一种来自豌豆的新型脂质转移蛋白gydF4y2BaPisum一gydF4y2Ba:分离、重组表达、溶液结构、抗真菌活性、脂质结合和致敏性gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

植物脂质转移蛋白(LTPs)是一类普遍存在的小(7 - 9kda)阳离子蛋白，具有结合和运输脂质的能力，并参与各种生理过程，包括对植物病原的防御。它们也形成了临床最相关的植物过敏原类别之一。迄今为止，ltp的脂质结合和ige结合特性之间的相关性尚不清楚。的豌豆gydF4y2BaPisum一gydF4y2Ba是广泛食用的作物和豆科植物中重要的致敏物种。这项工作旨在从豌豆种子中分离出一种新的LTP，并对其结构、功能和致敏性进行表征。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

在豌豆中发现了三种新的脂质转移蛋白，命名为Ps-LTP1-3gydF4y2BaPisum一gydF4y2Ba，测定其cDNA序列，并测定3种蛋白在豌豆不同器官的mRNA表达量。Ps-LTP1为首次从豌豆种子中分离得到，并测定了其完整氨基酸序列。该蛋白具有抗真菌活性，是一种膜活性化合物，可引起人造脂质体的泄漏。蛋白质结合各种脂类，包括生物活性茉莉酸。空间结构重组均匀gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC,gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba用异核NMR对n标记的Ps-LTP1进行了解析。在溶液中，该非配体蛋白是两个构象体(相对居群约85:15)的混合物，它们通过交换过程相互连接，特征时间约为100 ms。主要构象的疏水残基形成一个较大的内部隧道状脂结合腔(范德华体积可达~1000 ÅgydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba)．小的构象体可能与内部腔部分塌陷的蛋白质相对应。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

首次显示了非配体植物脂质转移蛋白在溶液中的构象异质性。热变性和模拟胃肠道消化试验表明，Ps-LTP1对食物过敏原具有较高的热和消化蛋白水解抗性。报道的结构和免疫学结果似乎描述了在ltp致敏患者中，Ps-LTP1是潜在的交叉反应过敏原，主要是Pru p3gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba的人。与致敏ltp相似，Ps-LTP1潜在的ige结合表位位于建议进入内腔的入口附近，可能参与脂质结合。gydF4y2Ba

植物非特异性脂质转移蛋白(LTPs)是一个普遍存在的小阳离子蛋白家族，其分子质量分别为~9 ~ 10kda (LTP1)和~ 7kda (LTP2)。这些蛋白质在植物中的生物学作用仍有待讨论，尽管有人提出它们参与被子植物受精、花粉粘附、体细胞胚胎发生、脂质代谢、角质层的形成、细胞死亡、植物信号传导以及保护植物免受生物和非生物胁迫[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．一些脂质转移蛋白，例如水稻中的OsLTPL36，被证明是种子发育所必需的[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．许多ltp具有抗菌和抗病毒的特性，以及对肿瘤细胞的抗增殖活性gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba［gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．近年来，从诺丽中分离到具有抗接种活性的脂质转移蛋白。gydF4y2BaMorinda citrifoliagydF4y2Bal .)种子gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

LTP基因存在于从最原始的苔类、苔藓到气管植物的所有陆生植物中，但在藻类等低等植物中未发现。在这方面，今天的研究表明，植物在从水向陆地过渡后，即大约4.5亿年前，ltp已经升高[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．这些蛋白质是由大型基因家族编码的，据信，在进化过程中执行不同功能的多个LTP亚型基因是由祖先基因的一系列连续复制和随后的突变引入的。异构体功能的多样化是植物防御系统的有力工具。例如，众所周知，取代成熟蛋白质序列中的单一氨基酸残基会产生截然不同的抗真菌特征[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

许多ltp1表现为重要的食物花粉和乳胶过敏原负责过敏反应。新型植物LTPs的结构、功能和免疫学研究深化了我们对其抗菌作用、脂质结合活性和致敏性的分子机制的认识，并为LTPs在医学和农业中的实际应用打开了大门。值得强调的是，在天然和重组植物ltp的基础上，可以开发现代的过敏原特异性免疫治疗诊断试剂盒和有效的疫苗，并作为降低免疫反应性和预防过敏反应的手段。gydF4y2Ba

的gydF4y2Ba豆科植物的gydF4y2Ba或gydF4y2Ba蝶形花gydF4y2Ba它是被子植物的第三大科，仅次于豆科、豆科或豌豆科gydF4y2Ba兰科gydF4y2Ba(兰花)和gydF4y2Ba菊科gydF4y2Ba(雏菊，向日葵)，然后第二个gydF4y2Ba禾本科gydF4y2Ba就农业和经济重要性而言。今天，豆科植物由于其高营养价值和对栽培条件的朴素性而广泛分布在世界各地，是一种日益珍贵的食物来源。然而，豆类往往会引起不同的过敏反应。例如，在5岁以下的西班牙儿童中，对豌豆、豆类、扁豆和鹰嘴豆等豆类的过敏在食物过敏发生频率中排名第五[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．豆类过敏在亚洲国家也很普遍，特别是在印度，鹰嘴豆是主要的食物过敏原[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．到目前为止，几个LTP1过敏原被分离gydF4y2Ba蝶形花科gydF4y2Ba:花生中的Ara h 9, Ara h 16, Ara h 17gydF4y2Ba落花生hypogaeagydF4y2Ba［gydF4y2Ba12gydF4y2Ba， Len c 3来自扁豆gydF4y2Ba镜头culinarisgydF4y2Ba［gydF4y2Ba13gydF4y2Ba和从豆子中提取的Pha v 3gydF4y2Ba菜豆gydF4y2Ba［gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．到目前为止，已从豌豆中分离出两种过敏原，并在WHO/IUIS过敏原命名小组委员会数据库(gydF4y2Bahttp://www.allergen.org/gydF4y2Ba): Pis s 1 (Vicilin, 47 kDa)和Pis s 2 (convilin, 97 kDa)。本文报道了从花园豌豆中分离出的一种新型LTP的分离、重组表达、溶液结构、抗真菌活性、脂质结合和致敏特性gydF4y2BaPisum一gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

一种新型豌豆LTP的分离与鉴定gydF4y2Ba

从豌豆中分离到一种新的脂质转移蛋白gydF4y2BaPisum一gydF4y2Ba种子。由于LTPs的高稳定性，对粗提取物进行热处理，以沉淀出高分子质量的蛋白质。用连续超滤、阳离子交换色谱和反相高效液相色谱法纯化蛋白质gydF4y2Ba1gydF4y2BaA, B)。MALDI-TOF-MS分析得到的部分显示存在一种分子质量为9400.48 Da的蛋白质gydF4y2Ba2gydF4y2BaA).纯化蛋白n端氨基酸微测序，命名为Ps-LTP1，显示序列为ALSgydF4y2BaХgydF4y2BaGTVSADMAPgydF4y2BaХgydF4y2BaVTYLQA-与LTP1亚家族具有显著的同源性，并且它们的CD光谱相似gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．Ps-LTP1在DTT存在下的还原和随后与碘乙酰胺的烷基化导致分子质量增加464 DagydF4y2Ba2gydF4y2BaB).未经事先还原的提纯蛋白的烷基化没有导致任何分子质量的变化(数据未显示)。这些结果表明，Ps-LTP1含有8个半胱氨酸残基，形成4个二硫键。Ps-LTP1的产量达到每100克豌豆种子1毫克。gydF4y2Ba

RT-PCR克隆和测序豌豆LTP前体cdnagydF4y2Ba

通过RACE策略，确定了两个全长cDNA (Ps-LTP1-2)和一个部分cDNA (Ps-LTP3)编码的新豌豆ltp1前体。三个核苷酸序列[GenBank登录号:KJ569141、KJ569142和KJ569143，分别用于Ps-LTP1-3]包括357-360 bp的开放阅读框，编码119-120个氨基酸残基(a.a.a)长的蛋白质前体。在SignalP_v4.1 (gydF4y2Bahttp://www.cbs.dtu.dkgydF4y2Ba) web服务器，并显示了信号序列与成熟蛋白之间最可能的边界。三种新型豌豆ltp的前体包括24-25 a.a信号肽和95 a.a成熟蛋白，每个都包含8个保守半胱氨酸残基(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

实时RT-PCR定量分析组织特异性基因表达gydF4y2Ba

利用实时荧光定量pcr技术研究了豌豆不同器官Ps-LTP1-3亚型的基因表达谱。熔融曲线分析证实PCR扩增Ps-LTP1-3和β-微管蛋白片段的引物对具有特异性。每个引物对的扩增率根据稀释行线性回归斜率(Pearson相关系数RgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba= 0.95 - -0.99)。相对表达式软件工具(RESTgydF4y2Ba^©gydF4y2Ba)对real-time RT-PCR实验的相对表达结果进行分组比较和统计分析。REST-MCS是从几个软件版本中挑选出来的，因为它允许比较最多6个感兴趣的条件和一个参考条件，每组最多10个样本。计算不同组织样品中每种基因的mRNA水平，并将其与对照豌豆干种子在萌发前的表达量进行比较(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

根据实验数据，Ps-LTP1基因在干燥种子中表现出较高的表达量，但在萌发后急剧下降。显然，这种蛋白质在种子发芽之前就完成了它的生物学作用。相比之下，在发芽后，Ps-LTP2和Ps-LTP3基因的表达量急剧增加，并在成熟豌豆植株的所有检测器官中保持不变。gydF4y2Ba

Ps-LTP1的分子特征gydF4y2Ba

计算得到的成熟氧化Ps-LTP1的分子质量(9548.08 Da)与蛋白质相差147 DagydF4y2Bam / zgydF4y2BaMALDI-TOF-MS测定结果为(9401.48 Da)，与c端苯丙氨酸残留的缺失相吻合。为了证实这一建议，对减少的Ps-LTP1进行胰蛋白酶消化。蛋白胰蛋白酶解得到14个肽片段gydF4y2Ba4gydF4y2BaA).利用ExPASy在线服务器上的PeptideMass工具计算片段的分子质量(gydF4y2Bahttp://web.expasy.orggydF4y2Ba)．计算值与实测值吻合较好gydF4y2Bam / zgydF4y2BaMALDI-TOF-MS(附加文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．未检出含有苯丙氨酸残基的c端片段。获得的片段的结构通过MALDI-LIFT-TOF/TOF-MS微测序进行了确认gydF4y2Ba4gydF4y2BaB).由此确定了Ps-LTP1的完整氨基酸序列。Ps-LTP1的一级结构对应于不含c端苯丙氨酸残基的成熟蛋白的翻译核苷酸序列[UniProt Knowledgebase登录号:C0HJR7]。由于所有纯化阶段都是在蛋白酶抑制剂存在的低温条件下进行的，因此可以得出结论，c端苯丙氨酸残基的酶切直接发生在植物细胞中。值得一提的是，两种不含c端苯丙氨酸残基的LTP异构体较早地在小扁豆发芽种子中被发现[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

重组蛋白Ps-LTP1及其异体表达、纯化和鉴定gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC,gydF4y2Ba^15gydF4y2BaN-labeled模拟gydF4y2Ba

大肠杆菌gydF4y2BaBL21 (DE3) Star™细胞由含有硫氧还蛋白A (Met37Leu)作为载体蛋白的pET-His8-TrxL-Ps-LTP1质粒转化。Ps-LTP1序列中的一个Met残基被Leu取代，以防止目标蛋白被CNBr裂解。结果表明，Met/Leu取代不影响蛋白质结构[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．重组Ps-LTP1及其gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC,gydF4y2Ba^15gydF4y2Ban标记的类似物在gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba．诱导温度降低到26-28°C导致目标融合蛋白以可溶性形式增加。重组蛋白Ps-LTP1的产量gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC,gydF4y2Ba^15gydF4y2Ban标记的类似物分别为5和2.5 mg/L的细菌培养物。gydF4y2Ba

重组蛋白的CD光谱未标记和gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC,gydF4y2Ba^15gydF4y2Ban标记蛋白与原生Ps-LTP1的CD谱相似。抗微生物活性测试和抗体结合试验没有发现Ps-LTP1原生(不含c端Phe)和重组(全长)形式之间的任何行为差异。gydF4y2Ba

Ps-LTP1的生物活性gydF4y2Ba

利用TNS荧光探针估计重组蛋白Ps-LTP1与不同脂质相互作用的能力。饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸(FAs)、茉莉酸(JA)和溶固体被用作测试化合物。已知TNS的荧光在与蛋白质的疏水腔结合后急剧上升[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．所测脂类与TNS之间未发现明显的相互作用。结果表明，Ps-LTP1结合所有被测试的脂质具有不同的效率(图1)。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba，gydF4y2BabgydF4y2Ba)，以及TNS亲脂性探针。当将Ps-LTP1加入到TNS和一种脂质的混合物中，最后一种脂质能够与TNS竞争与蛋白质结合。结果表明，不饱和脂肪酸取代TNS的效率高于饱和脂肪酸。亚麻油酸(C18:2,所有gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba-9,12)和亚麻酸(C18:3，全部-gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba-9、12、15)酸与TNS竞争最有效，两者都能产生23%的TNS荧光。同时，硬脂酸(C18)和马来酸(C17)取代TNS探针的效率最低(分别为对照荧光的80%和85%)。尽管分子尺寸相对较小，JA以中等效率取代TNS(62%的对照荧光)。溶固体与TNS具有较高的竞争效率，特别是带负电荷的LMPG (C14)和LPPG (C16)，分别产生22%和7%的对照荧光。根据获得的数据，Pru p3可以结合广泛的饱和和不饱和FA, JA和溶固体类似于Ps-LTP1(数据未显示)。gydF4y2Ba

Ps-LTP1对革兰氏阴性菌的抗菌活性gydF4y2Ba农gydF4y2Ba而且gydF4y2Bap .两gydF4y2Ba革兰氏阳性细菌gydF4y2Bac . michiganensisgydF4y2Ba和植物病原真菌gydF4y2Ba答:alternatagydF4y2Ba，gydF4y2Ba答:尼日尔gydF4y2Ba,一个gydF4y2Ba．多色的gydF4y2Ba，gydF4y2Ba病圃gydF4y2Ba，gydF4y2Baf .以上gydF4y2Ba而且gydF4y2Ban .菌gydF4y2Ba进行了研究。结果表明，Ps-LTP1具有抗菌活性gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．gydF4y2Baf .以上gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba病圃gydF4y2Ba是对Ps-LTP1最敏感的试验微生物。结果表明，Ps-LTP1抑制了植物病原真菌的孢子萌发，延缓了菌丝的伸长，但并未引起其形态扭曲。gydF4y2Ba

评估了Ps-LTP1诱导含有囊化钙黄素的大单层囊泡(LUVs)渗漏的能力。泄漏被证明依赖于由阴离子磷脂POPG组成的囊泡的蛋白质浓度gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．另一方面，在POPC和POPC/POPG(1:1摩尔比)脂质体的所有测试蛋白浓度下(数据未显示)，泄漏均不显著。gydF4y2Ba

Ps-LTP1的构象非均质性和次生结构gydF4y2Ba

脊骨有140多个交叉峰gydF4y2Ba^1gydF4y2BaHgydF4y2Ba^15gydF4y2Ba在2D中确定N组gydF4y2Ba^15gydF4y2BaPs-LTP1的N-HSQC谱(附加文件gydF4y2Ba7gydF4y2BaA)而不是预期的84个(95个残基，不包括10个脯氨酸和一个n端残基)。三维分析gydF4y2Ba^15gydF4y2Ban - noasy - hsqc谱显示交换H的存在gydF4y2Ba^NgydF4y2Ba- hgydF4y2Ba^NgydF4y2Ba在一些自旋系统之间交叉峰值(附加文件gydF4y2Ba7gydF4y2BaB).这些观察揭示了溶液中蛋白质的两种结构形式的存在，这是由缓慢的(在核磁共振时间尺度上)构象交换过程引起的。(请注意，Ps-LTP1制剂的均匀性是通过生化方法证明的)。三维NOESY谱对角线和交换交叉峰强度的分析(τgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba80 ms)允许估计两种形式的蛋白质的相对种群(~85:15)和它们之间的交换率(KgydF4y2Ba_{前女友gydF4y2Ba}~ 10年代gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})．这个速率对应于交换过程的特征时间~ 100 ms。gydF4y2Ba

几乎完整的gydF4y2Ba^1gydF4y2BaHgydF4y2Ba^13gydF4y2BaC,gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba得到了Ps-LTP1的主要结构形式的N共振赋值。用异核磁共振波谱对其空间结构和动力学进行了研究。特征维gydF4y2Ba_αNgydF4y2Ba(i,i + 3)和dgydF4y2Ba_{αβgydF4y2Ba}(i,i + 3) NOE触点，酰胺质子温度系数和gydF4y2Ba^3.gydF4y2BaJgydF4y2Ba_HgydF4y2Ba^NgydF4y2Ba_HgydF4y2Ba^αgydF4y2Ba偶联常数显示这种形式的蛋白质包含了二级结构中四个相对较长的螺旋元件:Cys4-Gln19 (H1)， Pro29-Ala40 (H2)， Pro45-Ser60 (H3)和Thr66-Cys76 (H4)(图4)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．H1-H4元素以α-螺旋构象为主，但3gydF4y2Ba_10gydF4y2Ba-螺旋蛋白在H1中部(在Pro13水平)和H3 c端(Ala58-Ser60，图5)均有表达。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．此外，该蛋白分子有一个c端长尾(Gly77-Phe95)，包含β-转角和3的孤立转角gydF4y2Ba_10gydF4y2Ba螺旋(螺旋元件H5, Cys90-Thr92)。gydF4y2Ba

由于溶液中人口较少，所以有限gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH和gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba得到了Ps-LTP1的小结构形式的N共振分配(58个自旋体系)。蛋白质分子中类似的缓慢构象交换往往是由gydF4y2Ba顺反gydF4y2BaXxx-Pro肽键的异构化。Ps-LTP1分子包含10个Pro残基，其中4个残基形成一个序列片段(Pro26-Pro29)。获得的gydF4y2Ba^13gydF4y2BaPro残基的C化学位移和观察到的连续NOE交叉峰表明，在蛋白质的主要结构形式中，所有Xxx-Pro肽键都具有gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba配置。同时，两种蛋白质形态之间化学位移的最大差异(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba在螺旋H1、H3和H4的中间部分，以及在gydF4y2BaCgydF4y2Ba终端的尾巴。这些区域只包含两个脯氨酸残基(Pro13和Pro81)。因此，观察到的交换过程可以由gydF4y2Ba顺反gydF4y2BaAla12-Pro13或Ile80-Pro81肽键的异构化，或通过其他结构重排(如通过改变Cys51-Cys90二硫键的构象)。现有的实验数据不允许区分这些可能性。gydF4y2Ba

观察到的构象交换过程也可能是由于样品中一些疏水分子的缓慢结合/解结合造成的。这种可能性似乎不大。首先，通过几个色谱步骤(包括两步反相高效液相色谱)纯化蛋白质，以去除任何疏水杂质的痕迹。第二，如果这个假设的配体在纯化过程中与蛋白质紧密结合，应该用质谱法检测，但事实并非如此。此外，在Ps-LTP1的核磁共振光谱中，我们没有观察到任何多余的脂肪族信号和NOE接触。以上数据证实核磁共振样品中含有非配位形式的Ps-LTP1。gydF4y2Ba

空间结构的主要结构形式为Ps-LTP1gydF4y2Ba

20个空间结构的集合(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)的主要形式的Ps-LTP1从可用的核磁共振数据计算(附加文件gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．该蛋白由4个二硫键(Cys4-Cys53 Cys14-Cys30, Cys31-Cys76, Cys51-Cys90)和46个与二级结构元素相关的主链-主链氢键稳定。除了这些键外，蛋白质结构还可以通过附加的氢键和静电相互作用来稳定。gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba)．例如，两个可能的氢键(HNδ21 Asn68 - CO Tyr17和HNδ22 Asn68 - CO Pro21)控制着螺旋H4相对于连接H1和H2螺旋的环(H1-H2环)的空间排列。封顶相互作用(HN Asp46 - Oγ1 Thr43)稳定了H3螺旋的n端。此外，Arg47的胍基与c端羧基之间可能存在的离子桥控制了c端尾相对于H2-H3环的相对位置。gydF4y2Ba

该蛋白的空间结构在保守螺旋核(H1-H4)区域被二硫键稳定(RMSD ~ 0.8 Å在Cys4-Cys76残基的主链原子上)gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．计算得到的结构系合在n端区域(Ala1-Cys4)和c端尾部(Gly77-Phe95)收敛性降低(图1)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba；额外的文件gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)可能与这些片段增强的分子内移动性有关(图。gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba)．事实上，来自c端尾的残基显示了观测到的ms时间尺度构象波动的最大影响(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba前,见上图)。此外，测量的稳态gydF4y2Ba^15gydF4y2BaN - {gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH}异核NOE值(图;gydF4y2Ba4gydF4y2Ba底)显示在分子的N端和c端ps-ns时间尺度迁移增强。gydF4y2Ba

与已确定的Ps-LTP1空间结构中的其他ltp1类似，螺旋H1在Pro13处表现出明显的扭结(58±5°)(图1)。gydF4y2Ba5度gydF4y2Ba额外的文件gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)．因此螺旋H1-H3形成的平行束整体呈船状。腔体内部由极侧链排列，并由H4螺旋和c端尾部屏蔽水环境。这个疏水口袋，有比较大的体积(1000±300 ÅgydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba)，可能在结合脂质和其他疏水分子中起作用。进入内部疏水腔的入口(图中箭头所示)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)由位于H2-H3环(Leu38-Arg47)和c端尾(Ser79-Tyr82)的两个保守片段组成。gydF4y2Ba

与内表面相反，Ps-LTP1的外表面主要排列着极性和带电残基(图1)。gydF4y2Ba5 dgydF4y2Ba)．几个小的极状斑块是由疏水性不太强的残基(主要是Ala和Pro)侧链形成的。最大的疏水斑块包括来自H1和H2螺旋和H1-H2环的残基(Ala12-Ala32片段，图。gydF4y2Ba5 dgydF4y2Ba)．有趣的是，带电残基不均匀地分布在Ps-LTP1的外表面。分子的一侧(图。gydF4y2Ba5 dgydF4y2Ba左)，包括进入疏水腔，容纳所有带电残基，除了Lys55和Lys63突出到另一侧。Ps-LTP1只有一个带电荷的侧链与外表面几乎没有接触。带正电荷的残余(Asp10)在H1和H2螺旋之间的界面上毛刺。gydF4y2Ba5 dgydF4y2Ba,对吧)。有趣的是，同源物Lc-LTP2蛋白来自gydF4y2Ba镜头culinarisgydF4y2Ba有类似的空间位置的Asp10(附加文件gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

Ps-LTP1空间结构的热稳定性gydF4y2Ba

在纯化原生Ps-LTP1的过程中，其中一个步骤是将温度延长到80°C。研究酰胺质子二次化学位移的温度依赖性(ΔδgydF4y2Ba^1gydF4y2BaHgydF4y2Ba^NgydF4y2Ba(附加文件。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)．温度范围为20-70°C;由于仪器的限制，无法获得更高的温度。众所周知，ΔδgydF4y2Ba^1gydF4y2BaHgydF4y2Ba^NgydF4y2Ba该值取决于蛋白质的二级结构，可以用作酰胺基团上氢键相对强度的指标[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

研究发现，随着温度的升高，受ms时间尺度波动强烈影响的残基共振变得不可观测。很可能，随着温度的增加，交换过程的速率改变了它在核磁共振时间尺度上的变化，从缓慢到中间。另一方面，ΔδgydF4y2Ba^1gydF4y2BaHgydF4y2Ba^NgydF4y2Ba残基的值受构象交换的影响很小，有线性的温度依赖性(附加文件gydF4y2Ba10gydF4y2BaB).大多数来自H1-H4螺旋的酰胺质子表现出相当低的温度梯度(< - 4.5 ppb/K，图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)，甚至在较高的温度下也有负ΔδgydF4y2Ba^1gydF4y2BaHgydF4y2Ba^NgydF4y2Ba值，它指示螺旋构象(附加文件gydF4y2Ba10gydF4y2BaA).因此可以得出结论:随着温度的升高，Ps-LTP1分子的二级结构和整体空间排列都没有改变。gydF4y2Ba

在硅分析中预测致敏性和交叉反应性gydF4y2Ba

世界卫生组织(世卫组织)、粮食及农业组织(粮农组织)及食品法典委员会就评估蛋白质的潜在致敏性提出准则[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．根据这些指南，如果一种蛋白质与已知的过敏原具有6个连续氨基酸残基的匹配，或在80个氨基酸窗口中> 35%的同一性，则该蛋白质具有潜在的致敏性[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．该算法主要用于在观察到高度过敏原相似度(超过50%)时识别过敏交叉反应[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

FARRP序列分析显示，在80 A . A .窗口内，Ps-LTP1对超过31个致敏ltp具有47%以上的同一性。它与扁豆过敏原lenc 3有81%的同源性，与花生Ara h9有69%的同源性，与绿豆Pha v3有68%的同源性，与桃树Pru p3有60%的同源性gydF4y2Ba11gydF4y2Ba)．研究发现，Ps-LTP1还与31个致敏ltp共享至少一个相同的6-氨基酸区段。大部分的匹配是Len c3, Pha v3, Ara h9和Pru p3(分别为32,20,17和16个匹配)。通过使用其他网络工具，如AllergenFP、AlgPred和SDAP，也确认了可能的致敏性。gydF4y2Ba

之前在Pru p3中已经鉴定了三个序列的IgE表位(见图。gydF4y2Ba5 egydF4y2Ba)[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．其中两个形成构象表位(Asn35-Ala46/Ser76-Tyr79)，包括三个关键氨基酸残基(Arg39、Thr40和Arg44)，提供ige结合能力。上面提到的两个关键残基——thr43和Arg47(在Pru p3的情况下分别对应Thr40和Arg44)存在于Ps-LTP1表面，而带正电的Arg39被极性的Thr42取代(图4)。gydF4y2Ba5 dgydF4y2Ba，gydF4y2BaegydF4y2Ba)．因此，可能构象IgE表位Thr42-Ala49/Gly77-Tyr82区域的电荷分布存在一定差异，但该区域整体上具有与Pru p3主表位相似的物理性质(突起位置、带电基团的聚类等)(图4)。gydF4y2Ba5 dgydF4y2Ba，gydF4y2BaegydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

模拟胃肠道蛋白水解作用gydF4y2Ba

在还原条件下，通过模拟胃肠道消化的酶切割对Ps-LTP1的体外破碎进行SDS-PAGE分析(图1)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．从牛奶中添加α-酪蛋白(Sigma)作为内控，以监测酶活性。结果表明，Ps-LTP1对胃蛋白酶2 h的胃消化表现出显著的抗性(裂解率为19%)。与此同时，α-酪蛋白在前5分钟内被胃蛋白酶完全降解。在十二指肠消化过程中，用胰蛋白酶和糜凝胰蛋白酶混合物处理Ps-LTP1 24小时后，观察到Ps-LTP1的中度降解(裂解率为47%)。由此可见，Ps-LTP1对典型的食物过敏原胃肠道消化具有较高的稳定性。gydF4y2Ba

Ps-LTP1的免疫学特性gydF4y2Ba

如前所述，在豌豆Ps-LTP1和扁豆过敏原lenc3之间观察到最显著的相似性。为了验证该蛋白的免疫学相似性，先前获得的兔抗len c3抗血清[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]用于western blot和ELISA检测。通过还原条件下的SDS-PAGE和随后的western blot，表明兔抗Len c3 IgG与重组蛋白Len c3、Pru p3和Ps-LTP1以及来自豌豆提取物的天然LTP相互作用gydF4y2Ba12gydF4y2Ba)．ELISA检测显示抗Len c3 IgG与Len c3结合最为显著(附文件)gydF4y2Ba13gydF4y2BaA). Pru p3结合最弱，与Len c3的结构相似度低于Ps-LTP1。这些结果也通过抑制试验得到证实，其中抗Len c3 IgG与Len c3的结合被Ps-LTP1或Pru p3抑制gydF4y2Ba13gydF4y2BaB).获得的数据显示所有三个ltp的IgG表位至少部分相似。gydF4y2Ba

利用含有特异性IgE的Pru p3食物过敏患者的血清，用ELISA法体外分析IgE结合(图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)．Ps-LTP1与所有Pru p3致敏患者血清中的特异性IgE结合，其免疫反应性较Pru p3和Len c3弱。这证明了Ps-LTP1可能是一种新的交叉反应性食物过敏原。gydF4y2Ba

植物LTPs是一个多基因家族，在植物个体发育的不同阶段表达不同的基因。多种LTP异构体的生物合成是组织特异性的。不同LTP异构体基因的表达主要由环境决定，这使得多种LTP异构体的生物合成成为植物在不同非生物和生物胁迫下防御策略的一个要素。几个LTP异构体的存在已经在小扁豆中得到证实gydF4y2Ba镜头culinarisgydF4y2Ba其中发现了8个新型脂质转移蛋白Lc-LTP1-8的亚家族[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．在本研究中，我们证实了菜园豌豆中也存在多种LTP亚型gydF4y2BaPisum一gydF4y2Ba．在豌豆种子中发现了3个新的LTP1亚型，命名为Ps-LTP1-3，并对它们的cdna进行了测定。所有前体蛋白均含有24-25个a.a.残基信号肽和95个残基成熟蛋白，其中8个是植物LTPs的典型保守半胱氨酸残基。所有三个豌豆ltp都彼此相似(Ps-LTP1与Ps-LTP2和Ps-LTP3分别有91%和75%的同源性)(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．从不同Ps-LTP亚型基因的实验表达谱可以得出初步结论。(1) Ps-LTP1是未发芽豌豆种子中丰富的异构体，在种子发育和萌发过程中参与脂质动员。从未发芽的豌豆种子中分离得到的蛋白是Ps-LTP1。测定了其全氨基酸序列。该蛋白含有8个半胱氨酸残基，位于植物LTP序列高度保守的位置。(2) Ps-LTP2和Ps-LTP3基因的表达量仅在发芽后急剧上升，并在成熟豌豆的不同器官中保持相同水平。后者可能认为这些异构体在植物生理中具有更普遍的生物学作用，如参与细胞壁生长、信号转导或防御病原体。我们的结果为不同的Ps-LTP亚型可能的生物学作用提供了进一步的分子洞察。gydF4y2Ba

此前已经在豌豆幼苗中发现了两种编码LTPs的mRNA。第一个豌豆LTP [UniProtKB: Q9M7D7]仅在转录水平被发现[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]含有10个半胱氨酸残基，这是植物ltp的非典型特征。结果表明，在非生物胁迫条件下，其mRNA水平升高，证实了LTP亚型的差异表达及其多功能特性。第二个豌豆LTP [UniProtKB: O24309]也在转录水平被发现[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，最近在蛋白质水平检测到[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．通过豌豆粉超滤提取、反相快速高效液相色谱(RP-FPLC)、SDS-PAGE、胰蛋白酶凝胶内消化和MS/MS串联质谱法进行鉴定。该蛋白也具有非典型结构，含有7个半胱氨酸残基。值得注意的是，这种蛋白质不是从豌豆粉中分离出来的，而是通过胰蛋白酶消化的串联质谱法鉴定出来的。显然，它在豌豆种子中的表达水平很低。这就是为什么我们没有分离这种蛋白质，因为我们的目的是识别和表征在豌豆种子中高水平表达的主要食物过敏原。gydF4y2Ba

目前获得的核磁共振数据显示了Ps-LTP1与其他植物ltp1的结构相似和不同之处。与其他ltp1类似，Ps-LTP1包含4个α-螺旋(H1-H4)，它们围绕着可能包含脂质结合位点的内部疏水腔，然后是一个长长的c端尾巴(图1)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．Ps-LTP1可以很好地与非配体高度同源的过敏原蛋白Len c3叠加gydF4y2Ba镜头culinarisgydF4y2Ba(77%身份，PDB ID 2MAL， [gydF4y2Ba27gydF4y2Ba])以及配体和同源性较低的桃源过敏原Pru p3(58%的身份，PDB id 2ALG和2B5S， [gydF4y2Ba28gydF4y2Ba)(附加文件gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)．结构集之间的最小RMSD，用C计算gydF4y2Ba^αgydF4y2Ba8个保守半胱氨酸的原子数，分别约为0.6和0.8 Å。同时，比较发现螺旋间环和c端尾部的相对方向有显著差异gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)．这些差异导致了Ps-LTP1螺旋的排列略有不同，并导致了内部疏水腔体积的显著增加。与其他具有内腔van der Waals体积从80到800的非配体ltp1相比ÅgydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba(在Len c3的情况下观察到最大的空腔[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba和dill Ag-LTP [gydF4y2Ba29gydF4y2Ba])，无脂Ps-LTP1具有更大的疏水囊(1000±300 ÅgydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba)．这个空间足够容纳双链脂质(~1100 ÅgydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba)，与配体ltp1的内部口袋的体积相似(从650到1350 ÅgydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba)．部分配体和完全配体的Pru p3的腔体体积分别为~ 500和1200 ÅgydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba,分别。gydF4y2Ba

Ps-LTP1与其他植物ltp1的主要区别是构象的非均质性。在溶液中，该非配体蛋白表示两种构象的混合物，其相对种群约为85:15，它们之间相互转化的特征时间约为100微秒。目前，我们无法描述导致Ps-LTP1构象异质性的交换过程的起源。这可能和gydF4y2Ba顺反gydF4y2BaAla12-Pro13或Ile80-Pro81肽键的异构化或连接分子c端尾和螺旋核的Cys51-Cys90二硫键桥构象的改变。然而，所有螺旋(H1-H4)和c端尾的残基都参与了这一过程(图5)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba)意味着相应的构象波动伴随着内部疏水腔的重塑。因此，Ps-LTP1的小构象可能对应内腔塌陷的结构，体积小得多，类似于其他非配体ltp1结构。据我们所知，在非配体植物ltp的构象异质性之前没有描述过。gydF4y2Ba

已知植物LTPs属于病原相关蛋白(PRP)，参与系统获得性抗性保护植物免受病原体和感染。许多ltp的防御作用与抑制植物病原生长的能力有关。然而，LTPs家族中有一些成员在相对高浓度时不表现出任何抗菌活性或抑制植物致病生长。从豌豆种子中分离到的一种新型LTP具有一定的抗真菌活性，其作用具有特异性。对Ps-LTP1试验培养物最敏感的是真菌gydF4y2Ba镰刀菌素gydF4y2Ba属，可引起植物赤霉病、根腐病和幼苗枯萎病。据了解，一些豌豆品种对真菌引起的疾病具有很高的抵抗力gydF4y2Ba镰刀菌素gydF4y2Ba属(gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．豌豆对镰刀病的高抗性也可能是Ps-LTP1高表达的结果。LTP的抗菌作用的一个假定靶点是细胞质膜[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．我们发现Ps-LTP1干扰人工脂质体的通透性，值得注意的是脂质体的组成对这种作用非常重要。Ps-LTP1能够诱导POPG脂质体渗漏，且这种作用与蛋白浓度有关，而POPC和POPG/POPC脂质体则保持不变。有趣的是，钙黄素泄漏的有效性取决于蛋白质浓度，而蛋白质浓度与抗菌试验中使用的浓度相关。可能是阳离子植物ltp与细胞膜的阴离子组分相互作用，导致细胞膜的不稳定和通透性增加。所得数据证明了Ps-LTP1对模型膜的渗透能力。gydF4y2Ba

脂类及其衍生物参与植物的多种生理过程，包括膜生物发生、细胞分化、细胞间和细胞内信号转导等。推测ltp的不同生物学功能是基于其结合和运输各种脂质分子的能力。研究ltp的脂质结合特性可以为了解其生物学功能提供有用的数据。这表明ltp1参与了构成蜡质和聚合角质层的疏水单体的运输。尽管ltp的空间结构具有高度的序列同源性和相似性，但ltp可以表现出结构差异，从而导致对脂质的不同亲和力[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．以小扁豆Len c3为例，其疏水腔体积为~600 ÅgydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba)对不饱和FAs具有脂质结合特异性，而莳莳香Ag-LTP (~800 ÅgydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba)与饱和和不饱和FAs的结合没有显著差异，这可能与Ag-LTP中更大的疏水袋有关[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．这里确定的Ps-LTP1的空间结构包含更大的疏水腔(~1000 ÅgydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba)，但对不饱和FAs也具有脂质结合特异性，这可能与观察到的Ps-LTP1的构象异质性有关。可能，对不同脂质的特异性是在Ps-LTP1的小结构形式构象中“编码”的，该结构形式只负责在溶液中出现的蛋白质的~ 15%。在这种情况下，脂质与内腔结合的过程应该具有兼容的时间尺度，甚至比观察到的交换过程更慢(时间尺度~ 100 ms)。gydF4y2Ba

ltp构成了一个真正的过敏原家族，可以引起花粉，特别是食物的敏化。从未发芽的豌豆种子中分离出的Ps-LTP1是一个组成性表达丰富的异构体，可能表现出真正过敏原的特性。食物过敏原通常以热稳定性和蛋白酶抗性为特征。例如，胃肠道消化的稳定性，特别是胃蛋白酶消化的稳定性，被认为是真正食物过敏原的一个特征[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba］．此外，它们对热处理的稳定性也暗示加工食品中存在活性过敏原形式。由于其对胃肠道酶的极端抗性，Ps-LTP1可以被评估为一种潜在的严重食物过敏原。通过核磁共振热稳定性实验和Ps-LTP1的热处理，可以将该蛋白标记为耐热蛋白。此外，ltp属于最临床相关的交叉反应性植物过敏原类别。由于其极其保守的结构，ltp1不仅负责食物之间的IgE交叉反应，也负责不相关的花粉和植物食物过敏原源之间的IgE交叉反应，因此被归类为泛过敏原。如桃Pru p3是LTP1家族中主要的交叉反应性变应原，在大多数过敏患者的致敏中起着主要作用。我们发现，分离出来的豌豆LTP与几种食物过敏原具有很高的氨基酸相似性，包括扁豆Len c3、花生Ara h 9和桃子Pru p3。通常，具有序列相似性的高度保守分子通常共享与致敏性相关的表面拓扑结构。抗体-过敏原复合物的已知结构表明，IgG抗原表位与IgE抗原表位至少有部分重叠[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba］．我们发现，Ps-LTP1似乎与其他两个IUIS食物过敏原(Len c3和Pru p3)共享IgG表位，并具有类似的能力结合食物过敏患者的IgE。类似的ige免疫反应可能是由于蛋白质表面存在类似的ige结合表位。我们认为ige结合区域应该同时具有突起的局部表面和静电活性的局部分子结构域[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．因此，与Pru p3构象表位同源的Ps-LTP1的Thr42-Ala49/Gly77-Tyr82区域的物理性质可以认为它是该蛋白最有可能的IgE表位。值得注意的是，该区域也被确定为小麦Tri a 14的主要构象表位[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba］．有趣的是，在Ps-LTP1和Pru p3的情况下，来自该区域的残基限制了进入内部疏水腔的入口，并参与脂质结合(图1)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba；无花果。gydF4y2Ba5 dgydF4y2Ba，gydF4y2BaegydF4y2Ba)．此外，在Pru p3中，上文提到的与ige结合的Arg44以及与ige结合区域极性Tyr79结合的关键残基对植物ltp1高度保守，可能也负责脂质摄取[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba］．这使得我们可以推测，植物ltp1表面的一个区域既负责与脂质分子的相互作用，也负责与ige结合。gydF4y2Ba

总之，我们从豌豆中发现并分离出一种新的脂质转移蛋白gydF4y2BaPisum一gydF4y2Ba．在这里，我们开发了一个从豌豆种子中分离LTP的程序。对编码Ps-LTP1前体和其他两种亚型的cdna进行了分子克隆和测序。测定了Ps-LTP1的完整氨基酸序列和溶液结构。构建了重组Ps-LTP1的细菌表达系统gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC,gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba研制了n标记的模拟物。研究了Ps-LTP1的生物活性及其脂质结合能力。首次观察到非配体植物LTPs的构象不均一性，可能与内部脂质结合腔的重塑有关。报道的结构和免疫学结果似乎描述了在ltp致敏患者中，Ps-LTP1是潜在的交叉反应性食物过敏原，主要是Pru p3gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba的人。gydF4y2Ba

豌豆LTP的分离gydF4y2Ba

豌豆种子(m = 100克)gydF4y2BaPisum一gydF4y2Ba(品种“Sacharniy 2”，GOST P 52171-2003, 8374系列，由“Udachnye semena”公司)粉末状，混合300毫升提取缓冲液(150 mM СН)gydF4y2Ba_3.gydF4y2BaCOONHgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba， 200 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1.5% PVPP, pH 5.5，蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Sigma))，在4℃搅拌2 hgydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C下透析40分钟)，在4°C下透析100倍体积的50 mM CHgydF4y2Ba_3.gydF4y2BaCOONa, pH 5.3，含0.2 mM PMSF。然后在80°C下热处理20分钟，离心去除变性蛋白。上清液使用Amicon压力池通过YM100和PM30膜进行连续超滤。滤液装入1ml阳离子交换柱HiTrap SP FF (GE Healthcare)上。用氯化钠浓度(从0到0.5 M)在50 mM CH中梯度洗脱gydF4y2Ba_3.gydF4y2BaCOONa, pH 5.3，流速0.7 ml/min。用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)在Vydac C上进一步纯化豌豆LTP，命名为Ps-LTP1gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba色谱柱(5 μm, 250 × 4.6 mm, Grace)，流速0.5 ml/min，乙腈浓度从5到80%梯度，0.1% TFA中60 min。蛋白的最终纯化在Luna C上进行gydF4y2Ba_18gydF4y2Ba柱(5 μm, 250 × 4.6 mm, Phenomenex)采用相同的条件。gydF4y2Ba

豌豆Ps-LTPs基因cdna的扩增、克隆和测序gydF4y2Ba

用SV总RNA分离系统试剂盒(Promega)从豌豆发芽种子中分离总RNA。RT-PCR采用SMART™RACE cDNA扩增试剂盒(BD Biosciences, Clontech)和Mint RACE cDNA扩增试剂盒(Evrogen)进行。gydF4y2Ba

3 ' -RACE的简并引物设计对应于不相关植物ltp核苷酸序列的保守区。第一轮3’- race采用1号引物(TG(T,C)(G,A)G(T,C)GT(C,T)AACAT(T,C)CCTTAC)和通用适配引物，采用降压PCR协议:1)95°C - 1分钟;2)25个循环，94°C - 30秒，50…42°C - 40秒(温度每5个循环逐步降低2°C)， 68°C - 2分钟;3) 94°C - 30秒，40°C - 40秒，68°C - 2分钟，10个循环;4)最后延伸10分钟，在68°C。用2号引物(AACAT(T,C)CCTTAC(A,C)(A,C)GATCAG)和相同的引物在退火温度50°С下进行半嵌套PCR扩增35次。gydF4y2Ba

然后用基因特异性引物对3 ' -未翻译区域的保守部分进行5 ' -RACE。第一轮3号底火(ACAAGAAGATAGGACCACAT)包括25个63-51°C退火循环(每5个循环温度逐步降低3°C)和10个48°C退火循环。稀释后的产物用引物4号(CCCACTCTCATATACTAGTGA)在48°С退火温度下重新扩增35个循环。gydF4y2Ba

最后，用基因特异性引物补充豌豆Ps-LTPs cDNA编码信号多肽的保守区，进行3’-RACE半巢式PCR。引物5号(СССATGAAATTAGCATGTG)的降压PCR扩增程序为65-49℃退火25个循环(每5个循环逐步降低4℃)和45℃退火10个循环。然后用嵌套引物6号(ATGGTAGTTATTGCGCCT)在50°退火温度下重扩增35个循环С。gydF4y2Ba

PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶中分离，用清洁标准试剂盒(Evrogen)洗脱，并用pAL2载体(Evrogen)连接。然后用这些结构进行DH-10B的转化gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba(技术)。使用ABI PRISM 3100-Avant(应用生物系统公司)进行核苷酸测序分析。gydF4y2Ba

实时定量RT-PCR转录本分析gydF4y2Ba

花园豌豆种子(品种“Sacharniy 2”，GOST P 52171-2003, 8374系列，由“Udachnye semena”公司)在蒸馏水浸泡的纸上的培养箱中发芽3天。种子发芽后转移到玻璃罐中，生长至35天大植株。gydF4y2Ba

为了进行总RNA分离，分别收集3天大的豌豆幼苗和35天大的豌豆幼苗的组织。根据制造商的说明，使用SV总RNA分离系统试剂盒(Promega)从根、叶和卷须中分离总RNA。用MLT法从富含多糖的干种子中分离总RNA [gydF4y2Ba37gydF4y2Ba］．茎部总RNA采用KLC法分离[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba，只是做了一些修改。简单地说，7.5 ml萃取缓冲液(0.25 M NaCl, 0.05 M Tris-HCl (pH 7.5)， 20 mM EDTA, 1% (w/v) SDS, 4% (w/v) PVPP, 5% β-巯基乙醇)与7.5 ml苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1 v/v)混合在50 ml Falcon管中。将1克冷冻豌豆茎用研钵和杵在液氮中捣碎，转移到管中，用力旋转。样品在12,900的温度下离心gydF4y2BaggydF4y2Ba4℃下2分钟，上部水相转移到新的50ml Falcon管中。用等体积的氯仿:异戊醇(24:1 v/v)萃取法去除痕量苯酚。水相转移到新的50ml Falcon管中，加入十分之一体积的3m醋酸钠(pH 5.2)和2.5体积的冷无水乙醇，混合均匀，在- 20℃下孵育30分钟。12900离心沉淀核酸gydF4y2BaggydF4y2Ba4℃风干30min后，在750 μl无rnase水中溶解，转移到2ml管中。加入1 ml TRIzol (MRC, Inc.)，按照制造商的说明进行后续RNA纯化。所有分离的总rna都用DNase I处理以去除任何DNA痕迹。用紫外/可见分光光度计(OD)估计分离rna的数量和质量gydF4y2Ba_{260/280gydF4y2Ba}所有分离的rna的值均大于1.95)。根据Masek T.等人的观点，通过在TAE琼脂糖凝胶中变性RNA电泳来评估RNA完整性。[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

每个组织约2 μg的总RNA用1 μM的寡脱氧胸腺嘧啶(oligo dTgydF4y2Ba_25gydF4y2Ba)引物。将合成的cdna用无菌水稀释至100 μl体积，作为模板进行实时RT-PCR。插入EvaGreen染料型实时RT-PCR在real-time Detection Thermal Cycler DTprime (DT-96) (DNA-Technology)中进行，条件如下:95℃5分钟，95℃10秒，59℃30秒，72℃40秒，循环50次。选择β-微管蛋白[GenBank登录号:X54844]基因作为内控基因，以规范每次反应中总RNA的含量。结果表明，β-微管蛋白基因在豌豆中表达量最稳定[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba］．引物设计如下:CCCGTGGAACTGTATCTGC (Ps-LTP1-Fw)、GCCGTGGAACTGTATCCTG (Ps-LTP2-Fw);CCGGCGTGCAACTGTAATGA (Ps-LTP3-Fw);CGCGGCACTGATCTTGTAA (Ps-LTP1-3-Rv);gctcccagcagaggactct (β-微管蛋白- fw)， TGGCATCCCACATTTGTTGA (β-微管蛋白- rv)。反应液(20 μl)为:1 μl EvaGreen Dye 20X溶液(Biotium)，每个脱氧核苷酸0.2 mM, Taq DNA聚合酶(Evrogen) 2 U, Taq 10X缓冲液2 μl，正向引物和反向引物各0.2 μl, cDNA模板1 μl(相当于总RNA 20ng)。gydF4y2Ba

胰蛋白酶的消化gydF4y2Ba

Ps-LTP1在10 mM DTT存在下被还原，并在50 mM NH中用改良胰蛋白酶(Promega)消化gydF4y2Ba_4gydF4y2BaHCOgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba, pH值8.0。水解在37℃下进行1 h，在10%乙腈中加入0.5% TFA终止水解。用正离子反射模式测定了蛋白片段的质谱。用Ultraflex MALDI-TOF/TOF质谱计(Bruker)测定Ps-LTP1片段的MS/MS谱。gydF4y2Ba

Ps-LTP1的还原和烷基化gydF4y2Ba

采用碘乙酰胺烷基化法测定半胱氨酸残基数。Ps-LTP1样品(10 μg)溶于50 мМ NH 90 μl中gydF4y2Ba_4gydF4y2BaHCOgydF4y2Ba_3.gydF4y2BapH 8.0，含2 mM二硫苏糖醇(DTT)，在37°С孵育2 h。然后用20 mM碘乙酰胺在室温黑暗下烷基化1 h。用反相高效液相色谱法对s -羧基甲基衍生物进行脱盐gydF4y2Ba_18gydF4y2Ba列。二硫键的存在用同样的方案证明了，没有事先的还原。gydF4y2Ba

抗菌试验gydF4y2Ba

Ps-LTP1的抗菌活性通过96孔微板显微分光光度法测定，并按所述顺序稀释蛋白[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．的集成电路gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba定义为在细菌或真菌分别孵育24或48小时后导致至少50%生长抑制的最低蛋白质浓度。在Olympus CKX41显微镜下观察孢子萌发情况和菌丝形态，孢子悬浮培养(半强度马铃薯葡萄糖汤)12和24小时，25℃，蛋白溶液或水(作为对照)存在。gydF4y2Ba

脂质结合gydF4y2Ba

如前所述，使用荧光探针TNS评估了Ps-LTP1结合脂质的能力[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．激发波长和发射波长分别为320 nm和437 nm。TNS (3.5 μM)加或不加脂质(18 μM;所有来自Sigma的FAs和JA，来自Avanti的溶固体)在含有1ml测量缓冲液(175 mM甘露醇，0.5 mM K)的搅拌试管中孵育1分钟gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba所以gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba， 0.5 mM CaClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba， 5 mM MES, pH 7.0)，然后记录荧光(FgydF4y2Ba_0gydF4y2Ba)．然后加入Ps-LTP1 (4 μM)， 2 min后记录荧光平衡(F)。结果用Ps-LTP1 - tns络合荧光的百分比表示[(F - FgydF4y2Ba_0gydF4y2Ba) / FgydF4y2Ba_CgydF4y2Ba× 100%，其中FgydF4y2Ba_CgydF4y2Ba是不含脂质的Ps-LTP1-TNS复合物的荧光。gydF4y2Ba

染料从脂质囊泡中泄漏gydF4y2Ba

在含有50 mM钙黄素，10 mM HEPES, 200 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, pH 7.5的缓冲液中制备了由POPC或POPG或POPC/POPG(1:1摩尔比)组成的钙黄素包埋luv(均来自Avanti)。然后，悬浮液在室温下通过两个堆叠的100 nm聚碳酸酯膜过滤器(核孔)，每对通过10次，在迷你挤出机(Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL)上挤出。在Sephadex G-75柱上通过凝胶过滤去除未捕获的钙黄素。将洗脱的钙黄素包埋囊泡进一步稀释到所需的脂质浓度。用F-2710荧光计(日立)测量激发波长490 nm和发射波长520 nm下的荧光强度，以监测钙黄素从luv中泄漏的情况。在1.5% Triton X-100的存在下，通过溶解囊泡来测定最大荧光强度。蛋白质引起的染料泄漏率计算如下:gydF4y2Ba

式中F为添加蛋白质后的荧光强度，FgydF4y2Ba_0gydF4y2BaFt分别为无该蛋白和有Triton X-100时的荧光强度。gydF4y2Ba

非标记和的异源表达gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC,gydF4y2Ba^15gydF4y2BaN-labeled Ps-LTP1在gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba

将pET-31b(+)载体(Novagen) 5253 bp的BglII/XhoI片段与pcr构建的内含T7启动子、核糖体结合位点和编码重组蛋白序列(包括八组氨酸标签、TrxL载体蛋白(gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba引入Met37Leu突变的pET-32a(+)载体(Novagen)扩增的硫氧还蛋白A)、蛋氨酸残基和成熟的Ps-LTP1序列[GenBank登录号:KJ569141]。最后一个被放大了gydF4y2Bap .一gydF4y2Ba使用诱变(Met11Leu)正向引物(GCGGGATCCATGGCTTTGTCTTGTGGAACTGTATCCGCTGATTTGGCTCCATGCGTTAC)和反向引物(GCGGAATTCTCAAAACCTAACAGTGTTACAG)构建cDNA池。gydF4y2Ba

pET-His8-TrxL-Ps-LTP1转化的BL21 (DE3) Star™细胞在添加100 μg/ml氨苄西林和20 mM葡萄糖的LB培养基中培养。后ODgydF4y2Ba_600gydF4y2Ba达到0.7时，用0.2 mM异丙基-β- d -1-硫半乳糖吡喃苷(IPTG)诱导细胞，26℃220转/分孵育4 ~ 6 h。gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC,gydF4y2Ba^15gydF4y2Ban标记的Ps-LTP1在含1 g/L的M9最小培养基中表达gydF4y2Ba^15gydF4y2BaNHgydF4y2Ba_4gydF4y2BaCl (CIL)和20mm [U-gydF4y2Ba^13gydF4y2BaCgydF4y2Ba_6gydF4y2Ba标记的d -葡萄糖(CIL)分别作为唯一的氮源和碳源。后ODgydF4y2Ba_600gydF4y2Ba达到~0.7时，用0.2 mM IPTG诱导细胞，然后在26℃、220转/分孵育10-12 h。用SDS-PAGE检测融合蛋白的表达水平和溶解度。目标蛋白通过细菌细胞的顺序裂解、固定化金属离子亲和层析(IMAC)、透析、融合蛋白的溴化氰裂解、重复IMAC和RP-HPLC纯化。gydF4y2Ba

核磁共振实验与空间结构计算gydF4y2Ba

采用1.0 mM的样品进行核磁共振研究gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC,gydF4y2Ba^15gydF4y2BaN标记的Ps-LTP1在5% DgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO在pH 5.5和30°C。在配备有室温三共振(gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH,gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC,gydF4y2Ba^15gydF4y2BaN)调查。使用标准的三维三共振实验集获得骨干共振分配[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba］．3 dgydF4y2Ba^13gydF4y2BaC-HCCH-TOCSY和gydF4y2Ba^15gydF4y2BaN -或gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba采用c滤波的三维TOCSY和NOESY谱进行侧链分配。的gydF4y2Ba^3.gydF4y2BaJgydF4y2Ba_HgydF4y2Ba^NgydF4y2Ba_HgydF4y2Ba^αgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba^3.gydF4y2BaJgydF4y2Ba_NHgydF4y2Ba^βgydF4y2Ba利用三维HNHA和HNHB实验测量耦合常数[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba^3.gydF4y2BaJgydF4y2Ba_CgydF4y2Ba^γgydF4y2Ba_{C 'gydF4y2Ba}，gydF4y2Ba^3.gydF4y2BaJgydF4y2Ba_CgydF4y2Ba^γgydF4y2Ba_NgydF4y2Ba从自旋回波差中的交叉峰强度定量计算了Val、Ile和Thr残基的常数gydF4y2Ba^13gydF4y2BaС-HSQC实验(gydF4y2Ba42gydF4y2Ba］．酰胺质子的温度系数(ΔδgydF4y2Ba^1gydF4y2BaHgydF4y2Ba^NgydF4y2Ba/ΔT)在20-70°C的温度范围内使用2D测量gydF4y2Ba^15gydF4y2BaN-HSQC光谱。杂环的gydF4y2Ba^15gydF4y2BaN - {gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH} NOE值在30°C下采用伪三维实验测量[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

空间结构计算在CYANA 3.0程序中进行[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba］．从三维交叉峰强度推导出了上部质子间距离约束gydF4y2Ba^15gydF4y2BaN-NOESY-HSQC和gydF4y2Ba^13gydF4y2BaС-NOESY-HSQC(τgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba= 80 ms)通过" 1/rgydF4y2Ba^6gydF4y2Ba“校准。gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH,gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC,gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba使用N个骨干化学位移作为TALOS+软件的输入，预测二级结构[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba］．通过J耦合常数、NOE强度和TALOS+预测得到扭转角约束和立体定向分配。氢键是在Δδ的基础上介绍的gydF4y2Ba^1gydF4y2BaHgydF4y2Ba^NgydF4y2Ba/ΔT值。根据观察到的NOE接触建立了二硫键连通性模式，并在空间结构计算的初步阶段进行了验证。使用CASTp计算蛋白空洞的位置和体积，探针半径为1.4 Å (gydF4y2Bahttp://sts.bioe.uic.edu/castp/calculation.phpgydF4y2Ba)[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba］．Ps-LTP1主要结构形式的原子坐标已保存在PDB中，登录代码为2N81。gydF4y2Ba

在硅分析中预测过敏原性gydF4y2Ba

为了预测潜在的致敏性，我们使用了过敏原在线数据库“食物过敏研究和资源计划”(FARRP) (gydF4y2Bahttp://www.allergenonline.orggydF4y2Ba)、AllergenFP v.1.0 (gydF4y2Bahttp://ddg-pharmfac.net/AllergenFP/index.htmlgydF4y2Ba)和致敏蛋白结构数据库(SDAP) (gydF4y2Bahttps://fermi.utmb.edu/SDAPgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

模拟Ps-LTP1的胃肠道消化gydF4y2Ba

体外模拟胃肠消化，如[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba］．简单地说，在0.1 M HCl, ph2.0中，每1 μg底物使用50 ng胃蛋白酶(Sigma)进行胃消化2 h。对于十二指肠消化，通过添加碳酸氢铵将胃消化产生的混合物的pH值调整为8.0。得到的混合物在37°C下孵育24小时，每1 μg底物加入2.5 ng胰蛋白酶(Promega)和10 ng α-糜凝蛋白酶(Sigma)。SDS-PAGE检测蛋白水解程度。凝胶图像用Gel- pro软件分析。gydF4y2Ba

患者血清和免疫球蛋白结合试验gydF4y2Ba

在莫斯科流行病学中央研究所分子诊断中心收集了20例过敏患者的血清，经批准并按照机构审查委员会的规则和规定进行。根据食物过敏患者血清中Pru p3特异性IgE的存在，选取9例食物过敏患者血清。根据制造商的说明，使用Total IgE HRP EIA试剂盒(Dr. Fooke)测定总IgE水平gydF4y2Ba．gydF4y2BaELISA法检测特异性IgE水平。将重组蛋白在TBS (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4)中包被板孔(Costar, 3590)，在37℃下孵育1小时，用1%牛血清白蛋白(BSA)在TBS缓冲液中饱和1小时，在37℃下孵育2小时，然后与Pru p 3致敏患者的血清池(1:2至1:16连续稀释)孵育2小时。用山羊过氧化物酶偶联抗人IgE (Sigma)(1:20 00稀释)和ELISA中3,3 '，5,5 ' -四甲基联苯胺(TMB)液体底物体系(Sigma)检测特异性IgE结合。2 N H酸化20 min后停止酶促反应gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba所以gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba，在450 nm处测定吸光度值。采用含0.05% TBS- 20 (TBS- t)的TBS作为洗涤液。根据非过敏患者血清中IgE - Pru p3水平，<0.25 OD为阴性。gydF4y2Ba

用western blotting和ELISA方法评价兔抗len c3抗血清与重组蛋白的相互作用。免疫前兔血清作为阴性对照。如本节所述，从豌豆种子中提取蛋白质gydF4y2Ba”方法。豌豆LTP的分离gydF4y2Ba．采用兔抗len c3抗血清进行酶联免疫吸附试验和抑制试验。在阻断自由结合位点后，将板孔与抗len c3兔抗血清在TBS(1:50 00至1:64 000连续稀释剂)中孵育1小时，37℃。在抑制酶联免疫吸附试验中，兔抗血清与增加数量的重组蛋白在室温下预孵育3小时，然后添加到重组Len c3包被板上。采用TBS中山羊过氧化物酶偶联抗兔抗体(1:5万稀释)进行检测。gydF4y2Ba

支持数据的可用性gydF4y2Ba

本文报告的蛋白质序列数据将出现在UniProt知识库的登录号下gydF4y2BaC0HJR7gydF4y2Ba(Ps-LTP1)。核苷酸序列已按登录号存放在GenBank中gydF4y2BaKJ569141gydF4y2Ba(Ps-LTP1),gydF4y2BaKJ569142gydF4y2Ba(Ps-LTP2),gydF4y2BaKJ569143gydF4y2Ba(Ps-LTP3)gydF4y2Ba．gydF4y2Ba原子坐标和结构因子已存入世界蛋白质数据库，登录号为PDB:gydF4y2Ba2 n81gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准gydF4y2Ba

患者的血清在莫斯科流行病学中央研究所分子诊断中心收集，经批准并按照机构审查委员会的规则和条例收集。gydF4y2Ba

同意出版gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

德勤:gydF4y2Ba

二硫苏糖醇gydF4y2Ba

EDTA:gydF4y2Ba

乙二胺四乙酸gydF4y2Ba

ELISA:gydF4y2Ba

酶联免疫吸附试验gydF4y2Ba

费尔南多-阿隆索:gydF4y2Ba

脂肪酸gydF4y2Ba

是:gydF4y2Ba

茉莉酸gydF4y2Ba

LMPC:gydF4y2Ba

lyso-myristoyl磷脂酰胆碱gydF4y2Ba

LMPG:gydF4y2Ba

lyso-myristoyl phosphatidylglycerolgydF4y2Ba

LPPC:gydF4y2Ba

lyso-palmitoyl磷脂酰胆碱gydF4y2Ba

LPPG:gydF4y2Ba

lyso-palmitoyl phosphatidylglycerolgydF4y2Ba

LTP:gydF4y2Ba

脂质转运蛋白gydF4y2Ba

爱:gydF4y2Ba

大单膜泡gydF4y2Ba

MALDI-TOF-MS:gydF4y2Ba

飞行时间矩阵辅助激光解吸电离质谱gydF4y2Ba

市场经济地位:gydF4y2Ba

(2) - N-Morpholino ethanesulfonic酸gydF4y2Ba

核磁共振:gydF4y2Ba

核磁共振gydF4y2Ba

种族:gydF4y2Ba

cDNA末端的快速扩增gydF4y2Ba

PMSF:gydF4y2Ba

phenylmethanesulfonyl氟化gydF4y2Ba

POPC:gydF4y2Ba

1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholinegydF4y2Ba

POPG:gydF4y2Ba

1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho - (1 ' -rac-glycerol)gydF4y2Ba

PVPP:gydF4y2Ba

polyvinylpolypyrrolidonegydF4y2Ba

组织:gydF4y2Ba

三氟乙酸gydF4y2Ba

TNS:gydF4y2Ba

(6) - p-Toluidino 2-naphthalenesulfonic酸。gydF4y2Ba

我们非常感谢伊利亚·余博士。Toropygin获得MALDI-TOF-MS和MALDI-LIFT-TOF/TOF MS/MS光谱，Yulia F. Leonova协助进行蛋白质微测序，Alexander Paramonov博士帮助进行核磁共振实验。作者感谢German Shipulin博士和中央流行病学研究所分子诊断中心提供食物过敏患者血清。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

报道的研究得到了俄罗斯科学基金会的支持(协议号为14-50-00131)。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 俄罗斯科学院生物有机化学研究所，miklukhoo - maklaya str.， 16/10, 117997，莫斯科，俄罗斯gydF4y2Ba

   Ivan V. Bogdanov, Zakhar O. Shenkarev, Ekaterina I. Finkina, Daria N. Melnikova, Eugene I. Rumynskiy, Alexander S. Arseniev & Tatiana V. OvchinnikovagydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba塔蒂阿娜诉OvchinnikovagydF4y2Ba．gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者声明他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

IVB完成了大部分的实验工作;ZOS、EIR和ASA进行了核磁共振实验;EIF进行了抗菌试验，并对工作的设计做出了贡献;DNM对脂质进行了实验;IVB和ZOS起草了手稿;TVO对工作的构思、协调研究、分析所有实验数据、对稿件进行批判性修改并准备出版。所有作者阅读并批准了最终稿件。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文根据创作共用署名4.0国际许可协议发布(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba)，该协议允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是您适当地注明原作者和来源，提供创作共用许可的链接，并说明是否有更改。创作共用公共领域奉献放弃书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)除另有说明外，适用于本条提供的资料。gydF4y2Ba

再版和权限gydF4y2Ba