好土壤条件下的低地水稻有关[13.]．鉴于〜90 kb indel可能对应于PSTOL1存在/缺失，这个模式表明PSTOL1存在/缺失变化可能反映对低耐受性和 - 耐药基因型的地理上异质选择。

虽然PSTOL1似乎是栽培水稻对贫瘠环境的重要基因，但该基因座的序列变异仅在少数品种中直接检查[22.那24.]．在这项研究中，我们报道PSTOL1野生，栽培和吞食稻米基因存在/不存在多态性的分子演化与分布。使用这些数据我们解决了以下问题：1）分布是什么PSTOL1栽培，杂草和野生稻田的存在/缺失变化告诉我们对低p土壤条件的长期演变吗？2）用于携带的植物PSTOL1，该基因的分子进化揭示了功能变异的选择机制?3)如何PSTOL1在控制温室条件下生长的水稻植株对低磷耐受性的表型变异?我们的结果表明长期的平衡选择在PSTOL1早于和超越水稻驯化的位点，具有强大和持久的选择来维持这一农学上重要基因的功能性和非功能性等位基因。

系统发育分布PSTOL1存在/不存在多态性

282株筛选植株中，160株(56.7%)携带了病菌PSTOL1122例(43.3%)所有pcr基因分型反应均为阴性。1；额外的文件1:表S1)。横跨六个AA基因组选用物种采样，所有登录o . barthii那O. Glaberrima.那o. glumaepatula.和O. Meridionalis.被发现携带基因。相比之下，30％的基因不存在由样品和52％的o.苜蓿样本。这些模式表明PSTOL1存在/缺失多态性局限于亚洲栽培水稻及其野生祖先。在o.苜蓿，存在/不存在多态性跨越籼稻和japonica.亚种。PSTOL1在所有的啊和芳香作物样品（属于籼稻和japonica.分别为亚种），以及所有我们杂草的杂草（籼稻亚种），虽然它缺席了所有温带粳稻样本。籼稻和热带粳稻作物品种是多态性的，马来西亚和韩国杂草（包括组合）籼稻和japonica.菌株）。

额外的功能丧失突变PSTOL1

虽然PSTOL1存在/不存在多态性限制为o.苜蓿和由在采样的探测中，基因似乎通过其他突变事件在多种物种上具有独立地发展的函数等位基因（图。2）.在携带基因的样品子集中，在所有六个中检测到核苷酸位置381-382处的2-BP框架缺失O. Meridionalis.加入;此删除也被检测到五个中的一个o. glumaepatula.登记入册。在o.苜蓿，在位置411处取代的g，其导致氨基酸位置137处的过早止动密码子，在籼稻作物品种和四个韩国人籼-喜欢杂草。有趣的是，相同的密码子通过五分之一检测到的独立过早停止而改变啊品种和一个由加入;这些样本在核苷酸位置410携带一个G到a的取代。因此，出现了功能性和非功能性PSTOL1等位基因跨越多个AA基因组选用物种和变异PSTOL1内的功能由和o.苜蓿包括存在/不存在变化和功能损失突变。这种模式与划分的分类和地理上 - 广泛选择，以保持多态性PSTOL1功能。

进化地分歧了PSTOL1平衡选择的进化枝和特征

系统发育分析PSTOL1序列显示出不同之间的分歧O. Meridionalis.，最远心相关的采样AA基因组物种[21.)，以及其他样本类群(图。3.，思考c）。对于剩余的样品，序列落入两种良好的支持和高度分散的片状（疏水剂A和B），其被27个突变步骤分开，包括14个非唯一取代。在表中显示了采样载体中的分布1在无花果。1和3.．单倍型o. glumaepatula.及非洲大米(o . barthii和O. Glaberrima.)按物种分组，用o. glumaepatula.CLADE B中的曲线A和非洲稻序列中的序列（图。3.）.相比之下，野生和驯养的亚洲稻米的单倍型在两种植物中都存在。在o.苜蓿四种栽培品种中的三种携带PSTOL1也存在于两个进化支(籼稻那啊那热带粳稻)，分支分化与籼/粳稻亚种指定。鉴于两片枝条之间的深处分歧和不协调O. Rufipogon / Sativa单倍型与已知的物种关系，这些分布表明亚洲水稻A和B等位基因类都有长期的选择性维持。与此推断一致的是，基于频谱的中性平衡测试揭示了统计上显著的平衡选择特征热带粳稻序列（Tajima的D.= 2.43,P.< 0.001;傅和李的F_S. = 2.25,P. < 0.001), although deviations from neutrality were not significant for啊那芳香要么由样品（表1）.找到了定向选择的统计上显着的签名籼稻样品（Tajima的D.=−2.26,P.< 0.001;傅和李的F_S. = 3.08,P.< 0.001)，这可能是由于12个样本中只有1个具有B分支等位基因。

重要的是要注意爆炸搜索使用PSTOL1来自每个主要赛道的序列没有额外的证据PSTOL1在已发表的数据库中，我们也从未扩增支A和支B的单倍型。因此，A和B进化支似乎是同一基因高度分化的等位基因，而不是副同源和/或伪基因拷贝。有趣的是,o.苜蓿和由具有过早停止突变的序列仅在疏枝A内发生（图。3.)，这可能进一步指出A和B等位基因类之间的功能差异。

亚洲驯化水稻与其野生祖先的核苷酸多样性的比较进一步表明，亚洲驯化水稻的非中性进化发生在PSTOL1．然而，水稻基因组中中性进化的基因显示了驯化瓶颈的证据，与之相比，作物的多样性较低由[25.]，PSTOL1相反，水稻的核苷酸多样性更高(见π和θ)_W.值,表1）.该模式表明，通过驯化事件，平衡选择在此基因座中保持了升高的多样性。与此发现一致，我们观察到池池的所有栽培水稻样本的Tajima的D，虽然非重大，值得高，但是（Tajima的D. = 2.37,P. > 0.05). In contrast too.苜蓿，非洲驯化稻米(O. Glaberrima.)没有证据表明平衡选择在PSTOL1在驯化期间;作物中的多样性比其野生祖细胞较低，与非洲稻驯化瓶颈期间的中性演变一致[20.]．

杂草稻株的核苷酸多样性模式PSTOL1与这些杂草从其驯化的祖细胞演变时发生的人口瓶颈一致（例如，[16.那18.])。美国杂草固定为一个单一的，共同的支系a单倍型，这也存在于两种籼稻和啊栽培品种群(美国杂草的推断祖先;[16.]） （图。3.）.所有马来西亚杂草也分享了这种普通的思考，这是一个单倍型，与他们的密切关系一致籼稻作物品种(18.]．四籼稻- 妥善韩国杂草携带PSTOL1固定为单倍型不同的疏水液;与其他杂草米单倍型一样，这种单倍型与一个共享籼稻裁剪加入（图。3.）.

温室生长的实验

与Gamuyao等人的发现相反[22.]，低于高P病症的基因型性能的比较没有揭示具有功能性的植物的明显健康优势PSTOL1基因在低P病症下拷贝。虽然具有功能基因拷贝的植物在低P条件下表现出更好的增长的非显着趋势，但是表现出最佳的植物是完全缺乏基因的植物;这些结果对于根和芽生长一致（图。4 a、b额外的文件2:图S2和附加文件3.:图S3)。当植株在低磷条件下生长时，两个主要等位基因类(进化枝A和B)的根和茎的生长没有显著差异。高磷条件下植株比低磷条件下植株长出更大的枝条PSTOL1基因型(无花果。4B.和额外的文件3.:图S3)。根生长在除了具有过早停止突变之外的植物的高p和低P条件之间没有显示出显着差异，其中在高p条件下根重量更大（图。4A和额外的文件2：图S2），以及那些缺乏的人PSTOL1,在低p条件下根部更长的地方（附加文件4.:图S1)。虽然我们的温室实验是基于Gamuyao等人的方法建模的，但我们没有检测到与PSTOL1在该研究中观察到的变异可能反映了实验设计的差异，包括测定的发育阶段的差异。另外两项最近的研究也表明两者之间没有明显的相关性PSTOL1基因型变异和植物性能高，低p病例[26.那27.]．

PSTOL1是AA基因组的高多态性基因选用物种。我们发现了基因存在/缺失多态性在驯化亚洲水稻及其野生祖先中选择性维持的证据(图。1)，功能缺失等位基因的独立进化，尽管无意义和移码突变(图。2），并且在亚洲稻米中维持两种不同的功能等位基因，该稻米承受平衡选择的清晰签名（图。3.和表格1）.这两个的分歧PSTOL1片断可能会使亚洲稻驯化术语，因为在野生稻中发现了两种植物的等位基因（由)到达(无花果。1和3.）.也有证据表明，长期的平衡选择，以维持两个独立的分支在几个栽培水稻群体(表)1）.这些调查结果提高了关于保持这种功能变异的选择性因素的有趣问题及其对适应高和低P环境的影响。

功能含义PSTOL1变异

有充分的证据表明PSTOL1赋予具有基因功能拷贝的植物中磷的增加增加。该基因编码受体样细胞质激酶[22.]，通过精细绘图来确定P用于P吸收的主要QTL，PUP1已发现，在Kasalath和Nipponbare之间解释该特质的近80％的变化[28.]．PSTOL1在两种转基因中的过度表达在低P条件下增加谷物产量超过60％，通过自下的根长度和表面积产生改善的P和其他营养物的摄取[22.]．此外，对159种培养的亚洲稻米加入调查表明PUP1QTL以适应不利的，应激易生长的条件的品种差异表示差异化[13.]．同源染色体的PSTOL1高粱对磷的吸收效率也有所提高[29.]和玉米[30.]．所有这些发现表明，选择应该强烈倾向PSTOL1功能稻植物生长在压力，低p土壤条件下。

相应地，最合理地解释为拮抗性肺炎的实例，能量的权衡或其他成本的情况下，最合理地解释了功能和基因缺失等位基因的系统源和地理上广泛的发生。PSTOL1具有更高P可用性的环境中的表达。然而PSTOL1完全迷失了温带粳稻米饭，有些功能副本存在印度，澳大利亚，热带日本和非洲栽培的水稻，这表明在后者品种种植的部分地区耐磷可能是有益的。转基因表达实验提供了额外的证据PSTOL1可能有多种作用。例如,35 s: PSTOL1过度表达系会导致比较时与根生长和应激反应相关的基因表达的变化PSTOL1零线(22.];受影响的基因包括与干旱反应和叶子衰老有关的基因，这两种性状很可能是在它们自身的强烈选择限制下产生的。在植物中，拮抗多效性的例子是罕见的PSTOL1将需要多态性以明确证实在一些环境条件下选择功能等位基因。

就像多态性一样PSTOL1功能可能反映了适应性多态性，亚洲水稻中两个进化分支的出现也表明了平衡选择，在这种情况下，维持两个功能不同的等位基因类。支A和支B单倍型之间有14种不同的取代(4.3%的氨基酸差异)，这些氨基酸差异的一个子集可能是蛋白激酶活性功能差异的基础。然而，进化支A和B等位基因之间的功能差异尚不明确。卡萨拉特特色鲜明PSTOL1等位基因属于进化支A单倍型(附加文件1:表S1)，以及迄今为止对其表型效应的研究PSTOL1变异要么专注于该等位基因[22.那28.]或已经评估了PUP1 / PSTOL1没有基本序列变异信息的多态性[13.那26.那27.]．因此，与基因存在/缺失多态性一样，需要进一步的工作来评估主要基因之间的功能差异PSTOL1单体型演化支。

Pariasca-Tanaka等[24.最近描述了一种非洲水稻PSTOL1与我们在大多数非洲大米样品中发现的支B单倍型相匹配的序列(见图)。3.）.他们注意到，虽然与Kasalath等位基因有6%的氨基酸位点不同，但该序列在激酶催化域是保守的。同样，除了三种外，我们的进化枝B单倍型的所有加入都有一个完全保守的激酶催化结构域。例外包括两个方面由登记入册,一籼稻每一种添加物在该区域中含有一个氨基酸替换物。这些发现表明，如果进化枝A和B等位基因有功能差异，它们很可能不是通过改变蛋白质的催化结构域而产生的。

根据之前的记录证据PSTOL1在低磷条件下提高磷的吸收[13.那22.那28.那31.]我们在该基因座上平衡选择的证据（图。3.和表格1），我们没有发现任何明显的效果有些令人惊讶的是PSTOL1温室内植物生长的变化(图。4.）.另一方面，其他最近的研究也发现了没有明确的相关性PSTOL1基因型和植物在高磷和低磷环境中的表现。在对31人的调查中籼稻水稻品种，Sarkar等人[27.报道了PUP1在低磷和高磷土壤中，只有3个品种对磷的吸收效率最高。同样，慕克吉等人[26.]发现没有关联PSTOL1108个印度品种对缺磷耐性的研究。后一项研究还评估了PSTOL1利用180个重组自交系对低磷耐受性进行研究，同样没有发现该基因提高磷吸收效率的证据。与所有对非生物胁迫的生理反应一样，磷吸收效率无疑是一个复杂的性状，因此，表型效应PSTOL1预计将在遗传背景和环境中各不相同。似乎有可能报告的变量效应PSTOL1在不同的研究中，这些基因与基因以及基因与环境的相互作用都得到了体现。

平衡选择

推定的功能性和非功能性的系统发育分布PSTOL1等位基因表明，选择已经在多个中保持了这种功能多态性选用物种(无花果。1和3.）.当平衡选择在很长一段时间内作用于基因时，通常建立杂种多态性[32.，这表明在亚洲水稻驯化之前，同样的选择压力差异可能早就在这个属中起作用了。跨种多态性的例子很少;自交不亲和基因座是植物长期平衡选择的最佳例子之一。33.])。然而，作用于自交不亲和的选择压力是由于负频率依赖选择，即罕见等位基因比普通等位基因具有选择优势。相反，平衡非生物胁迫基因的选择可能是由于基于可变环境条件的差异选择。

在两种野生番茄中发现了非生物胁迫基因长期平衡选择的例子茄属植物peruvianum和美国chilense[34.]．C-repeat结合因子(CBF2）参与植物对冷和干旱的反应，各种各样的环境条件Solanum.物种范围。mboup等人。发现跨物种多态性在CBF2保持了平衡选择的特征。环境异质性很可能驱动着两者的平衡选择CBF2和PSTOL1，并且可能不限于非生物胁迫耐受基因的这两个例子。植物多态性的基因组研究已经确定了几种具有平衡选择的基因组区域（例如[35.]），但很少有研究在密切相关的植物中考虑了跨物种多态性的物种。

农业环境表现出一系列非生物应力，包括干旱，低营养可用性和高盐度。这些压力的地理变异可以导致在基因座上平衡选择，使得适应这些压力。我们的研究结果PSTOL1表明该基因的适应性变异已成为环境异质性选择的目标，不仅在栽培水稻中，而且在更大的时间框架和地理范围内，包括多个AA基因组选用物种。虽然我们没有观察到明显的表型联系PSTOL1温室中的分子变异，我们在该位点检测到的平衡选择的分子特征表明，无论是栽培水稻还是野生水稻，功能变异在田间都是重要的选用物种。非生物应激反应中的其他基因也将显示在作物植物及其野生亲属中平衡选择的签名。

PSTOL1基因分型和序列分析

水稻种子来自美国农业部(USDA)、国际水稻研究所(IRRI)的种质资源，或者来自马来西亚莫纳什大学(Monash University Malaysia)的Beng Kah Song博士(他好心地提供了马来西亚杂草水稻样本)。植株生长至苗期(10-20 cm)，收集幼叶组织进行DNA提取。使用Qiagen DNeasy试剂盒或改进的CTAB提取方案提取基因组DNA [36.]．采用0.8%琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色检测DNA的质量和数量。共有282株植物被纳入分析，代表6个AA基因组选用物种：o . barthii（N = 9),O. Glaberrima.（N = 9),o. glumaepatula.（N = 5),O. Meridionalis.（N = 6),由（N = 40), ando.苜蓿（N= 114个作物品种，99个杂草品种1:表S1)。

这PSTOL1使用跨越基因的不同部分的三组PCR引物评分存在/不存在多态性，其由975年的单个外显子组成（附加文件5.:表S2)。PCR扩增遵循标准协议[36.]，并在大规模筛选前进行优化。所有三对引物中至少有两次PCR结果为阴性的植物被标记为无引物PSTOL1基因。如果三对引物中有一对单独产生产物，而另外两对引物为阴性，则对扩增子进行测序;然而，没有结果产品的序列相似的情况PSTOL1，这些植物因此被评为阴性。使用Wizard PCR cleanup kit进行PCR清理。所有扩增子都按照前面描述的方法在两个方向进行直接Sanger测序[36.]．

PSTOL1使用Phred / Phrap和Biolign版本4.0.6.2（Tom Hall，http://en.bio-soft.net/dna/BioLign.html）.只有高质量的基础呼叫(质量分数为30或更高)被保留。对起始密码子和终止密码子进行修剪PSTOL1基因。杂合子snp(双峰)的证据通过眼睛筛选，发现在数据集中不存在，这与栽培稻和杂草稻的高度自交特性一致。

使用MEGA版本5构建最大似然树[37.]完全删除空白和10,000个引导重复。树施工采用GTR加上伽马突变模型，它使用Akaike信息标准选择，如在ModelTest中所实施的[38.]．DNASP版本5 [39.]用于计算遗传多样性的总统计量，包括分离位点数、沉默位点的平均成对核苷酸多样性(π) (Jukes-Cantor校正)和θ的Watterson估计。通过估计田岛的D和Fu的F来检验中性平衡模型_S.在DnaSP的统计与10,000合并模拟评估显著性。

低磷耐受的表型

在Gamuyao等人的协议之后，通过温室的低磷条件下的低和高磷条件的根生长来测量对低p生长条件的敏感性。[22.]，以及总射击质量。实验中包含二十四个跨越分类学研究的分类学抽样（附加文件1:表S1)。其中包括6个缺乏PSTOL1基因;四个具有基因但携带过早的停止突变，预期会使它不起作能（见结果）;还有14个有可能具有功能的基因拷贝。种子在湿滤纸上发芽，每个磷处理3个重复。甘木瑶等移栽幼苗后3天发芽;然而，我们的幼苗直到第10天才全部发芽。在萌发后10天，将幼苗转移到悬挂在吉田生长培养基中的泡沫塑料托盘中[40，每3天更换一次。通过不同浓度的NaH，建立了高磷和低磷的生长条件₂宝_4.在媒体100 um或10 um。每3天测量根长度，在生长培养基中21天后拍摄最终干根和枝重。

伦理

不适用。

同意发布

不适用。

数据和材料的可用性

支持本文中的结果的数据集可在Genbank，Ku922566 - Ku922725中获得。

P：

磷

该研究由美国国家科学基金会植物基因组研究计划(IOS-1032023)资助给KMO。我们感谢Patrick Vigueira博士和Zach Arias博士在温室实验和表型方面的帮助，感谢benkah Song博士(马来西亚莫纳什大学)为马来西亚杂草水稻样品提供的帮助，感谢Olsen实验室小组成员对手稿的评论。

资金

NSF IOS-1032023提供了研究设计，数据收集，分析和解释的所有资金。

隶属关系

1. 生物科学系，高点大学，高点，美国国家

   辛西娅·c·Vigueira

2. 华盛顿大学生物学系，美国密苏里州圣路易斯

   Linda L. Small＆Kenneth M. Olsen

通讯作者

对应到Kenneth M. Olsen.．

利益争夺

提交人声明他们没有竞争利益。

作者的贡献

CV参与了研究的设计，序列数据的分析，温室数据的收集和分析，并帮助起草了手稿。LS参与了序列数据的收集。KO参与了研究的设计，数据的分析，并帮助起草了手稿。所有作者都已阅读并批准了手稿的最终版本。

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再版和权限