比较蛋白质组学分析为抗性之间的相互作用提供了新的见解vs感病番茄品种与TYLCV侵染

背景

番茄黄曲叶病毒(TYLCV)是一种双病毒科病毒属Begomovirus.．病毒是一种广泛的植物病毒，导致西红柿的重要经济损失。越来越多地采用基因工程策略来改善西红柿对Tylcv的抵抗力。

结果

本研究采用蛋白质组学方法研究番茄叶片对TYLCV侵染的防御分子机制。利用二维凝胶电泳技术，对番茄抗性品种浙扎301和感病品种金鹏1号侵染番茄TYLCV后叶片中提取的蛋白质进行分析。鉴定了86个差异表达蛋白，并根据其功能将其分为7组。对于包括CDC48、CHI和HSC70在内的几种蛋白，实时荧光定量PCR测定的表达模式与蛋白质组学分析的结果不同。番茄叶片和TYLCV感染之间的相互作用网络为我们提供了参与响应TYLCV感染的细胞活动的重要信息。

结论

我们对番茄抗病品种和感病品种的TYLCV侵染进行了蛋白质组学比较研究。我们所鉴定的蛋白质在番茄- TYLCV互作过程中显示了多种功能和表达模式，这些结果有助于我们在蛋白质水平上理解番茄抗TYLCV的机制。

番茄黄叶卷曲病毒（Tylcv），是属的成员Begomovirus.属双生病毒科，该科有三个其他属，即Mastrevirus那Curtovirus和Topocuvirus.，并含有圆形单链DNA（SSDNA）分子为2.7-2.8kb [1那2］．TylCV基因组编码六个开放阅读框（ORF）：两个重叠ORFS AV1（编码衣壳蛋白），AV2（编码运动蛋白MP）和ORFS AC1-AC4（编码复制相关蛋白批准，转录激活剂TRA，复制增强剂蛋白分别对植物细胞分裂蛋白的诱导互补义氏菌[3.-8.］．Tylcv，由粉虱传播烟，威胁多达20种不同的植物物种，包括南瓜，烟草和番茄[9.那10.］．泰国感染从viruliberes粉虱开始B. Tabaci.通过将其悬浮液插入叶子，将病毒传递给工厂的宿主细胞[11.］．进入宿主细胞后，TylCV的SSDNA基因组开始通过滚动圆机构进行复制。TylCV可以通过复杂的细胞质和偏振物蔓延到相邻的细胞，诱导新的感染过程。

TYLCV侵染约2周后，症状日益明显，叶片黄枯、植株矮小、花朵枯萎、生长迟缓，造成严重的经济损失。越来越多的基因参与了对TYLCV感染的应答，如呻吟声[12.]，发育调节的脂素状基因SlVRSLip[13.]和转录因子，包括bhlh [14.]，AP2 / ERF [15.),南京(16.］．比较转录组和代谢组科也在抗性和易感番茄品种中进行，分析抗泰利菌感染的机制[16.那17.］．

近年来，蛋白质组学在研究植物防御反应等潜在生理过程中发挥了重要作用。鳄梨根蛋白的蛋白质组学分析Phytophthora cinnamomi.鉴定出21个差异表达蛋白，包括谷胱甘肽s-转移酶、异黄酮还原酶和几种脱落酸胁迫成熟蛋白同源物[18.］．而且，与互动的研究Lasiodiplodia theobromae.在腰果植物感染中鉴定出73个表达水平差异显著的蛋白，这些蛋白主要参与能量代谢途径、应激与防御、蛋白质代谢和细胞信号传导[19.］．

白蝇传播的双生病毒如begomovirus TYLCV对番茄生产构成严重威胁。抗TYLCV的番茄育种始于20世纪60年代末[20.］．番茄基因型与抗begomoviruses从不同的野生物种。迄今为止，5个基因座与抗性连锁已经确定：TY-1 / TY-3和Ty-4从美国chilense，ty-2来自美国habrochaites和Ty-5S. Peruvianum.[17.］．已经确定了与这些Ty Loci，Ty-1 / Ty-3和Ty-5相关的两个基因[21.那22.］．为了研究番茄与TYLCV的互作，我们对TYLCV侵染后的番茄抗病品种和感病品种进行了蛋白质组学分析。以番茄抗性品种浙扎301和感病品种金鹏1号为材料，在侵染19 d后提取叶片蛋白质，并利用二维凝胶电泳(2-DE)分析其蛋白质含量。鉴定了86种蛋白质，并将其分为不同的功能类别。采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)分析了19个编码这些蛋白的基因在感染后6个时间点(2、4、6、10、15和19 dpi)的表达水平。构建了番茄叶片TYLCV侵染反应网络。

本工作主要(1)鉴定了番茄对TYLCV侵染反应的显著表达蛋白;(2)分析了抗病和感病番茄品种间差异表达的蛋白质;(3)从蛋白质水平和生化过程水平揭示了番茄对TYLCV的防御机制;(4)分析了TYLCV侵染后番茄叶片细胞的互作网络。这些结果有助于我们理解番茄中蛋白质的反应和改变，并为番茄TYLCV感染反应的分子机制提供了深刻的见解。

抗临床感染的抗性和易感番茄品种症状

对两个叶期番茄品种(抗性品种‘浙扎301’和感病品种‘金鹏1号’)进行了毒粉虱的田间试验。两个番茄品种在10dpi时均无症状。在17 dpi时，金鹏1号的叶子有点发黄1:图S1)。与对照植株相比，‘金鹏1号’表现出典型的TYLCV表型，叶片呈卷曲黄色，dpi为19 dpi。相比之下，“Zheza-301”没有表现出任何症状(图3)。1）.为了更好地对泰国感染的发展的比较理解，收集19dPI和对照植物的两个番茄品种的叶片，并在液氮中冷冻以提取蛋白质和总基因组DNA。为了检测TylCV累积，使用引物TylCV-01进行半定量PCR（附加文件2：表S1）。如图1所示。2在对照植株中，‘Zheza-301’和‘Jinpeng-1’在不同的PCR循环下均无TYLCV积累。在TYLCV侵染植株中，经过23个PCR循环后，‘金鹏1号’的TYLCV DNA表达量较高，而‘浙扎301’的TYLCV DNA表达量较弱或不表达。经过约25个循环后，TYLCV在‘浙扎-301’中明显存在，但水平低于‘金鹏1号’。

番茄TYLCV侵染后叶片蛋白的2-DE分析

如前文所述，在感病品种‘金鹏1号’叶片呈黄色卷曲时，以19 dpi采集样品进行蛋白提取。2个番茄品种(‘Zheza-301’:对照和TYLCV侵染;金鹏1号:对照和TYLCV感染)用2-DE分离。三个生物复本的代表性地图见附加文件3.:图S2。

在每个凝胶中检测到超过500个蛋白质点，具有不同的表达丰度。检测差异表达的蛋白质，蛋白质丰度Z_T./ Z._C(Zheza-301处理/对照厂)和J_T./ J._C(金鹏1号处理/对照)每点进行计算。Z_C/ J._C和Z_T./ J._T.还计算出分析两种番茄品种之间的差异。共有86个斑点，表观分子量在26.08和114.02kda和等电点之间（PI.）4.69和8.96之间显示出与超过2.0倍或小于0.5倍的丰度比（差异图显著差异表达。3.）.鉴定的蛋白质如表所示1．在86个蛋白斑点中，四个斑点（点34点，点35点，点36和斑点53）显示出表达没有显着差异，但两种番茄品种之间表达的显着差异。这些蛋白质在19 dpi的泰国感染没有显着反应，但与两个西红柿品种之间的差异有关。在两个番茄品种中的TylCV感染中显着差异表达的蛋白质如图2所示。4.．

TYLCV感染相关蛋白的功能分类

所有86个差异表达的蛋白质成功地鉴定为植物蛋白。如图1所示。5，将蛋白质根据基因的京都百科全书和基因组（KEGG）分类为以下功能类别（http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html):光合作用27个(31.4%)，蛋白质代谢15个(17.4%)，碳水化合物代谢和能量13个(15.1%)，氨基酸代谢12个(14.0%)，解毒和抗氧化7个(8.1%)，信号转导6个(7.0%)，伴侣6个(7.0%)。在两个不同的番茄基因型‘浙扎301’和‘金鹏1’中，所鉴定的蛋白质的功能分类相同。5 c）.

在参与光合作用的27个蛋白质中，11个酶，包括驾驶室（叶绿素A-B结合蛋白，斑点1-3）[23.那24.， OEE1(氧进化增强蛋白1，斑点4,5)[25.那26.]和LFNR (ferredoxin-NADP还原酶，叶型同工酶，斑点22,23)在光依赖反应中起重要作用(表22,23)1）.其他16种酶，如核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(RuBisCO，斑点11-14)和碳酸酐酶(斑点24,25)，参与卡尔文循环[27.］．参与碳水化合物代谢和能量的蛋白质有13种，如GAPDH(甘油醛3-磷酸脱氢酶，spot 28)、AH (aconitate hydratase, spot 33)、EA(烯醇化酶，spot 35)、ID(异柠檬酸脱氢酶，spot 38)和CHI(几丁质酶，spot 40)。CAR(伤口诱导羧肽酶前体，位点41,42)，CDC48(细胞分裂周期蛋白48同源物，位点51,52)，PRO(枯草杆菌素样蛋白酶前体，位点54)和真核起始因子4A-2(位点46,47)参与蛋白质代谢。一些蛋白被确认参与信号转导或作为伴侣，如HSP83(斑点69,70)，HSC70(斑点71)和14-3-3蛋白(斑点74,75)。解毒和抗氧化是植物生存所必需的。在TYLCV侵染过程中，两种番茄基因型均检测到PPO(斑点85)、Glo I(斑点83)和APX(斑点80-82)。鉴定出12个与氨基酸代谢相关的蛋白，包括GLDC(甘氨酸脱氢酶(脱羧)，斑点60-62)，THD(苏氨酸脱氨酶，斑点63-65)，MAT (s -腺苷蛋氨酸合成酶2，斑点59)和CYS(半胱氨酸合成酶，斑点66,67)。

在TylCV感染后鉴定在抗性和易感番茄品种中的差异表达蛋白质

86种蛋白质在两个番茄品种间的表达模式存在差异。差异表达蛋白点的热图提供了两个tylcv感染番茄基因型中蛋白表达修饰的概述(图2)。6.）.通常，'Zheza-301'中的大多数蛋白质显示下调的表达谱。在'金鹏-1'中，上调和下调蛋白质的比例几乎是相同的。在“Zheza-301”中，在TylCV感染和对照样品之间调节71种蛋白质，表达水平的28个蛋白质增加，43个蛋白质降低。在“金鹏-1”中，59个蛋白质似乎被改变，并且分别上调和下调这些28和31的蛋白质（图。4.）.在86个蛋白质斑点中，在“Zheza-301”和“金鹏-1”中，17个蛋白质的表达水平上调，包括OEE1（点5），HSP83（点69）和PPO（点85点）。在两种品种中，共有24个蛋白质点被鉴定为下调表达水平，包括14-3-3蛋白（斑点74,75）和Rubisco（斑点11-14）。一些蛋白质显示出两种品种表达模式。斑点48,62和66的表达水平在“Zheza-301”中显示了上调，但在“金鹏-1”中的下调（表2）.蛋白质表达模式的差异表明几种蛋白质在番茄抗病和感病品种对TYLCV侵染的响应中发挥着不同的作用。

表达式的分析Ty-1和Ty-5番茄TYLCV侵染后的基因

两个基因,即Ty-1和Ty-5与泰轨迹关联，已经在番茄鉴定。的表达模式Ty-1和Ty-5使用QRT-PCR在'Zheza-301'和'金鹏-1'番茄品种中进行分析（图。7.）.在'Zheza-301'中，表达模式Ty-5在感染后六个时间点（2,4,6,15和19dpi）在六个时间点上调，并且在15 dpi下达到峰值，增加5倍。表达水平Ty-1当它增加约3倍时，直到19 dpi直到19 dpi明显增加。的表达模式Ty-1和Ty-5均在‘金鹏1号’中上调。表达水平峰值为Ty-1和Ty-5在“金鹏-1”中观察到在2 DPI中观察到，增加30倍，10 dpi分别增加70倍。

番茄中泰国感染蛋白的表达谱分析

19个编码蛋白质的基因，oee.那出租车那LFNR.那ID那啊那ea那GAPDH那车那PPO.那APX.那如果我那ch那CDC48那GLDC.那半胱氨酸那垫那th那HSC70和箴，根据我们的2-DE结果选择，并进行表达模式分析。为了确定19个选择的基因在不同疾病感染阶段的表达差异，在感染后的6个时间点(2,4,6,10,15,19 dpi)进行qRT-PCR(图2)。8.和9.）.

表达水平ch那啊那HSC70和垫在早期阶段（2,4和6 dpi）不同于19dpi的阶段。在2,4和6 dpi，ch那啊和HSC70在“Zheza-301”中被负调控。的表达ch那啊和HSC70在19 dpi上上调（图。8.和9.）.解毒和抗氧化功能基因在不同侵染期的表达模式不同。Glo I可以通过与Glo II合作将2-氧醛转化为活性较低的2-羟基酸。在《Zheza-301》中如果我和APX.在2和4 dpi时降低(图。8.）.在19 dpi，转录水平如果我和APX.在“Zheza-301”上调（图。9.）.的表达模式PPO.和箴在感染后的所有时间点，分别在两种番茄品种中对番茄品种产生负面调节。以前的研究表明，CDC48可以通过从内质网传输途径中除去病毒编码的MP，并通过促进MP与微管动态的干扰来损害烟草病毒（TMV）运动。表达水平CDC48在'金鹏-1'高于“Zheza-301”的时间点。在2,4和6 dpi，表达模式LFNR.那啊那ch那CDC48那半胱氨酸那HSC70和PPO.在“浙扎301”中被下调。相比之下，oee.那出租车那ID那啊那车那APX.那如果我那ch那CDC48那GLDC.那th那HSC70和箴' Zheza-301 '在19 dpi水平上调。因此，这些基因可能通过正调控机制响应TYLCV感染(fig。8.和9.）.

qRT-PCR与2-DE检测表达模式的比较分析

比较了使用QRT-PCR和2-DE观察19dPI的表达模式。在“Zheza-301”，五种蛋白质，即OEE，CAR，GLDC，THD和Pro在QRT-PCR和2-DE结果中积极调节。在“金鹏-1”中，OEE的蛋白质丰富，啊，奇，CDC48，THD，HSC70和GLO我的增加。在两种分析中，LFNR的表达水平下调。使用QRT-PCR检测到的基因的转录水平与使用2-de检测到的蛋白质的蛋白质丰富并不好。驾驶室在光合作用中起作用，在两种分析中显示出相反的表达模式。在'Zheza-301'中的Glo I的蛋白质丰度降低但是通过QRT-PCR测量的转录水平在19dpi的19 dpi中增加了约3倍。在2段中，两种番茄品种PPO的蛋白质丰度增加了大约10倍;相比之下，如使用QRT-PCR测量的转录水平降低（图。9.， 桌子1）.

植物使用补偿性策略来保护自己免受病原体等病毒和昆虫的各种侵略。与毒性粉底的侵染会在西红柿造成广泛的伤害。将控制和泰国感染的番茄品种中鉴定的蛋白质分为不同的基团，例如与防御相关的蛋白质，伴侣和信号转导蛋白。这些组响应于TylcV感染而发挥了不同的作用。鉴定了几种蛋白质产生了多个不同的斑点PI.和分子质量，这表明存在亚型和翻译后修饰[28.］．抵抗TylCV感染的能力在不同的西红柿品种之间变化。以前的研究表明，'Zheza-301'和'金鹏-1'表现出不同的抗泰缅感染抗性[15.那29.］．在感染TYLCV 2个月后，‘浙扎301’具有抗性，发病率为45.0%，病害指数为9.0。金鹏1号对TYLCV易感，发病率为90.0%，病指数为60.9 [29.］．因此选择了两种番茄品种“Zheza-301'and'Jinpeng-1”，以进一步分析对TylCV感染的反应机制。

对不同阶段的抗性和易感番茄品种抗核癌感染的反应

番茄对TYLCV感染的反应涉及一种复杂的防御机制，该机制与转录因子和涉及丝裂原活化蛋白激酶的基因调控网络有关[15.那16.］．这种反应与解剖结构相关[30.，番茄基因型[31-33]和不同的感染阶段[17.那33］．Glick和他的同事报告说，番茄TYLCV感染的早期(2周前)和后期(4周后)阶段的症状和反应是不同的[34］．番茄植株出现TYLCV感染2周后正常的，那么容易番茄品种的叶子变黄和卷曲随着时间的推移，与新形成的叶子较小和瘪。在后期阶段，整个植株停止生长，这会导致严重的产量损失[15.那34］．在不同的感染阶段，应分析西红柿对TylCV感染的反应。为了确定编码抗TylCV感染的基因，已经在TylCV感染的早期和后期进行了一些研究[16.那17.那33那35那36］．对3,5和7 DPI进行了比较转录组分析，用于抗性和易感番茄品种[16.］．比较代谢组学和转录组学在1、3、7和14 dpi对TYLCV侵染的反应也在两个番茄系中进行了研究[17.那36］．阿迪等。分析应力响应TYLCV感染番茄4周后，这是足以使差动外壳蛋白（CP）的聚集[发展33］．miozzi等。典型全身症状后6周后6周后泰利治疗感染诱导的转录变化[35］．然而，番茄对TYLCV感染中期(约3周)的反应迄今尚未见报道。

'Zheza-301'（抗性番茄品种）和'金鹏-1'（易感番茄品种）对TylcV感染的反应是复杂的和长期。蛋白质组学方法用于研究抗性和易感番茄品种，了解中期番茄品种中TylCV感染的反应（〜3周）。在19 dpi，在“金鹏-1”中发现了一种典型的Tylcv表型，但在'Zheza-301'中没有观察到症状。当遇到压力条件时，植物可以触发与能量新陈代谢相关的事件网络[37］．这个网络中的大多数蛋白质参与光合作用、碳水化合物代谢和能量代谢。这一发现表明了能量代谢在应对TYLCV感染中的重要性。碳水化合物代谢的变化与能量分配和长期防御过程有关[38］．TYLCV侵染番茄后，整个侵染期番茄植株的能量代谢和创伤反应均发生变化[2那7.-10.］．通过QRT-PCR在2,4,6,10,15和19dpi之后通过QRT-PCR分析编码具有不同功能的蛋白质的19个选定基因的表达模式。通过QRT-PCR和2-DE揭示了代谢途径和不同表达水平的变化。两种番茄品种的症状是由19 dpi的Tylcv感染引起的综合反应结果。

与国防有关的蛋白质

在病毒与宿主相互作用的某些过程中，最近的研究报道了一些氧化应激的产生和碱基损伤是由活性氧(ROS)引起的，如H₂O.₂[39-42］．超氧化物歧化酶和抗坏血酸 - 谷胱甘肽循环涉及H的击穿₂O.₂进入h.₂o和O.₂[43那44］．将三种APX（斑点80-82）同种型被识别为具有不同的表达模式。斑点81在蛋白质丰富率方面显示出上调的表达，“Zheza-301”（表1）.表达水平APX.随着使用QRT-PCR测量的，在19dpi上上调，其与2-de的结果一致。PPO在植物中普遍存在，并对植物防御造成害虫和病原体的重要作用[45-47］．PPOs可以催化酚类氧依赖氧化成醌类，这可能对病原体有直接的抗生素和细胞毒活性[45］．在我们的研究中，在使用2-de测量的两种品种中高度表达一个PPO蛋白，特别是在“Zheza-301”中，其中蛋白质丰度率增加了15倍。相比之下，表达模式PPO.使用QRT-PCR测量的基因在'Zheza-310'和'金鹏-1'中表现出下调的表达谱。

除了PPO，APX，乳酰戊酰胺蛋白酶蛋白（点83），称为甘氨酸酶I（GLO I）的叔甘油溶解于番茄品种。该酶催化来自甲基乙二醛和谷胱甘肽的S-D-LactoylglutaThione的形成，以减少损伤[48］．甲基乙二醛是一种细胞毒性和诱变α-酮醛，其在植物中非生物胁迫下显着增加（2-6倍）[49］．该化合物可以用蛋白质和核酸形成加合物，损坏细胞功能[49-52］．如果我那encoding the Glo I protein, showed up-regulated transcription levels of about 3.0-fold and 2.5-fold in ‘Zheza-301’ and ‘Jinpeng-1’ at 19 dpi, respectively, while the protein abundance ratio was down-regulated in ‘Zheza-301’ (Fig.9.， 桌子1）.Chi是一种致病性相关的蛋白质，可通过真菌，细菌或病毒攻击显着诱导，并且可以在真菌细胞壁中水解几丁质以保护植物免受生物和非生物胁迫的影响[52-54］．在TylCV感染后，CHI蛋白的活性比喷洒与丁烯醇喷涂的未感染的西红柿增加。在该研究中，Chi蛋白在'Zheza-301'和'金鹏-1'中诱导。'金鹏-1'中的蛋白质丰度比在“Zheza-301”中的4.2倍。定量PCR显示出显着增加的表达ch“Zheza-301”和“金鹏-1”中的基因分别在10dpi和12倍和35倍的增加，在19dpi上增加（图。8.和9.）.两种品种中Chi蛋白的类似表达模式表明Chi蛋白在植物的抗性中发挥着重要作用至Tylcv。

陪伴

当植物细胞面临不利条件时，蛋白质的错误折叠或展开会伤害它们[55那56］．许多研究表明，热休克蛋白(heat shock proteins, HSPs)可以折叠蛋白质，以维持细胞内稳态，并在不利条件下重建正常的蛋白质构象[24.］．HSC70S是一系列主要的伴侣类系列，可在一系列蛋白质折叠过程中起始，包括蛋白质进口和易位，促进不稳定蛋白的降解[57那58］．另一项研究表明，HSP83蛋白参与了一种普遍的调控机制，并控制多种细胞功能[59那60］．在鳄梨，用oomycete感染后诱导17.3 kda热休克蛋白Phytophthora cinnamomi.[18.］．HSP70.在接种的腰果厂之后过度代表Lasiodiplodia theobromae.感染 [19.］．在本研究中，在TylCV感染后，在“Zheza-301”和“Zheza-301”和“金鹏-1”中鉴定了HSP83的HSP83的两种同种型。HSP83和HSC70显示出较高的蛋白质丰度比，分别增加了9.5倍，9.2倍，In'jinpeng-1'。如图1所示。9.，的转录水平HSC70在番茄品种中占据了12倍（在'Zheza-301'）和8倍（在'金鹏-1'）的表达中。所有这些结果表明，HSP在番茄中批识和纠正错误的蛋白质中发挥着至关重要的作用。

信号转导蛋白

14-3-3蛋白是植物细胞信号转导和初级代谢的重要调节蛋白，在真核生物中广泛存在;这些蛋白质调节植物发育，保护植物免受不利条件的影响[61那62］．以往的研究表明14-3-3蛋白可以对各种非生物胁迫做出反应，如环境胁迫[63]代谢/营养应激[64]，取食和伤口应力[65]和生物应激，如稻瘟病菌和黄oryzae在水稻61］．14-3-3蛋白可能通过参与各种信号转导过程来控制激酶和磷酸酶的活性[66］．TylCV感染后，'Zheza-301'和'金鹏-1'中14-3-3蛋白的蛋白质丰度比显示出显着下降。这种减少表明响应于TylCV感染而下调14-3-3。

参与Tylcv感染的其他重要蛋白质

丝氨酸羧肽酶在植物生长发育中起重要作用，参与蛋白质水解、信号转导以及对创伤和不利条件的响应[67-71］．CAR的两种同种型（点41，42）被确定为在所述两个番茄品种具有正蛋白丰度比（表1）.如通过定量RT-PCR和2-DE（图测量CDC48上调在两个“金鹏-1”和“浙杂-301”。9.， 桌子1）.如图1所示。9.，三种基因的表达模式（OEE1.那出租车和LFNR.)，它们编码与光合作用有关的蛋白质，以及四个能量基因(GAPDH那ea那啊和ID与碳代谢相关的，通过QRT-PCR在19dpi中鉴定出碳代谢。转录水平OEE1.那出租车那ID和啊较高无论是在“浙杂-301”和“金鹏-1”。LFNR.和ea编码铁氧脱氧核糖核酸还原酶和烯醇化酶的基因表达下调。GLDC.那半胱氨酸那th和垫参与氨基酸代谢的参与，在两种番茄品种中显示出不同的转录曲线。th增加5-和在“浙杂-301”和“金鹏-1”分别为10倍，。垫在两个番茄品种中均有下调。在2-DE和qRT-PCR分析中，ID的表达水平相反，2-DE表达下调，qRT-PCR表达上调(图1)。9.， 桌子1）.从基因到相应蛋白质的复杂过程涉及复杂的翻译和修饰，这可能导致基因和蛋白质之间观察到的表达水平差异。

不同番茄品种的Tylcv CP聚集

TYLCV的CP形成衣壳，并显示各种功能[72］．gorovits等。在14 dpi下检测到易受影响的'906-4'番茄植物中表达水平的Tylcv Cp，但在耐药的'902'番茄植物中直到21 dpi [31］．在我们的研究中，2-DE在抗性品种‘浙扎-301’和感病品种‘金鹏1号’在19 dpi时均未检测到TYLCV CP。使用PDQuest软件，采用自动化模式(数据未显示)，共鉴定了500个不同蛋白丰度的蛋白点。人工选择86个表达水平明显不同的蛋白点，切除后采用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOF MS)分析。CP蛋白点可能没有被切除;因此，未检测到CP蛋白。CP蛋白可能是414个未被分析的位点之一。

病毒复制，转录，翻译和运动，以及病毒接种剂量和接种方法，影响番茄植物中TylCV CP的聚集水平[31］．不同的番茄基因型和对TYLCV侵染的抗性也影响TYLCV CP的表达。TYLCV感染后，宿主化合物如伴侣、蛋白酶和胁迫诱导蛋白也有助于维持番茄植株中的小团聚体[32］．“金鹏1号”和“906-4号”对TYLCV感染的遗传背景和抗性存在差异。因此，这些参数影响了TYLCV CP的积累[20.那29.］．为了分析TYLCV CP在番茄中的积累，我们将在进一步的研究中延长TYLCV感染时间或使用相对和绝对定量等压标签(iTRAQ) [73］．

番茄叶片中TYLCV感染反应网络的推测

在蛋白质组学分析的基础上，在番茄叶片中鉴定出86个蛋白质。提出了一个TYLCV感染反应网络，包括86个TYLCV应答蛋白中的大部分，这些蛋白参与了系统获得性抗性、氧化还原稳态、光合速率、能量代谢、蛋白质水解和氨基酸水解等功能过程。

如图1所示。10.，番茄叶在TylCV感染后感知应力信号，通过位于膜上的一些受体，并通过信号转导过程将其传递给细胞机制，这些过程改变了许多细胞和代谢过程。响应于Tylcv感染和系统性，诱导了诱导包括CHI和β-1.3-葡聚糖酶的某些激素等激素的水平，例如包括CHI和β-1.3-葡聚糖酶的疾病相关（PR）蛋白质获得性阻力[32那74］．TYLCV侵染番茄后ROS含量增加，导致番茄叶片氧化还原失衡。为了维持氧化还原稳态，抗氧化酶如SOD、APX、Glo I和PPO的合成会增加以降低ROS水平，使细胞达到氧化还原平衡。RuBisCO、LFNR和CAR蛋白下调会影响番茄叶片的光合速率(见表)1）.TYLCV侵染番茄后，番茄能量代谢通过上调ID和啊，这提高了番茄叶响应TylCV感染并降低损伤的能力（图。9.）.TYLCV感染后，番茄叶蛋白质生物合成是通过EF-4A-2的下调抑制，而因为PRO和CAR蛋白的上调的蛋白水解增加。的番茄叶氨基酸代谢受THD和GLDC蛋白的过表达增强。

番茄叶片通过细胞信号转导和代谢过程的变化，努力抵抗TYLCV侵染，适应或减少TYLCV造成的损害。在目前的研究中，番茄叶片与TYLCV感染之间的相互作用网络为我们提供了重要的信息，以了解番茄叶片响应TYLCV感染的细胞活动策略。

与用于研究植物-病毒相互作用的其他“组学”进行比较分析

“OMICS”技术，包括转录组织，蛋白质组学和代谢组学，可以应用于监测和捕获在转录物，蛋白质和代谢水平的不利条件下发生的完全变化[75那76］．在植物中，Geminivirus感染，包括TylCV，很少进行转录组分析。通过转录组织鉴定了总共3604个基因和34,83​​1种转录物，如MioZzi等人所述。和陈等人。分别[16.那35］．使用蛋白质组学，在该研究中仅鉴定了86种显着差异表达的蛋白质。由于转录物不稳定性和转录后改性，转录物水平的基因表达的变化与蛋白质水平的改变并不好。编码参与TylCV感染的不同蛋白质的基因通过转录组和蛋白质组学分析揭示;这些基因包括在内HSP那ch和半胱氨酸．基因本体学分析还证明通过转录组和蛋白质组学分析鉴定的基因主要涉及对生物应激，氨基酸代谢和蛋白质降解的反应。通过转录组织可以通过转录组织鉴定监管因素，例如MyB，NAC和Wrky，但不是通过蛋白质组学分析来识别。这些蛋白质通常难以进行调查，因为它们的低积累[16.那35］．

在植物的先天免疫反应中，小分子可以通过代谢组学方法进行详细分析，化合物可以通过代谢组学方法进行鉴定[77］．全球基因表达和代谢谱的结合是一种强有力的方法，可以提供与病原体感染相关的细胞动力学的全面见解[17.那33］．TYLCV感染后，大量代谢物参与多个代谢途径，如苯丙素和木质素;这些代谢物在抗病和感病番茄品种间表现出不同的调控机制[17.］．葡萄糖胺是一种参与ROS代谢的代谢化合物;在感染早期，葡萄糖胺的含量减少，但在25-28 dpi时急剧增加[33］．在两个番茄品种中，参与抗氧化的APX蛋白丰度(斑点81)上调(见表)1）.结果表明，番茄中泰国泰国感染的防御中发生初级和次生代谢物的变化。

蛋白质组学已被用于研究番茄抵抗病原菌感染的潜在功能机制[78那79］．在受tylcv感染、tmv感染和黄瓜花叶病毒(CMV)感染的番茄植株的蛋白质组学数据中，已鉴定出包括APX和OEE在内的蛋白质[78那80］．在Tylcv感染和TMV感染的番茄植物中已经鉴定了Chi和Lap。发生TylCV和CMV感染后，在番茄植物中改变光合作用，能量代谢和碳代谢。诱导涉及防御反应的蛋白质。用作伴侣的HSP，在TylCV感染后4周诱导和19 dpi [33］．

进行了抗性和易感番茄品种叶片的综合蛋白质组学分析。在两种品种的TylCV感染后，在蛋白质丰富比中以超过2倍或小于0.5倍的蛋白质丰富比鉴定了八十六个蛋白质。分为七种官能团，泰利菌感染后鉴定的蛋白质在番茄 - Tylcv相互作用过程中发挥了不同的作用。番茄叶和Tylcv感染之间的相互作用网络为番茄叶细胞提供了有关可能活动的信息。结果将有助于找到番茄 - TylCv相互作用的关键蛋白质，以增强对TylCV的抗性并获得病毒感染的保护。

植物材料和TylCV感染

In this study, resistant tomato cultivar ‘Zheza-301’, derived from T5678161-1-1-2-2 and T07-018, and susceptible tomato cultivar ‘Jinpeng-1’, a hybrid of Holland tomato cultivar 99-13A and 9708B from America, were chosen as the source for the comparative proteomic analysis. ‘Zheza-301’ was identified as carrying the Ty-2 locus, which because T07-018 was selected from the 4th generation of the ‘CLN2498E’, breeding to contain theTy-2抗性基因[81］．番茄品种浙杂301和金鹏1号的种子分别来自浙江省农业科学院蔬菜研究所和西安金鹏种子有限公司。番茄‘Zheza-301’和‘jinpeng1’的幼苗在25°C/18°C、12 h/d、相对湿度60 - 70%的条件下生长[29.］．由江苏省农业科学院农业生物学省级重点实验室提供的毒粉虱，被允许在一个防虫温室中取食番茄植株。将二叶期番茄苗移送到防虫温室，使其接触带毒的白蝇。将对照植株转移到无毒粉虱的防虫温室。感染tylcv的番茄植株分别在2,4,6,10,15,19 dpi收获叶片。为了更好地比较抗病和感病番茄品种的侵染过程，对两个番茄品种的叶片进行了19 dpi处理;此时，“金鹏1号”出现了黄叶卷曲等全身症状，而“浙扎301号”则没有。在19 dpi下采集对照和病番茄品种的叶片并冷冻提取蛋白质。

蛋白质提取和2-de

每个样品采集3个生物重复以提高准确性。根据Bio-Rad (Hercules, CA, USA)二维手册，采用丙酮/三氯乙酸(TCA)沉淀法提取蛋白质，稍加修饰。番茄叶片样本粉暂停在10% w / v TCA /丙酮包含1毫米phenylmethanesulfonyl氟化物(PMSF)和0.07% w / vβ巯基乙醇,并举行−20°C 1 h。大约800μL的溶菌作用的解决方案(包含7 M尿素,2 M硫脲,4% (w / v) 3 - [(3-cholamidopropyl) dimethylammonium] 1-propanesulfonate,用65 mM二硫苏糖醇、1 mM PMSF和0.5% v/v生物电解质溶解离心后的真空干燥颗粒。离心后，不溶性物质被去除。采用Bradford方法对每个样品的蛋白浓度进行量化[82］．将每个样品的约1500μg蛋白质加载在24cm非线性梯度固定的pH梯度条（pH 4-7）上，并在20℃下进行IEF：50V，持续13小时，100V，200V，用于1小时，1000 v 1小时，8000 v 3小时，8000 v总共110,000 VH。之后，使用12％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）用于第二电气尺寸。通过用Coomassie辉煌的蓝色G-250染色来观察蛋白质。使用自动化模式的凝胶扫描仪（PowerLOOK 2100xL，UMAX）和PDQUEST软件包（VER 7.2.0; BIO-RAD）分别用于数字化和分析凝胶图像[83］．基于具有百分比体积的参数的凝胶的总密度，检测到斑点，匹配和标准化。随后，计算每个点的平均相对体积三种生物重复，并且被认为是差异表达蛋白质的蛋白质的蛋白质的斑点且小于0.5倍以下的蛋白质丰度。实验设计在附加文件中显示4.：图S3。

In-Gel消化和MALDI-TOF-TOF MS分析

人工切除差异表达蛋白斑点，用Millipore纯水洗涤3次，用50 mM nhh染色2次_4.HCO_3.在50％乙腈（ACN）。随后，10mM的二硫苏糖醇的50mM NH_4.HCO_3.用于将40mM碘乙酰胺的烷基化减少50mM NH_4.HCO_3.．将ACN(100%)晾干两次，在37℃下用测序级改良胰蛋白酶(Promega, Madison, WI, USA)在50 mM NH下消化过夜_4.HCO_3.．用0.1%三氟乙酸(TFA)在50% ACN中提取2次。将冻干后的胰肽混合在含0.1% TFA和50%乙腈的5 mg/mL CHCA中溶解。使用4800 plus MALDI-TOF-TOF TM分析仪(美国福斯特市应用生物系统公司)进行分析。

采用MASCOT程序在线搜索所有蛋白谱数据库(http://www.matrixscience.com），针对NCBINR数据库。搜索参数如下：肽0.15A质量耐受TOF-TOF片段的大众耐受性，一种允许胰蛋白酶切片，胱氨酸（CYS）的氨基甲酰基作为固定改性，氧化氨基氧化（MET）和吡喃 - 谷氨酰胺（Glu）形成N-末端戊酮（GLN）和Glu作为可变改性。为了选择显着的命中，将每个斑点（治疗/对照）的蛋白质丰度与2.0倍以下或小于0.5倍的蛋白质丰度为选择标准。只接受了由吉祥物概率分析鉴定的显着命中。

表中显示的每个斑点的蛋白质丰富率1使用log2变换进行分析归一化，然后使用HemI 1.0软件生成具有分层聚类的热图[84］．

半定量PCR和qRT-PCR分析

用RNA试剂盒(RNA simple total RNA kit, Tiangen, Beijing, China)提取番茄叶片总RNA，用Primer Script RT试剂盒(TaKaRa, Dalian, China)转录成cDNA。SYBR预混物qRT-PCRTaq交货使用ABI7500 (Applied Biosystems, Foster, CA, USA)进行:95°C 30 s，然后在95°C 5 s和60°C 30 s下进行40个循环，并在65°C 10 s下进行熔化曲线分析(61个循环)。利用Primer Premier 5.0软件对所选蛋白进行引物设计一潜能素(Solyc04g077020.2)调节表达水平[85］．两个基因的表达模式(Ty-1和Ty-5与泰轨迹相关联）TYLCV感染的不同品种番茄后进行了评估，18S核糖体RNA作为使用以下引物5'-GCGACGCATCATTCAAATTTC-3'和5'-TCCGGAATCGAACCCTAATTC-3'[参考22.］．

为检测TYLCV感染后是否有TYLCV DNA的积累，采用引物TYLCV-01 F/R进行半定量PCR。一潜能素用作半定量PCR和QRT-PCR的内部控制。使用DNA试剂盒（DNAsecure Plant Kit，Tiangen，北京，北京，中国）从两种番茄品种（对照和治疗）的叶子中提取总DNA。PCR的条件和参数为95℃，5μm，然后在95℃下进行不同的循环（23,25,27和30），持续30s，54℃，72℃，72℃，然后72°C 10米。研究中使用的引物显示在附加文件中2：表S1。

2-DE:二维凝胶电泳;脱落酸ABA;ACN:乙腈;AD:芳基醛/乙醇脱氢酶相关蛋白;啊,aconitate水合酶;APX型抗坏血酸盐过氧化物酶;CAB:叶绿素a-b结合蛋白4;伤诱导羧肽酶前体CAR;CDC48，细胞分裂周期蛋白48同源物;气,几丁质酶; CMV, cucumber mosaic virus; CP, coat protein; CYS, cysteine synthase; dpi, day post infection; EA, enolase; GAPDH, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; GLDC, glycine dehydrogenase (decarboxylating); Glo I, lactoylglutathione lyase; Glu, glutamicacid; ID, isocitrate dehydrogenase; iTRAQ, isobaric tags for relative and absolute quantification; JA, jasmonicacid; KEGG, kyoto encyclopedia of genes and genomes; LAP, leucine aminopeptidase; LFNR, ferredoxin--NADP reductase, leaf-type isozyme; MALDI-TOF-TOF MS, matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry; MAT, S-adenosylmethionine synthase 2; MG, methylglyoxal; MP, movement proteins; OEE, oxygen-evolving enhancer protein; ORF, open reading frame;PI.等电点;PMSF phenylmethanesulfonyl氟化物;PPO,多酚氧化酶;公关,pathogenesis-related蛋白质;PRO:枯草菌素样蛋白酶前体;qRT-PCR，实时定量聚合酶链反应;ROS，活性氧;RuBisCO:核酮糖- 1,5 -二磷酸羧化酶;SA,水杨酸;SDS-PAGE:十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳; ssDNA, single-stranded DNA; TCA, trichloroacetic acid; TFA: trifluoroacetic acid; THD, threonine deaminase; TMV, tobacco mosaic virus; TYLCV, tomato yellow leaf curly virus

该研究得到了江苏自然科学基金（BK20130027），大学新世纪优秀人才（NCET-11-0670），江苏高等教育机构项目的优先学术计划开发（PAPD）。

可用性数据和材料

支持本文结论的数据集包含在文章及其附加文件中。

作者的贡献

ASX和YH构思和设计的实验中，YH，HYM，WH，ZSX和FW进行的实验，YH，HYM和ASX分析数据，YH写文章。ASX和YH修订的文件。所有作者阅读并认可的终稿。

利益争夺

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

同意发布

不适用。

伦理批准和同意参与

不适用。

从属关系

1. 南京农业大学园艺学院作物遗传学和种质增强国家重点实验室，1魏刚，南京，江苏210095

   黄颖，黄伟，王峰，徐志生，熊爱生

2. 2 .南京农业大学植物保护学院，江苏南京210095

   红玉马

通讯作者

对应于Ai-Sheng熊．

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