一个类黄酮-的分子克隆及特性研究gydF4y2BaOgydF4y2Ba-甲基转移酶具有广泛的底物特异性和区域选择性gydF4y2Ba柑橘depressagydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

黄酮类化合物是植物细胞中起重要作用的次生代谢产物。特别是，多甲氧基类黄酮(PMFs)，包括诺biletin，已被报道显示出各种健康支持特性，如抗癌、抗炎和抗致病特性。然而，由于植物细胞中含有少量这些化合物，因此很难将PMFs用于药用和膳食用途。植物细胞中PMFs的生物合成是通过黄酮类化合物羟基的甲基化进行的gydF4y2BaOgydF4y2Ba-甲基转移酶(FOMT)和多种具有不同底物特异性和区域选择性的FOMT协同参与了这种生物合成。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

在本研究中，我们分离了5个编码fmt (gydF4y2BaCdFOMT1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)gydF4y2Ba柑橘depressagydF4y2Ba众所周知，这种植物会在其果实的果皮中积累皂素。基因编码MggydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}独立的gydF4y2BaOgydF4y2Ba与高等植物类黄酮具有较高的氨基酸序列相似性(60 - 95%)gydF4y2BaOgydF4y2Ba-methyltransferases。其中一个基因是gydF4y2BaCdFOMT5gydF4y2Ba成功表达为可溶性同型二聚体酶gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba。重组物的分子质量gydF4y2BaCdFOMT5gydF4y2Ba亚基为42.0 kDa，包含一个6倍组氨酸标签。所展示的酶gydF4y2BaOgydF4y2Ba-甲基转移酶活性槲皮素，柚皮素，(-)-表儿茶素和雌马酚使用gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba-adenosyl -gydF4y2BalgydF4y2Ba-蛋氨酸(SAM)作为甲基供体，其最佳pH和温度分别为pH 7.0和45℃。重组CdFOMT5对黄酮的3-，5-，6-和7-羟基以及3,3 '，5,7-四羟基具有甲基化活性gydF4y2BaOgydF4y2Ba槲皮素作为全细胞反应体系的最终产物，合成了-甲基化槲皮素。因此，CdFOMT5是一个gydF4y2BaOgydF4y2Ba甲基转移酶对黄酮类化合物具有广泛的底物特异性和区域选择性。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

分离到5个fmt基因gydF4y2Bac . depressagydF4y2Ba，并测定其核苷酸序列。CdFOMT5成功表达于gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba并对重组蛋白的酶学性质进行了表征。重组CdFOMT5gydF4y2BaOgydF4y2Ba对许多类黄酮具有甲基转移酶活性，对槲皮素作为底物具有广泛的区域选择性。CdFOMT5表达的全细胞生物催化gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba以槲皮素为底物进行细胞处理，得到3,3 '，5,7-四甲基化的槲皮素作为最终产物。gydF4y2Ba

黄酮类化合物是植物主要的次生代谢产物。据估计，植物中存在的类黄酮衍生物有10000多种[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]．这些种类的类黄酮亚群包括黄酮类、黄酮醇类、黄烷类、黄烷醇类、异黄酮类和花青素类，它们都起源于苯丙类合成途径[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]．在植物细胞中，黄酮类化合物可被多种酶修饰，如甲基转移酶、糖基转移酶、硫基转移酶、酰基转移酶、氧化酶等。这些修饰，加上在不同类黄酮亚群中观察到的结构变化，促成了类黄酮的巨大多样性[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

众所周知，许多类黄酮在植物中具有重要的作用，如花序色素和抗氧化剂，以及作为抗致病性物质[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]、防虫[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]，以及信令功能[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]．最近，据报道，gydF4y2BaOgydF4y2Ba-甲基化黄酮类化合物在人体中具有显著的生物活性，表现出抗生素[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]，抗病毒[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]、抗癌[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]，消炎[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]，抗肥胖[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]，神经保护[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]和抗过敏[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]属性。影响的证据越来越多gydF4y2BaOgydF4y2Ba甲基化类黄酮对人体健康的影响表明，它们可以用来丰富加工食品或膳食补充剂和药品。野楝素(3′，4′，5,6,7,8-六甲氧基黄酮)是植物中含量丰富的多甲氧基类黄酮(PMF)之一gydF4y2Ba柑橘depressagydF4y2Ba剥皮，据报道它具有几种生物活性[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]．然而，在一般和医学研究中很难对皂素进行调查，因为从皂素中获得的皂素量很少gydF4y2Ba柑橘类gydF4y2Ba皮。在植物细胞中，黄酮类化合物的羟基被甲基化gydF4y2BaOgydF4y2Ba-甲基转移酶(OMT)使用gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba-adenosyl -gydF4y2BalgydF4y2Ba-蛋氨酸(SAM)作为甲基供体。gydF4y2Ba

根据植物omt的结构和酶的性质，它们一般分为I类或II类[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]．I类omt，包括众所周知的咖啡酰辅酶a 3-OMT (CCoAOMT)，其特点是低亚基分子质量(从23到27 kDa)，依赖于MggydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}离子，以及催化咖啡酰辅酶a的3-羟基甲基化以产生阿铁酰辅酶a的能力。因此，CCoAOMT参与植物细胞中木质素的生物合成，是产生单木质素醇的关键酶[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]．II类OMTs具有比CCoAOMTs更高的亚基分子质量(从38到43 kDa)，并且不需要MggydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}甲基化离子。植物细胞通过这些omt的反应积累了许多类黄酮。Ibrahim等人报道了gydF4y2Ba柑橘缓和的gydF4y2Ba表现出逐步gydF4y2BaOgydF4y2Ba多种类黄酮的甲基化活性，表明不同类型的omt参与了一些组织(果皮、根和愈伤组织)中PMFs的生物合成[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]．最近，有报道称，有58个OMT基因gydF4y2Bac . sinensisgydF4y2Ba(甜橙)基因组，这些基因在不同的组织和发育阶段表现出不同的表达模式[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]．这些发现强烈表明，柑橘PMFs的结构多样性是由不同类型的底物和区域特异性甲基转移酶的组合引起的。gydF4y2Ba

本文报道了五种黄酮类化合物的分离和鉴定gydF4y2BaOgydF4y2Ba甲基转移酶(FOMT)基因(gydF4y2BaCdFOMT1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)gydF4y2Bac . depressagydF4y2Ba。CdFOMT5成功表达于gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba作为一种功能酶，对其性质进行了详细的表征。CdFOMT5对植物中普遍存在的类黄酮槲皮素具有甲基转移酶活性，对黄酮的3-、5-、6-和7-羟基具有广泛的底物特异性和区域选择性。利用槲皮素在cdfomt5表达细胞中的生物转化gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba生物催化剂，我们成功地得到了3,3 '，5,7-四gydF4y2BaOgydF4y2Ba-甲基化槲皮素作为最终产物，表明该酶参与了槲皮素的生物合成。gydF4y2Ba

克隆gydF4y2BaCdFOMTgydF4y2Ba基因gydF4y2Bac . depressagydF4y2Ba

从…中分离fmt编码基因gydF4y2Bac . depressagydF4y2Ba，我们使用从高等植物fft的保守氨基酸序列设计的引物进行简并PCR。以基因组DNA为模板，我们得到了5个片段，它们的氨基酸序列与几种高等植物fmt相似。以获得全长gydF4y2BaFOMTgydF4y2Ba基因gydF4y2Bac . depressagydF4y2Ba，通过热不对称交叉PCR (TAIL-PCR)获得了5个fmt编码基因;gydF4y2BaCdFOMT1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba， 5和6。所有引物用于克隆gydF4y2BaCdFOMTgydF4y2Ba基因在附加文件中列出gydF4y2Ba1gydF4y2Ba表S1。然后，我们扩增了这些基因的全长cDNAgydF4y2BaCdFOMTgydF4y2Ba利用从推导出的n端和c端序列设计的特定引物进行基因分析。因此，我们分离了5个gydF4y2BaFOMTgydF4y2Ba编码同源蛋白CdFOMT1、3、4、5和6的基因。CdFOMT3、5、6氨基酸序列与其他CdFOMTs的同源性较低(28.9 ~ 39.9%)，但CdFOMT1、4氨基酸序列与其他CdFOMTs的同源性较高(67.8% ~ 82.3%)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

基因组序列和cDNA序列的比较表明，这些gydF4y2BaFOMTgydF4y2Ba基因包含一个或三个内含子(附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S1)。所有gydF4y2BaCdFOMTgydF4y2Ba基因在其编码序列的相同位置含有内含子[附加文件]gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S1，用星号标记;AIXXK-(内含子)-(S/W)(I/V)LHDW]，尽管这些gydF4y2BaCdFOMTgydF4y2Ba基因在整个核苷酸序列上的相似性很低，蛋白质的大小也有很大的不同。Schroder等。[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba发现gydF4y2BaCOMT的gydF4y2Ba基因gydF4y2BaCatharanthus roseus也叫gydF4y2Ba共享内含子插入位置。同样，在这个位点上的氨基酸序列gydF4y2BaCdFOMTgydF4y2Ba基因在许多植物omt中高度保守。gydF4y2BaCdFOMT3gydF4y2Ba和gydF4y2BaCdFOMT5gydF4y2Ba每个内含子都包含三个内含子，它们在氨基酸序列[QDKXXLXS-(内含子1)- wsxlk ~ PHVIXHXPXXP-(内含子2)- xxxhvggdm ~ DAIXXK-(内含子3)-(W/S)(I/V)XLHDW]中也有相同的位置，尽管它们作为蛋白质的大小和序列也有很大差异。这个结果表明这些gydF4y2BaCdFOMTgydF4y2Ba基因具有相同的起源，并在共同的进化史中获得内含子。gydF4y2Ba

新近被隔离的五个人gydF4y2BaCdFOMTgydF4y2Ba基因gydF4y2Bac . depressagydF4y2Ba编码335 ~ 362个氨基酸残基，与已知高等植物OMTs共享60 ~ 97%的氨基酸序列(表1)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。数字gydF4y2Ba1gydF4y2Ba显示了推导出的cdfmt氨基酸序列与高等植物fmt序列的一致性。gydF4y2BaCdFOMTsgydF4y2Ba显示了几个保守序列(图中A、B、C、J、K和L基序)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，它们可能与辅助因子SAM相互作用[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba]．这些保守区域的存在表明，这5个OMT基因来自gydF4y2Bac . depressagydF4y2Ba潜在的sam依赖的fmt代码。gydF4y2Ba

五种植物的系统发育分析gydF4y2BaCdFOMTsgydF4y2Ba有25个来自高等植物的推定和定义的植物II类omt(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)表明它们是植物II类omt(不依赖二价阳离子)。II类omt通常与类黄酮和异类黄酮具有活性[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]，而I类OMTs则催化木质素合成过程中酚类化合物的甲基化[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]．这些结果表明，分离gydF4y2BaCdFOMTsgydF4y2Ba可能参与了pmf的生物合成，如在gydF4y2Bac . depressagydF4y2Ba。gydF4y2Ba

重组蛋白的表达gydF4y2BaCdFOMTsgydF4y2Ba基因在gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba

为了获得重组酶，每个gydF4y2BaCdFOMTgydF4y2Ba基因被克隆到pET21b载体中gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba用构建的质粒转染BL21(DE3)细胞。除CdFOMT5外，其余四种CdFOMTs在几种培养条件下形成包涵体，未检测到这些蛋白的活性。Schroder等。[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba报道了三个OMT基因gydF4y2BaCatharanthus roseus也叫gydF4y2Ba（gydF4y2BaCrOMT5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)进行表达测试gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba、重组gydF4y2BaCrOMT6gydF4y2Ba和gydF4y2BaCrOMT7gydF4y2Ba形成可溶性蛋白质gydF4y2BaCrOMT5gydF4y2Ba形成一种不溶性的蛋白质。一般来说，功能性植物酶在gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba是不可预测的，必须确定经验与许多因素，如氨基酸组成，蛋白质折叠，和翻译后修饰影响结果。因此，新分离的甲基转移酶基因除gydF4y2BaCdFOMT5gydF4y2Ba可能有助于PMF的生物合成gydF4y2Bac . depressagydF4y2Ba，但其生化功能的细节尚不清楚。我们成功地表达了重组CdFOMT5gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba并确认其OMT活动。重组CdFOMT5是一种c端带有6×组氨酸标签的融合蛋白，通过Ni-Sepharose树脂柱层析纯化。重组CdFOMT5纯化至均匀性，通过SDS-PAGE分析获得一个42.0 kda的蛋白条带(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

CdFOMT5的理化性质gydF4y2Ba

利用高效液相色谱法估计重组CdFOMT5的分子量为88.0 kDa。含6×组氨酸标签的重组CdFOMT5的理论分子质量为42.03 kDa，与SDS-PAGE推测的42.0 kDa的实际分子质量一致。众所周知，典型的植物fmt亚基是同型二聚体[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]．这些发现表明重组CdFOMT5是一种同源二聚体蛋白gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba细胞。gydF4y2Ba

的gydF4y2BaπgydF4y2Ba根据该酶的氨基酸序列，理论上计算出无6×组氨酸标签的酶的值为5.79。gydF4y2Ba

以槲皮素为底物，测定了pH和温度对OMT活性的影响gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S2A)。重组CdFOMT5在pH 7.0(磷酸钾缓冲液)时活性最佳，在pH 5.5(柠檬酸钠缓冲液)或pH 9.0 (Tris-HCl缓冲液)时活性下降50%以上;额外的文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S2A)。CdFOMT5的最适温度为45°C，在55°C时，该酶的最大活性超过80%(附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S2B)。gydF4y2Ba

CdFOMT5对槲皮素的区域选择性gydF4y2Ba

当gydF4y2BaOgydF4y2Ba-甲基转移酶活性以槲皮素为底物测定，几个峰对应于gydF4y2BaOgydF4y2Ba高效液相色谱法检测-甲基化产物(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。P1的滞留时间与3-一致gydF4y2BaOgydF4y2Ba-甲基槲皮素，P2与杜鹃花素(5-)一致gydF4y2BaOgydF4y2Ba-甲基槲皮素)或鼠李素(7-gydF4y2BaOgydF4y2Ba-methylquercetin)。然而，P3和P4的保留时间与槲皮素单甲基化衍生物不同。为了研究这些化合物的分子质量，我们进行了LC-MS分析，观察到P3和P4的分子离子峰分别增加了28-和42-Da(附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S3)。这表明CdFOMT5可以催化gydF4y2BaOgydF4y2Ba槲皮素至少三个羟基甲基化，二羟基或三羟基甲基化gydF4y2BaOgydF4y2Ba通过这种酶促反应得到-甲基化槲皮素产物。gydF4y2Ba

为了确认CdFOMT5的区域选择性，用单羟基黄酮作为底物测定了酶促反应。如图所示。gydF4y2Ba5gydF4y2BaCdFOMT5对黄酮的3-、5-、6-和7-羟基具有甲基化活性。在标准条件(100 μM底物)下，3-羟黄酮(黄酮醇)的相对活性最高，7-羟黄酮的相对活性次之，为3-羟黄酮的15.6%，5-羟黄酮的相对活性为13.5%。6-羟黄酮的活性非常弱(与3-羟黄酮的活性相比为2%)，3 ' -或4 ' -羟黄酮和7-甲氧基-8-羟黄酮的活性未被检测到(数据未显示)。这似乎是首次报道一种OMT具有催化细胞凋亡的能力gydF4y2BaOgydF4y2Ba类黄酮A环和C环上四个羟基位置的甲基化。然而，也有一些报道称，omt对黄酮类化合物的顺序甲基化[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]．特别是，来自小麦的TaOMT2在其b环3 ' -，5 ' -和4 ' -羟基上表现出明确的顺序甲基化。然而，在CdFOMT5反应中，不仅仅是3-gydF4y2BaOgydF4y2Ba-甲基化槲皮素和杜鹃花素(5-gydF4y2BaOgydF4y2Ba-甲基化槲皮素)/鼠李素(7-gydF4y2BaOgydF4y2BaCdFOMT5对槲皮素的3-、5-和7-羟基的甲基化顺序不一致。gydF4y2Ba

诺比列素是一种主要的PMFgydF4y2Bac . depressagydF4y2Ba果皮及其3 '、4 '、5-、6-、7-和8-羟基都被甲基化了。因此，CdFOMT5被假设在PMF的生物合成中发挥重要作用gydF4y2Bac . depressagydF4y2Ba。有许多报道称，几种omt的组合催化了这一过程gydF4y2BaOgydF4y2Ba-类黄酮甲基化生成PMFs [gydF4y2Ba35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]．此外，Joe等人。[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba]报道突变体OMT (POMT7- m1)对类黄酮的3-羟基和7-羟基具有甲基化活性，而原生POMT7只能甲基化7-羟基[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba]．他们还发现，在257个氨基酸位置用Gly取代Asp显著影响了POMT7的区域选择性。虽然CdFOMT5含有与天然POMT7的Asp257对应的Asp260，但CdFOMT5比突变的POMT7能更广泛地催化黄酮类化合物的甲基化反应。一些II类氨基酸残基的变化gydF4y2BaOgydF4y2Ba-甲基转移酶对底物特异性、动力学性质和区域选择性也有实质性影响[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]．这些发现表明CdFOMT5催化中心的大小或形状在决定CdFOMT5的广泛区域选择性方面起着重要作用。gydF4y2Ba

CdFOMT5的底物光谱gydF4y2Ba

为了研究CdFOMT5的底物特异性，gydF4y2BaOgydF4y2Ba测定柚皮素、表儿茶素、马酚和花青素的甲基转移酶活性(附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S4)。重组CdFOMT5对除花青素外的每一种底物都表现出OMT活性，尽管尚未对产物进行详细的结构测定。然而，尽管CdFMOT5对槲皮素和单羟基黄酮具有广泛的区域选择性，但我们无法检测到柚皮素、(-)-表儿茶素和马雌酚的多甲基化产物。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。结果表明，CdFMOT5对黄酮醇(3-羟基黄酮)的偏好高于其他类黄酮结构。因此，衬底结构，尤其是gydF4y2BaCgydF4y2BaCdFOMT5在黄酮类化合物中的-环可能强烈影响底物偏好，包括区域选择性。gydF4y2Ba

重组多甲基化槲皮素的生物生产gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba表达CdFOMT5的细胞gydF4y2Ba

检查PMF的生产由一个gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba生物催化剂表达CdFOMT5，以槲皮素为底物进行生物转化。在…面前gydF4y2BalgydF4y2Ba用-蛋氨酸和葡萄糖在反应混合物中再生SAM，观察到许多与多甲基化槲皮素相对应的峰。这与单羟黄酮酶促反应的结果一致。相比之下，在没有蛋氨酸和葡萄糖的情况下，获得的产品数量可以忽略不计(数据未显示)。这一结果清楚地表明整个重组gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba细胞有效地再生SAM使用gydF4y2BalgydF4y2Ba-蛋氨酸和葡萄糖，甲基化反应成功进行。在酶促反应中没有预料到的额外峰被检测到(图6和7中的峰)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)。LC-MS分析表明，这些额外的产物对应于三甲基化和四甲基化的槲皮素(峰6和峰7分别在图中)。gydF4y2Ba6 bgydF4y2Ba)。数字gydF4y2Ba5gydF4y2BaCdFOMT5可以催化单羟基黄酮的3-、5-和7-羟基甲基化，但不能催化3 '或4 ' -单羟基黄酮(数据未显示)。此外，异鼠李素(3′-gydF4y2BaOgydF4y2Ba-甲基化槲皮素)的产物gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba作为对照，缺乏CdFOMT5的宿主细胞用于生物转化(图中峰2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)。因此，我们推测出一个意想不到的3 ' -gydF4y2BaOgydF4y2Ba-甲基化反应发生于gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba宿主细胞。因此，假设峰7对应的产物为3,3 '，5,7-四甲基化槲皮素。为了验证这一点，对峰7的产物进行了纯化和H分析gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba核磁共振。如图所示。gydF4y2Ba6摄氏度gydF4y2Ba在3.8 ~ 4.0 ppm的浓度范围内，检测到4个甲氧基对应的单线态峰。这有力地表明峰7对应的产物是3,3 '，5,7-四甲基化槲皮素(图2)。gydF4y2Ba6 dgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

在本研究中，我们成功获得了5个fmt基因gydF4y2Bac . depressagydF4y2Ba并表达了gydF4y2BaCdFOMT5gydF4y2Ba基因gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba细胞。重组CdFOMT5表现出sam依赖性gydF4y2BaOgydF4y2Ba槲皮素-甲基转移酶活性，其最适pH和温度分别为7.0℃和45℃。CdFOMT5不仅具有广泛的底物特异性，而且具有区域选择性，并能催化黄酮的3-、5-、6-和7-羟基的甲基化。此外，槲皮素被转化为3,3 '，5,7-四甲基化的槲皮素，作为顺序甲基化产物gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba全细胞反应系统。因此，CdFOMT5是一个有用的工具gydF4y2BaOgydF4y2Ba甲基转移酶对黄酮类化合物具有广泛的区域选择性，可能在黄酮类化合物的合成中起作用gydF4y2Bac . depressagydF4y2Ba。通过代谢工程和使用工程化CdFOMT5进一步改善宿主细胞，将使该生物工艺适用于生产各种PMFs。gydF4y2Ba

菌株和载体gydF4y2Ba

的果实gydF4y2Bac . depressagydF4y2Ba从日本冲绳的一家农业合作社购买了早田，以获得基因组DNA和总RNA。gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba利用JM109细胞和克隆载体pGEM-T Easy (Promega, Madison, WI, USA)和pUC118克隆JM109细胞gydF4y2BaCdFOMTgydF4y2Ba编码基因。表达载体pET21b(+)和gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba利用BL21(DE3)细胞表达重组cdfmt基因。gydF4y2Ba

基因组DNA和总RNA的制备gydF4y2Ba

使用标准技术进行DNA操作[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]．从果皮中提取基因组DNA和总RNAgydF4y2Bac . depressagydF4y2Ba水果。果皮是用研钵和杵在液氮中研磨的。采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)萃取法提取基因组DNA [gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]．总RNA采用TRI试剂(Cosmo Bio Co. Ltd, Tokyo, Japan)，按照制造商的方案制备。采用PrimeScript高保真RT-PCR试剂盒(TaKaRa, Shiga, Japan)和寡核苷酸dT引物合成第一链cDNA，作为PCR模板分离cdfmt编码基因。gydF4y2Ba

cdfft编码基因的克隆gydF4y2Ba

为了获得cdfmt编码基因的部分片段，以基因组DNA为模板进行PCR。用于放大的简并引物gydF4y2BaCdFOMTgydF4y2Ba从咖啡酸/类黄酮的氨基酸序列设计片段gydF4y2BaOgydF4y2Ba-甲基转移酶在高等植物中保守。为了获得全长cdfmt编码基因，TAIL-PCR [gydF4y2Ba43gydF4y2Ba]是根据推导出的部分核苷酸序列进行的。的cDNA片段的全长gydF4y2BaCdFOMTgydF4y2Ba以cDNA第一链为模板进行PCR扩增。扩增片段被克隆到pGEM-T Easy载体中。用于克隆cdfft编码基因的所有寡核苷酸引物均显示在附加文件中gydF4y2Ba1gydF4y2Ba表S1，所有核苷酸序列采用毛细管DNA测序仪3130 (Applied Biosystems, Tokyo, Japan)测定，对两条链进行Sanger DNA测序。gydF4y2Ba

核苷酸序列加入编号gydF4y2Ba

分离的核苷酸序列gydF4y2BaCdFOMTgydF4y2Ba已提交给日本DNA数据库(DDBJ)，加入号如下:gydF4y2BaCdFOMT1gydF4y2BaLC126056;gydF4y2BaCdFOMT3gydF4y2BaLC126057;gydF4y2BaCdFOMT4gydF4y2BaLC126058;gydF4y2BaCdFOMT5gydF4y2BaLC126059;和gydF4y2BaCdFOMT6gydF4y2Ba, LC126060。gydF4y2Ba

重组CdFOMT5的表达和纯化gydF4y2Ba

克隆的cdfmt编码基因cDNA片段通过gydF4y2BaBamgydF4y2Ba你好,gydF4y2Ba萨尔gydF4y2Ba通过琼脂糖凝胶电泳纯化。将纯化的DNA片段克隆到表达载体pET21b(+)中，用相同的限制性内切酶酶切。将得到的质粒分别命名为pET-CdFOMT1至pET-CdFOMT6，并分别导入gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaBL21 (DE3)细胞。gydF4y2Ba

变形者藏着gydF4y2BaCdFOMT5gydF4y2Ba在含有50 μg/mL氨苄西林的LB培养基上培养至ODgydF4y2Ba_660gydF4y2Ba0.5在30°C摇晃。异丙基-β-gydF4y2BadgydF4y2Ba加入终浓度为0.1 mM的-thiogalactopyranoside (IPTG)，在18℃下再孵育24 h，诱导重组CdFOMT5的表达。诱导后，在33,800 ×下离心收集细胞gydF4y2BaggydF4y2Ba用50mm磷酸钾缓冲液(KPB)洗涤5min;pH值7.0)。离心后将细胞重悬于细胞裂解缓冲液(50 mM KPB, 200 mM NaCl, 10%甘油，10 mM咪唑，pH 7.2)中。使用Insonator 201 M (Kubota, Tokyo, Japan)在4°C下超声破坏细胞30分钟，细胞碎片在33,800 ×下离心两次gydF4y2BaggydF4y2Ba静置20分钟以获得清晰的裂解液。回收的上清液应用于Ni-Sepharose色谱柱(GE Healthcare, Tokyo, Japan;10 mL床体积)并用50 mL相同的缓冲液洗涤。用含有250 mM咪唑的相同缓冲液洗脱与6×组氨酸标签融合的重组蛋白。收集的重组CdFOMT5蛋白通过脱盐柱(eco - pac PD-10;Bio-Rad实验室。，Tokyo, Japan) using 50 mM KPB containing 10 % glycerol. The concentration of the purified recombinant CdFOMT5 was determined using the Bio-Rad Protein Assay kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA), and recombinant protein was used for further experiments.

重组CdFOMT5分子质量的测定gydF4y2Ba

为了研究天然重组CdFOMT5的分子质量，使用岛津LC-10高效液相色谱系统(日本京都岛津)，配备Superdex 200 10/300 GL色谱柱(GE Healthcare, Port Washington, NY, USA)进行HPLC分析。首先，取100 μL纯化的重组CdFOMT5溶液，用流动相[100 mM KPB，含200 mM NaCl (pH 7.0)， 0.4 mL/min]分离。然后在280 nm处监测蛋白质吸光度，并根据真实分子量标记的保留时间估计分子质量(Oriental Yeast Co.， Ltd, Tokyo, Japan)。gydF4y2Ba

酶测定gydF4y2Ba

测定黄酮类化合物含量gydF4y2BaOgydF4y2Ba重组CdFOMT5的甲基转移酶活性，在SAM作为甲基供体存在下，测试了纯化酶与槲皮素、几种羟黄酮和一些黄酮类化合物的反应。反应混合物由50 mM KPB (pH 7.0)、500 μM SAM、100 μM底物(二甲基甲酰胺中10 mM)和50 μL纯化的CdFOMT5组成，总积为500 μL。反应混合物在30℃下振荡1 h(转速1000 rpm)，加入500 μL甲醇停止反应。强力混合后，离心回收上清液，用HPLC或lc -质谱(MS)分析。所有酶分析均为三份。gydF4y2Ba

静息细胞反应中多甲基化槲皮素的生物生产gydF4y2Ba

的gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba按照上述方法制备表达重组CdFOMT5的转化细胞。从100-mL培养物中收集的细胞洗涤，并在添加1%葡萄糖和10 mM的M9盐培养基中重悬gydF4y2BalgydF4y2Ba细胞终浓度为1%的蛋氨酸(gydF4y2BawgydF4y2Ba/gydF4y2BavgydF4y2Ba)，总体积为0.5 mL。然后，在反应混合物中加入100 μM槲皮素作为底物，在30℃下振荡反应适当时间。反应产物用等体积的乙酸乙酯提取两次，在无水硫酸钠上干燥，然后真空蒸发有机溶剂。所得产物用甲醇溶解，用HPLC或LC-MS进行分析。gydF4y2Ba

高效液相色谱分析gydF4y2Ba

反应产物HPLC分析采用岛津LC-10高效液相色谱系统，配有Cadenza CD-C18色谱柱(4.6 mm × 75 mm;Imtakt Corp.，京都，日本)。槲皮素、羟黄酮、柚皮素、马酚的分析条件为:A, 0.05% (gydF4y2BavgydF4y2Ba/gydF4y2BavgydF4y2Ba)甲酸;乙腈洗脱液B;流量:0.5 mL/min;柱温，40℃;进样量，5 μL;以及0至10分钟(15%)、10至25分钟(10至55%)、25至40分钟(55至75%)、40至45分钟(75至15%)和45至55分钟(15%)的线性梯度程序(%淋洗液B)。在254 nm处监测产物的吸光度。各化合物的保留时间如下:槲皮素的保留时间为24.8 min;25.8分钟为3-gydF4y2BaOgydF4y2Ba-methylquercetin;异鼠李素(3′-)27.7 mingydF4y2BaOgydF4y2Ba-methylquercetin);他玛西汀(4′-)27.8 mingydF4y2BaOgydF4y2Ba-methylquercetin);鼠李素29.7分钟(7-gydF4y2BaOgydF4y2Ba-methylquercetin) / azaleatin (5 -gydF4y2BaOgydF4y2Ba-methylquercetin);3-羟黄酮35.2 min;3-甲氧基黄酮为34.9 min;5-羟黄酮为37.7 min;5-甲氧基黄酮30.7 min;6-羟黄酮29.3 min;6-甲氧基黄酮34.3 min;7-羟基黄酮28.2 min;7-甲氧基黄酮33.2 min;柚皮素26.9 min; and 27.1 min for equol. The gradient program (% eluent B) for (-)-epicatechin was as follows: 0 to 5 min (10 %); 5 to 22 min (10 to 25 %); 22 to 27 min (25 %); 27 to 30 min (25 to 10 %); and 30 to 35 min (10 %). The retention time of (-)-epicatechin was 12.5 min. The gradient program (% eluent B) for cyanidin was as follows: 0 to 30 min (5 to 100 %); 30 to 35 min (100 %); 35 to 40 min (100 to 5 %); and 40 to 45 min (5 %). The retention time of cyanidin was 8.6 min. Eluents for analysis of (-)-epicatechin and cyanidin were the same as that used for quercetin.

质谱分析gydF4y2Ba

反应产物的LC-MS分析使用Agilent 1200高效液相色谱系统(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)连接布鲁克microTOF质谱仪(布鲁克公司，Billerica, MA, USA)，配备电喷雾电离(ESI)源。样品(5 μL)用甲醇溶解，进样于Cadenza CD-C18色谱柱。在HPLC分析中描述的相同条件下对产物进行分离和洗脱，在50 ~ 500 m/z范围内获得正离子质谱。gydF4y2Ba

多甲基化槲皮素的核磁共振分析gydF4y2Ba

^1gydF4y2Ba四氢核磁共振谱gydF4y2BaOgydF4y2Ba用AV400光谱仪(Bruker, rheinsteten, Germany)在DMSO-中记录-甲基化槲皮素gydF4y2BadgydF4y2Ba_6gydF4y2Ba(D, 0.05% TMS, 99.9%)。所有信号以ppm表示，以TMS为参考。的gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH-NMR (400 MHz, DMSO-)gydF4y2BadgydF4y2Ba_6gydF4y2Ba3,3 '，5,7-四元-的光谱gydF4y2BaOgydF4y2Ba-甲基化槲皮素:δ 3.83 (s);gydF4y2Ba^3.gydF4y2BaH)， 3.90 (s)，gydF4y2Ba^3.gydF4y2BaH)， 3.92 (s)，gydF4y2Ba^3.gydF4y2BaH)， 3.93 (s);gydF4y2Ba^3.gydF4y2BaH)， 6.36 (d);gydF4y2BaJgydF4y2Ba= 2.4 Hz，gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH)， 6.66 (d);gydF4y2BaJgydF4y2Ba= 2.0 Hz，gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH)， 7.13 (d);gydF4y2BaJgydF4y2Ba= 8.8 Hz，gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH)， 7.74 (d);gydF4y2BaJgydF4y2Ba= 2.0 Hz，gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH)， 7.79 (dd，gydF4y2BaJgydF4y2Ba= 2.2, 8.6 Hz，gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH)。gydF4y2Ba

化学物质gydF4y2Ba

SAM和3-gydF4y2BaOgydF4y2Ba-甲基化槲皮素购自Sigma (St. Louis, MO, USA)。所有其他化学品均购自Wako Pure chemicals Industries (Osaka, Japan)。gydF4y2Ba

FOMT:gydF4y2Ba

类黄酮gydF4y2BaOgydF4y2Ba甲基转移酶gydF4y2Ba

OMT:gydF4y2Ba

OgydF4y2Ba甲基转移酶gydF4y2Ba

及:gydF4y2Ba

Polymethoxy类黄酮gydF4y2Ba

长官:gydF4y2Ba

年代gydF4y2Ba-adenosyl -gydF4y2BalgydF4y2Ba同型半胱氨酸gydF4y2Ba

山姆:gydF4y2Ba

年代gydF4y2Ba-adenosyl -gydF4y2BalgydF4y2Ba蛋氨酸gydF4y2Ba

数据和材料的可用性gydF4y2Ba

支持本文中提供的结果的数据作为附加文件包含。的gydF4y2BaCdFOMTgydF4y2Ba基因序列沉积在DDBJ (gydF4y2Bahttp://www.ddbj.nig.ac.jp/gydF4y2Ba)，编号如下:gydF4y2BaCdFOMT1gydF4y2BaLC126056;gydF4y2BaCdFOMT3gydF4y2BaLC126057;gydF4y2BaCdFOMT4gydF4y2BaLC126058;gydF4y2BaCdFOMT5gydF4y2BaLC126059;和gydF4y2BaCdFOMT6gydF4y2Ba, LC126060。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

NI构思并监督了这个项目，并撰写了手稿。HT进行了所有的实验并撰写了手稿。CI与HT合作进行了重组酶的表征和生物转化。所有作者都阅读并认可了稿件的最终版本。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者宣称他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

发表同意书gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

批准。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 富山县立大学生物技术研究中心和生物技术系，日本富山县Imizu Kurokawa 5180, 939-0398gydF4y2Ba

   伊藤伸弥，岩田聪和户田宏gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba伊藤NobuyagydF4y2Ba。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba)，它允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是您要适当地注明原作者和来源，提供到知识共享许可协议的链接，并注明是否进行了修改。创作共用公共领域免责声明(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本文中提供的数据，除非另有说明。gydF4y2Ba

转载及权限gydF4y2Ba