单一和多重抗性QTL延缓症状的出现，减缓根系定植丝囊euteiches在豌豆近等基因系中

背景

了解抗性QTL对病原体发育周期的影响是创建QTL组合策略以持久提高植物抗病性的重要问题。oomycete病原体丝囊euteiches，引起根腐病，是限制在主产国豌豆作物的主要因素之一。没有商业抗病品种是目前在欧洲上市。在七个主要QTL抗性等位基因近日被确定，并渗入到豌豆农艺系，导致产生的QTL近等基因系（近等基因系）的。本研究旨在确定的主要作用答:euteiches在病原生命周期的不同步骤中抵抗QTL。

结果

在控制条件下进行破坏性试验，对敏感遗传背景中主要QTL上携带抗性等位基因的NILs进行鉴定。在接种10 d后测定根腐病的发展情况、严重程度和根内病原菌DNA水平。多个抗性等位基因在两个主要QTL上均表现显著AE-PS7.6.和AE-PS4.5用答:euteiches．在其他三种次要效应QTL的一些阻力等位基因（Ae-Ps2.2那Ae-Ps3.1和AE-PS5.1.)显著降低根定殖。抗性等位基因在两个或三个QTL上的组合，包括主效QTLAE-PS7.6.（AE-PS5.1./AE-PS7.6.或Ae-Ps2.2/Ae-Ps3.1/AE-PS7.6.)对延迟症状出现和/或减缓根定殖有增强作用答:euteiches与植物抵抗水平相比，与个体或无阻力等位基因的影响相比。

结论

本研究证明了单或多阻力QTL对延迟症状外观和/或减慢殖民化的影响答:euteiches在豌豆根中，采用原始植物材料和精确的病原菌定量方法。我们的研究结果表明，单一抗性QTL可以作用于病害发展周期的多个或特定步骤，它们的作用可以叠加，以提高豌豆品种的部分抗性。需要进一步研究QTL在病原菌生命周期不同阶段的作用，以及在病原菌生命周期相同阶段的QTL的堆积策略的有效性和持久性。

遗传抗性是植物病害可持续管理的主要途径。虽然多基因部分抗性被认为比单基因完全抗性更持久，但这种抗性的机制尚不清楚[1那2］．只有几项研究鉴定了抗性定量性状基因座的基因（QTL）[2-4.］．这些研究表明，大多样性的基因功能涉及多基因植物阻力[5.］．这种抗性QTL机制的多样性表明，抗性QTL针对病原菌生命周期的不同阶段，事实上，已有报道称部分抗性作用于病原菌发育的不同阶段。针对病原菌生命周期中不同阶段的抗性QTL进行堆积，可以更好地阻止疾病的发展，从而提高抗性水平。它也可能使病原体更难适应，从而成为一种提高耐药持久性潜力的方法[6.-8.］．抗病QTL所针对的病原菌生活史性状或发育周期步骤很少有研究，由于QTL难以亲和和单独归属于表型，因此更加复杂。以往研究采用的方法包括在病原生命周期特定步骤的双亲本群体中检测植物抗性的QTL，以及评估不同抗性QTL渗入敏感遗传背景的近等基因系(NILs) [9.那10.］．使用NILS，显示两个QTL，专门用于不同阶段Setosphaeria turcica玉米叶片渗透和定殖的循环[7.］．与此相反，在PUCCINIA Striformis./大麦相互作用，三QTL据报导通电阻（潜伏期，感染效率，病变的大小和密度脓包的几个部件单独行动;11.])。

隐孢子菌根腐病，由土传卵菌引起丝囊euteichesDrechs。[12.]，是豌豆的一个主要限制，栽培是因为其蛋白质含量和固定大气氮的能力。这种病在小根上引起半透明的病变，演变成棕色腐烂，影响整个根系和上胚轴[13.］．在地上，疾病导致黄叶甚至死亡。两个主要答:euteiches豌豆报道了病理型[14.］．致病型我是在欧洲占主导地位，并在美国进行了观察。致病型III是特定于在美国（Onfroy C，的Tivoli B，Grünwald的NJ，Pilet-Nayel ML，Baranger A，Andrivon d，Moussart甲一些位置：攻击性和毒力丝囊euteiches分离株从美国和法国提交的豌豆苗圃中恢复过来）。主要接种物由OOSpores组成，可以在土壤中持续最多10年[15.］．流行病主要来自在土壤中发芽的oospores释放的双鞭素移动动物孢子的快速分散。当检测到宿主根或根渗出物时，毒素发芽并渗透到根部。然后通过菌丝菌素殖民，其区分成单倍体氮素和食卵醛。在性生殖后，生产了新的二倍体OOSPOURES。OOSpores的长距离传播是通过污染的土壤或材料的运输或感染植物的介导的。在豌豆图中，作物损失可达到疾病有利条件的100％[16.］．目前，疾病管理的唯一方法是接种土壤电位测试，以避免高度感染的田地[17.］．

的一代答:euteiches因此，耐药豌豆品种是根腐败管理综合策略的关键因素。然而，豌豆的抵抗源是稀缺的[18.]，polygenically继承并提供仅部分抗性水平[19.那20.］．重组近交系（RIL）群体，从四个部分抗性系获得，被用于检测抗性QTL的[21.-24.］．Meta-QTL分析鉴定出23个与豌豆抗病性相关的基因组区答:euteiches，包括七个主要电阻QTL，其中两个是主要效应QTL [19.］．这些QTL在不同的环境(年，本地化)中被一致地检测到，答:euteiches菌株和不同的评分标准。7个QTL均在至少2个RIL群体中检测到，表明部分抗性源之间存在共同的遗传基础。利用标记辅助回交(MAB)程序，在豌豆株系7个QTL中的0个、1个、2个或3个位点上获得了携带抗性等位基因的NILs [25.］．对抗性的抗性的评估答:euteiches在控制条件下，基于常规使用的疾病严重程度试验，允许主效应和一些小效应QTL得到验证[13.那25.那26.］．然而，目前尚不清楚主要抗病QTL在病害发生和发展中的作用答:euteiches生命周期，可用于支持QTL金字塔策略中的建议，以持久提高偏重。牛皮纸和血统[27.报告了对…的部分抵抗答:euteiches在豌豆育种线和种质中与降低的Oospore生产，病原体繁殖，Zoospore发芽和较慢的病变发展有关。未鉴定靶向这些病原生物循环步骤的部分抗性的遗传组分。精确的答:euteiches在病原体发育过程中对细胞抗性的更精细评估进行了定量方法，包括酶联免疫吸附试验（ELISA; [27.那28.)，特定脂肪酸分析[29.或者，最近，答:euteichesDNA定量pcr (Q-PCR;[30.那31.])。由于其高灵敏度，特异性和再现性，Q-PCR是检测宿主阻力的微小变化的理想方法[32.]并且常用于不同遗传系统中的抵抗评估[1那7.］．

本研究的目的是在疾病开发循环的两个主要步骤中，包括症状外观和根殖民化的两个主要步骤来识别主要抗性QTL的影响。一系列以前发达的Nils [25.[携带个体或选择的抗性QTL组合，随着时间的推移在破坏性动力学测定中得到时间。根腐病的严重程度和数量答:euteiches在受控条件下在接种植物中评估植物中的DNA。每个QTL在限制下的影响答:euteiches疾病的发展归因于研究的一个或两个步骤。分析组合效应与个体效应的比较，以确定个体效应相似或不同的堆积型QTL是否能提高部分抗性水平。

植物病原物质

在InRA，UMR IGEPP和Lavaud等人描述的157个Nil中。[25.]，共使用23个nill，每个nill在主位点上携带或不携带抗性等位基因答:euteiches电阻QTL在用于QTL检测的易感参考遗传背景下（表1）.包括的线是：i）三个载没有阻力等位基因的含量，即具有与受体线类似的基因组，作为易感控制。ii）12个Nils，每个QTL携带阻力等位基因，用于测试单独的QTL效应。十二个Nils代表了以前的MAB计划中的所有旋转投递。iii）八个载有阻力等位基因的八个QTL，用于测试所选QTL组合的效果，具体取决于个体QTL结果。基于基因分型数据，在姐妹NIL中选择每个具有零或一个QTL的NIL [25.，因为QTL之外的受体基因组有更好的回报，杂合度水平更小(数据未显示)。选择2个或3个QTL组合的所有可用姐妹NILs均保留在本研究中。

先前用于检测QTL近等基因系和/或重组自交系的五个亲本株包括在如实验部分抗性对照[25.] （桌子1）.NIL亲本RIL 831.08、RIL 847.50、RIL BAP8.70和RIL BAP8.195的抗性分别来源于育种或种质系90-2079、90-2131和PI180693，分别作为之前研究的RIL群体的亲本[19.］．病原体物质包括答:euteiches菌株RB84和Ae109，属于豌豆分别致病型I和III。两种菌株均被先前用于近等基因系性评价在Lavaud等。[25.］．

在控制条件下进行疾病实验

在对照条件下进行了两个实验，分别研究了单个QTL对这两个菌株的抗性。试验1包括2个零QTL和10个零QTL，分别携带1个抗性QTL和3个抗性对照(表1)1），并与RB84菌株接种。实验＃2包括一对NIL具有或不具有重大效抗性等位基因在QTL到III致病类型AE-PS4.5[25.]以及抗控RIL 831.08（表1），并用AE109菌株接种。进行了另外两种实验以评估QTL组合的抗性对RB84菌株的抗性的影响。实验＃3和＃4包括两个载有两个电阻QTL的二十次来自DSP X RIL 847.50交叉和六个含有来自Baccara x 552交叉的两个或三个电阻QTL的六个零。两种实验还包括相应的零和单QTL NIL和抵抗等位基因供体作为对照（表1）.

每个实验包括两个生物重复。在每种生物复制中，所有线条在随机的完整块设计中评估，每个块的四个块和五个植物中的每条块。在破坏性测试中接种后，在研究后的七个时间点中的每一个中收获植物。在蛭石种植的七天幼苗上进行抗病抗性试验，并用每毫升纯培养株200个孢子孢子接种，如Lavaud等人所述。[25.］．试验在20°C条件下进行，白天16小时，晚上18°C条件下8小时。在接种后的第2、3、4、5、6、7和10天，在每个评分日对每个株系的不同植株进行疾病严重程度(DS)评分，采用Lavaud等人的0(无症状)至5(死亡植株)评分量表[25.］．在每个生物学重复，所有的蛭石是从植物根部去除。从膨体5植物根部的两个组织样本从两个块被保留用于DNA提取和答:euteichesDNA定量（即那每次实验的两个生物重复上总共有四个Q-PCR区段)。在每一个得分日，在种子水平割根收获。五种植物的根部一锅被集中在50毫升Sarstedt锥形管包含5毫升3毫米的玻璃珠研磨后,放置在−80°C至少24小时。根样本然后冻干(3天,−24°C)和地面(9分钟)。在96孔板的每个孔中放入10mg根粉。每个板还包括两个空井作为阴性对照。使用自动DNA提取机器人oKtopure®(LGC Genomics, Germany)提取DNA, DNA浓度归一化为20 ng/μl。

定量PCR（Q-PCR）A.欧盟T.Eiches.DNA量化

使用特定于其的底漆/探针组136F-161T-211R进行Q-PCR反应136F-161T-211R进行A. Euteiches，由Vandemark等人开发。[31.］．引物由Sigma生命科学（USA）合成。将探针在用6-FAM（6-羧基荧光素）标记的其5’ 末端和与MGB-NFQ（小沟结合剂 - 非荧光淬灭）在其3’ 末端（应用Biosystems®，USA）。最佳的引物/探针浓度和扩增循环条件的优化试验确定。对于每个DNA样品，一式三份反应在含有40 DNA，400nM引物136F，400nM引物211R，200nM的探针161T的纳克20个微升反应物运行，2微升的DDH的₂o和10μl的2xTaqman®通用主混合物II（应用Biosystems®，USA）。在Lighcycler®480仪器II实时PCR系统（德国Roche Life Science）上进行荧光的扩增和检测。PCR反应由95℃的循环组成10分钟，然后在95℃下进行50次循环，15s和60℃。每次分析还包括三种对照反应，其中DNA被DDH取代₂O.数量答:euteiches使用校准刻度（10 DNA估计²10.^3.10.^4.10.^5.10.^6.10.^7.和10^8.76 bp片段的拷贝答:euteichesRB84菌株纯化DNA;3技术复制）。用LightCycler®480软件1.5（Roche Life Science，Germany）用相同的反应分析Q-PCR数据。对于每个Q-PCR反应，对应于荧光信号超过检测阈值的PCR循环数（CT）的阈值循环数（CT）被绘制针对76-BP片段拷贝数的每个LOG10。反应效率（E）计算如下：E =(10 ^(−1 / b)) 1与B.对应于标准曲线的线性回归方程的斜率。从分析中除去具有超过0.5的技术复制之间的CT标准偏差值的样本。

数据分析

使用R软件3.1.2版本进行统计分析[33.］．

对于每个实验和评分日，使用Pearson系数（α= 5％）对DS分数和DNA定量值的基因型方法进行评估对生物复制和块数据之间的相关性。还基于常规线估计来自不同实验的数据之间的相关性，从两个生物复制中的所有块的基因型均值。对每个实验和评分日进行DS评分和DNA定量数据的统计分析。还针对来自DS和DNA量值的三个变量进行分析，包括（i）对应于每个评分日的植物百分比的症状外观的可能性，（ii）对应于坡度的根殖民速度从评分日中检测到10,000个病原体DNA拷贝的评分日的变化量和（iii）根据病原体的DNA定量值计算的曲线进展（III）的区域，根据Shaner和Finney提出的公式[34.］．在每个区块和实验中计算了这三个变量的豌豆线值。

DS分数，作为有序定性数据，使用一个累积的链接的混合模型[CLMM分析;“clmm”功能，“序”包[35.那36.]]。DNA定量值、根定殖速度和AUDPC作为定量数据，采用线性混合模型[LMM;' lmer '函数，' lme4 '包[37.]]。使用广义的线性混合模型（GLMM; GLMER'功能，'LME4'封装进行分析症状外观值的概率[37.])。

对于每个模型，我们认为基因型作为固定因子，两个生物学的块作为随机因子。似然比试验（LR）（α= 5％）和WALD试验（α= 5％）分别用于评估CLMM模型和GLMM或LMM模型中的基因型效果。

使用'lsmeans包的lsmeans'函数估计每个基因型上的所有变量的最小方形意味着（lsmeans）[38.］．对于DS变量，为每个基因型和日期暗示的潜伏变量的比例计算lsmeans [39.那40］．对于每个变量，使用“LSMeans”包的“CLD”功能，使用Tukey Test（α= 5％）进行多重比较每个NIL集合的基因型之间的比较。

单抗性QTL对水稻抗性的影响答:euteiches发展

疾病严重程度评分

在实验＃1和＃2的每个评分日期，两个生物重复之间的所有线条的DS分数明显相关R.> 0.82,P.< 0.05和R. > 0.90P.< 0.05)，除试验2第4天的1个重复外。

共5个携带单一QTL的NIL与不携带QTL的对照NIL在LSMeans评分上存在显著差异，至少在一个评分日(表2)2，附加文件1一种）。在实验＃1中，对RB84菌株的部分抗性水平显着高（P.< 0.001)AePs7.6不同供体(NIL4-7.6a、NIL7-7.6a和NIL13-7.6b)的QTL，并与相应的对照NIL4-0b或NIL7-0b进行比较。NIL4-5.1b，携带单一QTLAE-PS5.1.的DS值仅在接种后第4天显著低于对照NIL (P.< 0.05)。在实验＃2中，显着降低（P. < 0.001) DS scores were obtained for the NILs carrying the major QTLAE-PS4.5(NIL1-4.5b)2，附加文件1一种）。在抗性供体线部分抗性较高水平的确认接种在每个NIL之后是五和十天之间显著集相比每个易感对照NIL（P. < 0.001), except for 90–2131 (Table2）.

A. euteiches DNA的定量分析

16个板的Q-PCR反应效率为93.6% ~ 100.1%。这些结果与Schena等人一致[41.他建议效率尽可能接近100%。接种后2天，由于根中病原菌DNA含量较少，检测限为1000拷贝，不能考虑所有株系的DNA量值。同样，552、RIL 831.08和NIL1-4.5b分别在接种后4天、5天和6天前无法定量测定DNA含量(见表2)3.）.6%的区块数据的DNA数量被从分析中删除，因为在一个区块的技术三次重复之间，CT标准偏差超过0.5。在试验1和试验2的每个评分日，所有品系的病原菌DNA量在两个生物重复之间存在显著相关性(R.> 0.95,P.< 0.05和R. > 0.73P.< 0.06)，除试验1和试验2第4天外，第4天从分析中删除1个重复。

所有携带单一QTL的NILs在接种后第6天根系中病原菌DNA含量均显著降低(P.< 0.05)，与不含QTL的对照NILs相比(表3.）.在试验1中，所有的NILs都在单主效QTL上携带抗性等位基因艾普斯7.6，无论抗性来源的供体是什么(NIL4-7.6a、NIL7-7.6a和NIL13-7.6b)，在5或6个评分天内降低病原体DNA数量的效果最高且最显著(P.< 0.05)。的NIL携带90-2131抗性等位基因在AE-PS5.1.，在五个时间点上对减少病原体DNA数量有较小但仍然显著的影响(P.< 0.05)，而对照组为NIL。具有抗性等位基因的NILs来自552 atAePs2.2和AePs3.1显著降低(P.< 0.01)答:euteiches与控制零相比，DNA超过四天。剩下的四个含量（NIL7-4.1b，NIL10-1.2a，NIL10-2C和NIL10-3.1b）在一到四个得分日时具有较小和/或更少的效果（P.< 0.05)。在实验＃2，NIL携带主要阻力QTLAE-PS4.5（nil1-4.5b）有很少的数量答:euteiches与无QTL (P. < 0.001) (Table3.）.

疾病发展变量

对近等基因系疾病症状出现的概率是从DS分数计算数据随着时间的推移，以估计抗性QTL在病原体周期的早期阶段的影响在根（病原体渗入根和发展直到症状出现）。对于每组在两个实验近等基因系（图获得的概率曲线。1A，附加文件2）显示症状显着出现，以至于携带主要阻力QTL的零AE-PS7.6.（NIL4-7.6a，NIL7-7.6a）或AE-PS4.5（NIL1-4.5B）比没有QTL的相应含量。与易感控制液相比，供体系PI180693,552和RIL 831.08观察到相同的效果。

两个性状被用来测量无菌根定殖答:euteiches:定殖速度和已在根上定殖的病原菌数量。这两个性状分别由接种后10天内病原菌DNA进展曲线的斜率和AUDPC估计。在两次试验中，除NIL7-4.1a、NIL10-1.2a和NIL10-3.1b 3个供体品系和90-2131、PI180693、552和RIL 831.08 4个供体品系外，其余4个供体品系的曲线斜率和AUDPC值均显著低于对照nill(图1)。1A和额外的文件2）.其中4个NILs携带单一主效QTLAE-PS7.6.或AE-PS4.5在所有NIL中有最低的AUDPC值。观察到含量明显更平缓的斜坡，在两个比分中的含量明显降低DNA水平（表3.)，与易感控制NILs相比。

多重抗性QTL对水稻抗性的影响答:euteiches发展

总体而言，选择了2个对症状出现和/或根定殖(速度和数量)均有显著个体效应的NIL组(n°4和n°13)QTL组合来研究多重QTL效应。在这两个零等位基因组合中，抗性等位基因90-2131在AE-PS5.1.和AE-PS7.6.，552岁Ae-Ps2.2那Ae-Ps3.1和AE-PS7.6.在实验3和实验4用RB84菌株进行检测。

试验3和试验4的症状比试验1的症状发展得更快，主要是由于生长室内各实验之间的温度变化。因此，我们观察到疾病开始的速度更快，基因型之间的区别也更小，尤其是在实验4中。然而，基于常见基因型，DS评分和答:euteiches实验3和实验1的DNA定量数据高度相关(R. > 0.98,P.< 0.001)以及#4和#1 (R. > 0.84,P.< 0.001)。在试验3和试验4中，两个生物重复在每个评分日期的DS评分与病原菌DNA数据均高度相关(R. > 0.95P. < 0.05), except at the fourth day in experiments #3 and #4 for DS scores as well as at the tenth day in experiment #3 and the seventh day in experiment #4 for the amount of pathogen DNA, for which data from one replicate were removed from the analysis. In experiment #3, additional pathogen DNA data were removed from the analysis from one biological replicate for NIL4-7.6a at all days and from the two biological replicates for RIL 847.50 at the 6^TH.当天，由于在重复或数天之间的数据语无伦次。

在试验3中，两个单独的QTL NILs和RIL 847.50亲本对DS评分和Q-PCR数据的显著影响均得到了证实，且对带QTL的NIL的评分时间比试验1晚AE-PS5.1.(表4.，附加文件1B).单个QTL对延迟症状出现概率的影响(AE-PS7.6.）和减少根殖民（AE-PS7.6.和AE-PS5.1.）也得到了证实。ds得分和数量答:euteiches两个妹妹零携带的DNAAE-PS5.1.和AE-PS7.6.和用于RIL 847.50抗性亲本系，是高度显著降低（P.< 0.001)，而对照组在所有评分日均为NIL(表4.）.从携带单个QTL的NIL，DS和病原体DNA值甚至显着降低AE-PS7.6.在计分天数(表4.）.三条线也有用于减少症状的出现概率，并与单和/或游离QTL近等基因系和用于减缓根定殖速度与对照相比没有NIL QTL（图1中的AUDPC显著增加的效果。1B.）.

在实验4中，显著效应(P. < 0.001) of the single QTL NIL carrying QTLAE-PS7.6.确认在较早的得分天，比在实验＃1用于减少两个DS分数和DNA量，与对照相比，没有NIL QTL（表4.，附加文件1乐队2）.552个抗性父母线的显着效果也被证实在几乎所有评分日期下减少了变量值（P.< 0.001)，并降低三个疾病发展变量的估计值，与两个具有单一QTL的nill相比AE-PS7.6.也没有QTL。但与试验1相比，(i)单抗QTL为NILAe-Ps3.1有低但显著的影响(P. < 0.05) on reducing DS scores and pathogen DNA amount at only early time points; (ii) the NIL with resistance QTLAe-Ps2.2有在它的根比对照更NIL DNA而不QTL从第五阶段的得分，因此没有显示出任何效果显著;（ⅲ）与对照相比NIL根定殖速度和AUDPC和（iv）的NIL携带QTL三个单QTL近等基因系没有显示出差异显著AE-PS7.6.显着延迟症状外观概率。两个姐妹in携带两个qtlAe-Ps2.2和AE-PS7.6.对降低DS分数显示没有影响答:euteiches除接种后第4天DS评分的NIL13-2.2/7.6a外，与未添加QTL的对照无差异。姐妹NILs携带两个QTL中的一个Ae-Ps3.1和AE-PS7.6.或三个QTLAe-Ps2.2那Ae-Ps3.1和AE-PS7.6.，显示出显着的影响（P.< 0.05)在多个时间点降低DS评分和病原菌DNA水平AE-PS7.6.．一致地，这些双或三QTL的NIL与没有QTL的对照NIL相比，有显著的症状出现概率延迟曲线。双、三qtl缺失显著降低了根定殖速度。只有两个三QTL的NILs的AUDPC值低于无QTL的NIL，而不是来自单个QTL的NILs。

本研究以NILs为原始材料，以Q-PCR为精确定量方法，研究单一和多重抗性QTL对豌豆蚜根腐病发生、症状出现和根定殖两个步骤的影响。我们的研究结果表明，抗性等位基因在两个主要QTL (AE-PS7.6.和AE-PS4.5）在几个次要QTL (Ae-Ps2.2, Ae-Ps3.1和AE-PS5.1.)的根殖民。选择两个或三个单效最显著的QTL组合，包括QTLAe-Ps7.6,随后被测试。根据实验结果，携带QTL组合的NILs在延缓症状出现和减缓病原菌根定殖方面的作用显著或相似。我们的发现验证了之前的QTL效应[25.，并指出Q-PCR在准确定量方面的相关性答:euteiches在真菌发病机制不同阶段的豌豆根。

疾病严重动力学和答:euteichesDNA定量允许评估两步疾病发展

在这项研究中，我们使用了动态病理检查来衡量丝囊霉属在接种后，幼豌豆根的根腐烂发育。该测试是破坏性的，因为植物在每个评分日拔除以评估疾病严重程度和用于病原体DNA定量的样品根部。然而，对于每个豌豆线，假设在不同得分日在不同得分日的不同植物获得的分数是可比的，因为肉脂为三代或四代自授粉（BC_5／6F_3/4)和来自每个NIL的个体具有相同的基因组。已有非破坏性测量方法的报道丝囊霉属随着时间的推移root rot开发。尽管不能使用这些方法量化病原体DNA，但它们具有以下优点，即可以在同一植物上观察到症状进化。Malvick等人开发的“滚动毛巾测定”。[42.]使用已发芽的植物放在20°C的纸巾中，测量同一植物21天根腐病症状的演变。然而，使用这种方法的毛巾会出现继发性疾病感染[43.］．此外，还设计了一项体外试验来评估其发展丝囊霉属根腐败症状m . truncatula在三个，15和/或21天根接种后[44.那45.］．

定量-PCR是原始PCR技术的发展，其允许基于反应中包括的染料荧光进行精确定量靶扩增子。该测定通常用作快速有效的工具，用于准确和特异性的检测和定量植物病原体，例如sclerospora graminicola.[46.在梨粟里，Fusarium solani.在大豆47.] 要么Thielaviopsis斯基罗拉在棉花48.］．Vandemark等人使用它[31.具体地量化答:euteichesDNA的基础上，76 bp的扩增，并成功地应用于在豌豆根部病原体量化即使病原体DNA的量并不总是与疾病严重程度相关。

在我们的研究中，使用动力学病理学检测和Q-PCR观察了疾病发展周期的两个阶段，症状出现和根定殖。症状的出现源于病原菌在植物生命周期的早期步骤。当使用无损检测时，这些早期步骤通常由潜伏期或潜伏期来衡量，特别是空气中的病原体。在这里，与潜伏期相对应的根上出现最初症状的日期难以衡量。我们需要增加接种后头几天观察到的时间点的数量，例如，每6小时一次。例如，我们还可以通过将测试温度降低到15-18°C来减缓疾病的发展，以便更好地区分基因型。相反，我们根据不同时间点在根中检测到的DS症状计算症状出现的概率，这使得携带主要效应QTL的nill在相互作用的早期阶段显著分化。在这些早期步骤中，由于Q-PCR不能可靠地检测到小于1000份扩增的DNA片段，因此病原体DNA水平不能用于鉴别NILs。通过定量测定不同时间点的病原菌DNA，可以准确测定病原菌在植物根中的定殖，成功地判别了病原菌的基因型。在其他根病系统中，如大麦/牙孢菌孢菌素，低温扫描电子显微镜(LTSEM)的使用揭示了定植过程的细节[49.］．

病原体生命周期的各个步骤对应于疾病发展周期的更高级阶段，这对评估很重要，但由于缺乏合适的方法，本研究无法观察到。孢子形成是一个关键的生活史特征，是病原菌繁殖的必要条件。牛皮纸和血统[27.通过在Hawksley线虫计数玻片上计数卵孢子来测量孢子形成，这些卵孢子来自于之前浸泡在Sorval微搅拌器中的样品。jøller和Rosendahl [50.使用刺染源与台盼蓝和显微镜，以评估根部的Oospore数量。在我们的研究中，我们试图在接种后的七天和十天内从根部提取OOSPORES，用于两块实验＃3中的所有液体（数据未显示）。从每壶5株植物的根部被研磨在含酶的搅拌器中[51.[后，浸渍过夜后，悬浮液是真空过滤，最后将OOSPORES计数在Malassey刀片上。结果表明卵球孔提取的效率低。因此，需要进一步优化来改善Oospore提取产率。OOSpores使用萌发测试[52.，或游动孢子对根分泌物的吸引[27.]也是关键的病原生涯历史特征，以衡量有趣。

单个QTL可以在一个或两个步骤上采取行动答:euteiches生命周期研究

据我们所知，这是第一次利用NILs研究单一抗性QTL对根病原体病害发育周期的影响。以前QTL效应仅描述在空气病原发育上[7.那9.那53.］．在我们的研究中，单一主要QTL对疾病严重程度的显着影响与先前使用相同含量和菌株的受控条件报告的那些符合[25.］．显著较小的QTL影响使用还透露答:euteichesQ-PCR检测DNA。(i)主效QTLAE-PS7.6.（PI180693和90-2131阻力等位基因）和AE-PS4.5(带有90-2079抗性等位基因)明显延迟症状的出现，甚至在症状出现之前，从早期阶段就开始减缓根定殖。抗性等位基因来源于豌豆品系552AE-PS7.6.只有对降低根定植显著的效果。如以前RIL群体中报道在近等基因系观察到两个主效QTL抗性等位基因的影响大多与他们的性贡献的水平相一致19.那21.］．（ii）本次要效果QTLAe-Ps2.2（与PI180693和552个抗性等位基因），Ae-Ps3.1(具有552抗性等位基因)AE-PS5.1.(90-2131抗性等位基因)显著减缓根系定植答:euteiches，特别是QTL后期Ae-Ps2.2和Ae-Ps3.1．从552抗性等位基因的QTLAe-Ps2.2和AePs3.1，以及90-2131在QTLAE-PS5.1，以前检测到低效应对RIL人群的抗性对RB84（R² = 6.4-9.4 %; [19.那21.])。在我们的病害系统，症状的外观和根定殖预计将是独立的，即，部分抗性可延缓症状的外观，但在根不减少病原体的定植或相反地，如之前观察到的[54.］．然而，在这项研究中，我们没有观察到任何对延迟症状外观的豌豆线，而不会降低根殖民。在一些遗传系统中，对单个病原体周期的单一步骤具有高效果的特定QTL，如延迟时段[6.那9.或孢子形成[10.]，被鉴定。然而，若干个体QTL的例子，作用于疾病发展的几个步骤或病原体生命周期[7.那8.那53.那55.还报道了。

单独作用于疾病发展周期相似步骤的抗性QTL组合可以提高部分抗性水平

本研究的结果表明，阻力QTL作用于疾病开发循环的类似步骤，可以赞成增加部分电阻效率。NIL在QTL的90-2131携带阻力等位基因AE-PS5.1.和Ae-Ps7.6,这两者都是单独行动，以限制根殖民化答:euteiches与携带每个单个QTL的含量相比，对限制根系和疾病严重程度的病原体水平显着增加，特别是主要QTLAE-PS7.6.．也可以在携带552个抗性等位基因组合近等基因系上观察到限制性根定殖的累积效应的QTLAe-Ps2.2, Ae-Ps3.1和AE-PS7.6.，但与单QTL效应相比，具有较低和非显着水平。耐药控制线，RIL 847.50和552对降低症状外观，根殖民化的影响显着更高答:euteiches与单个QTL NILs相比，疾病严重程度进展。类似地，最近发现了一种高度抗药的豌豆[20.]，AED990SW45-8-7也被评估并表达了比测试的多个QTL NIL的更强的效果（P.< 0.001;数据未显示)。Desgroux等[20.结果表明，AeD99OSW45-8-7、552和RIL 847.50 3个品系在关联遗传检测到的14个一致的白念珠菌抗性位点上，累积了12个、9个和5个有利标记单倍型，其中包括与QTL共定位的位点Ae-Ps1.2那Ae-Ps2.2那Ae-Ps3.1和AE-PS7.6.(附录14及图2载于[20.])。在我们的研究中，这4个QTL都在一个或多个评分日期单独贡献了病原体DNA的数量。因此，我们可以假设在这四个QTL上堆积抗性等位基因，它们似乎特别通过减少作用答:euteiches根定殖，可能会导致增加的部分抗性的水平。

然而，这种假设并不排除这些QTL在疾病发展或病原生命周期的其他步骤中的累积也有助于增加抵抗效率。事实上，牛皮纸和血统[27.]表明局部抵抗答:euteiches在抗性种质PI180693中，与ELISA透露的症状的症状和繁殖率较慢相关。作者还发现，从PI180693的根部的渗出物中发现了减少的OOSpores和发芽的动物孢子。抗性QTL显然作用于病原体生命周期的类似步骤，也可以参与控制发病机制的不同步骤或分子机制。Chung等人。[7.]表现出一个控制抗性的QTLSetosphaeria turcica在玉米中，它增强了侵染部位周围胼胝质和酚类物质的积累，减少了菌丝向维管束的生长，并破坏了随后在叶片中的坏死营养定植。

本研究利用NILs和基于q - pcr的病原菌DNA定量研究表明，之前鉴定的单个和联合抗性QTL延缓了豌豆症状的出现，并延缓了豌豆根系定植答:euteiches．进一步的方法，需要开发来研究QTL对病原生命周期的其他步骤的影响，例如孢子。还需要进一步的工作来验证是否在侵扰领域观察到在受控条件下观察到的QTL效应。QTL组合作用于疾病发展周期类似步骤的耐久性，因为几个QTL对病原体发育的目标阶段施加的压力可以诱导可能能够能够的外观和/或选择隔离物克服该阶段的植物阻力效率[56.那57.］．

AUDPC:疾病发展曲线下的面积;CLMM:累积关联混合模型;CT:阈值周期数;DNA脱氧核糖核酸;DS,疾病严重程度;DSP:深色肌肤完美(种质);E、效率;酶联免疫吸附法(ELISA);广义线性混合模型;国家农学研究所; LMM, linear mixed model; LSMeans, least square means; MAB, marker-assisted backcrossing; NILs, near isogenic lines; Q-PCR, quantitative-polymerase chain reaction; QTL, quantitative trait loci; RILs, recombinant inbred lines; USA, United States of America.

我们承认“Estelle Billard”为在根系中启动了Oospore提取方法的发展，“Gildas Le Bail”和“AgnèsGareil”，以极大地支持数据生产的技术方面。我们感谢Clermont-Ferrand，France，更特别是“Anthony”的Gentyane平台，用于对根DNA提取的技术援助。我们感谢Leigh Gebbie进行了修改了稿件的英语书面风格。

资金

这项工作得到了INRA博士前研究员(Clément LAVAUD)、Département de Biologie et Amélioration des Plantes(法国)和布列塔尼地区(法国)的支持。PeaMUST项目获得了法国政府的资助，由国家研究局(ANR)管理，名为“未来投资”(ANR-11- btbr -0002)。

可用性数据和材料

所有支持数据都包含在附加文件中。

作者的贡献

CL协调并参与了整个研究以及手稿的起草。MB生成表型和基因型数据，进行所有的统计分析，并参与手稿的起草。GLR通过实验获得表型数据。MH支持所有的统计分析。AM开发了运动病理学测试的方案。RD共同指导CL博士工作，并参与修改稿件。MLPN监督NIL评估计划，CL的博士工作和手稿写作。所有作者都通过了手稿的定稿。

利益争夺

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

同意出版物

不适用。

伦理批准和同意参与

不适用。

从属关系

1. INRA, UMR IGEPP 1349, Institut de Génétique, Institut, environmental and Protection des Plantes, Domaine de la Motte au Vicomte, BP 35327, 35653, Le Rheu cedex，法国

   C. Lavaud，M. Baviere，G.LeRoy，M.R.Hervé，R. Delourme＆M-L。Pilet-Nayel.

2. PISOM, UMT INRA/Terres Inovia, UMR IGEPP 1349, Domaine de la Motte au Vicomte, BP 35327, 35653, Le Rheu cedex，法国

   C. Lavaud, G. Le Roy, A. Moussart & M-LPilet-Nayel.

3. Terres Inovia，11 rue de Monceau，CS 60003,75378，巴黎Cedex 08，法国

   A. Moussart

相应的作者

对应到M-L.Pilet-Nayel.．

开放访问本文根据创意公约署署署的条款分发了4.0国际许可证（http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)，它允许在任何媒体上无限制地使用、分发和复制，前提是你给予原作者和来源适当的荣誉，提供一个到知识共享许可协议的链接，并指出是否作出了更改。创作共用及公共领域专用豁免书(http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/)适用于本条提供的数据，除非另有说明。

重印和权限