综合分析碳代谢、蛋白质组和代谢组的基因表达，揭示了原发性代谢的改变gydF4y2Ba桉树茅gydF4y2Ba吠叫，是对季节变化的反应gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

季节变化对树木生长具有重要的调节作用，尤其是对植物生长的调节作用gydF4y2Ba桉树茅gydF4y2Ba，一棵快速生长的树。这种变异可能导致整个树在转录、蛋白质和代谢物水平上的变化。树皮是保护树木免受干燥和病原体侵袭的重要组织，已被确定为木质纤维素衍生生物燃料的潜在原料。尽管人们对树皮代谢的兴趣越来越大，但对调节树皮代谢的分子机制知之甚少，尤其是在热带国家。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

在本研究中，我们报告了观察到的变化在初级代谢gydF4y2Ba大肠茅gydF4y2Ba通过结合转录本(RT-qPCR)、蛋白质组(2-DE凝胶)和代谢组(GC-MS)分析，综合分析巴西夏季(潮湿)和冬季(干燥)两个对比季节的树皮。研究人员在两个季节分析了与碳代谢有关的24个基因。其中11个在夏季表达上调，3个在冬季表达上调，10个在表达模式上无统计学差异。利用2-DE凝胶进行蛋白质组学分析，结果显示77个蛋白表达丰度差异，其中夏季上调38个，冬季上调37个。不同代谢产物在冬季显著积累。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

这项研究揭示了在初级代谢的代谢重构gydF4y2Ba大肠茅gydF4y2Ba吠叫，由季节变化引发。转录本和蛋白质数据表明，在冬季碳水化合物的形成似乎有利于树的新陈代谢。葡萄糖、果糖和蔗糖在冬季大量积累。gydF4y2Ba

尤加利树种是最广泛种植的硬木由于其质量的木材。这些快速生长的树木在一系列不同的气候条件下种植，可以用于不同的工业过程(如纸浆和纸张、木炭、燃料木材和实木产品)。目前巴西的大部分桉树种植面积超过540万公顷[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．考虑到它的快速生长速度和造林能力，桉树也被认为是一种潜在的生物燃料原料[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．此外，树皮也是营养物质和碳的来源，并在商业种植园中被用来形成土壤保护层。树皮包括维管形成层外的所有组织，包括初生和次生韧皮部、皮层、第一周皮、皱皮和扩张生长形成的组织[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．这些组织还保护木本植物器官和愈合组织免受脱水、太阳照射和病原体的伤害[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．树皮的形成是由形成层的细胞分裂过程开始的，它产生木质部在内部的木质部和韧皮部，树皮的初级组织，在树皮的外部。韧皮部组织包括韧皮部薄壁组织、韧皮部纤维、伴细胞和筛细胞[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．虽然树木的发育受季节的调节，但人们对与生长相关的潜在分子过程知之甚少，尤其是在树皮中。Soler等[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]分析了软木组织mRNA丰度的季节变化gydF4y2BaQuercus木栓gydF4y2Ba．他们发现了与软木蛋白生产有关的结构基因的转录本在晚春积累;这种积累与温度和相对湿度呈显著相关。与应激有关的基因表达的增加也与温度密切相关。Pagter等人利用蛋白质组学方法[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba在树皮中观察到明显的季节性蛋白质模式gydF4y2Ba绣球花macrophyllagydF4y2Ba而且gydF4y2Ba绣球花香gydF4y2Ba在冷适应和反适应期间。gydF4y2Ba

在本研究中，我们调查了代谢反应gydF4y2Ba大肠茅gydF4y2Ba利用RT-qPCR、蛋白质组学和代谢组学方法对夏/湿季和冬/干季树皮进行分析，重点分析碳代谢。尽管树皮代谢对整个树木的重要性及其在生物燃料生产方面的潜力[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，据我们所知，这是第一个显示桉树树皮代谢随季节变化而变化的分子研究。gydF4y2Ba

季节性影响树皮中mRNA的表达gydF4y2Ba

作为了解维持初级代谢的分子机制的第一步gydF4y2Ba大肠茅gydF4y2Ba树皮在夏季和冬季，一组24个候选基因的相对mRNA丰度(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba利用RT-qPCR技术分析了糖酵解、蔗糖代谢、乙醇发酵、三羧酸循环和碳固定等碳水化合物代谢过程中所涉及的碳水化合物。数字gydF4y2Ba1gydF4y2Ba显示了这些基因在对比季节的相对mRNA丰度。其中11个基因在夏季上调(果糖二磷酸醛缩酶细胞质上调(gydF4y2BaFBAcytgydF4y2Ba)、丙酮酸激酶(gydF4y2BaPKgydF4y2Ba)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(gydF4y2BaPEPCgydF4y2Ba)， atp依赖性磷酸果糖激酶(gydF4y2BaPFKgydF4y2Ba), Phosphoglucomutase (gydF4y2Ba的PGMgydF4y2Ba)、蔗糖合酶3 (gydF4y2BaSuSy3gydF4y2Ba)、丙酮酸脱羧酶(gydF4y2BaPDCgydF4y2Ba)、异柠檬酸脱氢酶(gydF4y2BaIDHgydF4y2Ba)，琥珀酰辅酶a连接酶(gydF4y2BascigydF4y2BaRubisco大亚基(gydF4y2Ba:gydF4y2Ba)和5-磷酸核糖异构酶(gydF4y2Ba零售物价指数gydF4y2Ba)， 3个基因在冬季上调(磷酸甘油酸变位酶(gydF4y2BaPGAMgydF4y2Ba)、蔗糖合酶1 (gydF4y2Ba超对称性理论gydF4y2Ba1)和醇脱氢酶3 (gydF4y2Ba抗利尿激素gydF4y2Ba3))和10个基因在季节间差异无统计学意义(葡萄糖6-磷酸异构酶(gydF4y2Ba谷歌价格指数gydF4y2Ba)、磷酸甘油酸激酶(gydF4y2BaPGKgydF4y2Ba)、烯醇酶(gydF4y2Ba伊诺gydF4y2Ba)、丙酮酸脱氢酶(gydF4y2BaPDHgydF4y2Ba， ppi依赖的磷酸果糖激酶(gydF4y2Ba亲gydF4y2Ba)、醇脱氢酶2 (gydF4y2BaADH2gydF4y2Ba)、NADP苹果酸酶(gydF4y2BaNADP-MEgydF4y2Ba)、碳酸酐酶(gydF4y2BaCAgydF4y2BaRubisco小亚基(gydF4y2Ba红细胞表面gydF4y2Ba和果糖二磷酸醛缩酶叶绿体(gydF4y2BaFBAclgydF4y2Ba))。gydF4y2Ba

大部分参与碳水化合物代谢和糖酵解的基因在夏季表达上调(图1)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，这表明在这个季节，需要初级代谢来产生减弱力和ATP，这是树木发育和生长所必需的。在冬季，新陈代谢活动减少，因此，树木降低了它们的生长速度，从而减少了它们的能量消耗。有趣的是，每一个SuSy分析显示了不同的表达模式;gydF4y2Ba超对称性理论gydF4y2Ba1在冬季高表达gydF4y2Ba超对称性理论gydF4y2Ba3个在夏季高表达。Susy在蔗糖代谢中起着至关重要的作用。这种酶催化蔗糖和UDP可逆转化为UDP-葡萄糖和果糖，但它也降解蔗糖[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．因此，每个备选转录本可能需要不同的分子功能。此外，有人提出，高等植物中存在两种Susy [gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]，一种是存在于细胞质中的可溶性酶(S-Susy)，另一种是膜结合酶(P-Susy)。两种形式都可能受到酶的磷酸化状态的调节[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．需要进一步的研究来完全理解桉树树皮中Susy亚型的调控机制。gydF4y2Ba

的基因gydF4y2Ba抗利尿激素gydF4y2Ba3和gydF4y2BaPDCgydF4y2Ba参与发酵代谢的蛋白表达差异有统计学意义(图。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)．奇怪的是，每个转录本都在不同的季节上调。正如我们预期的gydF4y2BaADH3gydF4y2Ba在夏季的生长季节被上调。我们也期望gydF4y2BaPDCgydF4y2Ba夏季上调;然而，它表现出相反的表达模式。作为一种快速生长的树木，桉树在夏季需要高水平的ATP来维持这一过程。同时，形成层和树皮组织由于解剖学上的气体交换障碍处于缺氧状态。因此，呼吸作用可能从有氧发酵模式转变为乙醇发酵模式，作为一种维持底物水平以产生ATP的手段。这需要对乙醇发酵的关键基因进行转录激活，gydF4y2BaPDCgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba抗利尿激素gydF4y2Ba［gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．结果表明，夏季和冬季可能需要乙醇发酵，但参与程度不同gydF4y2BaPDCgydF4y2Ba选择记录。的调节作用gydF4y2BaPDCgydF4y2Ba在乙醇发酵中还没有得到充分的解释[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．在拟南芥中，有4个编码PDC的基因和一个与低氧条件相关的微阵列数据集gydF4y2BaPDC1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaPDC2gydF4y2Ba在低氧条件下被强烈上调，而gydF4y2BaPDC3gydF4y2Ba而且gydF4y2BaPDC4gydF4y2BamRNA水平不是由缺氧诱导的，这表明这两个基因不太可能在缺氧应激中发挥作用[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

Yang等[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba)发现了一个gydF4y2Ba抗利尿激素gydF4y2Ba在…的吠声中gydF4y2Ba洋槐pseudoacacia,gydF4y2Ba然而，作者没有讨论转录功能。树木乙醇发酵过程的研究大约始于20世纪80年代末[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba17gydF4y2Ba尽管到目前为止，可利用的信息很少，在这一领域进行更多的研究是必要的。gydF4y2Ba

IDHgydF4y2Ba而且gydF4y2BascigydF4y2Ba为我们工作中分析的TCA基因，两者均在夏季上调(图;gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)．gydF4y2BaIDHgydF4y2Ba负责异柠檬酸氧化脱羧到2-氧戊二酸，该酶的功能与维持2-氧戊二酸水平和调节氮同化有关[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．gydF4y2BascigydF4y2Ba催化琥珀酰辅酶a可逆地转化为琥珀酸，该酶的调控特性表明，它可能代表了一种适应机制，试图在次优条件下维持呼吸速率[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．我们的结果可能表明，在夏季，丙酮酸产生gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba糖酵解主要被发送到线粒体，在那里它将被TCA循环用于能量生产，而不是用于发酵代谢。需要指出的是，如上所述，碳水化合物代谢和糖酵解过程中分析的大部分转录本在夏季也被上调，这表明该通路正向丙酮酸形成的方向工作。夏季树木表现出较高的代谢活性，在此期间，活跃的生长、糖酵解和TCA循环是维持高代谢率的基础。奇怪的是，我们观察到了这一点gydF4y2BaPEPCgydF4y2Ba在夏天被上调。TCA循环中间体的输出需要输入能够同时生成乙酰辅酶a和草酰乙酸(OAA)的底物[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．如果使用丙酮酸作为唯一的底物，输出TCA循环中间体，会减少OAA再生，使TCA循环停止。在这种情况下，PEPC在CO的非情感性固定中起着重要的作用gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba以及补充从池中提取的TCA中间体的过程中[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．据报道，紫花苜蓿茎中PEPC的活性比紫花苜蓿高10倍以上gydF4y2BaFagus sylvaticagydF4y2Ba比树叶[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．PEPC在茎中的高活性可能是由于在C3植物中常见的PEPC的无上位作用，或者，在C4代谢中，PEPC可能为NADP-ME提供苹果酸，而NADP-ME提供COgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba通过苹果酸去羧化Rubisco [gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

树木生长、呼吸、气孔缺乏和茎周层气体扩散渗透性低等生理过程导致内部CO含量较高gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba浓度([有限公司gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba])(范围<1 - 26%)，因此CO含量要高出500-800倍gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba高于普通植物器官或周围空气的水平[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．高有限公司gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba浓度可有效消除光呼吸作用，增强树枝和树皮的光合势[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．据此，我们在桉树树皮中发现了与CO相关的mrna的积累gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba固定(图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．仅在分析的转录本中gydF4y2Ba:gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba零售物价指数gydF4y2Ba差异表达，夏季上调。的gydF4y2BaNADP-MEgydF4y2Ba夏季和冬季的转录本无差异表达。gydF4y2Ba:gydF4y2Ba在树木呼吸水平最高的夏季，二氧化碳浓度上调，导致COgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在茎的内部释放。的gydF4y2Ba零售物价指数gydF4y2Ba在夏季也上调，在卡尔文循环和戊糖磷酸途径中催化5-磷酸核糖转化为5-磷酸核酮糖[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．考虑到二氧化碳含量高gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba我们的研究结果表明，树皮的有效性gydF4y2Ba:gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba零售物价指数gydF4y2Ba在代谢产生的CO的再固定中起作用吗gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba．木本植物的茎部有绿色的组织，其中含有叶绿素(chlorochymes)，位于外表皮层或皱襞层以下。这些组织能够利用茎内COgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba以及穿透rhytidome固定碳的光[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，解释了树皮中存在rubisco的原因。因此，高COgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba浓度和低氧供应可以解释这个事实gydF4y2Ba:gydF4y2Ba差异表达和gydF4y2Ba红细胞表面gydF4y2Ba不是。在如此富裕的环境下gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba环境，里面的树皮，也许是不必要的植物过度生产gydF4y2Ba红细胞表面gydF4y2Ba促进有限公司gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba固定。高等植物Rubisco由一个基因编码的8个大亚基组成gydF4y2Ba:gydF4y2Ba，以及8个由核编码的小亚单位gydF4y2Ba红细胞表面gydF4y2Ba基因家族(gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．RbcL含有酶的催化位点，负责羧化酶和加氧酶反应，但是gydF4y2Ba红细胞表面gydF4y2BaRubisco在Rubisco的结构和功能中的确切作用目前还不清楚，它导致了Rubisco酶之间动力学性质的差异[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．参与光系统I和II的酶转录本也被发现gydF4y2Ba洋槐pseudoacaciagydF4y2Ba树皮(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

蛋白质组学分析gydF4y2Ba大肠茅gydF4y2Ba在夏天和冬天吠叫gydF4y2Ba

蛋白质图谱的分析gydF4y2Ba大肠茅gydF4y2Ba对树皮进行2-DE凝胶初步评估，在第一个维度使用pH值为3-10的条带(数据未显示)。观察到的大多数蛋白质点集中在pH范围4-7(数据未显示)。在此基础上，我们决定分析蛋白质谱，在3个重复，使用pH范围4-7(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S1)。经图像分析，夏凝胶和冬凝胶中分别鉴定出445和424个蛋白质斑点。从这些位点中，有125个差异表达(gydF4y2BaPgydF4y2Ba≤0.05)，均进行质谱分析(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S1)。在数据库中成功鉴定出75个(63%)蛋白质点(见表1)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）;夏季上调38个，冬季上调37个。剩下的蛋白质没有在分析中进一步考虑，因为它们不符合搜索条件。gydF4y2Ba

树皮中差异表达蛋白的功能分类gydF4y2Ba

将夏季和冬季差异表达蛋白按其生物学过程分为5类(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，类似于Rison等人使用的惯例[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba和Carvalho等人[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．代表功能类别“1-代谢和能量”(36%)、“5-信息通路”(33.3%)和“2-细胞过程”(20%)的蛋白最多。“1-代谢和能量”类蛋白质分为碳代谢、能量代谢、能量转移/ atp -质子动力、核苷酸/核苷代谢和次级代谢5个亚类。来自“5-信息通路”(翻译相关、蛋白质折叠/陪伴和蛋白质转换)和“2-细胞过程”(信号转导和反应蛋白和解毒)类别的蛋白质也观察到了同样的情况。gydF4y2Ba

与初级代谢相关的蛋白质gydF4y2Ba

令人惊讶的是，我们发现只有少数蛋白质在初级代谢中有差异表达。这一结果可能是由于2-DE凝胶技术的局限性，或者是两个季节之间只有少量与初级代谢有关的蛋白质发生了大量变化。我们发现了在碳水化合物代谢、细胞壁生物合成、糖酵解和TCA中起作用的不同蛋白质:udp -葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)、udp -葡萄糖脱氢酶(UGDH)、磷酸甘油酸激酶(三种可能的异构体)、三糖磷酸异构酶、烯醇化酶(四种可能的异构体)、柠檬酸合酶(两种可能的异构体)和苹果酸脱氢酶，它们都属于“1”类中的不同亚类。代谢和能量”。gydF4y2Ba

发现了四种可能的UGPase亚型，表现出不同的表达模式。其中3个在冬季表达上调，最后一个在夏季表达上调，表现为时序性表达上调。UGPase是蔗糖代谢中的关键酶，它根据组织的代谢状态催化葡萄糖-1-磷酸和UTP可逆地生成udp -葡萄糖和焦磷酸盐。在光合组织中，UGPase将葡萄糖-1-磷酸转化为udp -葡萄糖，可用于合成蔗糖或细胞壁多糖[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．在非光合库组织中，UGPase通过将蔗糖合酶产生的udp -葡萄糖转化为葡萄糖-1-磷酸与蔗糖降解途径相联系[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba］．UGDH在冬季上调，将半纤维素和果胶的前体UDP-glucose转化为UDP-glucuronate。在木质组织中，UGPase和UGP的作用尚不清楚。两个UGDH基因主要表达在6月龄的根、茎和树皮中gydF4y2Ba大肠茅gydF4y2Ba是克隆gydF4y2Ba34gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

我们发现了树可能的磷酸甘油酸激酶亚型和四种可能的三磷酸异构酶亚型，它们都在冬季上调。2个烯醇化酶在冬季上调，2个在夏季上调。在冷驯化过程中，与碳水化合物和能量代谢相关的蛋白质丰度发生了变化gydF4y2Ba绣球花香gydF4y2Ba树皮(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．在“碳代谢”亚类中，我们发现树木RbcL亚型在冬季均上调。在我们的工作中没有发现红细胞，这可能是没有检测到红细胞作为差异表达点。据我们所知，文献中没有关于树皮中rubisco亚基表达模式(转录本和蛋白质)的数据。在gydF4y2Ba大肠茅gydF4y2Ba在不同树龄的树木形成层中，RbcL已经被证实存在，通过免疫印迹，RbcS亚基仅在叶片对照中被检测到[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba］．在树皮中发现了与碳固定有关的蛋白质gydF4y2Ba碧桃gydF4y2Ba［gydF4y2Ba36gydF4y2Ba),gydF4y2Ba云杉sitchensisgydF4y2Ba［gydF4y2Ba37gydF4y2Ba］．我们在研究中观察到的RbcL的蛋白谱与我们发现的转录模式相反，因为该转录在夏季被上调。转录组和蛋白质组数据之间的差异在文献中被广泛讨论，可能表明转录后和/或翻译后修改的发生[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba40gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

与其他生物学途径相关的蛋白质gydF4y2Ba

蛋白质组学提供了一组在特定时间、组织或条件下表达的蛋白质的鉴定。因此，我们确定了除初级代谢外，还涉及其他生物过程的多种蛋白质。与蛋白质折叠/陪伴相关的蛋白最为丰富，其中热休克蛋白(HSP) 17个，2个在冬季表达上调。一些热休克蛋白是调节蛋白质折叠、定位、积累和降解的分子伴侣[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba］．因此，热休克蛋白通过重建正常的蛋白质构象和内稳态，在保护植物免受多种环境胁迫方面起着至关重要的作用。研究还发现了其他与胁迫相关的蛋白，如:1个胚胎晚期蛋白(LEA)、7个抗坏血酸过氧化物酶(APX)和2个14-3-3蛋白。冬季LEA蛋白表达上调;这种蛋白质存在于植物种子中，也存在于寒冷、干旱或高盐度等胁迫条件下的营养组织中[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba］．在鉴定的7个APX中，夏季上调的有5个，冬季上调的有2个。APX的表达被诱导响应不同形式的压力，导致活性氧(ROS)的积累[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba］．14-3-3蛋白也被发现。这些是磷酸化丝氨酸结合蛋白，通过直接的蛋白质-蛋白质相互作用调节一系列靶点的活性。在植物中，14-3-3调节质膜HgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba- atp酶和碳氮代谢酶[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba］．鉴定出3个翻译相关蛋白，2个起始因子(夏季上调)和1个延伸因子(冬季上调)。两种咖啡酸o-甲基转移酶(COMT)在冬季上调。COMT是植物细胞壁合成中控制木质素单体生成的重要酶之一。gydF4y2Ba

树皮可溶性糖gydF4y2Ba

树木在其木材和树皮的薄壁组织中储存大量的碳水化合物。当当前的光合作用水平不够时，这些储存的碳水化合物可以被用来满足树木维持和生长的碳需求[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba］．为了确定夏季和冬季树皮碳水化合物贮藏的差异，我们测定了夏季和冬季树皮样品的可溶性糖。大幅增加(gydF4y2BaPgydF4y2Ba冬皮中葡萄糖、果糖、蔗糖含量≤0.05)和可溶性总糖含量(图;gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．根据文献，我们的结果表明，糖在冬季积累，在这个季节，树木表现出生长减少(热带地区)甚至休眠(温带地区)。夏季水分利用率较高，桉树生长速度较快。因此，为了保持高的代谢率，消耗储存在树皮中的碳水化合物是必要的。在gydF4y2Ba山茱萸sericea LgydF4y2Ba．冬季树皮和木材组织中可溶性糖以葡萄糖、果糖、蔗糖和棉子糖为主。在早春，可溶性糖浓度下降，淀粉浓度上升。可溶性糖在秋季增加，在冬季达到最大值[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba］．树皮中可溶性糖含量较高gydF4y2Ba蓝桉gydF4y2Ba耗水量不足[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba］．在碳水化合物储存方面的碳投资可能提供安全边际，使树木在干旱和昆虫袭击等胁迫期间保持水力运输和新陈代谢[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba］．我们认为，在我们的研究中，葡萄糖、果糖和蔗糖可能在冬季积累，以应对水分供应减少而不是低温。因此，夏季和冬季降水的差异可能与碳分配相关的代谢变化有关。另一点需要考虑的是可溶性糖在低温下的积累，这是冷适应的一种机制[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba49gydF4y2Ba特别是在温带地区的树木中。Travert等[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba的两种基因型gydF4y2Ba桉树gydF4y2Ba细胞悬浮培养到低温。抗性细胞(杂交gydF4y2Ba桉树gydF4y2Bagunnii x桉树gydF4y2Ba小球gydF4y2Ba)积累的可溶性糖，尤其是蔗糖和果糖。相比之下，霜冻敏感细胞(杂交gydF4y2Ba桉树cypellocarpagydF4y2BaxgydF4y2Ba桉树小球gydF4y2Ba)对相同的处理没有积累可溶性糖。作者将这些数据与几种碳水化合物(葡萄糖、果糖、蔗糖、棉子糖和甘露醇)对提高桉树细胞的抗冻性以及糖在冷适应过程中的低温保护作用联系起来。gydF4y2Ba

季节变化中的代谢分析gydF4y2Ba

采用GC-MS进行代谢谱分析，以确定季节变化导致的主要代谢物的变化。共鉴定出32种代谢物gydF4y2Ba大肠茅gydF4y2Ba树皮。所有代谢物分为5类，其中有机酸(28%)、糖(21%)、脂肪酸(18%)和氨基酸(9%)最具代表性(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．一个PLS-DA(偏最小二乘判别分析)导出的得分图(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)显示两组间的差异有统计学意义。两个PLS分量占总方差的64.2%。我们的PLS-DA模型比较了夏季和冬季的吠叫声gydF4y2BaRgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba问gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba值分别为0.95和0.91。为了识别在夏季和冬季样本代谢物剖面之间有最显著贡献的变量，我们考虑了投影(VIP)值高于1.0的变量重要性，并结合gydF4y2BapgydF4y2Ba-值小于0.05。在此基础上，我们发现了夏季和冬季类群差异丰富的8种代谢物(TablegydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．冬季树皮中含量较高的有机酸为莽草酸和脱氢抗坏血酸。莽草是莽草途径中的一种中间体，将碳水化合物代谢与芳香族化合物的生物合成联系起来[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba］．脱氢抗坏血酸是一种重要的抗氧化维生素C的氧化形式[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba］．黄酮类化合物taxifolin和代糖赤藓糖醇在冬季也非常丰富。夏季代谢产物为苹果酸、半乳糖醇、葡萄糖酸钠和富马酸盐。苹果酸和富马酸是TCA的重要中间体。在某些C3植物中，它们可以在白天积累，在夜间减少，这表明它们是一种短暂的碳储存分子[gydF4y2Ba53gydF4y2Ba］．在C3植物中，维管系统周围的光合细胞提供苹果酸盐或COgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba从木质部导管。因此，苹果酸盐可以被这些血管系统和CO边缘的细胞脱羧gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba可用于光合作用产生碳水化合物[gydF4y2Ba54gydF4y2Ba］．虽然可溶性糖(蔗糖、葡萄糖和果糖)在冬季积累，但半乳糖醇在夏季高度丰富。它参与棉子糖的生物合成，两者都起保护细胞膜免受非生物胁迫的作用[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

综合分析gydF4y2Ba大肠茅gydF4y2Ba吠叫是对季节变化的反应gydF4y2Ba

树皮在将吸收的碳运输到碳汇组织中起着重要作用，在那里它可以用于生长和/或储存[gydF4y2Ba56gydF4y2Ba］．为了更全面地了解发生的动态变化gydF4y2Ba大肠茅gydF4y2Ba我们的工作中产生的所有信息都被分组(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．我们的数据显示了夏季和冬季样本之间的碳分配差异。在转录和代谢水平上，碳水化合物的形成似乎更倾向于冬季，与该途径相关的一些蛋白在冬季也上调。在冬季，干燥的季节，树木的生长减少，因此，促进细胞壁生长和扩大所需的碳骨架水平较低，有助于糖的积累。此外，与在树木中发生的情况相反，在温带地区，我们不相信碳水化合物在gydF4y2Ba大肠茅gydF4y2Ba树皮，响应冷适应/抗冻性。我们认为这是由于水的可用性较低。gydF4y2Ba

我们没有发现与乙醇发酵相关的蛋白质，可能是由于2d凝胶的局限性，另一方面，我们发现了差异表达gydF4y2Ba抗利尿激素gydF4y2Ba而且gydF4y2BaPDCgydF4y2Ba记录。gydF4y2Ba抗利尿激素gydF4y2Ba3在夏季和夏季上调gydF4y2BaPDCgydF4y2Ba在冬季上调。虽然我们没有发现任何与碳固定直接相关的代谢物，但我们发现了在Calvin-Benson循环中起作用的转录本和蛋白质，尤其是RbcL，这强烈表明碳固定发生在树皮中。gydF4y2Ba

关于树皮树代谢的研究较少，季节变化对其影响的了解也较少。鉴于…的重要性gydF4y2Ba桉树gydF4y2Ba尤其是在巴西，对于不同的工业应用，理解季节变化如何影响整个树木和组织是很重要的。我们的研究结果强烈表明，夏季和冬季之间的转变引发了代谢重构，因为我们在所有被调查的水平(转录本、蛋白质和代谢物)中发现了显著差异。在夏季，树木快速生长，能量化合物是支持糖酵解和线粒体电子传递链所必需的。然而，与解剖障碍相关的高呼吸率在树皮内部产生缺氧环境。因此，乙醇发酵是NAD再生的重要途径gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba维持糖酵解和植物代谢。众所周知，树皮是一种储存组织，在冬季树木生长减弱。在冬季，可溶性糖的积累可能是因为热带地区可用的水分减少，而不是因为温带树木中观察到的较低的温度(冷驯化)。我们观察到的一个有趣的数据是树皮中RbcL转录物和蛋白质的鉴定。本研究为了解季节变化提供了重要数据gydF4y2Ba桉树gydF4y2Ba树皮。未来的研究需要确定哪些亚型参与乙醇发酵和碳水化合物代谢，并阐明RbcL在树皮中的确切功能。gydF4y2Ba

植物材料和实验条件gydF4y2Ba

组织样本取自6年生的商业无性系树木gydF4y2Ba桉树茅gydF4y2Ba，由Suzano Papel e Celulose提供。现场试验地点位于巴西São Paulo州的Itapetininga市(23°35′20″S, 48°03′11″W)，海拔656米。为了分析夏季/活跃生长和冬季/减弱生长期间转录本、蛋白质和代谢物的变化，分别在2009年1月和2009年7月收获了夏季和冬季的树皮样本。样本在上午9点到10点之间采集。1 /夏季平均气温为23.7℃，平均降水量为213.2 mm。在7月/冬季，这些参数分别为16.8°C和47.7 mm。每棵树在胸高(1.30 m)处剥去树皮，露出约20 × 15厘米的面积gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba)．用剃须刀片刮除树皮内表面形成层组织，丢弃后立即放入液氮冷冻。现场试验采用完全随机设计。采用6个大体积样本(每棵10棵)作为生物重复。三大块代表夏天，三大块代表冬天。该植物材料经Suzano Papel e Celulose S/A许可使用。gydF4y2Ba

RNA提取和mRNA分离gydF4y2Ba

用Zeng和Yang描述的方法从树皮样本中提取总RNA [gydF4y2Ba57gydF4y2Ba］．总RNA浓度在260/ 280 nm分光光度法测量，在U-3300分光光度计(日立，东京，日本)。RNA降解的缺失通过甲醛变性琼脂糖凝胶电泳验证(1%)。根据制造商的说明书，使用Dynabeads®mRNA纯化试剂盒(Invitrogen Dynal, Oslo, Norway)分离mRNA。gydF4y2Ba

实时聚合酶链反应gydF4y2Ba

利用Primer 3软件设计基因特异性引物(附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba:表S1)。引物对设计如下:引物长度为18 pb - 25 bp，产物长度为100 ~ 250 bp，熔点温度为55 ~ 60℃，GC%为40 ~ 60%。cDNA第一和第二链的合成使用gydF4y2BaSuperScriptTM一步RT-PCR Platinum®TaqgydF4y2Ba(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) RT/Platinum®试剂盒gydF4y2BaTaqgydF4y2Ba(Invitrogen公司，Carlsbad, CA, USA)，并使用对感兴趣基因特异性的引物(附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba:表S1)。在57°C退火温度下，在Gene Amp®PCR System 9700热循环器(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)中产生cdna。互补脱氧核糖核酸(10gydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba})作为RT-qPCR检测的模板，在iQ5仪器(BioRad)中进行，以获得de threshold定量周期(gydF4y2BaCqgydF4y2Ba)及放大效率(gydF4y2BaEgydF4y2Ba)．在PCR循环结束时，用热循环仪绘制变性曲线。每个反应的最终体积为20 μL，包括cDNA，每个引物10 mM, 1x Supermix SYBR Green real-time RT-PCR (Invitrogen)。每个基因均纳入阴性对照(无cDNA模板)。分析了3个生物重复，每个重复有3个技术重复。使用relative expression Software Tool (REST)进行相对表达率的计算[gydF4y2Ba58gydF4y2Ba]使用两两固定再分配随机化检验对统计显著性(gydF4y2BaPgydF4y2Ba≤0.05)(gydF4y2Ba59gydF4y2Ba］．内参照基因(α-微管蛋白和citoplasmatic苹果酸脱氢酶(MDHc))被鉴定gydF4y2BaNormFindergydF4y2Ba［gydF4y2Ba60gydF4y2Ba］．该软件gydF4y2BaLinReggydF4y2Ba［gydF4y2Ba61gydF4y2Ba]计算PCR效率，CgydF4y2Ba问gydF4y2Ba分析每个基因的值。gydF4y2Ba

蛋白质组学分析gydF4y2Ba

根据Hurkman和Tanaka [gydF4y2Ba62gydF4y2Ba]，并在Celedon等人中进行了少量修改[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba］．组织在15 mL提取缓冲液(0.7 M蔗糖，0.5 M Tris-HCl, pH 7.5, 50 mM EDTA, 0.1 M KCl, 1% w/v聚乙烯聚吡啶酮(PVPP)， 2% v/v 2-巯基乙醇，2 mM PMSF)中匀浆，在4°C摇晃30分钟。在蛋白悬浮液中加入等量的pH为8.5的饱和三氯饱和苯酚。再4°C振荡30 min，离心(10000 ×gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C下30分钟)。回收苯酚相，用等量的提取缓冲液重新提取。在甲醇中加入5体积的0.1 M乙酸铵，从苯酚相中沉淀蛋白质，并在-20°C孵育过夜。样品离心(10000 ×gydF4y2BaggydF4y2Ba， 4°C 30 min)，用0.1 M醋酸铵甲醇洗涤三次，然后用丙酮洗涤。蛋白质颗粒在4°C真空下干燥，悬浮于1ml增溶缓冲液(7 M尿素，2 M硫脲，0.4% v/v Triton X-100, 50 mM二硫苏糖醇(DTT))中。蛋白质用Bradford法定量[gydF4y2Ba63gydF4y2Ba］．蛋白质样品(700 μg)与含有10 mM DTT、4% (w/v) CHAPS、1% IPG缓冲液(GE Healthcare, Chalfont St. Giles, UK)的缓冲液(340 μL)混合。使用溴酚蓝(1% w/v)将Immobiline IPG条带(18 cm -pH 4-7，线性梯度，GE医疗，查尔丰特圣贾尔斯，英国)再水化12小时(20°C, 50 v)。再水化带在Ettan™IPGphor II™(GE Healthcare)中等电聚焦1小时，从100 V开始，然后500 V 1小时，1000 V 1小时，5000 V 1小时和8000 V，直到达到80000 V-h。第二次维前，在平衡缓冲液(6 M尿素，2% w/v SDS, 50 Mm Tris-HCl, pH 6.8, 30% v/v甘油)中，先用1% w/v DTT，然后用2.5% w/v碘乙酰胺(IAA)和0.001 %溴酚蓝)室温保存15 min。每个处理进行3个生物重复。用考马斯亮蓝G-250检测蛋白质gydF4y2Ba64gydF4y2Ba］．凝胶在含有40% (v/v)乙醇和10% (v/v)乙酸的水溶液中孵育1小时。为了进行蛋白检测，凝胶在染色液(20% (v/v)甲醇，10% (w/v)硫酸铵，10% v/v磷酸和0.1% (w/v)考马斯g -250)中留过夜。使用Image scanner III和Labscan v 7.0软件(GE- Healthcare)对凝胶进行成像。图像分析使用Image Master 2D Platinum软件v 7.0 (GE Amersham Bioscience)自动进行。斑点的平滑度为8，最小面积为15，显著度为40，凝胶上的斑点用每个凝胶上的5个标记进行匹配。匹配是自动进行的，并在一个接一个的视觉检查后系统地进行确认:忽略无法确定为真实匹配的工件或点，并在适当时手动纠正错位。当3个生物重复中至少有2个溶解良好时，斑点被认为是可重复的。将夏季和冬季样品中相应斑点的归一化体积(% vol.)进行比较，以估计不同季节蛋白质的差异表达。为保证技术重复间的重现性，剔除变异系数大于30%的斑点。 To identify spots significantly expressed the data collected from protein spot volumes were subjected to Student’s t-test (PgydF4y2Ba≤0,05)在Image Master v7.0软件中。按照Celedon等人的描述进行蛋白质的凝胶内消化[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba之后，使用nano-Acquity UPLC (Waters®)系统与Q-TOF Ultima API质谱仪(Waters，英国)耦合，通过在线色谱对多肽混合物进行测序。质谱仪参数根据Celedon等进行调整[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba］．将10微升样品加载到柱前Symetry MCA C185 mm, 5630 mm (Waters)上进行样品预浓缩和脱盐，然后在LC色谱柱Symmetry C185 mm, 32 × 150 mm (Waters)上进行肽分离。采用B溶剂(95% (v/v)乙腈，0.1% (v/v)甲酸水溶液)的线性梯度(10 - 45%)洗脱多肽。前15分钟流速为5 mL/min，后25分钟流速为2 mL/min，最后5分钟流速恢复到5 mL/min。溶剂A由5% v/v乙腈和0.1% v/v甲酸组成。所有分析均在3kv针电压下使用正离子模式进行。质量范围设置在300到2000之间gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba，获得了至少有15个计数的最强烈的峰的MS/MS谱。gydF4y2Ba

蛋白质/ MSMS-data分析识别gydF4y2Ba

使用ProteinLynx v 2.0 (Waters)和Mascot Daemon (Matrix Science, Boston, MA)软件进行llc -MS/MS处理，并在内部进行序列搜索gydF4y2Ba桉树gydF4y2Ba数据库来自Phytozome v1.1 (gydF4y2Bawww.phytozome.net/eucalyptus.phpgydF4y2Ba)和NCBI。MS-MS/MS联合搜索标准如下:胰酶消化;固定修饰集为半胱氨酸氨基甲基化;可变修饰设定为蛋氨酸氧化);母离子的质量精度为50 ppm, MS/MS质量公差为0.1 Da。根据吉祥物概率分析，只有重大命中(gydF4y2BaPgydF4y2Ba≤0.05)为合格。如果肽得分高于70，则匹配被认为是显著的，根据Perkins等[gydF4y2Ba65gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

代谢分析gydF4y2Ba

将树皮样品在液氮中研磨成粉末gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和冻干。代谢物按照Hoffman等人描述的方法提取[gydF4y2Ba66gydF4y2Ba]，但略有改动。将大约5mg干燥组织与1ml氯仿-甲醇-水混合物(6:2:2)混合，其中含有稳定同位素参考化合物[15 ng mL]gydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}每个人(gydF4y2Ba^13gydF4y2BaCgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba肉豆蔻酸(gydF4y2Ba^13gydF4y2BaCgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba棕榈酸,gydF4y2Ba^2gydF4y2BaHgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba)琥珀酸(gydF4y2Ba^13gydF4y2BaCgydF4y2Ba_5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba^15gydF4y2BaN)氨基戊二酸,(gydF4y2Ba^2gydF4y2BaHgydF4y2Ba_7gydF4y2Ba)胆固醇(gydF4y2Ba^13gydF4y2BaCgydF4y2Ba_5gydF4y2Ba脯氨酸,gydF4y2Ba^13gydF4y2BaCgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba) -disodiumketoglutarate, (gydF4y2Ba^13gydF4y2BaCgydF4y2Ba_12gydF4y2Ba)蔗糖,(gydF4y2Ba^2gydF4y2BaHgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba腐胺,gydF4y2Ba^2gydF4y2BaHgydF4y2Ba_6gydF4y2Ba-水杨酸及(gydF4y2Ba^13gydF4y2BaCgydF4y2Ba_6gydF4y2Ba)葡萄糖)。代谢物提取使用振动磨进行，频率设置为30赫兹gydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}3分钟后，在每个萃取管中加入3 mm的碳化钨珠，以提高萃取效率。然后在Eppendorf离心机(型号54178)中14000 rpm离心10分钟。gydF4y2Ba

之后，各取100毫升上清液转移到气相色谱瓶中，蒸发至干燥。样品经30 μL盐酸甲氧胺(15 mg mL)衍生gydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba})在吡啶中室温保存16小时。在样品中加入30 μL n -甲基- n -(三甲基硅基)三氟乙酰胺(MSTFA)和1%的TMCS，室温孵育1 h，进行三甲基硅基化反应。硅基化后，加入30 μL庚烷。根据Gullberg等人的研究，对样本进行了分析[gydF4y2Ba67gydF4y2Ba]，采用气相色谱-飞行时间质谱(GC/TOF-MS)与空白对照样品和一系列gydF4y2BangydF4y2Ba-烷烃(C12-C40)，可计算保留指数[gydF4y2Ba68gydF4y2Ba］．每个衍生样品的1微升由CTC Combi Pal Xt Duo (CTC Analytics AG，瑞士)自动进样器在Agilent 7890A气相色谱仪中以不拆分的方式注入，该气相色谱仪配备30 m × 0.25 mm i.d.熔融石英毛细管柱，化学键合0.25-μm DB 5-MS UI固定相(J&W Scientific, Folsom, CA)。进样器温度260℃，间隔吹扫流量20 mL mingydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}净化在75秒后启动。通过色谱柱的气体流速为1ml mingydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}，柱温70°C保持2 min，再升高15°C mingydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}至320°C，并保持4分钟。柱流出物被引入Pegasus HT飞行时间质谱仪(Leco Corporation, St. Joseph, MI, USA)的离子源中。转移线温度为250℃，离子源温度为200℃。用70 eV的电子束在2.0 mA的电离电流和20-30的光谱s下产生离子gydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}(30光谱gydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}运行1,20个光谱秒gydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}运行2)在50−800的质量范围内记录gydF4y2Ba米gydF4y2Ba/gydF4y2BazgydF4y2Ba．经过290 s的溶剂延迟后打开加速电压。检测电压为1450-1490 V (1450 V运行1,1490 V运行2)。将代谢分析过程中所有未加工的ms文件导出至Leco公司的ChromaTOF 2.12软件中，进行所有人工整合和代谢产物鉴定。所有数据处理程序(基线校正和色谱比对)均使用海关脚本[gydF4y2Ba68gydF4y2Ba在MATLAB]。为了比较夏季和冬季之间的代谢物变化，将归一化数据集(组织干重和内部标准)进行Pareto标度、对数变换，并使用MetaboAnalyst软件应用于多变量和单变量分析方法[gydF4y2Ba69gydF4y2Ba］．采用监督分类方法PLS-DA对不同组别(夏季和冬季)进行区分。PLS-DA模型拟合采用RgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba和问gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba交叉验证性能测量[gydF4y2Ba69gydF4y2Ba，两者都在0到1之间变化。RgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba，因变量和PLS-DA预测之间的平方相关系数，表明模型的“拟合优度”(值在0到1之间，其中1是完全相关)。问gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba提供了“预测的好坏”的指示，是因变量和PLS-DA预测之间的平均相关系数。为了确定促成两组之间分离的代谢物，我们使用了来自PLS-DA模型的VIP。VIP是PLS负荷的加权平方和，表明变量对整个模型的重要性。基于PLS-DA模型，结合VIP值> 1.0和gydF4y2Bap -gydF4y2Ba值(gydF4y2BaPgydF4y2Ba≤0.05)，通过单变量不配对双尾Student’s t检验。gydF4y2Ba

碳水化合物提取和高效液相色谱分析gydF4y2Ba

从树皮样品中提取可溶性糖(葡萄糖、蔗糖和果糖)。组织粉碎，冷冻干燥48 h, 0.2 g干粉中加入1 mL水后，样品在80℃的浴中保存1 h，然后离心10 min 16.000gydF4y2BaggydF4y2Ba，回收上清，-4℃保存。夏季和冬季样品使用高性能液相色谱(ICS 2500, HPLC Dionex)分析，安培检测(ED50)配备自动进样器，AS50。糖按标准品(蔗糖、葡萄糖、果糖)的保留时间分配。色谱柱为Carbopac PA-1 (4 × 250 mm, Dionex)，防护柱为Carbopac PA-10 (4 × 50 mm, Dionex)。为了确定夏季和冬季样本之间的统计差异，我们进行了Tukey’s检验(gydF4y2BaPgydF4y2Ba≤0.05);SAS (SAS Institute, Cary, NC, USA);gydF4y2Ba

2-DE，二维链电泳;ADH2，醇脱氢酶2;ADH3，醇脱氢酶3;三磷酸腺苷、三磷酸腺苷;CA、碳酸酐酶;CgydF4y2Ba问gydF4y2Ba，阈值量化周期;伊诺,烯醇酶;果糖二磷酸醛缩酶叶绿体;FBAcyt，果糖二磷酸醛缩酶细胞质;气相色谱-质谱联用;GPI，葡萄糖6-磷酸异构酶;IDH、异柠檬酸脱氢酶;NADP- me, NADP苹果酸酶;PDC,丙酮酸脱羧化酶;PDH、丙酮酸脱氢酶; PEPC, phosphoenolpyruvate carboxylase; PFK, ATP-dependent phosphofructokinase; PFP, PPi-dependent phosphofructokinase; PGAM, phosphoglycerate mutase; PGK, phosphoglycerate kinase; PGM, phosphoglucomutase; PK, pyruvate kinase; PLS-DA, partial lest squares discriminant analysis; RbcL, rubisco large subunit; RbcS, Rubisco small subunit; RPI, ribose 5-phosphate isomerase; RT-qPCR, reverse transcription quantitative real time polymerase chain reaction; SCL, succinyl-CoA ligase; SuSy1, sucrose synthase 1; SuSy3, sucrose synthase 3; TCA, tricarboxylic acid cycle; UDP, uridine diphosphate; UTP, uridine triphosphate; VIP, variable importance in the projection

我们非常感谢Esteban Gonzalez博士(FuturaGene公司)提供的生物材料，José Mateus Wisniewski Gonsalves (FuturaGene公司)和Luis Felipe Boaretto博士帮助收集样本。我们要感谢FAPESP对J.S.M. (Proc. n .)的研究gydF4y2Ba^ogydF4y2Ba2011/01236-2)。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

这项工作得到了FAPESP (São保罗研究基金会)的支持(赠款2009/00808-2和2008/50361-1)。gydF4y2Ba

数据和材料的可用性gydF4y2Ba

支持本文结果的数据集包含在本文及其附加文件中。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

IGF构思了这项研究，进行了实验，分析了数据，撰写了手稿。DHM协助RT-qPCR分析和稿件修订。JSM参与RT-qPCR和蛋白质组学分析。JB协助进行了碳水化合物的提取和HPLC分析。PL和TM协助进行代谢组学研究。CAL构思了这项研究，参与了它的设计和协调，并审查了手稿。所有作者已阅读并批准最终稿。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者声明他们之间没有利益冲突。gydF4y2Ba

同意出版gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

伦理认可和同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. Laboratório Max Feffer de Genética de Plantas, departmento de Genética，路易斯·德奎罗斯高等农业学院São Paulo，皮拉西卡巴，SP, 13418-900，巴西gydF4y2Ba

   Ilara Gabriela Frasson Budzinski, David H. Moon, Júlia Silva Morosini, Juliano Bragatto & Carlos Alberto LabategydF4y2Ba

2. Umeå瑞典农业大学森林遗传与植物生理学系植物科学中心Umeå， SE-901 83，瑞典gydF4y2Ba

   Pernilla Lindén & Thomaz MoritzgydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba阿尔贝托LabategydF4y2Ba．gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文根据知识共享署名4.0国际许可协议(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba)，它允许不受限制地在任何媒体上使用、分发和复制，前提是您要适当地注明原作者和来源，提供创作共用许可的链接，并说明是否进行了更改。知识共享公共领域转让豁免书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本文提供的数据，除非另有说明。gydF4y2Ba

再版和权限gydF4y2Ba