植物花粉高含量筛选鉴定出新型植物生长发育小分子调节剂

背景

小合成分子为农业生物技术提供了有价值的工具，以规避基因工程的需要，并在调节植物生长和发育方面提供了独特的好处。

结果

通过对花粉细胞单倍体群体的高通量表型筛选，建立了一种探讨植物生长分子机制的方法。这些细胞迅速萌发形成花粉管。在不超过8小时的高光屏幕中识别出了作为花粉管生长抑制剂或刺激剂的化合物，这一分析方法具有广泛的适用性，可优先考虑未来植物机理研究中的化学物质。我们鉴定了65种影响花粉发育的化合物。我们证明了鉴定出的化合物作为烟草和拟南芥种子生长的启动子或抑制剂的有效性。当在这些化学物质存在的情况下生长7天的幼苗时，与在没有化学物质的情况下生长的对照相比，22种这些化合物导致拟南芥的根长度减少了4.76 - 49.20%。其中与噻唑烷类化合物具有结构同源性的两种化合物分别促进了根的生长，使根长增加了129.23和119.09%。花粉管促生长化合物(S-02)属于苯甲氮平型化合物，可使拟南芥根长增加126.24%。

结论

在本研究中，我们证明了基于植物花粉管的分析方法在筛选新的生物活性化合物小化合物库方面的有效性。花粉管是一种超快速的筛选工具，即使是大型化合物库也可以在很短的时间间隔内进行分析。广泛适用的高通量协议适用于发芽花粉的自动表型筛选，从而结合种子萌发分析鉴定植物生长抑制剂和刺激因子。

通过表型筛选化学文库鉴定新的生理活性化合物及其在功能研究中的应用与植物生物学越来越相关[1- - - - - -3.］．在大多数研究中，要么用植物细胞培养，要么用整个幼苗进行基于表型的化学筛选[4旨在识别以细胞壁生物合成等过程为目标的小分子[5]，细胞骨架功能[6]，激素生物合成[7和信号[5，8),向地性9]、发病机制、嘌呤生物合成及内膜转运[10- - - - - -13］．在某些情况下，相关的基因靶标已被确定[14- - - - - -20.］_．尽管取得了这些成就，但植物化学生物学的进一步发展在很大程度上取决于基于图像的筛选管道的改进和应用，以提高快速生长的植物系统的时空表型分辨率，并能够快速、敏感地筛选大型小分子文库[14，21，22］．出版的筛选通常很慢，使用从种子中发芽的幼苗，并在含有感兴趣的化学物质的培养基中生长[14］．

花粉粒有几个独特的特征，这使它们非常适合高通量的化学生物筛选[21，23］．首先，仅从少数开花植物中就可以很容易地获得充足而均匀的花粉。其次，花粉萌发和花粉管生长是一个非常快速的过程，可以以小时为时间尺度进行有效的测量。第三，可以在非无菌条件下在实验室台上进行完整的筛选程序。最后，也是最重要的是，研究中的植物几乎70%的基因在花粉发育过程中被转录[24］．因此，我们假设，任何抑制或刺激花粉萌发和花粉管生长的化合物，也可能影响植物的其他过程，如种子萌发、根或芽的生长或分化。

我们的高通量表型筛选集成了各种植物中已发表的小分子筛选的操作细节，以及在着手进行这种化学筛选时的关键考虑因素。该策略的概述如图所示。1．在烟草中，花芽大小是花粉发育阶段的一个很好的指示器[25］．为了验证该相关性的适用性，我们对取自不同大小花蕾的4 '，6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)染色花粉进行了分析。结果表明，新鲜开放的花朵大小约为40 - 45mm，含有完全成熟的花粉粒，是筛选实验的最佳选择(图4)。2)．为了提高筛选的效率，确定烟草花粉发育的正确阶段至关重要，花粉粒采集的方法是将新鲜开放的花轻轻搅拌到埃宾多夫管中。然后，花粉粒在液体萌发培养基(GVH14)中重新悬浮，室温孵育。30 min后花粉萌发，不到120 min即可分析花粉管的生长情况。接下来，对花粉培养条件进行优化。基于图像的花粉表型评价发现，花粉粒的密度和均匀分布是获得重现性结果的最重要因素。最重要的是，为了获得良好的图像，花粉粒和它们生长的花粉管必须很好地分离，几乎不重叠和干扰。我们测试了从每毫升100粒到每毫升10,000粒花粉的不同密度的培养基，发现每毫升4.000粒花粉是获得对单个花粉管的良好鉴别的最佳培养基，花粉管长度的估计有意义，并具有良好的统计值(在CV和Z’因子方面)。

筛选实验时，花粉悬浮在GVH14培养基中，转入384个多孔板中，每孔加入化合物。以烟草花粉萌发和试管生长为表型特征，在室温下与测试化合物共孵育120分钟后开始采集，8小时后完成一次筛选板采集。对于图像分析，我们开发了一种算法，测量多孔板每个孔中所有可视化花粉颗粒所占的总面积(图2)。3.)．所有可见的花粉颗粒所占的总面积的量化与所测化合物的抑制效应(总面积减少)或刺激效应(总面积增加)密切相关。

该方法的稳健性和重复性是通过统计分析获得的数值数据来估计的，这些数据是在一系列至少四次相同的实验后收集的。以不添加化合物的0.1%二甲亚砜(DMSO) GVH14培养基为零对照，以含0.1% DMSO和1 μM水杨酸的GVH14培养基为阴性对照，水杨酸是一种已建立的抑制花粉萌发和试管生长的抑制剂。为了评价分析的性能，不同的统计参数被用于质量和重现性评估。我们确定了板内和板间的变异性，评估了在重复中建立的控制板的最大和最小信号数据。我们还应用了Z’因子分析，在4个独立实验中，Z因子的平均范围为0.45，根据每次试验选择的不同花粉群体，每个实验之间的变异性为+/−5%。经统计分析证实，高通量筛选(HTS)数据具有良好的动态范围和高重现性，标准差(SD)为0.45±0.02761)．

理想情况下，一个化学图书馆应该包含一系列不同的生物活性和结构多样化的化学物质。我们首先建立了一个专注的小型化学库，与吲哚-、腺嘌呤-、β-carboline-和植物甾体类家族中著名的植物生长抑制剂或激活剂共享结构特征[5］．采用拓扑药效团指纹图谱进行化学物质的选择，计算其与参比样品的谷本系数。最终筛选出的化合物与已知的植物生长抑制剂和激活剂拓扑相似率最高。为了评估我们的分析特异性和可能的命中率，我们将聚焦的小型文库随机纳入940个选择的化合物中通过支架跳变与分子量、溶解度和结构元素的相似性。合并化学库包括1040个化合物(附加文件2)．每个化合物的最终浓度为10 uM，由10 mM原液溶于100% DMSO中稀释。初步筛选了1040种化合物，发现了65种潜在的命中点(附加文件3.)，包括花粉管生长的抑制剂和刺激物。

在拟南芥种子萌发的二次筛选中，利用初筛分离得到的化合物进行鉴定，以验证其对植株一般发育的影响。如前所述，拟南芥种子是在特定化合物的存在下发芽的[12］．研究发现，19种化合物能抑制花粉萌发和花粉管生长，同时也能抑制种子萌发和根的生长，而三种化合物能刺激花粉萌发和花粉管生长，对种子萌发和花粉管生长有类似的作用(图3)。4、表1)．这些生长抑制剂属于至少十个不同的化学类别，包括吡唑，吡嗪，硫脲，硫酰胺，恶唑，吲哚，二嗪烷，噻唑烷，胍和苯扎平(附加文件4从化学多样性研究所(CDRI)化合物库的1040种化合物中，经过一、二次筛选，筛选出22种化合物。这些化合物还导致拟南芥的根长度(作为对照%)在4.76% (I-01)到49.20% (I-19)之间的范围内，当这些化学物质存在的7天幼苗生长。与噻唑烷类化合物具有结构同源性的两种化合物(S-01、S-03)对根生长长度的刺激(对照%)分别高达129.23和119.09%。另一种刺激根生长的化合物(S-02)属于苯甲氮平类化合物，与未处理的拟南芥相比，拟南芥的根长增加了126.24%4,无花果。5)．我们假设花粉和种子萌发是非常相似的过程，基于常见的基因和调控途径(表)1)．结果22个化合物对花粉管和根生长均有抑制(I)或刺激(S)作用。虽然种子在琼脂平板上培养3天后即可萌发，但种子萌发和根系生长的最终结果需要至少10-14天的培养才能得到，可见花粉系统作为快速筛选系统的优势，2-3 h即可完成。

我们已经证明，利用从少数开花植物收获的花粉进行的小型化学筛选不仅是最快的高温胁迫处理系统之一，而且几乎可以使用任何植物的花粉。通过将生物多样性与可用的化学空间联系起来，这扩大了筛选空间。筛选的成功取决于花粉粒的质量，在实验条件下易于萌发。

对于不同的植物种类，可能需要一个优化阶段，但应该只需要很短的时间和精力，以获得满意的条件，基于统计分析，并使稳健，敏感，可靠和可复制的筛选。在不同的条件和生物背景下，如从同一植物的种子发芽生根，可以在不到2周的时间内完成再筛选。我们的研究表明，该筛选具有广泛的通用性，其中刺激或抑制花粉管生长的化合物对种子萌发和根生长也有效，从而表明在生长调节途径中有共同的目标。

在本研究中，我们证明了植物花粉管在筛选新的生物活性化合物小化合物库方面的实用性。花粉管是一种超快速的筛选工具，即使是大型化合物库也可以在很短的时间间隔内进行分析。广泛适用的高通量协议适用于发芽花粉的自动表型筛选，从而结合种子萌发分析鉴定植物生长抑制剂和刺激因子。

植物材料

烟草L．简历。SR1种子由奥地利维也纳大学A. Bachmair教授提供。在日光温室中，光照为100-150 μE m，光照时间为16 h-光/8 h-暗，24°C⁻²年代⁻¹相对湿度为60 - 70%，持续6-8周，定期施肥，定期浇水，直到密集开花和花粉扩散。连续开花可以通过定期采收开放的花朵来实现。采用DAPI (Invitrogen, cat。不。D1306染色(DAPI原液:5mg DAPI加1ml 50%乙醇)。采集不同发育阶段的花蕾，从花蕾上分离花药，将花药置于玻璃载玻片上，滴入DAPI工作液(DAPI工作液:在1倍花粉分离缓冲液(PIB缓冲液)中稀释DAPI原液1:2000)。在载玻片上用镊子轻轻挤压花药以释放花粉粒，载玻片上盖有玻璃盖。在室温下孵育5分钟，使用DAPI过滤器组在荧光显微镜下观察。

花粉采集和制备

用轻柔的摇动从开放的花的花药中取出花粉粒，收集到含有GVH14的离心管中(体积为50毫升)。25]培养基(708毫克钙(NO ._3.）₂x 4 h₂O, 100mg KNO_3.， 200mg MgSO₄x 7 h₂氧，14mg H₂薄_3.1 g酪蛋白水解物，10 g蔗糖，0.5 g 2-(N-morpholino)乙基磺酸(MES)溶于1 l蒸馏水中，pH = 5.9，过滤器灭菌)。将花粉悬液稀释至每ml 4000个花粉粒。每次实验至少取30-35朵花。用40 μm的尼龙网过滤花粉悬液，另取一离心管收集干净的花粉悬液。

化学筛选与处理

化学品由化学多样性研究所(CDRI，莫斯科，俄罗斯)慷慨提供。所有化学试剂在添加了14 mg硼酸的100 μM GVH14溶液中溶解，然后用BiomekFXP机器人系统将每孔100 μl的培养基GVH和从10 mM原液(化合物库)中取1 μl的化学化合物加入到96孔板中，使用BiomekFXP的96尖端，从2到11柱的每孔中加入99 μl培养基和1 μl化合物，以达到化合物的最终浓度为100 μM。在某些孔中，从A1 ~ D1和E12 ~ H12孔中分别加入1 μl 1 mM的水杨酸原液(在附加文件中标记为min)5)．将花粉悬浮液装入384孔板，使每ml花粉的最终密度达到4.000个花粉粒。这将产生5个384孔板，用于筛选超过1000种化合物。每孔45 μl花粉悬浮液由机器人系统自动添加。为了进行筛选，从100 μM原液中自动加入20 μl化合物到每孔中，平板在室温下孵育2小时，或在4℃下保存，直到筛选程序开始，但不超过4小时。对于表型筛选平板，打开，每孔用10倍物镜在透射光下拍摄4张图像，ImageXpress Micro XL(宽场高含量筛选系统(Molecular Devices, USA))。一个底片总共拍摄了1536张照片。数据分析采用基于自定义模块编辑器(Molecular Devices, USA)注册单个花粉正方形的算法进行。对图像进行处理，根据图像的强度和物体的大小确定感兴趣的物体(花粉粒)。

分析变异性评估

在384孔板(培养基GVH14, 0.1% DMSO)上将花粉调整到最大信号水平，连续3天重复进行检测。计算每个最大和最小信号控制板的平均值和标准差。将两个384个多井最大信号控制板的数据合并，得到重复数据的平均值和标准差。最后，利用最大板和最小板的组合数据计算z因子。

种子萌发及根生长试验

大约20消毒种子发芽被用于在Murashige和斯库中(MS-medium)(1.7克(MS)宏观盐混合物,1克(MS)微盐混合物,1毫升1000 x (MS)维他命原液和0.5 g的MES水合物和10 g phytagar 1 L去离子水,pH = 5.7,消毒由高压灭菌15分钟在121°C)在培养皿中,进行春化处理2到3天在4°C在黑暗中,然后转移到植物生长室(21 - 25日°C, 16 h光周期)。生长10天后测定主根长度。每组至少测量20株幼苗。用不同量种子进行了至少2次重复试验。

CDRI:

化学多样性研究所

DAPI:

4, 6-diamidino-2-phenylindole

DMSO溶液:

二甲亚砜

高温超导:

高通量筛选

市场经济地位:

(2) - N-morpholino ethanesulfonic酸

MS-medium:

Murashige和skoog中号

加以:

花粉隔离缓冲

SD:

标准偏差

作者感谢M. Kirpichnikov教授的有用建议。

资金

这项工作得到了俄罗斯联邦教育和科学部(协议编号02.A03.21.0003，于2013年8月28日签署)和俄罗斯基础研究基金的资金支持。KP感谢德国联邦政府für Bildung und Forschung (BMBF Microsystems FKZ 0316185)的支持。

支持数据的可用性

所有支持数据都包含在附加文件中。

作者的贡献

AT、AI、KS、KP设计研究;RCN, YN, YM和PV建立了实验方法;RCN、YN、PV进行实验，EM、SL制定实验方法，审稿;KP, RCN, YM和YN写了手稿。所有作者阅读并批准最终稿。

相互竞争的利益

作者声明他们之间没有利益冲突。

同意出版

不适用。

伦理认可和同意参与

不适用。

从属关系

1. 莫斯科物理与技术研究所，多尔戈普rudny, 141700，莫斯科地区，俄罗斯联邦

   罗曼·丘普罗夫-内托钦，埃琳娜·马鲁西奇，波琳娜·伏林丘克，谢尔盖·列昂诺夫，康斯坦丁·斯克里亚宾，安德烈·伊瓦申科和阿利舍尔·图拉耶夫

2. 俄罗斯科学院生物技术研究中心，117312，俄罗斯联邦莫斯科

   Yaroslav Neskorodov, Yana Mishutkina和Konstantin Skryabin

3. 罗蒙诺索夫莫斯科国立大学，119991，莫斯科，俄罗斯联邦

   康斯坦丁·斯克里亚宾和阿利舍尔·图拉耶夫

4. 生物学教师;生物信号研究中心;弗莱堡大学ZBSA生物系统分析中心，Schänzlestr。179104，德国弗莱堡

   克劳斯金棕榈奖

相应的作者

对应到克劳斯金棕榈奖．

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