不定根形成在黄瓜中一氧化氮是参与氢气诱导的细胞周期激活GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

不定根的发育是一个复杂的过程，受到多种信号分子的调控。氢气(HGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba)和一氧化氮(NO)，这两个新的信号分子都参与植物的发育和逆境耐受性。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

为了研究不定根发育由富氢水（HRW）诱导的机制，荧光显微镜和分子方法的组合被用来研究细胞周期激活和细胞周期相关基因的表达在黄瓜（GydF4y2BaCucumis sativusGydF4y2Ba'新春4'）外植体。结果表明，HRW对不定根发育的影响是依赖于剂量的，最大生物反应在50％HRW下。HRW治疗以时间依赖的方式没有增加内容。结果还表明，HRW和促进了G1-o的转变和上调细胞周期相关基因：GydF4y2BaCycAGydF4y2Ba(a类型细胞周期蛋白),GydF4y2BaCycBGydF4y2Ba（B型细胞周期蛋白），GydF4y2BaCDKA.GydF4y2Ba(周期素依赖性激酶A)和GydF4y2BaCDKB.GydF4y2Ba(周期蛋白依赖性激酶B)的表达。在黄瓜外植体中，HRW和NO上调了与黄瓜不定根相关的靶基因。而hrw诱导的不定根发育和NO含量增加的响应部分被特定的NO清除剂2-(4-羧基苯基)-4,4,5,5-四甲基咪唑啉-1-氧基-3-氧化物钾盐、NO合酶(NOS)样酶抑制剂N所阻断GydF4y2Ba^GGydF4y2Ba硝基 -GydF4y2Ba_L.GydF4y2Ba-Arpinine甲基酯盐酸盐，或硝酸还原酶抑制剂钨酸盐和南GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba．这些化学物质还部分逆转了HRW对细胞周期激活以及细胞周期调控基因和与不定根形成相关的靶基因转录的影响。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

在一起，否可能出现在H中的下游信号分子GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba诱导不定根器官发生。此外,HGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba在不定根形成过程中通过NO途径介导的细胞周期激活。GydF4y2Ba

不定根是植物无性繁殖的关键环节。了解不定根的形成机制对制定育种策略以最大限度地提高其市场产量具有重要意义[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba］．不定根开发是由几种环境和内源性因素调节的复杂过程。近年来，在偶然生根期间对信号转导领域的兴趣日益增加。立即直接ill，一氧化氮（否）[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba那GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba),GydF4y2Ba^{２＋GydF4y2Ba}钙调素(CaM) [GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba),GydF4y2Ba^{２＋GydF4y2Ba}- 依赖蛋白激酶活动（CDPK）[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba]，环状guanosinemonophosphate（cGMP）的[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba),乙烯(GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba]，丝裂原激活蛋白激酶[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba]， 一氧化碳 [GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba),多胺(GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba]，过氧化氢[GydF4y2Ba10GydF4y2Ba]，硫化氢[GydF4y2Ba11GydF4y2Ba]和氢气（HGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba） ［GydF4y2Ba12GydF4y2Ba已建议参与外来生根过程。然而，与不定根相关的信号传导分子的复杂网络仍不清楚。更好地理解通过信号分子的不定根引发的调节将推进我们对调节不定根发育的分子机制的理解。GydF4y2Ba

气态化合物NO是一种氧化还原活性小信号分子，可以调节几乎所有的生物和非生物应激反应[GydF4y2Ba13GydF4y2Ba那GydF4y2Ba14GydF4y2Ba］．以往的研究也表明NO参与植物的成熟、衰老等各种生理过程[GydF4y2Ba15GydF4y2Ba那GydF4y2Ba16GydF4y2Ba]种子萌发或休眠[GydF4y2Ba17GydF4y2Ba那GydF4y2Ba18GydF4y2Ba]，花卉过渡[GydF4y2Ba19GydF4y2Ba]和气孔运动[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba］．在根的器官发生中，包括侧根的形成，也需要NO [GydF4y2Ba21GydF4y2Ba]，根毛的形成[GydF4y2Ba22GydF4y2Ba和不定根[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba23GydF4y2Ba］．虽然众多研究表明，禁止不定的根部形成，但目前有关于其机制的信息。GydF4y2Ba

HGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba，一种无色，无臭，无味的气体在本质上是已知的和作为惰性气体的结构最简单的气体。以前的研究已经表明，^ hGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba是潜在的治疗医疗气体[GydF4y2Ba24GydF4y2Ba］．它已在全球范围内引起关注，因为它可以在细胞中选择性地减少羟基和过氧基酯[GydF4y2Ba25GydF4y2Ba］．随后，从各种动物实验和临床试验中积累的证据表明，HGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba可能具有抗炎、抗凋亡和抗过敏作用[GydF4y2Ba26GydF4y2Ba］．最近，有一些报道表明HGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba可能在包括盐度的植物压力反应中发挥关键作用[GydF4y2Ba27GydF4y2Ba-GydF4y2Ba29GydF4y2Ba],干旱[GydF4y2Ba29GydF4y2Ba那GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba]，百草枯诱导的氧化应激[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba]，镉毒性[GydF4y2Ba31.GydF4y2Ba]，铝应力[GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba]，汞毒性[GydF4y2Ba33.GydF4y2Ba]和紫外线 - 一种照射[GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba］．通过调节抗氧化剂防御，富含氢水也可以在储存期间延迟猕猴桃的开采成熟和衰老[GydF4y2Ba35.GydF4y2Ba］．值得注意的是，Lin等人[GydF4y2Ba12GydF4y2Ba]发现hGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba可能以血红素加氧酶-1/一氧化碳依赖的方式调控黄瓜不定根的发育。作者认为，外源HRW处理可能是诱导植物根系器官发生的较好选择。然而，HGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba对不定根发育的调控需要充分研究。GydF4y2Ba

因此，H.GydF4y2Ba_2GydF4y2BaNO和NO被认为是植物中具有多种生物学功能的信号调节剂。然而，关于HGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba和NO在调节生理过程中的作用。人们发现HGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba抑制LPS /IFNγ诱导的NO的产生通过信号转导的调节巨噬细胞和小鼠中改善炎症性关节炎[GydF4y2Ba36.GydF4y2Ba］．它为H，条件的分子基础GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba对炎症的影响和HGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba也没有。HGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba和NO也在苜蓿找到。最近，人权观察报告，以减轻根伸长的铝 - 诱导抑制通过降低NO产生[GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba］．最近，H之间的串扰GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba而NO在气孔运动过程中ABA信号级联中起核心作用[GydF4y2Ba37.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

细胞发育是植物生命周期中完成个体发生程序的关键驱动力，细胞发育是植物生命周期中完成个体发生程序的关键驱动力。细胞周期的所有阶段都由高度保守的蛋白质、周期蛋白依赖性激酶(CDK)和周期蛋白的异二聚体复合物调控[GydF4y2Ba38.GydF4y2Ba］．在高等真核生物中，CYCD和CDKA的激活导致产生抑制蛋白激酶，在g1 - s期转变时磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白[GydF4y2Ba39.GydF4y2Ba］．在下一个检查点中，b型CKDs和a、b型cyclin参与g2 - m期转变[GydF4y2Ba40GydF4y2Ba］．此外，CDK/周期蛋白复合物可被一类CDK抑制蛋白灭活[GydF4y2Ba41.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

有人建议使得hGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba和NO对不定根的形成有积极的影响。前期研究结果表明，50 μM NO供体硝普钠(SNP)对不定根有显著影响[GydF4y2Ba10GydF4y2Ba］．但是，否定的串扰GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba在促进不定根方面的作用及其机理尚不清楚。本研究采用分子和药理学方法研究了HGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba没有关于黄瓜的不定根发育（GydF4y2BaCucumis sativusGydF4y2Ba“新春4”）外植体，以及细胞周期激活和细胞周期和细胞周期和偶然生根相关基因在下杆杆菌。因此，本研究的目的是确定不在H中的作用GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba- 在不定根期间进行细胞周期。GydF4y2Ba

HRW以剂量依赖的方式促进不定根的发育GydF4y2Ba

为了理解HRW对不定根发育的影响，黄瓜外植体用不同浓度的HRW处理（0,1％，10％，50％，100％）。与对照（蒸馏水）相比，HRW对不定根（图显著影响。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.与对照相比，1和10% HRW处理的根数和根长差异不显著，但显著低于50和100% HRW处理。在不同浓度中，50% HRW处理根数(10.13)和根长(7.84 cm)最大(图)。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.因此，根部发育的促进在50％HRW下最大化，并且在生根过程中进一步使用该浓度进行研究。GydF4y2Ba

NO的消除逆转了hrw诱导的不定根的发育GydF4y2Ba

然而，SNP诱导不定根的开发，CPTIO降低了SNP的积极作用。进一步调查NO中的参与GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba引起的不定根发育，NO清除剂CPTIO的影响，NOS抑制剂L-名称和NR抑制剂NANGydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba和与HRW处理的外植体的不定根发育钨进行了测定。HRW诱导生根部分被cPTIO，L-NAME钨或NaN反转GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba．与对照相比，HRW + cPTIO、L-NAME或NaN处理的外植体效果更好GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba导致显着降低根系和长度（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba）.此外，SNP分解的其他副产品对不定根发育的显着促进，它显着低于活性SNP的治疗。上述结果表明，不可能充当HRW诱导的不定根开发中的下游信号分子。GydF4y2Ba

内源性的生产没有参与HRW诱导的不定根形成GydF4y2Ba

由于NO在调控不定根发育中起着关键作用，我们测定了HGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba影响与硬红冬小麦或用蒸馏水处理胚轴NO生产。如图1所示。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba50% HRW诱导NO的产生具有时间依赖性。HRW处理6 h后NO含量增加，在处理24 h达到最大值。对照外植体中NO含量较低，在18和24 h显著低于hrw处理的外植体(图2)。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

在不定根开发期间，不可涉及HRW诱导的细胞周期激活GydF4y2Ba

为了深入了解HRW诱导不定根发育的机制，我们分析了NO是否可能参与HRW诱导细胞分裂活性的功能。细胞核的代表性图片(DAPI板)，以及DAPI染色得到的DNA直方图(HCA板)，如图所示。GydF4y2Ba4GydF4y2Ba．与对照样品相比，具有50％HRW或50μMSNP的处理显示得更明显的焦点（图。GydF4y2Ba4GydF4y2Ba)，说明处于g1 - s过渡阶段的细胞较多。然而，cPTIO, L-NAME或NaNGydF4y2Ba_3.GydF4y2BaHRW引起的明显病灶减少。DAPI染色得到的DNA直方图及细胞核的代表性图片如图所示。GydF4y2Ba4GydF4y2Ba（HCA面板）。DNA histograms of asynchronous cells clearly display a S peak in HRW and SNP treatment and a diploid (G1) peak in the control, HRW + cPTIO, HRW + L-NAME and HRW + NaN_3.GydF4y2Ba治疗方法。GydF4y2Ba

对照中G1期细胞比例最高，分别比HRW和SNP处理高700.50%和634.20%(图2)。GydF4y2Ba4 bGydF4y2Ba）.然而，HRW和SNP处理的细胞总数百分比高于对照(图2)。GydF4y2Ba4 bGydF4y2Ba）.因此，H.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba并且没有促进G1至S转化阶段，表明诱导G1相中细胞的亚群以同步方式进入新的细胞周期。如果cptio，l-name或nanGydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba同时加入HRW溶液，G1期细胞百分率分别增加了43.64、25.01和45.33%，S期细胞百分率分别减少了28.48、21.72和27.3%(图3)。GydF4y2Ba4 bGydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

不定根发育过程中细胞周期调控基因HRW介导的转录水平NO参与GydF4y2Ba

为了研究hrw诱导不定根发育时相变化的分子机制，我们通过研究两种周期蛋白(GydF4y2BaCycA和CycBGydF4y2Ba）和两个CDK（GydF4y2BaCDKA.GydF4y2Ba和GydF4y2BaCDKB.GydF4y2Ba)基因进行qRT-PCR分析。如图1所示。GydF4y2Ba5GydF4y2Ba， HRW和SNP表达增加GydF4y2BaCycAGydF4y2Ba与对照相比，15.14和26.28％。但是，与HRW治疗相比，表达GydF4y2BaCycAGydF4y2Bawas significantly reduced by 83.00, 67.70 and 98.90 % in the treatments of HRW + cPTIO, HRW + L-NAME and HRW + NaN_3.GydF4y2Ba（无花果。GydF4y2Ba5GydF4y2Ba）.数字GydF4y2Ba5bGydF4y2Ba表明，HRW和SNP治疗增加了增加的表达GydF4y2BaCycBGydF4y2Ba分别为138.83和148.11%的对照。后续观察表明，cPTIO、L-NAME和NaN的应用GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba是否能够下调hrw介导的GydF4y2BaCycBGydF4y2Ba由64.97，54.50和96.30％，分别为（图GydF4y2Ba5bGydF4y2Ba）.的转录水平GydF4y2BaCDKA.GydF4y2Ba在外植体中，HRW和SNP均显著增加，分别比对照增加了145.38和164.21%。而当，cPTIO, L-NAME和NaNGydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba施用到HRW处理的外植体，它导致26.96，20.44，和在表达减少23.51％GydF4y2BaCDKA.GydF4y2Ba（无花果。GydF4y2Ba5度GydF4y2Ba）.同时，较高的成绩单水平GydF4y2BaCDKB.GydF4y2Ba在HRW和SNP处理中，分别比对照高143.72和163.95%。cPTIO、L-NAME、NaNGydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba降低了转录水平GydF4y2BaCDKB.GydF4y2Ba在HRW处理(图。GydF4y2Ba5 dGydF4y2Ba）.这些发现表明NO可能参与了HGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba诱导细胞周期调控基因的表达。GydF4y2Ba

NO与hrw诱导的不定根发育过程中CsDNAJ-1、CsDPK1和CsCDPK5的表达谱有关GydF4y2Ba

此外,GydF4y2BaCsDNAJ-1GydF4y2Ba那GydF4y2BaCsCDPK1GydF4y2Ba和GydF4y2BaCsCDPK5GydF4y2Ba基因表达用作分子探针，研究HRW诱导的不定根生根的分子机制。与对照，HRW和SNP治疗能够诱导更高的表达GydF4y2BaCsDNAJ-1GydF4y2Ba那GydF4y2BaCsCDPK1GydF4y2Ba和GydF4y2BaCsCDPK5GydF4y2Ba在处理前24 h(图2)。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba）.这些表达与4天后观察到的不定根的数量和长度很好地匹配。有趣的是，他的表情GydF4y2BaCsDNAJ-1GydF4y2Ba与对照处理相比，HRW和SNP分别提高了252.67和236.35%(图2)。GydF4y2Ba6GydF4y2Ba）.这GydF4y2BaCsCDPK1GydF4y2Ba和GydF4y2BaCsCDPK5GydF4y2Ba转录水平也比对照（图更高诱导HRW和SNP。GydF4y2Ba6.GydF4y2Baa和b). HRW和cPTIO联合处理下调了转录水平GydF4y2BaCsDNAJ-1GydF4y2Ba那GydF4y2BaCsCDPK1GydF4y2Ba和GydF4y2BaCsCDPK5GydF4y2Ba由27.46，33.56和54.20％，分别为（图GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba）.同时，如果将L-NAME注入hrw处理的外植体中，也会导致这些基因的表达减少。与HRW处理相比，HRW + NaNGydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba治疗显着降低了这些基因的转录水平（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba）.因此，hrw诱导的表达GydF4y2BaCsDNAJ-1GydF4y2Ba那GydF4y2BaCsCDPK1GydF4y2Ba和GydF4y2BaCsCDPK5GydF4y2BacPTIO、L-NAME和NaN显著抑制基因表达GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba．上述结果进一步强化了NO可能至少部分参与hrw诱导不定根发育的假设。GydF4y2Ba

不定根在植物吸收养分和水分方面起着重要作用;它们的形成被广泛应用于植物无性系繁殖。以往的研究表明，HGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba植物压力反应没有否[GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba]及气孔关闭[GydF4y2Ba37.GydF4y2Ba］．然而，在H中之间的串扰的研究很少GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba不定芽生根过程中NO含量的变化。这里，我们关注NO H的参与GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba诱导不定根过程中细胞周期的激活。GydF4y2Ba

HGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba由于其选择性还原，在全世界引起了兴趣[GydF4y2Ba25GydF4y2Ba］．越来越多的证据表明，HGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba是一种新的信号分子，在植物中起着重要的作用。在本研究中，我们发现，当外源施用HRW时，以剂量依赖的方式增加了不定根的数量和长度(图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.这些发现也与之前的报告一致，表明外源性HGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba能调节黄瓜不定根发育[GydF4y2Ba12GydF4y2Ba］．许多研究都集中在H的生理作用GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba在对盐胁迫的植物反应[GydF4y2Ba27GydF4y2Ba那GydF4y2Ba28GydF4y2Ba]，镉毒性[GydF4y2Ba31.GydF4y2Ba]，汞毒性[GydF4y2Ba33.GydF4y2Ba]，百草枯诱导的氧化应激[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba]和铝胁迫[GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba］．充足的证据表明，NO分类为gasotransmitter能够诱导不定根[GydF4y2Ba23GydF4y2Ba］．我们之前已经证明外源施用NO也能促进万寿菊不定根的形成[GydF4y2Ba10GydF4y2Ba］．没有被发现促进不定根的发展GydF4y2BaPanax Ginseng.GydF4y2Ba由O代产生GydF4y2Ba_2-GydF4y2Ba[GydF4y2Ba42.GydF4y2Ba］．为了确定是否NO信号传导途径参与H中GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba诱导不定根，NO清除剂cPTIO和抑制剂L-NAME和钨NaN的GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba被用于实验。我们发现cPTIO, L-NAME钨酸盐和NaNGydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba导致部分抑制HRW诱导的不定根发育（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba）.从NO清除剂、nos -抑制剂和nr -抑制剂在hrw诱导的反应中的抑制作用来看，NO可能是H中必不可少的气体信号分子GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba- 相关的偶然生根。到目前为止，H之间的关系GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba和NO在动植物中的作用尚待阐明。尽管HGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba不能抑制细胞内没有生产，它在PC12细胞中显着抑制了无诱导的细胞毒性[GydF4y2Ba43.GydF4y2Ba］．在紫花苜蓿,HGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba通过降低NO产量来缓解铝应力[GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba］．Xie et al. [GydF4y2Ba37.GydF4y2Ba表明NO的产生对H有促进作用GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba促进的气孔关闭在拟南芥中。我们的研究结果还表明，当NO生产被阻断，人权观察在不定根的促进角色互换（图GydF4y2Ba2GydF4y2Ba）.这些结果表明，不可能充当涉及H的下游信号分子GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba诱导不定根发育。然而，还需要进一步研究，以确定h的串扰GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba和NO在不同生理过程中的作用。GydF4y2Ba

以前的动物研究表明，H之间存在关系GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba在某些情况下，“不”[GydF4y2Ba36.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba43.GydF4y2Ba］．在植物中，Xie等[GydF4y2Ba37.GydF4y2Ba]发现拟南芥暴露于HRW，导致没有内容的增加。另外，h的效果GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba缓解铝对紫花苜蓿根系伸长的抑制作用可能来自NO的降低[GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba］．此外，H的增加GydF4y2Ba_2GydF4y2Banos样蛋白和NR介导的NO生成可能是必需的，是HGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba行动。在这里，我们的证据支持nos样和nr依赖的NO产生有助于H的可能性GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba-促进黄瓜不定根发育(图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba）.巧合，已经证明了H中没有明显的水平GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba诱导的气孔闭合[GydF4y2Ba37.GydF4y2Ba］．它也被发现对面的观察GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba在铝诱导的根伸长率抑制中不降低生产[GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba］．因此，目前的研究表明，HGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba没有一些生理过程。GydF4y2Ba

以前的研究已经显示在木质部中柱鞘细胞周期调控可能在根器官至关重要的作用[GydF4y2Ba44.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba45.GydF4y2Ba］．细胞周期调节发生在木质部中柱鞘，细胞进入G2期，其余中柱鞘保持在G1期[GydF4y2Ba46.GydF4y2Ba］．在这里，我们的分析表明HGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba-和no诱导细胞在不定根S期的积累，表明HGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba- 和NO诱导的细胞周期活化促成了生根（图GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba）.之前报道，细胞周期感应在不定根生长中发挥了关键功能[GydF4y2Ba45.GydF4y2Ba]及侧根形成[GydF4y2Ba47.GydF4y2Ba］．这是第一份报告显示HGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba在不定根开发期间，没有参与细胞周期进展。有趣的是，CPTIO，L-NAME和NANGydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba全部部分还原HGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba- 诱导S期细胞的积累，然后抑制不定根发育（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba）.通常接受植物激素在根部发育期间在细胞周期的再激活中发挥着核心作用[GydF4y2Ba48.GydF4y2Ba］．NO对番茄侧向形成细胞周期激活的诱导作用已有报道[GydF4y2Ba47.GydF4y2Ba］．作者指出，生长素依赖的细胞周期基因调控可能依赖于NO。因此，我们的药理学证据支持这种可能性，至少在我们的实验条件下，HGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba和NO可能形成不定根期间调节细胞周期激活的线性信号传导途径。GydF4y2Ba

细胞周期调节基因已被证明参与调节节间生长中的细胞分裂[GydF4y2Ba49.GydF4y2Ba]和根分生组织的诱导[GydF4y2Ba45.GydF4y2Ba］．为了解NO参与H的机制GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba- 在本研究中进行了导致根本引发的细胞周期，详细分子研究。参与G1至S的转变的基因，GydF4y2BaCycAGydF4y2Ba那GydF4y2BaCycBGydF4y2Ba那GydF4y2BaCDKA.GydF4y2Ba和GydF4y2BaCDKB.GydF4y2Ba没有明显上调，没有GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba治疗(图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba)，与细胞周期的相变相一致。Otvos等人[GydF4y2Ba50.GydF4y2Ba报道NO促进了紫花苜蓿叶片原生质体来源细胞的细胞分裂和胚性细胞的形成。暂时没有诱导GydF4y2BaCyCA2; 1GydF4y2Ba和GydF4y2BaCYCD3; 1GydF4y2Ba细胞悬液中mRNA的表达。这些结果很好地符合的表达式GydF4y2BaCycAGydF4y2Ba和GydF4y2BaCycBGydF4y2Ba在我们的实验条件下。以前的研究还发现，没有介导的诱导GydF4y2BaCYCD3; 1GydF4y2Ba基因在侧根形成原基开始[GydF4y2Ba47.GydF4y2Ba］．这些结果证实了NO参与了侧根和不定根过程中细胞周期相关基因的调控。值得注意的是GydF4y2BaCDKA.GydF4y2BaHGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba否则暗示A型CDK可能在G1到S转换中发挥主要作用。Himanen等人。[GydF4y2Ba44.GydF4y2Ba还发现转录水平GydF4y2BaCDKA.GydF4y2Ba在早侧根引发期间诱导在肿瘤介导的细胞周期激活中。水平GydF4y2BaCDKA.GydF4y2Ba转录物在侧向生根期间没有治疗，表明植物细胞可能是番茄中细胞分裂的态度[GydF4y2Ba47.GydF4y2Ba］．此外，我们的数据显示了成绩单水平GydF4y2BaCDKB.GydF4y2Ba比的少GydF4y2BaCDKA.GydF4y2BaH.之后GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba治疗。它可能是因为B型CDKS调节细胞周期进程到有丝分裂阶段，G2至M [GydF4y2Ba51.GydF4y2Ba］．这项研究进一步表明，转录水平的GydF4y2BaCycAGydF4y2Ba那GydF4y2BaCycBGydF4y2Ba那GydF4y2BaCDKA.GydF4y2Ba和GydF4y2BaCDKB.GydF4y2Ba由HGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba由NO清除剂cPTIO，NOS抑制剂L-NAME和NR抑制剂的NaN被部分抑制GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba（无花果。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba）.因此，转录配置文件提出这里允许提出一个简单的模型NO可能在细胞周期活化中H参与GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba诱导不定根。提供的证据在这里进一步证实使得hGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba和NO具体可以调节细胞周期激活和不定根形成。另外，NO可以是H期间下游信号分子GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba诱导的不定根，存在于有能力的中柱鞘细胞中，最终激活细胞周期相关基因。GydF4y2Ba

已经观察到不定根发展的目标基因，GydF4y2BaCsDNAJ-1GydF4y2Ba那GydF4y2BaCsCDPK1GydF4y2Ba和GydF4y2BaCsCDPK5GydF4y2Ba可以通过生长素，CO [诱导GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba]，以及硫化氢[GydF4y2Ba11GydF4y2Ba］．所有DNAJ样蛋白质的特征在于J结构域对Hsp70的蛋白质折叠和组装和蛋白质复合物的组装和拆卸的相互作用。已经说明了DNAJ样蛋白和钙依赖性蛋白激酶（CDPK）的基因涉及不定根的启动和发展[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba52.GydF4y2Ba］．此外，IAA和NO诱导了与不定根形成过程中细胞分化、分裂和/或分化相关的CDPK活性[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba］．在本研究中，分子证据表明HGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba和NO处理均可诱导高表达GydF4y2BaCsDNAJ-1GydF4y2Ba那GydF4y2BaCsCDPK1GydF4y2Ba和GydF4y2BaCsCDPK5GydF4y2Ba基因（图GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba)，这与观察到的不定根数量一致。Bai et al. [GydF4y2Ba52.GydF4y2Ba]发现IAA，3-O-C10-HL和H.GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba增加的表达GydF4y2BaCDC2GydF4y2Ba那GydF4y2Baarc2.GydF4y2Ba,GydF4y2BaCDPKGydF4y2Ba以及Aux/IAA基因家族成员GydF4y2BaAUX22cGydF4y2Ba那GydF4y2BaAUX22dGydF4y2Ba，和AUX22e。最近，Lin等人[GydF4y2Ba12GydF4y2Ba还报告说GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba以血红素加氧酶-1/一氧化碳依赖的方式诱导黄瓜不定根形成相关靶基因的表达。NO清除剂cPTIO、NOS抑制剂L-NAME和NR抑制剂NaN的应用GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba能够下调HGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba诱导的转录水平GydF4y2BaCsDNAJ-1GydF4y2Ba那GydF4y2BaCsCDPK1GydF4y2Ba和GydF4y2BaCsCDPK5GydF4y2Ba（无花果。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba）.因此，我们推断使得hGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba- 诱导GydF4y2BaCsDNAJ-1GydF4y2Ba那GydF4y2BaCsCDPK1GydF4y2Ba和GydF4y2BaCsCDPK5GydF4y2Ba表达可能受NO产生的调控。这些发现可能表明GydF4y2BaCsDNAJ-1GydF4y2Ba那GydF4y2BaCsCDPK1GydF4y2Ba和GydF4y2BaCsCDPK5GydF4y2BaH可能需要更早状态的表达式GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba- 以无独立的方式引起了不定根开发。GydF4y2Ba

综上所述，我们的结果表明HGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba参与不定根发育，NO可能是HGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba信号级联。同时，这里提出的证据表明hGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba通过NO途径激活细胞周期，上调细胞周期相关基因和不定根相关靶基因(图2)。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba）.而HGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba和NO可能是非常复杂的。因此，相当多的工作将在分子机制H的进一步调查完成GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba-和no诱导不定根。GydF4y2Ba

植物材料及生长条件GydF4y2Ba

黄瓜 （GydF4y2BaCucumis sativusGydF4y2Ba“新春4号”种子由甘肃省农业科学院提供。选择相同的种子在蒸馏水滤纸浸渍的培养皿中萌发，然后转移到照明培养箱中，在25±1℃下培养5d，光周期14 h(光合有效辐射= 200 μmol mGydF4y2Ba^-2GydF4y2BaS.GydF4y2Ba^-1GydF4y2Ba）.除去5-D型幼苗的初级根，然后在如下所示的不同培养基存在下，在上述相同的温度和光周期条件下保持黄瓜外植体在另外5d中保持另外5d。然后，记录拍摄每次外植物的根数，根长度。同时，采取了相应的照片。GydF4y2Ba

外植体的处理，化学物质GydF4y2Ba

后初生根被拆除，每十黄瓜外植体放入含有6毫升蒸馏水，不同浓度的如图2所示的富含氢气的水（HRW）的培养皿中。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba．30μMN-硝基-L-精氨酸甲基酯（L-NAME，Sigma，美国）或200μM2-（4-羧基苯基）-4,4,5,5- tetramethylimidazoline -1-氧基-3-氧化物（cPTIO，Sigma，美国），或100μM钨酸盐或10μM的NaNGydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba加入最佳浓度的HRW。200 μM cPTIO与最适SNP浓度加在一起。失活的SNP (50 μM)曾在光照下去除NO约24小时，这些化学物质的浓度是根据初步实验和前期实验的结果选择的[GydF4y2Ba10GydF4y2Ba］．溶液在完全黑暗中制备，并立即在pH值为6.5的情况下稀释至所需浓度。除另有说明外，其余化学品均为中国公司的分析级化学品。GydF4y2Ba

富含氢水的制备（HRW）GydF4y2Ba

纯化的H2GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba天然气（99.99％，GydF4y2Bav / V.GydF4y2Ba)，由氢气发生器(QL-300, saikesasi氢能有限公司，中国)以300ml min的速度将其鼓泡到2 l蒸馏水中GydF4y2Ba^-1GydF4y2Ba然后，将相应HRW迅速稀释至所需饱和度(1,10,50%，[GydF4y2Bav / V.GydF4y2Ba]）。在我们的实验条件下，HGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba用“便携式溶解氢计”(Trustlex Co.， Led, hm -1000，日本)测定新鲜制备的HRW中的浓度为0.45 mM，并在25°C中保持相对恒定水平至少12小时。GydF4y2Ba

内源NO含量测定GydF4y2Ba

NO含量采用Greiss试剂法测定[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba经过一些修改。黄瓜下胚轴样品(0.2 g)用液氮冷冻，然后研磨在研钵和杵中，加入4 mL 50 mM的冰醋酸缓冲液，pH 3.6，含4% (GydF4y2BaW / V.GydF4y2Ba)二乙酸锌。匀浆10000 ×离心GydF4y2BaGGydF4y2Ba在4℃下持续15分钟，收集上清液。对于每个样品，加入0.1克炭（上海化学试剂有限公司）。在涡旋混合和过滤后，滤滤液并收集。将1ml滤液和1ml Greise试剂的混合物在室温下温育30分钟以使亚硝酸盐纳硝酸盐。然后在540nm处测定吸光度。通过与纳米标准曲线进行比较来计算任何内容GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

下胚轴细胞核提取物GydF4y2Ba

黄瓜下胚轴切出约0.5cm，并固定在4％甲醛（0.1M磷酸盐缓冲液，pH 7.4）中15分钟。然后下胚轴在加尔布雷思黄油（45毫米氯化镁削减了刀片GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba，30mM柠檬酸钠，20mM 4-吗啉代丙烷磺酸）。最后，在5ml管中用30μm网筛收集细胞核悬浮液。GydF4y2Ba

细胞周期的荧光显微图像分析GydF4y2Ba

如[GydF4y2Ba53.GydF4y2Ba]有修改。细胞核悬浮液加入荧光染料DAPI（1：100000，分子探针），0.1％Triton-X 100和50μgmLGydF4y2Ba^-1GydF4y2Ba用荧光显微镜(Leica 400×， Planapo, Wetzlar, Germany)观察Rnase1 (DNase-free, Qiagen)并拍照。显微摄影条件设定值固定，核未过度曝光。每个样品都被用来分析至少1000张荧光显微镜下的细胞核图像。利用Image Pro软件(Media Cyberntics, USA)测量细胞核的荧光强度(灰度值)。GydF4y2Ba

RNA提取GydF4y2Ba

使用TRIZOL试剂(中国Sangon)处理6 h和24 h后，从大约200 mg(鲜重)的黄瓜下胚轴(5mm)中提取总RNA。GydF4y2Ba

用定量RT-PCR转录水平估计GydF4y2Ba

使用ABI Stepone Plus系统（Applied Biosystems，Carlsbad，CA）以及Qiagen Quantifast Sybr Green PCR套件（华夏海洋科技Con。，Ltd。，Ltd.，China）进行定量实时PCR（QRT-PCR）反应。使用表中的引物扩增，对细胞周期相关基因（在处理后6小时的处理）和靶基因（在处理后24小时）（在治疗后24小时）进行扩增，这些基因负责QRT-PCR的偶然生根GydF4y2Ba1GydF4y2Ba．每种反应（20μL总体积）由10μLIQSYBR Gree Supermix，1μl稀释的cDNA和0.4μl的正向和储备引物组成。PCR循环条件如下：在95℃下在95℃下，在95℃和30s的60℃下，在60℃下，在退火步骤中的数据收集，50分钟。在40次循环之后，我们包括在95℃，60℃下的离解/熔融曲线阶段，60℃，60℃，15℃，在95℃下。黄瓜GydF4y2Ba施GydF4y2Ba基因用作内部对照。如Livak和Schmittgen [中所述进行相对基因表达的计算GydF4y2Ba54.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

统计分析GydF4y2Ba

其中，结果表示为至少三个独立实验的平均值±SE。使用Windows社会科学统计软件包(13.00版本;SPSS, Inc.，芝加哥，IC，美国)。为进行统计分析，邓肯多重检验(GydF4y2BaP.GydF4y2Ba< 0.05)was chose as appropriate.

CDKA，细胞周期蛋白依赖性激酶A;CDKB，细胞周期蛋白依赖性激酶B;CYCA，A型细胞周期蛋白;CycB，B型细胞周期蛋白;DAPI，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚;HGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba氢气;HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba过氧化氢;人权观察,研究水;LI SNP，光灭活SNP;L-NAME, NO合酶(NOS)样酶抑制剂GydF4y2Ba^GGydF4y2Ba硝基 -GydF4y2Ba_L.GydF4y2Ba精氨酸甲酯盐酸盐;NO，一氧化氮;SNP，souium硝普钠;cPTIO，2-（4-羧基苯基）-4,4,5,5- tetramethylimidazoline -1-氧基-3-氧化物钾盐GydF4y2Ba

作者感谢编辑和匿名评论者提供的宝贵意见和帮助。GydF4y2Ba

资金GydF4y2Ba

该研究得到了中国国家自然科学基金的支持（第31160398,31560563），中国博士后的中国博士学位（第20100470887,2012T50828），中国教育部的重点项目（第211182号），研究高等教育博士学位基金（20116202120005号），中国甘肃省自然科学基础（NO.1308RJZA179,130​​8RJZA262）。GydF4y2Ba

可用性数据和材料的GydF4y2Ba

原始数据可以通过对相应作者的要求获得。GydF4y2Ba

作者的贡献GydF4y2Ba

YZ和WL设计的研究;YZ，MW和LN进行了研究;YZ，WL和ZM贡献分析数据;和yz和wl写了这篇论文。所有作者阅读并认可的终稿。GydF4y2Ba

利益争夺GydF4y2Ba

作者宣称，他们有没有竞争的兴趣。GydF4y2Ba

同意出版物GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

伦理批准和同意参与GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

从属关系GydF4y2Ba

1. 甘肃农业大学园艺学院，兰州730070GydF4y2Ba

   永朱，廖Weibiao，牛丽娟，蒙王战军和马GydF4y2Ba

相应的作者GydF4y2Ba

对应到GydF4y2BaWeibiao廖GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

开放获取GydF4y2Ba本文根据创意公约署署署的条款分发了4.0国际许可证（GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/GydF4y2Ba)，它允许在任何媒体上无限制地使用、分发和复制，前提是你给予原作者和来源适当的荣誉，提供一个到知识共享许可协议的链接，并指出是否作出了更改。创作共用及公共领域专用豁免书(GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/GydF4y2Ba)适用于本条提供的数据，除非另有说明。GydF4y2Ba

再版和权限GydF4y2Ba