发育中的小麦籽粒类胡萝卜素代谢基因及其同源物的独特表达和功能

背景

β-胡萝卜素是植物产生的活性最高的维生素A原分子，在人体营养和健康中起着重要作用。β-胡萝卜素通常不会在成熟小麦的胚乳(即面粉)中积累，而胚乳是人类卡路里的主要食物来源。因此，增加小麦籽粒胚乳中β-胡萝卜素的积累将使维生素a原的持续补充成为可能。一些影响β-胡萝卜素积累的代谢基因已经从小麦中分离出来，包括植物烯合成酶1 (PSY1)，番茄红素ε-环化酶(LCYe)和类胡萝卜素β-环羟化酶1/2 (HYD1/2)。

结果

在这项工作中，我们克隆了两个类胡萝卜素裂解双加氧酶(ccd)，CCD1和CCD4，从小麦。在体外实验中，CCD1同源物将β-apo-8′-胡萝卜素、β-胡萝卜素、叶黄素和玉米黄质裂解为类胡萝卜素，而CCD4同源物对这些底物无活性。通过实时qPCR分析，PSY1，LCYe，HYD1/ 2和CCD1/4同源基因在小麦营养组织和发育中的四倍体和六倍体籽粒中表现出不同的表达模式，表明类胡萝卜素代谢基因和同源基因在小麦的转录水平上受到不同的调控。

结论

CCD1/4酶活性和基因时空表达数据为深入了解控制小麦籽粒胚乳中β-胡萝卜素积累的特定类胡萝卜素代谢基因同源性提供了关键信息，从而为通过育种和基因组编辑方法培育胚乳中β-胡萝卜素增强的小麦品种奠定了知识基础。

小麦(小麦属植物水稻和玉米是世界上消费最广泛的三种谷物。小麦胚乳(即面粉)的颜色在很大程度上是由类胡萝卜素色素决定的，在小麦育种的历史上，人们根据消费者的喜好进行选择。四倍体硬粒小麦(t . turgidum)用于制作意大利面和蒸粗麦粉，并被选择用于增加黄色色素的浓度。叶黄素是一种非维生素a原的类胡萝卜素，呈黄色，是成熟四倍体小麦籽粒胚乳中主要的类胡萝卜素分子。相比之下，六倍体面包小麦(t . aestivum)已被选择用于白面粉，导致成熟六倍体小麦籽粒胚乳中总类胡萝卜素浓度低[1- - - - - -3.]。因此，小麦胚乳通常缺乏维生素原A类胡萝卜素，无法在哺乳动物体内转化为维生素A。

由于人类不能从基本的碳氢化合物中合成维生素A，这种必需的微量营养素必须从食物中获取，以预先形成的维生素A或维生素A原的形式[4- - - - - -7]。考虑到维生素A在人体营养中不可或缺的作用以及小麦粉在提供膳食热量方面的重要性，提高小麦籽粒胚乳中维生素A原的积累对以主食为基础的维生素A营养的提供/补充具有很大的前景。在具有维生素A原活性的类胡萝卜素分子中，β-胡萝卜素可以最有效地转化为维生素A，因为它拥有两个未修饰的β-离子环(对维生素A活性至关重要的结构特征)[5(图。1)。因此，了解类胡萝卜素，特别是β-胡萝卜素在小麦胚乳中的积累是如何被控制的，对于在胚乳组织中生物强化维生素A是至关重要的。

几个控制β-胡萝卜素积累的代谢基因已经从小麦中分离出来，包括植物烯合成酶（PSY1)，引导碳通量进行类胡萝卜素的生物合成，番茄红素ε环化酶（LCYe)，将共同的生物合成前体番茄红素转移到叶黄素生物合成的竞争途径β-胡萝卜素hydroxylase1/2（HYD1/2)，使β-胡萝卜素转化为下游的羟基化产物[8- - - - - -10(图。1)。

除了羟基化作用外，β-胡萝卜素及其衍生物还可以通过转化成更小的分子(也称为。类胡萝卜素裂解双加氧酶(CCDs)(图。1)。在四种植物ccd (CCD1、CCD4、CCD7和CCD8)中，CCD7和CCD8的偶联作用是由9-生物合成独脚金内酯所必需的独联体根组织中-β-胡萝卜素[11]。从不同的植物物种中鉴定出的CCD1s定位于细胞质，并表现出对all-的裂解活性反式-β-胡萝卜素(以下简称β-胡萝卜素)和其他位于不同双键位置的线性或环状(载脂蛋白)类胡萝卜素底物(例如C9-C10/C9 ' -C10 '， C7-C8/C7 ' -C8 '和C5-C6/C5 ' -C6 ')的体外酶测定[12- - - - - -32]。从单子房植物中鉴定出的CCD1s中，水稻和玉米的CCD1s (操作系统CCD1和Zm评选CCD1)的功能特征[15，16，30.，33]。这两种酶在C9-C10/C9 ' -C10 '或C7-C8/C7 ' -C8 '位置对称地切割线状(如番茄红素)和环状(如β-胡萝卜素和玉米黄质)类胡萝卜素[15，16，30.]。然而，过度表达OsCCD1在黄金大米胚乳(经过高β-胡萝卜素积累改造)中，β-胡萝卜素含量没有显著改变，这与黄酮的作用相反操作系统CCD1在水稻胚乳类胡萝卜素分裂中的作用[j]34]。CCD1酶是否能将其他谷物(如小麦)中的类胡萝卜素转化为类胡萝卜素产品仍有待确定。

与CCD1s的胞质定位不同，CCD4蛋白含有转运肽，用于靶向质体[24，35，36]。还原间的相关性CCD4在拟南芥、菊花、葡萄、桃子、土豆和藏红花的花、果或贮藏组织中，已经观察到基因的表达/活性和类胡萝卜素积累的增加或类胡萝卜素挥发性释放的减少，这表明CCD4s在这些植物的类胡萝卜素裂解中起作用[qh]19，21，24，37- - - - - -40]。然而，在RNAi敲低系中检测到紫黄质积累增加StCCD4(土豆CCD4)，尽管圣在酶分析中，CCD4不能切割紫黄质，这表明CCD4活性的降低可能不会导致其直接底物的积累在足底［41]。在体外实验中，苹果和菊花的CCD4s在C9-C10/C9 ' -C10 '位点上显示出大量β-胡萝卜素的裂解，而拟南芥、玫瑰和桂花的CCD4s几乎没有将β-胡萝卜素转化为类伪胡萝卜素的产物。18，42]。虽然Cs藏红花CCD4a/b/c (番红花)在C9-C10/C9 ' -C10 '处均可切割β-胡萝卜素，仅在C7-C8/C7 ' -C8 '处观察到少量的切割活性CsCCD4c [24，43]。叶黄素、新黄质和紫黄质也可以作为底物Cs的类胡萝卜素谱表明烟草benthamiana植物短暂的过度表达CsCCD4c［43]。

由于多倍体小麦具有多个亚基因组(AA、BB和DD基因组)，因此小麦类胡萝卜素代谢基因存在多个同源性。而四倍体小麦(基因组AABB)是由t . urartu大约50万年前，六倍体小麦(基因组AABBDD)起源于四倍体小麦(基因组AABB)和二倍体小麦(基因组AABBDD)的杂交。山羊草属tauschii) (DD)大约在8000至10000年前[42，44]。有人提出，四倍体和六倍体小麦的基因组复制和进化可能导致基因同源物的亚功能化或新功能化，正如其他多倍体植物物种所报道的那样[45- - - - - -47]。然而，由于多倍体小麦的进化时间跨度相对较短，新功能化在多倍体小麦中发生的频率较低[42]。此外，小麦亚基因组之间的差异通常表现为同源基因的差异表达(即同一基因的不同同源物)。与这一观点一致，我们最近观察到不同的表达模式HYD1/2和LCYe四倍体和六倍体小麦籽粒发育的基因和同源性(本研究分析全谷物)[10]。特别是,HYD-B1同源表达与胚胎特异性基因非常相似[10]。这些数据提出了一种可能性，即类胡萝卜素代谢基因同源物可能在小麦籽粒的不同部位受到不同的调控，并可能具有特定的功能。

这项工作的总体目标是全面了解控制类胡萝卜素，特别是β-胡萝卜素在小麦中的积累的代谢基因和同源物。自CCD1/4在小麦中尚未分离和功能鉴定的，我们首先克隆了CCD1和CCD4从小麦中提取同源物，测定其编码蛋白的体外酶活性。然后，我们分析和比较了类胡萝卜素含量以及类胡萝卜素代谢基因同源物(包括PSY1，LCYe，HYD1/2和CCD1/4)在营养组织和发育中的四倍体和六倍体小麦籽粒的三个部分。

植物生长和组织收集

将四倍体小麦品种Kronos和六倍体小麦育种系UC1041的种子在预湿的滤纸上萌发，并在萌发后7 d转移到蛭石上，然后在温控生长室中生长(用于收集营养组织)，或者转移到土壤中，然后在温控温室中生长(用于收集籽粒)。小麦幼苗在室内生长3周后收获叶片、茎和根组织;收集的组织立即在液氮中冷冻。当第一个花药从穗的中间小花可见时，温室种植的小麦植株就被标记了。如前所述，根据六个定义的发育阶段收获发育谷物，包括水/1、早乳/2、晚乳/3、软面团/4、硬面团/5和成熟/6 [10]。用镊子和手术刀将发育3-5期的籽粒切成果皮、胚乳和胚段。第1、2和6阶段的晶粒不适合解剖，因为第1和2阶段的晶粒很小且含水，而第6阶段的晶粒非常干燥。解剖后的颗粒组织立即在液氮中冷冻。三个生物重复，每个重复包含从多个植物收获的多个籽粒汇集的切片，用于基因表达和代谢物分析。冷冻的营养组织和谷物切片用研钵和杵在液氮中研磨成细粉，保存在- 80°C以待进一步分析。

小麦RNA的提取与克隆CCD1和CCD4homoeologs

用TRI试剂(Invitrogen, Carlsbad, CA)从小麦组织中提取总RNA。采用Nanodrop®分光光度计，根据260 nm处的吸收(RNA量)和a的比例，测定RNA样品的数量和质量₂₆₀/一个₂₈₀和一个₂₆₀/一个₂₃₀(RNA质量)。通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。采用混合随机六聚体和寡聚物(dT)的BioRad iScript cDNA合成试剂盒进行首链cDNA合成。_20.引物(Hercules, CA)。

小麦的编码序列CCD1或CCD4同源物在5′和3′端高度相似。因此，同一套引物，除CCD-B1，用于小麦的扩增CCD1或CCD4同源性和克隆到pENTR/D-TOPO载体(Invitrogen)。从多个菌落中提取的质粒在每次克隆实验中测序，以确定不同的同源性CCD1或CCD4。序列确认后，CCD1/4然后将pENTR/D-TOPO中的基因同源物重组到pDEST17 (Invitrogen)中，作为his标记蛋白表达大肠杆菌。拟南芥CCD1（AtCCD1)和β-葡萄糖醛酸酶(格斯)也克隆到pDEST17中，分别作为类胡萝卜素裂解活性的阳性对照和阴性对照。为了提高重组CCD4蛋白的溶解度，用his标记小麦CCD4同源物也被亚克隆到pMAL-c2x载体上(New England BioLabs, Ipswich, MA)，用于标记麦芽糖结合蛋白(MBP)。有他标记的小麦CCD-A1平行克隆到pMAL-c2x中，作为比较His-tagged和MBP-His-tagged CCD蛋白的裂解活性的对照。

当TargetP [48]，预测小麦CCD4同源物含有不同长度的n端质体传递肽(CCD-A4为50 aa, CCD-B4为65 aa, CCD-D4为49 aa)。有研究表明，去除亚细胞靶向序列可以提高重组蛋白的表达大肠杆菌［49，50),截CCD4同源物(即没有传递肽编码的DNA序列)也被克隆到pENTR/D-TOPO中，然后在pDEST17中进行蛋白表达大肠杆菌。用于小麦克隆的引物CCD1和CCD4同源物在附加文件中列出1表S1。

重组蛋白纯化及CCD酶分析

重组质粒携带AtCCD1，格斯、小麦CCD1或CCD4(全长或截短)同源物转化为具有化学活性的细胞大肠杆菌菌株Rosetta (DE3)pLysS。的大肠杆菌37℃培养至OD₆₀₀达到0.6 - -0.8。将异丙基β- d -1-硫代半乳糖苷(IPTG)添加到细菌细胞培养物中，最终浓度为0.4 mM。细胞在16°C下继续生长20 h，在3000 x g离心20 min。使用Ni-NTA琼脂糖珠(Qiagen, Valencia, CA)纯化his标记的蛋白。使用直链淀粉树脂纯化mbp - his标记的蛋白(New England BioLabs)。通过SDS-PAGE检测重组蛋白的诱导和纯化。

β-apo-8′-胡萝卜素(Sigma Aldrich, St. Louis, MO)，叶黄素(Chromadex, Irvine, CA)和玉米黄质(纯化自大肠杆菌将表达pAC-ZEAX的细胞溶解在含有1.5% n-辛基-β- d -葡萄糖吡喃苷的乙醇中(Sigma Aldrich)。β-胡萝卜素(Sigma Aldrich)按先前描述的方法溶解，稍加修改[16]。简单地将β-胡萝卜素溶于含2% Tween-80的20 μl氯仿中。真空干燥后，加入20 μl乙醇重悬，再加入反应液中。体外CCD酶检测，200 μl反应液包括20 μg纯化重组蛋白、100 mM Tris-HCl (pH 7.0)、0.5 mM FeSO₄5 mM抗坏血酸和(apo)类胡萝卜素底物(120 μM β-apo-8′-胡萝卜素，40 μM β-胡萝卜素，20 μM玉米黄质或100 μM叶黄素)。反应在30℃下进行2 h，用乙酸乙酯萃取停止;反相高效液相色谱法注射乙酸乙酯提取物20 μl。酶测定分三次进行。

携带小麦的重组质粒CCD1或CCD4(全长)同源物以及格斯控制也变成了大肠杆菌JM109 (DE3)细胞表达pAC-BETA(含有产生β-胡萝卜素的基因)。从单个菌落开始培养过夜，用1%葡萄糖和适当的抗生素接种25 ml Bertani Luria (LB)。室温振荡培养至OD₆₀₀达到0.6。加入终浓度为0.02 mM的IPTG，细胞在室温下继续生长12 h。然后用乙醚提取生长培养基，N下干燥₂，再用乙酸乙酯重悬;HPLC分离乙酸乙酯重悬液20 μl。培养基提取从独立转化和培养的细菌细胞中重复至少三次。

HPLC和MS分析

CCD酶分析产物的HPLC程序由三种溶剂组成:(A) 20%乙腈，(B)乙腈:H₂O:三乙胺(900:99:1,v/v/v)和(C)乙酸乙酯。梯度洗脱包括:0-2 min, 100% A;2-5分钟，100- 50% A, 0- 50% B;5-10分钟，50- 0% A和50- 100% B;10-13分钟，100- 75% B, 0- 25% C;13-16分钟，75- 30% B和25 - 70% C;16-19分钟，30- 0% B和70 - 100% C;19-21分钟，100% C;21-22 min, 0- 100% A和100- 0% c，从小麦籽粒组织中提取类胡萝卜素，并进行HPLC分离和定量，如前所述[10]。细菌生长培养基的高效液相色谱分析程序包括(A) 50%乙腈，(B)乙腈:H₂O:三乙胺(900:99:1,v/v/v)和(C)乙酸乙酯，梯度如下:0-10分钟，100- 0% A和0- 100% B;10-13分钟，100- 75% B, 0- 25% C;13-16分钟，75- 30% B和25 - 70% C;16-19分钟，30- 0% B和70 - 100% C;19-21分钟，100% C;21-22 min, 0- 100% B, 100- 0% c，流速维持在1 ml min⁻¹用于所有HPLC分析。

质谱分析在热电子LTQ-Orbitrap混合质谱仪(Thermo Scientific, Waltham, MA)上进行。CCD酶分析的产物峰从高效液相色谱中收集，并用于注射到质谱仪上。等温流量为50% (A) H₂O和50% (B)乙腈保持在0.2 ml min⁻¹进行质谱分析。采用电喷雾电离法(ESI)在正极模式下获得质谱，质谱范围为m / z50 - 1000。

系统发育分析

代表性的CCD和九独联体采用Log-Expectation (MUSCLE)多序列比对方法，选择不同植物物种的-环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)蛋白进行多序列比对[51]。然后使用MEGA5使用两两删除法构建相邻连接(NJ)树[52]。用1000轮bootstrapping测试了NJ树的鲁棒性。米饭(操作系统)、高粱(某人)和玉米(Zm评选) CCD和NCED序列从[33]。基因银行(非)答:芥序列)和AGI (答:芥序列)加入编号为:在CCD1 At3g63520;在CCD4 At4g19170;在CCD7 At2g44990;在CCD8 At4g32810;在NCED2 At4g18350;在NCED3 At3g14440;在NCED5 At1g30100;在NCED6 At3g24220;在NCED9 At1g78390;CaCCD1 DQ157170;CcCCD1 DQ157166;独联体CCD1 AB219165;ClCCD1 AB219168;厘米CCD1 DQ269467;CsCCD1a AJ132927;CsCCD1b EU523661;铜CCD1 AB219164;直流CCD1 DQ192203;足总CCD1 ACA13522;的CCD1 BAJ05401;Ph值CCD1 AY576003;理查德·道金斯CCD1 ABY47994;SlCCD1A AY576001;SlCCD1B AY576002;助教CCD-A1 KU975445;助教CCD-B1 KU975446;助教CCD-D1 KU975447;VvCCD1 AY856353;CsCCD4a EU523662;CsCCD4b EU523663;CsCCD4c JN131499;铜CCD4 BAO18774;CxmCCD4a ABY60885;CxmCCD4b BAF36656;医学博士CCD4 ABY47995;的CCD4 ABY60887;页CCD4 JX309999;理查德·道金斯CCD4 ABY60886;圣CCD4 XP_006359966;助教CCD-A4 KU975448;助教CCD-B4 KU975449;助教CCD-D4 KU975450;薄液晶,AJ489277;CsZCD AJ489276。在，拟南芥;薄，Bixa奥雷利亚纳;Ca，Coffea阿拉比卡;Cc，Coffea canephora;独联体，素类;Cl，柠檬;厘米，Cucumis梅洛;Cs，番红花;铜，柑橘unshiu;Cxm，菊花x鉴定;直流，Daucas胡萝卜;足总，草莓属ananassa;医学博士，马吕斯x有明显;的，桂花fragans;操作系统，栽培稻;Ph值，佩妮矮牵牛;页，碧桃;理查德·道金斯，罗莎x波纹的;某人，高粱二色的;Sl，茄属植物lycopersicum;七、龙葵;助教，小麦;Vv，葡萄;Zm评选，玉米。LCD，番茄红素裂解双加氧酶;玉米黄质裂解双加氧酶。

实时qPCR分析

总RNA用RNase-free DNase I (Fermentas, Glen Burnie, MD)处理。采用5 μg总RNA、随机六聚体和iScript cDNA合成试剂盒(BioRad)进行cDNA合成。小麦专用引物HYD1和HYD2同源基因和内参基因已被报道[10]。特定引物PSY1，LCYe，CCD1和CCD4利用六倍体小麦品种“中国春”的零染色体-四染色体和二染色体系设计并验证了同源性2:表S2;额外的文件3.:图S1)。对qPCR产物进行克隆和测序，以验证扩增的目的基因同源性。

如前所述，使用iTaq SYBR®Green Supermix进行实时qPCR分析[10]。目的基因同源物的qPCR扩增效率在90% ~ 121%之间。转录本定量采用相对标准曲线法[53]。从全谷物合成的cdna用于构建标准曲线，以便比较不同谷物切片中表达的同源性。利用在小麦不同组织中稳定表达的两个内参基因Ta2291和Ta54227的几何平均值对基因表达进行归一化[j]。54]。

统计分析

单向变异分析(ANOVA)之后是未配对的双尾分析t采用-试验(四倍体小麦中类胡萝卜素含量及基因表达)或Tukey试验(六倍体小麦中基因表达)。所有统计分析均采用JMP (SAS Institute, Cary, NC)进行。

小麦的克隆与生化特性研究CCD1和CCD4homoeologs

小麦CCD1和CCD4通过检索TIGR基因指数和基因组序列，确定了同源性Ae。tauschii六倍体小麦品种中国春利用拟南芥CCD1和CCD4序列作为查询。CCD1和CCD4基于小麦-水稻合成，对不同的小麦亚基因组进行了同源性定位，并利用中国春的零染色体-四染色体和二染色体系对亚基因组的定位进行了验证3.:图S1)。与之前从其他植物物种中鉴定出的CCD1和nced相比，小麦CCD1和CCD4同源物分别属于CCD1和CCD4分支，具有很强的支持(图2)。2)。此外，小麦CCD1和CCD4同源基因与其单子叶近缘基因紧密聚集(图2)。2)。

为了确定小麦CCD1和CCD4同源物对(载脂蛋白)类胡萝卜素底物的催化活性，用纯化的CCD1/4重组蛋白进行了体外酶分析(附加文件)4:图S2)。三个小麦CCD1同源物裂解β-apo-8′-胡萝卜素(C_30.类伪胡萝卜素)在C9-C10位置形成β-离子酮(m / z[m + h]⁺)和β-apo-10,8′-胡萝卜素(C₁₇二醛;m / z[qh] [qh]⁺)(图。3.;附加文件5:图S3和附加文件6:图S4)。除了β-apo-8′-胡萝卜素外，小麦CCD1同源物对叶黄素也表现出显著的裂解活性，而以β-胡萝卜素和玉米黄质作为底物时，产生的产物相对较少(图2)。3.;附加文件5:图S3和附加文件6:图S4)。值得注意的是，β-胡萝卜素在反应缓冲液中仅部分可溶，这可能限制了该底物对酶的可及性。

C₁₄双醛β-apo-10,10 ' -胡萝卜素(m / z[m + h]⁺)与β-胡萝卜素、玉米黄质或叶黄素反应产生，表明这些类胡萝卜素在C9-C10/C9 ' -C10 '双键上被小麦CCD1同源物对称切割(图1)。3.;附加文件5:图S3和附加文件6:图S4)。类胡萝卜素底物在C9-C10/C9 ' -C10 '处的对称切割也被β-离子酮(来自β-胡萝卜素;m / z[m + h]⁺)， 3-OH-β-离子酮(来自玉米黄质;主要的片段m / z[qh] [qh]⁺),和3 ' -哦-α紫罗酮+ 3-OH -β紫罗酮(叶黄素;m / z[au:] [au:]⁺)在这些反应(图。3.;附加文件5:图S3和附加文件6:图S4)。3-OH-β-ionone和3 ' -OH-α-ionone在以叶黄素为底物的反应中共洗脱时间为6.97 min，在质谱分析中显示出与玉米黄质裂解反应中得到的3-OH-β-ionone不同的断裂模式(图2)。3.) [31，55]。CCD1对β-胡萝卜素的活性进一步得到验证大肠杆菌与pac - β(一种含有β-胡萝卜素生物合成基因的质粒)和CCD1同源物共转化的细胞。在产生β-胡萝卜素的培养基中也发现了β-离子酮大肠杆菌表达小麦CCD1同源物的细胞(图2)4;额外的文件7:图5)。

与his标记的CCD1蛋白部分分裂为可溶性蛋白部分不同，his标记的CCD4蛋白在很大程度上是不溶的4:图S2)。CCD4同源物随后表达为mbp - his标记的蛋白，并显示出更高的蛋白溶解度4:图S2)。总的来说，纯化的MBP-His-CCD4蛋白在酶分析中对β-apo-8′-胡萝卜素、β-胡萝卜素、玉米黄质和叶黄素没有表现出任何裂解活性。3.;附加文件5:图S3和附加文件6:图S4)。此外，β-胡萝卜素生产培养基中未检测到β-离子酮大肠杆菌共表达小麦CCD4同系物的细胞(图2)4;额外的文件7:图5)。为了确定MBP标签是否会影响蛋白活性，MBP- his - ccd - a1也在大肠杆菌与His-CCD-A1相比，显示出更高的蛋白质溶解度4:图S2)。MBP-His-CCD-A1和His-CCD-A1证明了(载脂蛋白)类胡萝卜素底物的裂解活性相当，这表明MBP标签不影响CCD蛋白的活性(图2)。3.和4)。去除n端质体传递肽后，his截短的CCD-4A/B/D蛋白的溶解度得到了适度改善(附加文件)4:图S2)。然而，his截断的CCD-4A/B/D蛋白对β-apo-8′-胡萝卜素、β-胡萝卜素、玉米黄质和叶黄素没有活性(附加文件)8:图S6)。

发育中的小麦籽粒不同部位的类胡萝卜素代谢物谱

我们之前对全谷物的分析表明，在四倍体和六倍体小麦籽粒发育的6个确定阶段，类胡萝卜素的积累逐渐减少[10]。为了进一步研究类胡萝卜素在发育中籽粒的空间积累，对四倍体(变种Kronos)和六倍体(育种系UC1041)小麦籽粒在3-5期(代表后期乳期、软面团期和硬面团期)的胚乳、胚和果皮的类胡萝卜素总量进行了分析和比较(表1)1和2)。

小麦籽粒的果皮含有β-胡萝卜素、新黄质、紫黄质和叶黄素，与光合组织的类胡萝卜素成分相似1和2) [10]。在四倍体和六倍体小麦的果皮组织中，个体类胡萝卜素和总类胡萝卜素水平在第3期和第4期相似;然而，在第5阶段，类胡萝卜素含量持续下降，其中β-胡萝卜素、新黄质和总类胡萝卜素含量显著下降(表2)1和2)。另一方面，在籽皮第3 ~ 5阶段，β、ε-/β、β-胡萝卜素分支(β、ε/β、β)类胡萝卜素的比例呈明显的增加趋势(表2)1和2)，表明类胡萝卜素的积累倾向于α-胡萝卜素/叶黄素分支，而不是β-胡萝卜素/玉米黄质分支(图2)。1)。

与果皮相反，叶黄素和紫黄素是四倍体和六倍体小麦籽粒胚乳中唯一可检测到的类胡萝卜素(表2)1和2)。在籽粒发育的各个阶段，四倍体小麦胚乳积累的叶黄素和紫黄素浓度始终高于六倍体小麦。随着籽粒胚乳的成熟，紫黄质比叶黄素下降得更快，导致四倍体和六倍体小麦籽粒第5期β、ε/β、β比值增加1倍(表1)1和2)。

除了存在于果皮和胚乳组织中的类胡萝卜素外，胚中还发现了花黄质和玉米黄质(表1)1和2)。其中花黄质占胚组织中总类胡萝卜素的20%左右。与果皮和胚乳一样，胚中总类胡萝卜素在籽粒发育后期减少，主要原因是叶黄素减少。四倍体小麦成熟胚中β、ε/β、β比值下降，而六倍体小麦成熟胚中β、ε/β、β比值基本保持不变1和2)。

发育中的小麦籽粒不同部位类胡萝卜素代谢基因同源物的表达

评价类胡萝卜素代谢基因同源性对籽粒类胡萝卜素积累、表达、表达的空间贡献PSY1，LCYe，HYD1/2和CCD1/4采用实时荧光定量pcr技术对四倍体和六倍体小麦籽粒的果皮、胚乳和胚组织的同源性进行了分析。5和6)。

在果皮组织中，PSY-A1和PSY-B1在四倍体小麦籽粒发育过程中，除第5期外，表达量均有类似的下降PSY-B1转录水平显著高于PSY-A1(无花果。5）。b基因组的优势PSY1同源性在六倍体小麦中更为明显;PSY-B1是专业吗?PSY1同系物表达于第3阶段和唯一PSY1第4期和第5期检测到的转录本(图2)。5和6)。而LCYe，HYD1和HYD2同源基因在四倍体小麦籽粒发育过程中表现出相似的转录物积累;HYD1同源性分析表明，在六倍体小麦籽粒发育的第5期表达量增加。此外,LCYe-A是唯一LCYe同源基因在六倍体小麦果皮中表达。的CCD1/4homoeologs,CCD-B4四倍体和六倍体小麦籽粒在第5期果皮表达量逐渐增加。另一个CCD1/4同源物表达相似或略有减少(CCD-A1)在四倍体和六倍体小麦籽粒发育过程中(图2)。5和6)。

在胚乳组织中，这三种基因的转录本PSY1在六倍体小麦籽粒中，同源物在实时荧光定量pcr检测限内，而在高检测限内PSY1同源表达在四倍体小麦中有所减少PSY-A1和PSY-B1在3-5阶段观察转录水平(图2)。5和6)。有趣的是,LCYe-A是唯一LCYe在四倍体和六倍体小麦籽粒胚乳中同源表达。的HYD1/2的基因,HYD1同源表达未检测到，而HYD2同源性分析表明，在四倍体和六倍体小麦中表达量降低。5和6)。只有CCD-A1和CCD-B4在四倍体小麦籽粒胚乳中观察到表达。相反，三者都是CCD1同源物在六倍体小麦籽粒胚乳中表达CCD-A1和CCD-D1在籽粒发育过程中表达增加;另一方面，没有一个CCD4同源物在六倍体小麦籽粒胚乳中有可检测到的转录物积累(图2)。5和6)。

在胚胎组织中，PSY-B1和PSY-D1是最丰富的PSY1四倍体和六倍体小麦的同源性(图2)。5和6)。LCYe-B在四倍体小麦和LCYe-A和LCYe-B在六倍体小麦中，表达量在籽粒成熟过程中显著增加，尤其是在第5期。而HYD2同源基因在籽粒发育的三个阶段表达基本一致HYD1在四倍体和六倍体小麦籽粒发育后期观察到同源表达(图2)。5和6)。有趣的是，CCD1，但不是CCD4在四倍体和六倍体小麦籽粒的胚组织中检测到同源物(图2)。5和6)。

类胡萝卜素代谢基因同源物在营养组织中的表达

为确定控制小麦四倍体和六倍体营养组织类胡萝卜素积累的遗传因素，采用实时荧光定量pcr技术分析了小麦叶、茎和根3个营养组织类胡萝卜素代谢基因同源物的表达情况(图5)。7和8)。

在离开时,HYD1/2和CCD1/4同源物在小麦四倍体和六倍体中表达相似。另一方面，PSY-A1和LCYe-一个在四倍体小麦中，转录本相对于相应的同源物更为丰富PSY-D1和LCYe-B在六倍体小麦中，转录本相对于相应的同源物更为丰富(图2)。7和8)。

在小麦四倍体和六倍体茎中，基因的相对表达模式PSY1，LCYe，HYD1和CCD1/4同系物通常与叶子中的同系物相似。然而，表达水平PSY1和CCD1/4与叶片相比，茎中的同源物要少得多(图2)。7和8)。不像可比的成绩单积累HYD2叶片中的同源物;HYD-A2看来是少校HYD2同源基因在四倍体和六倍体小麦茎中表达。7和8)。

在四倍体和六倍体小麦的根中，PSY1和CCD4同源物在检测范围之内，并且LCYe同源物缺失或表达极低(图2)。7和8)。在四倍体小麦根系中，HYD-A1和HYD-A2显然是主要的HYD1和HYD2分别homoeologs。相比之下，在三个同源物中观察到相似的表达HYD2,而HYD-D1仅在六倍体小麦根系中有基线表达(图2)。7和8)。CCD-A1和CCD-B1小麦四倍体和六倍体根系同源基因表达量差异不显著CCD-D1其表达量是其他两种的2倍CCD1六倍体小麦幼苗根系的同源性(图2)。7和8)。

叶黄素，而不是β-胡萝卜素，在四倍体和六倍体小麦籽粒的胚乳(面粉)中以不同水平积累(表2)1和2)。而在小麦中，通过阻断lye催化的反应，可以将叶黄素的碳通量重新定向到β-胡萝卜素的形成，这在玉米和马铃薯块茎中得到了证明[56，57]，了解所产生的β-胡萝卜素是否会积累或将通过HYDs的羟基化或ccd的裂解而被翻转是至关重要的(图2)。1)。我们的体外酶分析结果表明，小麦CCD1同源物可以对称地切割β-胡萝卜素，这表明CCD1同源物可能有助于在增加β-胡萝卜素产量的谷物中降解这种维生素A原分子(图2)。3.和4;附加文件5:图S3和附加文件6:图S4)。由于叶黄素在体外也可以作为CCD1同源物的底物，并且在小麦籽粒胚乳中自然积累，因此叶黄素的生物合成速率可能高于CCD1同源物在该组织中的潜在降解速率。或者，可能存在未知的机制保护叶黄素免受小麦籽粒胚乳中CCD1同源物的降解。

与CCD1同源物相比，小麦CCD4同源物不作用于β-胡萝卜素、叶黄素和玉米黄质(图2)。3.和4;附加文件5:图S3，附加文件6:图S4，附加文件7:图S5和附加文件8:图6)。它们是否能对其他类胡萝卜素分子起作用还有待确定，比如紫黄质，这些类胡萝卜素分子没有用于体外测试。在CCD4(拟南芥CCD4)先前在质体定位的质体红蛋白中被发现;特别是，它与正常叶绿体和栅栏细胞发育所需的蛋白质复合体中的锌指蛋白VAR3相互作用[35，58]。确定小麦CCD4同源物是否也结合到质体红蛋白上并与var3样蛋白合作将是有趣的。进一步对小麦CCD4同源基因进行反向遗传分析，有助于阐明其酶功能在足底以及它们的裂解产物在质体、细胞和组织发育中的作用。

以前的研究表明，低水平的玉米基因型水文学委员会(即。海德拉巴),LCYe转录本与谷物中高水平的β-胡萝卜素积累有关[57，59]，这表明类胡萝卜素代谢基因的表达可能指示了它们在植物中的功能。因此，我们研究了类胡萝卜素代谢基因同源物的表达谱，以确定在发育中的小麦籽粒不同部位控制β-胡萝卜素积累的特定基因同源物。总体而言，基因表达数据表明，同源类胡萝卜素代谢基因在小麦籽粒切片的转录水平上受到调控(图2)。5，6，7和8)。此外，小麦类胡萝卜素代谢基因同源物的组织特异性表达比基因组特异性表达更为突出(图2)。5，6，7和8)。最近，一项全基因组研究检测了六倍体小麦籽粒在开花后10、20和30天三种细胞类型(胚乳、糊粉层和转移细胞)的同源表达和基因组相互作用[j]。60]。与我们在基因表达分析中观察到的结果类似，本研究也报道了同源基因的差异表达，但没有特定亚基因组的总体优势[60]。然而，本报告没有对胚胎和果皮组织进行检测，也没有分析类胡萝卜素代谢基因同源性的表达[60]。

在小麦四倍体和六倍体胚发育过程中，LCYe-A和LCYe-B同系物显示，与叶黄素积累减少相比，表达增加[10]，这表明除了转录控制外，其他机制也可能参与小麦籽粒叶黄素代谢的调节。在小麦籽粒发育后期，果皮中单个类胡萝卜素和总类胡萝卜素大量减少;CCD-B4表达急剧增加，提高了它可能负责谷物脱水过程中果皮中类胡萝卜素降解的可能性。这一观察结果与最近对拟南芥的一项研究一致AtCCD4在种子干燥期间(与小麦籽粒4-5期相当)，表达量上升，在遗传上被证明是拟南芥种子干燥期间β-胡萝卜素降解的主要因素[21]。然而，由于本研究使用的是整个拟南芥种子，因此AtCCD4β-胡萝卜素在拟南芥种子中的表达和积累未测定。

我们的基因表达结果也为未来增加小麦籽粒胚乳中β-胡萝卜素含量的尝试提供了重要的见解。在四倍体和六倍体小麦胚乳中，HYD1同源物未表达;CCD1和CCD4同源物要么无法检测到，要么表达水平较低，因此可能不会影响类胡萝卜素在该组织中的积累。另一方面，有显著的转录积累LCYe-A(但不LCYe-B或LCYe-D),HYD2同源性，表明这些同源性的下调或功能缺失可能足以导致四倍体和六倍体小麦籽粒胚乳中β-胡萝卜素的增加。由于六倍体小麦籽粒胚乳中类胡萝卜素的总含量较低，更多的碳还需要定向到类胡萝卜素的生物合成途径，如引入PSY1在六倍体小麦籽粒胚乳中增加β-胡萝卜素水平的高表达或活性基因。

考虑到类胡萝卜素在光收获和光保护中发挥的关键作用，确保谷物胚乳中特定类胡萝卜素代谢基因同源性的下调不会影响类胡萝卜素在光合组织中的生物合成和功能是很重要的。LCYe，HYD1/2和CCD1/4同源物在叶片中也有类似的表达(图2)。7和8)，这表明光合组织中特定类胡萝卜素代谢基因同源物活性的丧失/降低可以通过同源物的重叠活动来补偿。HYD1和HYD2)和/或同源物(如…的不同同源物)HYD2)基因。

综上所述，CCD1/4酶活性和空间基因表达分析表明LCYe-A以及一个或多个基因座，包括HYD-A2，HYD-B2,CCD1同源性(仅适用于六倍体小麦)可能导致小麦籽粒胚乳中β-胡萝卜素的富集，而不影响叶片中类胡萝卜素的代谢。鉴定控制β-胡萝卜素积累的特定类胡萝卜素代谢基因同源物，将有助于通过植物育种和基因组编辑技术对小麦籽粒进行高效和有效的维生素A原生物强化。

方差分析;CCD，类胡萝卜素裂解双加氧酶;ESI，电喷雾电离;格斯,β葡萄糖醛酸酶;HYD，类胡萝卜素β-环羟化酶;IPTG，异丙基β- d -1-硫代半乳糖苷;LCD:番茄红素裂解双加氧酶;lye，番茄红素ε-环化酶;麦芽糖结合蛋白;质谱法; MUSCLE, multiple sequence comparison by log-expectation; NCED, nine-独联体-epoxycarotenoid加双氧酶;新泽西,neighbor-joining;植物烯合成酶;玉米黄质裂解双加氧酶

我们感谢sarah Kuzay、Quoc Thiem和Hana Leist对小麦籽粒收集和解剖的协助，以及马里兰大学Francis Cunningham博士提供pAC-BETA和pAC-ZEAX质粒。本研究由美国加州大学戴维斯分校(University of California, Davis)给予LT. SY启动基金支持，并由中国留学基金委奖学金和加州大学戴维斯分校植物科学系研究生奖学金资助。JD感谢霍华德休斯医学研究所和戈登和贝蒂摩尔基金会的支持。

数据和材料的可用性

支持本文结论的数据集包含在本文及其附加文件中。

作者的贡献

LT和XQ设计了实验。XQ和KF收集和解剖小麦颗粒;XQ进行实时qPCR分析;XQ和SY进行CCD酶分析;JD提供小麦遗传学和序列分析方面的专业知识，并参与了手稿的修订;XQ, SY和LT分析数据;是我写的论文。所有作者都阅读并认可了稿件的最终版本。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

发表同意书

不适用。

伦理批准并同意参与

不适用。

从属关系

1. 美国加州大学戴维斯分校植物科学系邮编3站，加州，95616

   秦晓琼，凯瑟琳·菲舍尔，于舒，豪尔赫·杜布科夫斯基，田丽

2. 美国加州大学数量与系统生物学专业，加州默塞德，95343

   凯瑟琳•菲舍尔

3. 霍华德休斯医学研究所，切维蔡斯，马里兰州，20815，美国

   Jorge Dubcovsky

4. 上海市植物功能基因组学与资源重点实验室，上海辰山植物园，上海201602

   李天

5. 中国科学院上海辰山植物科学研究中心，上海201602

   李天

相应的作者

对应到李天。

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