一个自然的移码突变gydF4y2Ba风铃草属植物EIL2gydF4y2Ba与花的乙烯不敏感有关gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

植物激素乙烯在更年期花的发育和衰老过程中起着重要作用。在观赏植物生产中，乙烯敏感植物通常通过应用化学抑制剂来保护乙烯的负面影响。在gydF4y2Ba风铃草属植物,gydF4y2Ba花朵对微小浓度的乙烯也很敏感。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

监测花的寿命在三gydF4y2Ba风铃草属植物gydF4y2Ba物种透露gydF4y2Bac . portenschlagianagydF4y2Ba（gydF4y2BaCpgydF4y2Ba)对乙烯敏感，gydF4y2Bac . formanekianagydF4y2Ba（gydF4y2BaCfgydF4y2Ba)，具有中等灵敏度和gydF4y2Bac .介质gydF4y2Ba（gydF4y2Ba厘米gydF4y2Ba)对乙烯不敏感。我们鉴定了乙烯信号转导的关键元素，特别是在gydF4y2Ba乙烯响应传感器2gydF4y2Ba（gydF4y2BaERS2gydF4y2Ba)，gydF4y2Ba本构三重响应gydF4y2Ba（gydF4y2BaCTR1gydF4y2Ba),gydF4y2Ba乙烯不敏感3-像1和2gydF4y2Ba（gydF4y2BaEIL1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaEIL2gydF4y2Ba)同源。成绩单的gydF4y2BaERS2, CTR1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaEIL1gydF4y2Ba在所有物种的花发育过程中和对乙烯的反应中都有组成性表达。相比之下,gydF4y2BaEIL2gydF4y2Ba只在gydF4y2BaCfgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba厘米gydF4y2Ba．我们发现了一个自然突变gydF4y2BaCmeil2gydF4y2Ba产生移码，导致基因表达水平的差异gydF4y2BaEIL2gydF4y2Ba，两者之间的变化超过100倍gydF4y2BaCfgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba厘米gydF4y2Ba在年轻的花朵中。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

这项研究表明，在自然发生的7 bp移码中发现gydF4y2BaCmeil2gydF4y2Ba是乙烯信号通路中的一个关键基因，与花的乙烯不敏感有关。我们建议转让gydF4y2Baeil2gydF4y2Ba向其他植物的突变将为培育乙烯不敏感花提供一种新的手段。gydF4y2Ba

乙烯是一种气体植物激素，参与调节园艺的重要过程，包括花的发育、果实成熟、脱落、叶子和花的衰老[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．在乙烯信号转导途径中，内质网(ER)中受体蛋白中的铜辅助因子促进了乙烯的感知[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba，包括乙烯反应1 (ETR1)和乙烯反应传感器1 (ERS1)或ETR2, ERS2和乙烯不敏感4 (EIN4)的受体蛋白已被鉴定。它们的区别在于其激酶结构域的功能[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．乙烯受体以二聚体的形式存在，并与负调控因子本构三重反应1 (CTR1)发生物理相互作用[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．CTR1的激酶活性指向乙烯不敏感2 (EIN2)的c端，EIN2是乙烯响应的正调节因子[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．乙烯与受体结合使CTR1失活，导致EIN2去磷酸化[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．随后，EIN2的c端被切割并从内质网转移到细胞核[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]乙烯不敏感3/乙烯不敏感3- like (EIN3/EIL)依赖的转录和乙烯反应的激活[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

许多观赏植物采后品质在生产和销售过程中对乙烯敏感[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．在更年期植物中，花的发育受乙烯分泌和呼吸作用的控制，乙烯分泌和呼吸作用促进花的发育和衰老。具有更年期花衰老的植物物种对外源乙烯敏感，并可能在暴露后表现出加速花瓣或花枯萎。具有重要商业价值的更年期观赏植物包括康乃馨、兰花、gydF4y2Ba高凉菜属,风铃草属植物gydF4y2Ba和玫瑰[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．内源乙烯的产生可能是由于自然的花发育，但也可能是对压力和CO升高的反应gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba生产(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]或生长素产量增加[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．因此，观赏植物通常使用阻断乙烯信号的化学抑制剂来处理，以改善采后质量并延长花的寿命[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

降低花乙烯敏感性的遗传方法通过乙烯信号转导途径对信号进行了修饰。的gydF4y2Baetr1-1gydF4y2Ba乙烯受体突变体gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba乙烯结合失败[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．的表达gydF4y2Baetr1-1gydF4y2Ba在gydF4y2Ba佩妮gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba风铃草属植物carpaticagydF4y2Ba花(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba28gydF4y2Ba导致乙烯不敏感，延缓衰老和推迟花脱落。另外,转基因gydF4y2Ba佩妮gydF4y2Ba表达降低的水平gydF4y2BaPhEIN2gydF4y2Ba显示出延迟的花衰老[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．然而，迄今为止，成功延长花寿命的遗传方法已经产生了转基因植物[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

风铃草属植物gydF4y2Ba是一种重要的经济观赏植物，用作室内盆栽植物，园林植物，以及切花。的gydF4y2Ba风铃草属植物gydF4y2Ba属约有415种[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．在这里，我们描述了花的表达模式gydF4y2Ba人队gydF4y2Ba，gydF4y2BaCTRgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba面纱gydF4y2Ba三种观赏植物花发育和外源乙烯响应的基因gydF4y2Ba风铃草属植物gydF4y2Ba；gydF4y2Bac . portenschlagianagydF4y2Ba（gydF4y2BaCpgydF4y2Ba)，gydF4y2Bac . formanekianagydF4y2Ba（gydF4y2BaCfgydF4y2Ba),gydF4y2Bac .介质gydF4y2Ba（gydF4y2Ba厘米gydF4y2Ba)．乙烯不敏感植物的花对乙烯不敏感gydF4y2Bac .介质gydF4y2Ba与自然突变的发生相关的开放阅读框架gydF4y2BaEIL2gydF4y2Ba．这一发现为对乙烯不敏感的观赏植物提供了新的育种策略。gydF4y2Ba

风铃草属植物gydF4y2Ba对乙烯敏感gydF4y2Ba

了解乙烯敏感性的生理变异gydF4y2Ba风铃草属植物gydF4y2Ba物种，我们在收获后的环境中进行乙烯暴露测试。gydF4y2Bac . portenschlagianagydF4y2Ba，gydF4y2Bac . formanekianagydF4y2Ba而且gydF4y2Bac .介质gydF4y2Ba被选为观赏植物。gydF4y2BaCpgydF4y2Ba发现对浓度为0.05 μL·LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}．个体花的敏感性随着花龄的增加而增加。在gydF4y2BaCpgydF4y2Ba0.05 μL·L时，老花无法存活gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}乙烯处理48 h，幼花寿命维持在0.1 μL·LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}乙烯环境48小时以上。gydF4y2BaCpgydF4y2Ba高乙烯处理72 h后，不同花龄的花均无法存活。gydF4y2Ba1 a, dgydF4y2Ba)．乙烯敏感性较低gydF4y2BaCfgydF4y2Ba0.05 μL·L处理72 h后，26%的老花枯萎gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}乙烯，而不是旧的100%gydF4y2BaCpgydF4y2Ba花。同时增加乙烯浓度，导致4日龄大鼠完全衰老gydF4y2BaCfgydF4y2Ba花(图。gydF4y2Ba1 b, egydF4y2Ba)．就像在gydF4y2BaCpgydF4y2Ba,年轻的gydF4y2BaCfgydF4y2Ba花对乙烯的敏感程度低于老花，但在0.1 μL·L的乙烯胁迫下，93%的幼花萎蔫gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}乙烯(无花果。gydF4y2Ba1 egydF4y2Ba)．因此，两者都不是花gydF4y2BaCpgydF4y2Ba也不gydF4y2BaCfgydF4y2Ba能耐受0.5 μL·L 72 hgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}乙烯，不论花龄。相比之下,gydF4y2Ba厘米gydF4y2Ba花对乙烯无反应，在0.1 μL·L的浓度下，花的颜色和膨胀性均保持72 hgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}乙烯环境(图gydF4y2Ba1 c、fgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

乙烯信号转导关键基因的鉴定gydF4y2Ba

利用简并引物鉴定植物乙烯信号转导通路中的表达成分gydF4y2Ba风铃草属植物gydF4y2Ba花。这允许部分同系词的鉴定gydF4y2BaERS2gydF4y2Ba，gydF4y2BaCTR1gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba面纱。风铃草属植物gydF4y2Ba文本片段gydF4y2BaERS2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaCTR1gydF4y2Ba被翻译成蛋白质并根据它们的近亲命名gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba2gydF4y2Ba),而gydF4y2Ba风铃草属植物EIN3gydF4y2Ba/gydF4y2Ba面纱gydF4y2Ba同源物被命名gydF4y2BaEIL1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaEIL2gydF4y2Ba．蛋白质排列gydF4y2Ba风铃草属植物gydF4y2BaERS2在鉴定区域种间具有较高的相似性gydF4y2Ba风铃草属植物gydF4y2BaCTR1蛋白不同(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．在gydF4y2BaCfgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba厘米gydF4y2Ba，gydF4y2BaERS2gydF4y2Ba是由单一基因编码的gydF4y2BaCp ERS2gydF4y2Ba由两个包含不同内含子的位点表示，但产生相同的部分转录本(附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．测序结果显示部分基因间存在一定的多态性gydF4y2BaCTR1gydF4y2Ba记录。这些在RT-PCR反应中不能分离，可能代表同一位点上的不同等位基因。gydF4y2Ba

也gydF4y2Ba面纱gydF4y2Ba以花cDNA为模板，利用简并引物对转录本进行鉴定。测序发现了两个部分gydF4y2BaEIL1gydF4y2Ba同源染色体gydF4y2BaEIL1agydF4y2Ba而且gydF4y2BaEIL1bgydF4y2Ba在gydF4y2BaCpgydF4y2Ba只有一个部分gydF4y2BaEIL1gydF4y2Ba相同器官中gydF4y2BaCfgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba厘米gydF4y2Ba．在gydF4y2BaCfgydF4y2BacDNA池中含有一个额外的基因gydF4y2Ba面纱gydF4y2Ba同族体,gydF4y2BaEIL2gydF4y2Ba，然而，该转录本在gydF4y2Ba厘米gydF4y2Ba利用简并引物构建cDNA。作为gydF4y2BaCfgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba厘米gydF4y2Ba对乙烯有不同的敏感性(图;gydF4y2Ba1 e, fgydF4y2Ba)，引物设计用于分离和扩增两者gydF4y2BaEIL1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaEIL2gydF4y2Ba片段gydF4y2BaCfgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba厘米gydF4y2Ba基因组DNA。有趣的是,gydF4y2BaCmeil2gydF4y2Ba发现在gydF4y2BaEIL2gydF4y2BaORF导致相应蛋白质的帧移位(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．7个bp的缺失gydF4y2BaCmeil2gydF4y2Ba由独立的gDNA提取验证(数据未显示)。在核苷酸水平上gydF4y2BaCfEIL2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaCmeil2gydF4y2Ba共享96%的身份给对方和76%的身份给gydF4y2BaCfEIL1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaCmEIL1gydF4y2Ba分别(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．特异的PCR反应gydF4y2BaEIL2gydF4y2Ba使用gydF4y2BaCpgydF4y2BagDNA或cDNA不扩增产物。gydF4y2Ba

假定的表达式分析gydF4y2BaERS2gydF4y2Ba，gydF4y2BaCTR1gydF4y2Ba，gydF4y2BaEIL1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaEIL2gydF4y2Ba同系物gydF4y2Ba

研究乙烯信号转导通路的转录调控gydF4y2Ba风铃草属植物gydF4y2Ba，花组织在5个发育阶段(从花蕾到第4天完全开花，Fig。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．假定的文本gydF4y2BaERS2, CTR1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaEIL1gydF4y2Ba在花发育过程中呈组成型表达(图;gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．以确定是否gydF4y2Ba风铃ERS2, CTR1gydF4y2Ba或gydF4y2BaEIL1gydF4y2Ba对乙烯敏感，以0.025 μL·LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}或0.050 μL·LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}乙烯24小时。然而，两者都没有gydF4y2BaERS2gydF4y2Ba，gydF4y2BaCTR1gydF4y2Ba也不gydF4y2BaEIL1gydF4y2Ba转录本对乙烯处理有反应(图;gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

表达模式gydF4y2BaCfEIL2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaCmeil2gydF4y2Ba采用经典RT-PCR和RT-qPCR分析转录本。gydF4y2BaCfEIL2gydF4y2Ba转录物的表达模式和水平与对照组相似gydF4y2BaCfEIL1gydF4y2Ba0.025 μL·L对花发育有显著影响gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}0.050 μL·LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}乙烯24小时(图;gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．相比之下,gydF4y2BaCmeil2gydF4y2Ba在RT-PCR分析时可检测到微量。RT-qPCR定量分析显示，其含量一直很低gydF4y2BaCmeil2gydF4y2Ba通过花的发育，对乙烯没有转录反应。表达水平gydF4y2BaCfEIL2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaCmeil2gydF4y2Ba在幼花(第0天，第1天)中，差异超过100倍，而在老花(第4天)中，相同的比较仅产生40倍的变化。倍数变化的变化主要是由于gydF4y2BaCmeil2gydF4y2Ba转录水平。表达水平gydF4y2BaCfEIL2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaCmeil2gydF4y2Ba在对乙烯的反应中没有发现显著差异，因为在gydF4y2BaCfEIL2gydF4y2Ba表达水平(图;gydF4y2Ba6 bgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

的gydF4y2Baeil2gydF4y2Ba移码突变是独一无二的gydF4y2Bac .介质gydF4y2Ba

对假定的EIL2蛋白片段进行比对gydF4y2Ba风铃草属植物gydF4y2Ba与来自其他植物的EIL蛋白序列的研究证实了在其他EIL中发现的三个保守结构域的存在。这些结构域包括两个基本氨基酸结合结构域(BD I和BD II)和富脯氨酸区(PR)(图1)。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)．在蛋白质水平上，假定的EILs来自gydF4y2Ba风铃草属植物gydF4y2Ba与除Cmeil2外的其他EILs相比，彼此密切相关。Cmeil2在移码位置之前与其他EILs具有较高的同源性。移码后的序列仅在gydF4y2Ba厘米gydF4y2Ba并且与之前报道的EIL蛋白没有任何同源性。中的删除的省略gydF4y2BaCmeil2gydF4y2Ba阅读框产生了与其他EIL2蛋白完美对齐的蛋白质(数据未显示)。用其他植物的EILs进行系统发育分析表明，它们之间关系密切gydF4y2Ba风铃草属植物gydF4y2Ba并有明确的系统发育分离gydF4y2Ba风铃草属植物gydF4y2BaEIL1和EIL2蛋白(图;gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．系统发育分析中的一些分支点产生了较低的自举值，这是由于对齐片段的大小(200个氨基酸)和所有EILs之间的高度同一性(图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

描述的gydF4y2Baeil2gydF4y2Ba在gydF4y2Ba风铃草属植物gydF4y2Ba品种和栽培品种gydF4y2Ba

阐明…的自然发生gydF4y2Baeil2gydF4y2Ba在gydF4y2Ba风铃草属植物gydF4y2Ba的近亲gydF4y2Bac .介质gydF4y2Ba被确认为gydF4y2Bac . hofmanniigydF4y2Ba，gydF4y2Bac·阿尔gydF4y2Ba，gydF4y2Bac . alpestrisgydF4y2Ba而且gydF4y2BaEdraianthus graminifoliusgydF4y2Ba而且gydF4y2Bac . incurvagydF4y2Ba作为近亲gydF4y2Bac . formanekianagydF4y2Ba［gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．随着gydF4y2BaCmeil2gydF4y2Ba突变破坏了gydF4y2Ba国民gydF4y2Ba三、限制场地在gydF4y2BaEIL2gydF4y2Ba开发了一种简单的突变存在的筛选方法(图2)。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)．gydF4y2BaEIL2gydF4y2Ba酶切PCR产物gydF4y2Ba国民gydF4y2BaIII会产生两个或三个DNA片段，这取决于DNA的存在与否gydF4y2Baeil2gydF4y2Ba分别突变。通过gydF4y2Ba国民gydF4y2BaIII酶切经测序验证。有趣的是,gydF4y2Baeil2gydF4y2Ba被发现是具体的gydF4y2Ba厘米gydF4y2Ba并没有发生相关的事情gydF4y2Ba风铃草属植物gydF4y2Ba物种(图。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)．种内gydF4y2Ba国民gydF4y2Ba三、约束分析gydF4y2Ba厘米gydF4y2Ba品种证实的发生gydF4y2Baeil2gydF4y2Ba不论其品种来源如何。gydF4y2Ba9 bgydF4y2Ba)．由此报道了移码突变gydF4y2BaCmeil2gydF4y2Ba是特定的gydF4y2Ba厘米gydF4y2Ba并且在所有测试中都出现gydF4y2Ba厘米gydF4y2Ba无论是非驯化品种还是驯化品种。gydF4y2Ba

描述的gydF4y2Baeil2gydF4y2Ba在杂交中gydF4y2BaCf × CmgydF4y2Ba

作为gydF4y2Ba厘米gydF4y2Ba纯合子是为了gydF4y2Baeil2gydF4y2Ba而gydF4y2BaCfgydF4y2Ba纯合子是为了gydF4y2BaEIL2gydF4y2Ba的表现gydF4y2Baeil2gydF4y2Ba在杂合子植物中，通过乙烯暴露试验进行了评价gydF4y2Bac . formanekianagydF4y2Ba×gydF4y2Bac .介质gydF4y2Ba混合动力车。存在gydF4y2Baeil2gydF4y2Ba在gydF4y2BaCfgydF4y2Ba×gydF4y2Ba厘米gydF4y2Ba杂交(A-E)采用gydF4y2Ba国民gydF4y2Ba三筛分系统(图;gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)．5.0 μl·L高浓度乙烯处理幼花gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}花的反应分为无反应、有衰老迹象和完全衰老(表2)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．有趣的是，四个杂合子gydF4y2BaCfgydF4y2Ba×gydF4y2Ba厘米gydF4y2Ba杂交种表现出与杂交种难以区分的表型gydF4y2BaCfgydF4y2Ba87 - 100%的花对乙烯反应完全衰老。单一杂交(E)表现为中间表型，花衰老率为57%。相比之下，两个gydF4y2Ba厘米gydF4y2Ba5.0 μl·L处理72 h后，育种系花龄较长，0 ~ 5%的花龄下降gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}乙烯曝光。gydF4y2Ba

乙烯敏感性gydF4y2Ba风铃草属植物gydF4y2Ba

花卉对乙烯敏感是一个反复出现的问题，影响着观赏植物的育种者、生产者和消费者。[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．因此，生理和分子变异的特征具有重要的经济意义gydF4y2Ba风铃草属植物gydF4y2Ba物种是非常需要的。在本研究中，乙烯的敏感性gydF4y2Bac . portenschlagianagydF4y2Ba，gydF4y2Bac . formanekianagydF4y2Ba而且gydF4y2Bac .介质gydF4y2Ba都取决于生理和遗传因素。花对乙烯的敏感性与基因型有关gydF4y2BaCpgydF4y2Ba非常敏感，gydF4y2BaCfgydF4y2Ba有中等程度的敏感性gydF4y2Ba厘米gydF4y2Ba被发现对高浓度乙烯不敏感(图;gydF4y2Ba1gydF4y2Ba, 10)。花发育阶段的标记表明花龄与乙烯敏感性之间存在联系，在花龄较大的花中，衰老的花比例较高。只有古老的花朵gydF4y2BaCpgydF4y2Ba对0.05 μL·LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}乙烯，而所有的花gydF4y2BaCpgydF4y2Ba对0.1 μL·LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}乙烯。乙烯浓度增加一倍，衰老率无显著增加gydF4y2BaCfgydF4y2Ba花从26%到100%，也完全失去花的寿命在年轻gydF4y2BaCfgydF4y2Ba花(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．在相同的实验设置下，所有的花gydF4y2Ba厘米gydF4y2Ba对乙烯不敏感。花龄与乙烯敏感性之间也有相似的相关性gydF4y2Ba天竺葵属植物peltatumgydF4y2Ba［gydF4y2Ba33gydF4y2Ba］．这种与年龄相关的敏感性增加也可能与授粉有关，因为一些植物物种在授粉时诱导花朵衰老[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba36gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

而gydF4y2BaCfgydF4y2Ba花是乙烯敏感的浓度依赖的方式(图。gydF4y2Ba1 egydF4y2Ba、表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)即使乙烯浓度增加50倍，花的寿命也不会减少gydF4y2Ba厘米gydF4y2Ba．这说明乙烯不敏感gydF4y2Ba厘米gydF4y2Ba与乙烯浓度无关(图;gydF4y2Ba1 fgydF4y2Ba、表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

的本构表达式gydF4y2BaERS2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaCTR1gydF4y2Ba在花丛中gydF4y2Ba

的表达gydF4y2BaERS2gydF4y2Ba被发现是构成的gydF4y2Ba风铃草属植物gydF4y2Ba在花的发育和转录在年轻的花也没有反应低浓度的乙烯(图。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba)．在这两个gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba玫瑰乙烯受体由五个基因编码[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba39gydF4y2Ba]，其中一些在对外源乙烯的反应中表现出差异表达，并在花发育组织中受到调控[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba］．此外，外源应用乙烯不影响水平gydF4y2Ba石竹ERS2gydF4y2Ba在花瓣中，但该基因受花的发育调控[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba］．总的来说，在其他植物中获得的结果表明乙烯受体家族包括多个成员。基因组gydF4y2BaCpgydF4y2Ba被发现含有两个同源的gydF4y2Ba人队gydF4y2Ba受体中仅鉴定出一个基因/转录本gydF4y2BaCfgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba厘米gydF4y2Ba．由于gDNA也是克隆反应的模板，花组织中的mRNA水平不应是决定因素。因此这三个gydF4y2Ba风铃草属植物gydF4y2Ba由于引物的特异性，这些物种可能编码额外的乙烯受体。gydF4y2Ba

同样的gydF4y2BaERS2gydF4y2Ba,所有gydF4y2Ba风铃草属植物CTR1gydF4y2Ba转录本在花的发育过程中呈组成型表达，对外源乙烯的施用没有反应(图2)。gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba5度gydF4y2Ba)．在玫瑰中也观察到同样的模式gydF4y2BaRhCTR1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaRhCTR2gydF4y2Ba在整个花的发育过程中构成性地表达;然而这两个gydF4y2BaRhCTRgydF4y2Ba转录水平增加对乙烯的反应[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba］．在某些植物物种中gydF4y2BaCTR1gydF4y2Ba是非常复杂的。香蕉和西红柿gydF4y2BaCTR1gydF4y2Ba存在于15外显子14内含子结构中，分别产生11.5和12 kb的完整orf [gydF4y2Ba44gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45gydF4y2Ba］．即使在PCR反应中延长了很长时间，我们也无法识别的全长序列gydF4y2Ba风铃草属植物CTR1gydF4y2Ba．然而，小多态性检测部分gydF4y2BaCpgydF4y2Ba，gydF4y2BaCfgydF4y2Ba而且gydF4y2BaCm CTR1gydF4y2Ba转录本表明，这些植株可能是杂合子gydF4y2BaCTR1gydF4y2Ba轨迹还是那个附加的副本gydF4y2BaCTR1gydF4y2Ba的存在。二和四gydF4y2BaCTRgydF4y2Ba已分别在玫瑰和番茄中鉴定出同源物[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba，gydF4y2Ba46gydF4y2Ba］．因此，一个额外的gydF4y2BaCTR1gydF4y2Ba在gydF4y2Ba风铃草属植物gydF4y2Ba并非不可能。gydF4y2Ba

恶性肿瘤的发生和表达gydF4y2Ba风铃草属植物gydF4y2Ba

的gydF4y2BaEIN3gydF4y2Ba/gydF4y2Ba面纱gydF4y2Ba介导乙烯生理反应初始化的家族编码转录因子[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba47gydF4y2Ba］．在三个gydF4y2Ba风铃草属植物gydF4y2Ba在这里调查的物种大约600 bp的花表达gydF4y2Ba面纱gydF4y2Ba同源物被鉴定出来，gydF4y2BaEIL1gydF4y2Ba．所有gydF4y2BaEIL1gydF4y2Ba转录本在花的发育过程中持续表达，对乙烯没有反应(图2)。gydF4y2Ba4 dgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba5 dgydF4y2Ba)．在小花gydF4y2BaCpgydF4y2Ba的两个同源词gydF4y2BaEIL1gydF4y2Ba经测序鉴定为gydF4y2BaEIL1agydF4y2Ba而且gydF4y2BaEIL1bgydF4y2Ba，但在进行表达分析时，两者无法分离。相比之下，两个大花gydF4y2Ba风铃草属植物gydF4y2Ba（gydF4y2BaCfgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba厘米gydF4y2Ba)均包含的ORFgydF4y2BaEIL2gydF4y2Ba，一种基因没有检测到gydF4y2BaCp。CfEIL2gydF4y2Ba基因表达就像gydF4y2BaCfEIL1gydF4y2Ba对外源乙烯无反应(图。gydF4y2Ba6 c, dgydF4y2Ba)．在gydF4y2Ba厘米gydF4y2Ba，gydF4y2Baeil2gydF4y2Ba由于ORF中7 bp的缺失而未表达(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．部分Cmeil2蛋白的翻译分析表明，7 bp的缺失会在原本应该是脯氨酸丰富结构域之前引入移码gydF4y2BaCmeil2gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)．在核苷酸水平上gydF4y2BaCfEIL2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaCmeil2gydF4y2Ba共享96%的身份(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，表明它们是近亲。之间的紧密同源gydF4y2BaCfEIL2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaCmeil2gydF4y2Ba得到系统发育分析的支持(图;gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．假定的翻译gydF4y2BaCmeil2gydF4y2Ba说明移码突变在gydF4y2Baeil2gydF4y2Ba破坏了EIL2中脯氨酸丰富区前面假定的主要DNA结合域，同时在EIL2蛋白序列的下游引入了一个50个氨基酸的终止密码子。因此，与AtEIN3相比，如果翻译，蛋白质将被截断到大约40%的预期大小(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)．EIL DNA结合域的位置和功能已在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2BaEIL3和黄瓜中的EIN3 [gydF4y2Ba48gydF4y2Ba，gydF4y2Ba49gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

无论是发起人gydF4y2BaCfEIL2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaCmeil2gydF4y2Ba然而，同样的特异性仍有待证明gydF4y2BaCmeil2gydF4y2Ba在RT-PCR和RT-qPCR中观察到转录物的痕迹，可能在花中表达过。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．最后,额外的gydF4y2Ba面纱gydF4y2Ba同源物可能存在于gydF4y2Ba风铃草属植物gydF4y2Ba中已鉴定出4-6个同源物gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba、番茄及烟草[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba50gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba52gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

以前的研究gydF4y2BaEIN3gydF4y2Ba/gydF4y2Ba面纱gydF4y2Ba同系物已在gydF4y2Ba芍药属gydF4y2Ba，但在gydF4y2Ba石竹DcEIL1/2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaDcEIL3gydF4y2Ba乙烯处理后，花瓣和花柱的转录本迅速增加，然后逐渐下降[gydF4y2Ba53gydF4y2Ba，gydF4y2Ba54gydF4y2Ba］．的本构式gydF4y2BaERS2gydF4y2Ba，gydF4y2BaCTR1gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba面纱gydF4y2Ba在乙烯信号转导通路中gydF4y2Ba风铃草属植物gydF4y2Ba说明在乙烯的存在下，花能够产生快速的生理反应。这与之前的结果有很好的相关性gydF4y2Ba风铃草属植物gydF4y2Ba被描述为乙烯敏感物种[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．此外，对乙烯暴露缺乏转录反应可能是蛋白质水平调控步骤的组合[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba，gydF4y2Ba56gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

的gydF4y2BaCmeil2gydF4y2Ba表现型是作为隐性性状遗传的gydF4y2Ba

在本研究中gydF4y2Baeil2gydF4y2Ba移码突变不仅在丹麦语中被驯化gydF4y2Ba厘米gydF4y2Ba但在非驯化的标本中也是如此gydF4y2Ba厘米gydF4y2Ba与之密切相关gydF4y2Bac .介质gydF4y2Bavar。gydF4y2BacalycanthemagydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)．这表明gydF4y2Baeil2gydF4y2Ba移码一定发生在更早的祖先gydF4y2Ba厘米gydF4y2Ba．没有什么密切相关的gydF4y2Ba风铃草属植物gydF4y2Ba物种gydF4y2Bac·阿尔gydF4y2Ba，gydF4y2Bac . alpestrisgydF4y2Ba，gydF4y2Bac . hofmanniigydF4y2Ba或gydF4y2Ba大肠graminifoliusgydF4y2Ba包含gydF4y2Baeil2gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)．在杂交中gydF4y2BaCfgydF4y2Ba×gydF4y2Ba厘米gydF4y2Ba,杂合子gydF4y2Baeil2gydF4y2Ba结果与观察到的乙烯反应非常相似gydF4y2BaCfgydF4y2Ba5个杂交种中只有1个表现出乙烯不敏感性增加的中间表型gydF4y2BaCfgydF4y2Ba(表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．这表明gydF4y2Baeil2gydF4y2Ba由于野生型的存在，表型得以恢复gydF4y2BaEIL2gydF4y2Ba而且是作为隐性性状遗传的。纯合子gydF4y2Baeil2gydF4y2Ba在gydF4y2BaCfgydF4y2Ba不能通过十字路口同时获得男性和女性的部分gydF4y2BaCfgydF4y2Ba×gydF4y2Ba厘米gydF4y2Ba杂种不育。这里得到的结果是第一次描述了an的影响gydF4y2Baein3gydF4y2Ba/gydF4y2Ba面纱gydF4y2Ba花的变异。此外，没有报告存在的方法gydF4y2BaEIN3gydF4y2Ba/gydF4y2Ba面纱gydF4y2Ba通过基因修饰，基因被敲除或沉默。因此,gydF4y2Baeil2gydF4y2Ba表型描述于gydF4y2Ba厘米gydF4y2Ba不能与其他植物花的相关表型直接比较。在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba，最接近的同系物gydF4y2Ba风铃草属植物EIL2gydF4y2Ba是gydF4y2BaEIN3gydF4y2Ba（gydF4y2BaAtEIN3gydF4y2Ba)．在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba，gydF4y2Baein3gydF4y2Ba突变体具有很好的特征，它们也是以隐性方式遗传的[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．还有表型gydF4y2Baein3gydF4y2Ba或gydF4y2Ba面纱gydF4y2Ba突变体中gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba仅在幼苗或成熟的莲座中描述。据我们所知，乙烯敏感性和花的发育还没有被描述gydF4y2Ba拟南芥ein3gydF4y2Ba或gydF4y2Ba面纱gydF4y2Ba突变体。然而，支持我们的结果的数据来自番茄的表达式gydF4y2BaLeEIL1gydF4y2Ba，gydF4y2BaLeEIL2gydF4y2Ba或gydF4y2BaLeEIL3gydF4y2Ba反义转录导致乙烯不敏感芽[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba］．总的来说，这项研究是第一个将花对乙烯不敏感与空气污染联系起来的研究gydF4y2Ba静脉gydF4y2Ba/gydF4y2Ba面纱gydF4y2Ba突变表型。gydF4y2Ba

未来实现乙烯不敏感植物的方法gydF4y2Ba

以前的研究表明，个体可能有特定的功能gydF4y2Ba面纱gydF4y2Bas.因此，为了改变花对乙烯的生理反应，必须确定每种植物中正确的同源物。在本研究的框架下gydF4y2BaCmeil2gydF4y2Ba移码突变可能被转移到gydF4y2BaEIL2gydF4y2Ba通过常规杂交或缺失可通过亲缘物种间的广泛杂交引入亲缘物种的同源体，必要时可借助胚胎抢救技术[gydF4y2Ba57gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

移码gydF4y2BaCmeil2gydF4y2Ba它位于一个高度保守的区域，因此它具有分子育种乙烯不敏感植物的潜力。然而，完整的基因组序列的鉴定gydF4y2Ba厘米gydF4y2Ba而且gydF4y2BaCfgydF4y2Ba以及翻译基因产物的完整序列gydF4y2BaCfgydF4y2Ba都是这个过程中必不可少的步骤。最终，我们提出了7个bp的缺失gydF4y2BaCmeil2gydF4y2Ba可用于使其他植物对乙烯不敏感。这可能是可行的，通过利用ZNF, TALENs [gydF4y2Ba58gydF4y2Ba]或CRISPR/Cas9 [gydF4y2Ba59gydF4y2Ba］．因此，乙烯不敏感可能转移gydF4y2Ba厘米gydF4y2Ba对于其他重要的更年期观赏植物，例如玫瑰，gydF4y2Ba佩妮gydF4y2Ba，康乃馨，甚至是可食用的气候变化较大的作物，如西兰花和番茄。gydF4y2Ba

我们描述了三者之间的生理和分子反应gydF4y2Ba风铃草属植物gydF4y2Ba对外源乙烯的种类。乙烯信号转导途径中的关键基因gydF4y2Ba人队gydF4y2Ba，gydF4y2BaCTRgydF4y2Ba而且gydF4y2BaEIL1gydF4y2Ba被发现在gydF4y2Ba风铃草属植物gydF4y2Ba对外源性乙烯无反应。然而,gydF4y2BaEIL2gydF4y2Ba是专门针对大型开花物种的吗gydF4y2Bac . formanekianagydF4y2Ba而且gydF4y2Bac .介质gydF4y2Ba，却没有表达出来gydF4y2Ba厘米gydF4y2Ba由于编码区的7个核苷酸移码gydF4y2BaCmeil2gydF4y2Ba．在这里发现的自然突变gydF4y2BaCmeil2gydF4y2Ba与观察到的乙烯不敏感性相关。这一发现为未来乙烯不敏感植物的育种策略提供了很大的潜力。gydF4y2Ba

植物材料和生长条件gydF4y2Ba

风铃草属植物portenschlagianagydF4y2Ba舒尔特“蓝色GET MEE®”(gydF4y2BaCpgydF4y2Ba)，gydF4y2Ba风铃草属植物formanekianagydF4y2BaDegen & Doefler ' Blue MARY MEE®' (gydF4y2BaCfgydF4y2Ba)，gydF4y2Ba风铃草属植物中gydF4y2BaL.“甜MEE®”(gydF4y2Ba厘米gydF4y2Ba)，gydF4y2Bac .介质gydF4y2Ba育种2系和gydF4y2Bac .介质gydF4y2Bavar。gydF4y2BacalycanthemagydF4y2Ba来自育苗Gartneriet PKM A/S(欧登塞，丹麦)，处于花蕾发育阶段。混合动力汽车的gydF4y2Bac . formanekianagydF4y2Ba×gydF4y2Bac .介质gydF4y2Ba(A-E)经胚珠培养产生[gydF4y2Ba57gydF4y2Ba]或在高德纳(garterneriet PKM A/S)。到达后，植物被转移到白天18°C /夜晚15°C的温室，自然光周期为16小时。种子的非驯化gydF4y2Bac .介质gydF4y2Ba由Alpine Staudengärtnerei (Leisning, Germany)提供。的种子gydF4y2Bac·阿尔gydF4y2Ba，gydF4y2Bac . alpestrisgydF4y2Ba，gydF4y2Bac . hofmanniigydF4y2Ba，gydF4y2Bac . incurvagydF4y2Ba而且gydF4y2BaEdraianthus graminifoliusgydF4y2Ba均来自法国Aigues-Vives的B & T World Seeds公司。gydF4y2Ba

推定的鉴定gydF4y2BaERS2gydF4y2Ba，gydF4y2BaCTR1gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba面纱gydF4y2Ba基因gydF4y2Ba

基于NCBI GenBank [gydF4y2Ba60gydF4y2Ba从gydF4y2Ba风铃草属植物carpaticagydF4y2Ba(GenBank: AF413669)设计内含子跨引物扩增部分片段gydF4y2BaERS2。ERS2gydF4y2BagDNA PCR检测出两个gydF4y2BaERS2gydF4y2Ba产品在gydF4y2BaCpgydF4y2Ba和一个gydF4y2BaERS2gydF4y2Ba基因组片段gydF4y2BaCfgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba厘米gydF4y2Ba．在gydF4y2BaCpgydF4y2Ba，二gydF4y2BaCpERS2gydF4y2Ba产物来自两个内含子大小不同但转录本编码非常相似的基因(gydF4y2BaCpgydF4y2BaERS2agydF4y2Ba而且gydF4y2BaCpgydF4y2BaERS2bgydF4y2Ba，附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．部分gydF4y2BaCTR1gydF4y2Ba是用简并引物对准其中的保守区域产生的gydF4y2Ba荔枝，茄茄，拟南芥gydF4y2Ba而且gydF4y2BaRosa hybrida CTR1gydF4y2Ba序列(GenBank:JF430422, GenBank:AF096250, GenBank:NM_180429, GenBank:AY032953)。序列分析显示gydF4y2BaCTR1gydF4y2Ba的gydF4y2BaCpgydF4y2Ba，gydF4y2BaCfgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba厘米gydF4y2Ba．这可能表明不止一个拷贝gydF4y2BaCTR1gydF4y2Ba存在于gydF4y2Ba风铃草属植物gydF4y2Ba．部分gydF4y2Ba面纱gydF4y2Ba通过简并引物克隆的基因gydF4y2Ba马吕斯gydF4y2BaxgydF4y2Ba有明显gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba番茄龙葵EILgydF4y2Ba序列(GenBank:GU732486和GenBank:NM_001247617)。gydF4y2Ba风铃草属植物的行为gydF4y2Ba利用简并引物进行扩增、测序，并从该序列设计特异性引物进行表达分析。引物和PCR产物尺寸见附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

基因组DNAgydF4y2BaCp、Cf、gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba厘米gydF4y2Ba使用DNeasy植物迷你试剂盒(Qiagen)按照制造商的建议使用300毫克植物材料从花朵中分离出来gydF4y2Ba．gydF4y2BaPCR反应使用100-250 ng gDNA, 2% (v/v) DMSO和聚合酶LaTaq (Takara Bio Inc.)作为制造商推荐。人们的反应随节目而来;4分钟94°C, 33-35个循环[30秒94°C, 1分钟60°C, 1分钟72°C]和72°C在MyCycler (Biorad)中最后7分钟延伸步骤。按照制造商的建议，通过TOPO TA Cloning®kit (Life Technologies Corp, Invitrogen)克隆pcr产品。质粒用QIAprep Spin Miniprep kit (Qiagen)纯化，用Eurofins MWG Operon测序。gydF4y2BaEIL2gydF4y2BaPCR产物用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)进行纯化，并进行酶切分析gydF4y2Ba国民gydF4y2BaIII按照供应商推荐(New England Biolabs)进行。gydF4y2Ba

乙烯暴露实验gydF4y2Ba

为了监测花的发育，每个花蕾在花开放的前一天被标记。这一阶段被称为第0天。在接下来的几天里，新开的花(第1天)和4天的花(第4天)被鉴定、标记并用于后续实验。这使得在整个乙烯暴露实验中可以同时监测两个形态不同的阶段。乙烯暴露在收获后生长条件下的玻璃罐中的气候室中进行;20°C昼/18°C夜，光周期16小时，10-12 μmol mgydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}·年代gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}由冷白色荧光灯管(Philips Master TL-D-36 W/830)提供。每个玻璃罐的容积为128升，里面有三株植物。花标记结果是每个玻璃罐中有三株植物，每个发育阶段(第1天和第4天)总共有15个花标记gydF4y2Ba厘米gydF4y2Ba其中8-13个标记的花在生长期使用。乙烯浓度为0 μL·LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}， 0.05 μl·lgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}或0.1 μL·LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}通过将气态乙烯(Mikrolab Aarhus A/S)注入密封的玻璃罐中获得。对花进行监测，水箱通风，每24小时重新注入乙烯。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba衰老花被定义为花冠扭曲或闭合或枯萎的花。对于表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，乙烯敏感性gydF4y2BaCfgydF4y2Ba×gydF4y2Ba厘米gydF4y2Ba杂交花可分为三类;无症状、衰老迹象(花冠部分萎蔫、变色)和完全衰老(花冠完全萎蔫、变色)。后一种实验在5 μl·L的玻璃罐中进行gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}乙烯72小时。gydF4y2BaCpgydF4y2Ba而且gydF4y2BaCfgydF4y2Ba实验重复了两次gydF4y2Ba厘米gydF4y2Ba试验设3个重复。gydF4y2Ba

在花蕾、第0天(开花前1天)、第1天、第2天和第4天进行基因表达分析(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．0.025 μL·L的低乙烯浓度对植物的胁迫作用gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}0.050 μL·LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}每个罐中有三株植物，上面有标记为1天开花的花。每个罐子里的花都被放在一起，在液氮中收获，研磨并用于RNA提取。每个试验分为3个重复。gydF4y2Ba

RNA提取，cDNA合成及表达分析gydF4y2Ba

RNA提取使用RNeasy Plant Mini kit (Qiagen)，对制造商的方案进行如下更改:细胞裂解使用RLT缓冲液与0.01% β-巯基乙醇(v/v)在56℃下进行1分钟。RNA产量和纯度(A260/A280比值> 2.0)由Nanodrop测定gydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba1000分光光度计(赛默飞世尔科学公司)。RNA完整性在1.2%琼脂糖凝胶上进行评估。纯化的RNA储存在-80°C。RNA用放大级DNase I (Invitrogen)处理，cDNA合成使用iScript cDNA synthesis kit (Biorad)按照推荐进行。在20 μl反应中使用0.8 μg RNA。在非RT样本中，cDNA中没有DNA污染。在MyCycler (Biorad)中使用5倍稀释的cDNA和ExTaq作为推荐的聚合酶(Takara Bio Inc.)进行表达分析。在表达分析中使用的引物和基因特异性反应设置在附加文件中提出gydF4y2Ba4gydF4y2Ba．rt - pcr程序;4分钟94℃，25-32个循环[30秒94℃，1分钟55℃，1分钟72℃]和7分钟72℃。RT-qPCR反应按照供应商的说明在ICycler仪器(Bio-Rad)上使用iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad)进行[gydF4y2Ba61gydF4y2Ba使用程序;95°C 10分钟，50个循环[95°C 30秒，57.5°C 1分钟，72°C 1分钟]。为了评价qPCR的效率，用cDNA序列稀释法生成标准曲线。这导致了RgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba的值为0.998和0.994gydF4y2Ba行为gydF4y2Ba而且gydF4y2BaEIL2gydF4y2Ba引物集，分别。阈值周期(Ct)，(定义为信号超过基线标准差的十倍的周期)，为gydF4y2BaCfEIL2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaCmeil2gydF4y2Ba被标准化到相应的gydF4y2Ba肌动蛋白gydF4y2BaCt(ΔCt)。目的基因的相对定量gydF4y2BaCfEIL2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaCmeil2gydF4y2Ba差异为2^(−ΔΔCt)。值基于三个复制。gydF4y2Ba

生物信息学与统计学gydF4y2Ba

序列鉴定和分析使用CLC Sequence viewer (CLC bio)， BLAST和Clustal Ω [gydF4y2Ba62gydF4y2Ba］．系统发育分析使用MEGA version 6.06进行[gydF4y2Ba63gydF4y2Ba］．在SigmaPlot v. 13中使用Holm-Sidak方法进行单向方差分析，进行统计分析。gydF4y2Ba

1-MCP:gydF4y2Ba

1-methylcyclopropenegydF4y2Ba

CfgydF4y2Ba：gydF4y2Ba

风铃草属植物formanekianagydF4y2Ba

厘米gydF4y2Ba：gydF4y2Ba

风铃草属植物中gydF4y2Ba

CpgydF4y2Ba：gydF4y2Ba

风铃草属植物portenschlagianagydF4y2Ba

CTR:gydF4y2Ba

本构三重响应gydF4y2Ba

面纱:gydF4y2Ba

乙烯insensitive3-likegydF4y2Ba

人:gydF4y2Ba

乙烯响应传感器gydF4y2Ba

RT-qPCR:gydF4y2Ba

定量逆转录PCRgydF4y2Ba

Gartneriet PKM A/S因提供植物材料而受到广泛认可，Christian Hald Madsen因富有成效的讨论而受到感谢。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

这项研究由丹麦高等教育和科学部资助。gydF4y2Ba

数据和材料的可用性gydF4y2Ba

支持本研究发现的数据包含在手稿或补充文件中。植物材料(杂种除外)可从PKM A/S、Alpine Staudengärtnerei或Aigues-Vives购买，详见方法。这里描述的序列的Genbank登录号是:CpERS2a (KX058423)， CpERS2b (KM067692.1)， CfERS2 (KM067690.1)， CmERS2 (KM067691.1)， CpCTR1 (KM067689.1)， CfCTR1 (KM067687.1)， CmCTR1 (KM067688.1)， CpEIL1a (KX058425)， CpEIL1b (KX058426)， CfEIL1 (KX058427)， CfEIL2 (KX058428)， CmEIL1 (KX058429)， CmEIL2 (KX058430)和Actin (KX058424)。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者已经提交了一份专利申请，涵盖了这项工作的部分内容。申请的专利归哥本哈根大学和加特纳利特PKM A/S所有。gydF4y2Ba

发表同意书gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

道德gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 哥本哈根大学理学院植物与环境科学系，Højbakkegård Allé 9- 13,2630，塔斯特鲁普，丹麦gydF4y2Ba

   Line Jensen, Josefine Nymark Hegelund, Andreas Olsen, Henrik Lütken & Renate MüllergydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaJosefine Nymark HegelundgydF4y2Ba．gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文根据创作共用属性4.0国际许可协议(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba)，允许在任何媒介上不受限制地使用、分发和复制，前提是您对原作者和来源给予适当的赞扬，提供到创作共用许可证的链接，并注明是否进行了更改。创作共用公共领域奉献弃权书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)除另有说明外，适用于本条所提供的资料。gydF4y2Ba

转载及权限gydF4y2Ba