苹果发育和贮藏过程中细胞壁动力学涉及半纤维素修饰和相关表达基因gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

水果的品质取决于在整个果实发育和成熟过程中一系列改变外观、风味和质地的生化事件。细胞壁多糖的重塑在很大程度上有助于果实肉质结构的细化。虽然已知一些参与细胞壁多糖生物合成和修饰的基因和酶，但它们在这些过程中的协同活性尚未被发现。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

结合转录组学和生化分析，鉴定了在苹果果实生长和成熟过程中参与细胞壁多糖组成和结构变化的可能酶和相关基因家族的注释成员。早期发育基因主要与细胞壁生物合成和降解有关，以半纤维素为特定靶点。半乳糖甘露聚糖精细结构的进化与甘露聚糖合成酶、葡聚糖酶(GH9)和β-半乳糖甘露聚糖酶基因表达密切相关。相比之下，成熟果实中与果胶代谢和细胞膨胀相关的基因(膨胀素基因)较少，细胞壁多糖组成也发生了预期的变化。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

半纤维素经历主要的结构变化，特别是在早期果实发育期间。大量早期表达的β-半乳糖苷酶基因质疑其在果实发育和贮藏过程中对半乳糖基化结构的作用。它们的活性和细胞壁底物仍有待确定。此外，对过氧化物酶和转运体以及细胞壁代谢的潜在作用的新认识，为进一步研究果实发育和储存过程中细胞壁组装/拆卸的伴随机制开辟了道路。gydF4y2Ba

苹果gydF4y2Ba马吕斯有明显gydF4y2Ba)果实的发育涉及一系列的生化事件，这些生化事件决定了诸如外观、味道和质地等品质性状[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]。果实生长涉及细胞分裂和细胞膨胀，这是细胞膨胀压力、细胞壁生物合成和重塑之间动态相互作用的结果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]。苹果成熟过程包括淀粉转化为单糖、果皮颜色变化、乙烯产生、呼吸爆发和果肉软化[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]。组织硬度的降低结合了细胞膨胀压力的降低以及细胞壁多糖的重塑和代谢[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

细胞壁在很大程度上决定了水果的质地特征。在苹果中，像其他肉质水果一样，它们是由果胶、半纤维素和纤维素以及一些结构蛋白组成的。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]。苹果细胞壁多糖的组成和结构随遗传、发育阶段和生长条件的不同而不同[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。在苹果成熟过程中，以果胶产生的半乳糖醛酸为代表的主要细胞壁糖，以及纤维素和半纤维素产生的葡萄糖的相对含量增加[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]。半乳糖和阿拉伯糖含量在果实膨胀过程中下降，在成熟过程中进一步下降[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。这部分是由于β-半乳糖糖苷酶和α-阿拉伯糖核苷酶降解了果胶鼠李糖半乳糖酸I (RGI)的半乳糖侧链和阿拉伯糖侧链[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]。果胶甲基化酯酶(PME)在苹果发育过程中部分去除了果胶(HG)结构域的甲基取代[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

果胶的代谢增加了细胞壁的孔隙度，降低了细胞的粘附性，影响了果实的质地[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]。RGI半乳聚糖和阿拉伯聚糖侧链的损失与软化有关[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]，而高含量的半乳糖侧链与硬度有关[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。高阿拉伯糖铀酸苷酶活性与gydF4y2BaMdAF3gydF4y2Ba基因表达在粉状苹果中有报道[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]。果胶HG结构及其甲基酯化对苹果的质地也有重要影响。下行调控gydF4y2BaMdPG1gydF4y2Ba编码聚半乳糖醛酸酶的基因在成熟过程中保持果实的硬度[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。相比之下，PME的局部作用(MdPME2)与膳食发育有关[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

与果胶不同，苹果的整体半纤维素成分和分子量在果实发育和成熟过程中没有受到显著影响[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]。然而，它们的结构和与纤维素的相互作用可能发生了改变，如参与切割、剪切和粘贴以及破坏木葡聚糖与纤维素之间氢键的内切-1,4-β- d -葡聚糖酶、木葡聚糖内转糖基酶/水解酶(XTH)和扩张蛋白的活性和基因表达水平的变化[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

除了细胞壁化学和大分子相互作用外，苹果纹理的形成还涉及与组织组织有关的其他复杂机制[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]和细胞水分分配[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

因为整个果实的发育都涉及到质地的细化[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，我们研究了果实发育和冷藏过程中细胞壁化学成分和结构与细胞壁相关基因表达的平行进化。转录组学分析主要集中在细胞壁多糖生物合成、重塑和降解蛋白以及结构蛋白的注释基因上。由于膨胀压力与果实发育和质地有关，因此还分析了转运蛋白注释的基因。基因表达结果和生化与转录组学的相关性分析突出了新的候选基因，并为苹果发育和贮藏过程中细胞壁生物合成和代谢可能的协调活动提供了新的见解。gydF4y2Ba

细胞壁特性gydF4y2Ba

作为酒精不溶性物质(AIM)制备的细胞壁的总体糖组成在每个发育和储存阶段进行分析(表2)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。正如预期的那样，苹果果实在发育阶段积累的淀粉在110DAF时达到了AIM干重的47.1%。淀粉含量在收获和冷藏期间下降。AIM糖(non-starch polysaccharides, NSP)中扣除淀粉葡萄糖含量后的细胞壁多糖主要为葡萄糖、糖醛酸(UA)、阿拉伯糖和半乳糖。根据发育和贮藏阶段的不同，这4种主要糖的总含量达到NSP的85 ~ 88%。半乳糖含量从果实发育后期的18.7%下降到7.2%，而糖醛酸含量从果实发育后期的22.4%略有上升到29%。少量的木糖、甘露糖、鼠李糖和焦糖也被检测到。木糖和焦糖含量在成熟期略有增加，甘露糖含量则有所下降。在成熟期，乙酰酯含量也从60DAF时的1.5%下降到2 m时的1.2%，而甲酯含量则无显著变化。gydF4y2Ba

半纤维素精细结构的测定gydF4y2Ba

采用酶切法和MALDI-TOF质谱法对降解产物进行结构分析，跟踪半纤维素精细结构的修饰。苹果半纤维素包括木葡聚糖(XyG)、半乳糖甘露聚糖(GgM)和葡萄糖醛酸阿拉伯木聚糖(GAX) [gydF4y2Ba33gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]，甘露聚糖酶、木聚糖酶和葡聚糖酶依次降解。选择酶处理的顺序以最大限度地释放低聚糖。gydF4y2Ba

为了便于酶处理，首先用水(水溶性部分，WS，表)洗涤AIMgydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，然后由果胶裂解酶和鼠李糖半乳糖醛酸酶(果胶酶可溶性部分，PS)部分脱胶。测定各处理后的尿素酸(UA)和中性糖(NS)含量。在WS馏分中，UA的含量从60DAF时的0.5%持续增加到2m时NSP的1.3%(表1)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。相比之下，NS含量从60DAF时的1.3%下降到冷藏2个月(2 M)后NSP的0.9%。这种下降影响了甘露糖、半乳糖和葡萄糖的含量，但不影响阿拉伯糖的含量，阿拉伯糖是该部分的主要糖(表1)gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。正如预期的那样，随后的果胶酶处理(PS)产生了巨大的效果，根据果实阶段的不同，去除了15.2%至25.3%的NSP(表2)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。从60DAF到2m, NS含量从NSP的20.4%下降到10.9%(表2)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，包括大部分释放的鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖(表1)gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)。60DAF与2m之间的差异主要是由于PS部分中半乳糖含量降低(表2)gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。在60DAF和2m之间，UA含量没有明显变化(表2)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，但大多数UA在此治疗后得到释放(表2)gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

含甘露糖多糖的结构gydF4y2Ba

对剩余提取物进行远藤-β-甘露聚糖酶处理，可以获得富含甘露聚糖的半纤维素。在60DAF和110DAF时，该处理释放了2.8 - 3.3%的NSP，从收获到2 M时，该处理释放的NSP显著减少，仅为1.3%(表1)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。在早期发育阶段没有检测到UA，之后只有痕迹(表1)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。60DAF时，水解产物主要由葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖组成，各占NSP的0.3 ~ 0.4%(表1)gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)，在NSP中分别只占其初始含量的1.2、1.8、6.2和1.3%，因为它们大部分已经在PS馏分中被去除(表2)gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)。甘露聚糖酶组分在2 M时的NSP含量较低，主要是由于半乳糖和葡萄糖含量下降，每种NSP仅剩0.1%。gydF4y2Ba

通过MALDI-TOF质谱分析，对甘露聚糖酶水解产物中发现的半乳糖葡甘露聚糖精细结构进行了定性评估。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。正如预期的那样，质谱显示了一系列或多或少的乙酰酯化己寡糖，聚合度从4到8，属于甘露聚糖/葡甘露聚糖/半乳糖葡甘露聚糖片段。平均光谱中的主要片段属于Hex4a1(4个己糖残基被1个乙酰基取代)，见图中图例。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba对于命名法,gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba731)， Hex4a2 (gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba773)， Hex5a1 (gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba893) Hex5a2 (gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba935)和Hex6a1 (gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba1055)低聚物。一个质量分别对应于己糖和戊糖结构的离子，Hex3a1和Pen4gydF4y2BamzgydF4y2Ba569 (Pen4: 4个戊糖残基)。鉴定出的次要结构有Hex4 (gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba689)， Hex5 (gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba851)， Hex5a2 (gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba935)， Hex7a1 (gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba1217)， Hex7a2 (gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba1259)， Hex8a1 (gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba1379)和Hex8a2 (gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba1421)。光谱还显示了少量戊糖的存在:Pen3U1(3个戊糖残基被1个醛酸取代);gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba613)， Pen3U1a1 (gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba655)、Pen4a1 (gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba611)、Pen4a2 (gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba653)， Pen4U1m1 (gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba759)， Pen4U1m1a1 (gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba801)及Pen5a1 (gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba743)由于木聚糖酶对商用甘露聚糖酶的轻微污染而引起的。主成分分析(PCA)的注释寡糖离子强度提供了一个综合的观点，样品的变化以及贡献这些变化的变量。这一分析揭示了在果实发育过程中，特别是在早期阶段，含甘露糖半纤维素的精细结构发生了明显的变化。gydF4y2Ba1 b, cgydF4y2Ba)。质谱主成分分析表明，乙酰化低聚物Hex7a1和Hex8a1在60DAF时分化了果实。gydF4y2Ba

含木糖多糖的结构gydF4y2Ba

用内切β-木聚糖酶处理内切β-甘露聚糖酶残基，分析含木糖半纤维素。这种处理释放了少量的中性糖，在60DAF时仅为NSP的1%，在冷藏过程中下降到2m时NSP的0.5%(表1)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。该馏分中未检测到酸性糖(表2)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖是60DAF时检测到的主要中性糖，初始NSP为0.1 ~ 0.2%(表2)gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。冷藏2个月后，检测到更多的阿拉伯糖(0.9%NSP)、半乳糖(0.3%NSP)和葡萄糖(0.2%NSP)(表2)gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。它们分别占NSP初始含量的6.2、3.6和0.6%(表1)gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)。2 M样品鼠李糖和木糖含量分别增加了初始NSP的0.1%和0.5%，分别占其初始NSP含量的5.4%和6.0%。与全球比色法测定的NS相矛盾(表1)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，气相色谱法显示，与60DAF相比，2 M后处理释放的中性糖增加(表2)gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。由于水解产物中含木糖的低聚糖含量总体较低(表1)gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)，木聚糖酶水解物未作进一步分析。gydF4y2Ba

含葡萄糖多糖的结构gydF4y2Ba

在木聚糖酶残基上应用Endo-β-葡聚糖酶作为获得木聚糖结构的最后酶处理。在收获阶段，该处理从60DAF时的13.9% NSP溶解到15.7% NSP的最大值，并在2 M时下降到13.9% NSP(表1)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。只有极少量的UA (0.2% NSP)在收获期和之后被释放。正如预期的那样，在60DAF和2m条件下，主要的可溶性糖是葡萄糖，NSP分别为5.1%和5.7%gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)，在60 DAF时占NSP初始含量的16.4%，在2m时占15.8%。在60DAF和2m阶段之间没有显著差异，少量的其他糖也被溶解。大部分释放的焦糖、葡萄糖和木糖都存在于葡聚糖酶的水解产物中(表2)gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

与水解物中葡萄糖的高含量相一致(表1)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)、低聚木葡聚糖(XyGOs)通过MALDI-TOF质谱分析鉴定(图2)。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)。平均光谱显示主要的乙酰酯化XyGOs存在:XXFGa1 (gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba1435)和XLFGa1 (gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba1597)连同其他按质量归属于XXG (gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba791)， XLG (gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba953)、GFG (gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba967)， XFG (gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba1099)， XLXG (gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba1247)， XLXGa1 (gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba1289)， XXFG (gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba1393)， XLGa1 (gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba1451)， XXFGa2 (gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba1477)和XLFGa2 (gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba1639)。少量片段也被检测为己糖或戊寡糖，并归属于Hex4 (gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba689)， Hex4a1 (gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba731)， Hex4a2 (gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba773)， Hex5 (gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba851)， Hex5a1 (gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba893)， Hex5a2 (gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba935)， Hex6a1 (gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba1055)， Hex7a1 (gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba1217)及Hex8a1 (gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba1379)， Pen3U1 (gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba613)， Pen3U1a1 (gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba655)、Pen4a1 (gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba611)， Pen4U1m1 (gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba759)， Pen4U1m1a1 (gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba801)、5a1 (gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba743)及Pen5U1m1a1 (gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba933)。这些片段反映了商业葡聚糖酶对葡甘露聚糖的活性，以及少量污染木聚糖水解活性的存在。在未观察到全局NS组成变化的情况下，低聚糖精细结构在果实发育过程中发生了明显的变化，特别是在发育早期(60DAF和110DAF)和成熟期(H、1 M和2 M)之间。虽然大多数XyGOs低聚物，特别是XXG、GFG、XLXG、XXFGa2、XLFGa2是成熟阶段的代表，但己糖和戊糖区分了果实发育早期的光谱。其中，Hex6a1、Hex5a1、Hex7a1、Hex4a1、Hex4a2、Hex5a2、Pen5U1m1a1、Hex8a1、Hex4、Pen4U1m1a1、Hex5、Pen4U1m1和Pen3U1a1是早期阶段的代表。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

转录组分析gydF4y2Ba

为了鉴定可能参与细胞壁多糖结构修饰的基因，对用于细胞壁生化分析的相同样品进行了转录组分析。用AryANE_v1芯片进行的转录组学分析显示，42%的测试转录本在分析的8种基因型中的至少一种的一个或多个发育阶段表达。随后发育阶段的差异表达转录物被鉴定为显著的gydF4y2BaPgydF4y2Ba-t检验值(gydF4y2BaPgydF4y2Ba值< 0.01;无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。在110DAF和收获、收获和1m贮藏期间，差异表达转录本的数量最多。为了研究苹果发育和果实成熟之间的变化，我们将60DAF时的转录组与2daf时的转录组进行了比较，共鉴定出23001个差异表达转录本。随后的表达谱分层聚类分析表明，考虑到16个时间序列，在两个果园中生长的8个基因型中选择了5150个表达谱相似的转录本(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。利用60DAF和2m苹果果实的cDNA，通过RT-qPCR实验验证了微阵列数据的差异表达基因子集。两种技术的基因表达水平差异相似(Pearson相关= 0.82;gydF4y2BaPgydF4y2Ba-value < 0.01)(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

在AryANE_v1微阵列中，为每个苹果编码DNA序列(CDS)设计了正义(S)和反义(AS)探针，其中26%的差异表达探针对应AS转录本。Celton等。[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba表明这些AS转录本可能参与小干扰RNA (siRNA)依赖性编码mrna的负调控。本研究仅考虑具有差异表达意义转录本的基因。gydF4y2Ba

选择在果实发育早期(60DAF和110DAF: A簇)或果实成熟和冷藏(收获，1 M和2 M: B簇)表达较高的感觉转录本进行进一步分析，分别占所选差异表达转录本的6.2%和10.5%。基于基因注释，将它们划分为功能类。0.5%有与细胞壁生物合成和/或重塑或溶质通量变化相关的注释(附加文件)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)。为了完善选择，从这些基因推断的蛋白质序列进行亚细胞靶向和蛋白质结构域注释分析。使用ProtAnnDB工具分析了96.5%与这些基因对应的蛋白质的潜在细胞位置[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba[附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)。与细胞壁修饰功能一致，66种具有内质网(ER)靶向信号肽的蛋白质是输出到外质体的潜在候选者。在21个预测的转运蛋白中，2个出人意料地没有预测的跨膜结构域。通过peroxbase工具分析，6种过氧化物酶中有5种具有预测的ER靶向信号肽，4种预测属于III类过氧化物酶超家族。在与细胞壁修饰相关的酶和蛋白质中，15%不能分配到连贯的亚细胞区室。这可能是由于所使用的预测模型和/或从苹果基因组序列和注释中推断出的可能被截断的蛋白质序列[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]。此外，ProtAnnDB和CAZy数据库之间的一些注释存在差异。例如，几种蛋白被鉴定为与ProtAnnDB类似的果胶裂解酶，但被归类为糖苷水解酶28 (GH28) (MDP0000147794;MDP0000175027;MDP0000251956;MDP0000270685;MDP0000665344;MDP0000818931和MDP0000249285)或碳水化合物酯酶8 (CE8) (MDP0000177299;MDP0000212502;MDP0000251256; MDP0000252508; MDP0000287234) in CAZy database. Such discordances probably resulted from the markedly different methods and criteria used for protein annotation.

共筛选到114个细胞壁相关基因，其中82%在发育早期表达，18%在发育后期和贮藏阶段表达。根据表达模式，将早期表达的基因归为A类，晚期表达的基因归为B类(表2)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba;额外的文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)。A类细胞壁基因主要包括可能参与果胶代谢和纤维素/半纤维素代谢的基因，分别有20个和26个。在这个簇中还发现了一些可能编码扩张蛋白、半乳糖转移酶、糖蛋白和许多β-半乳糖苷酶的基因，以及过氧化物酶和转运蛋白。相比之下，在b群中鉴定到的细胞壁相关基因很少，鉴定到的主要是与果胶降解有关的基因，很少涉及纤维素/半纤维素代谢的基因，包括编码扩张蛋白的基因(表1)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba;额外的文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

综合分析gydF4y2Ba

基因表达网络在每个集群内实现(附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。聚类A的基因相关性产生了一个由70个基因组成的大网络(gydF4y2BargydF4y2Ba> 0.7)。网络中的一个基因子集显示出很强的相关性(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05,gydF4y2BargydF4y2Ba> 0.9)，并集中在属于家族9 (GH9)组的糖苷水解酶(MDP0000131397)注释的基因上，主要是葡聚糖酶。该亚群由GH9、β-葡萄糖苷酶(MDP0000140817)、β-半乳糖糖苷酶(MDP0000899966)、XTH (MDP0000378203)、FLA (MDP0000525641)、AGP (MDP0000893240)、过氧化物酶(MDP0000221335)和糖转运蛋白(MDP0000318992)组成。另一个包含CSLA (MDP0000717000)、FLA (MDP0000658332)和β-半乳糖苷酶(MDP0000310582)的子集也显著相关(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05,gydF4y2BargydF4y2Ba> 0.9)。在簇B中绘制了两个小的相关网络(附加文件)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。两个基因网络显示出显著的相关性(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05,gydF4y2BargydF4y2Ba> 0.7)。一项研究显示编码果胶降解酶(如PG)和果胶酯酶(MDP0000249285;MDP0000251256;MDP0000252508;MDP0000287234)和编码转运蛋白的基因(MDP0000216376;MDP000219430;MDP0000266249;MDP0000403872)。另一个网络显示出很强的相关性(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05,gydF4y2BargydF4y2Ba> 0.8)，编码扩展蛋白样A (MDP0000906812)和扩展蛋白样B (MDP0000214811)的基因之间;MDP0000292477)， β-半乳糖苷酶(MDP0000416548)和过氧化物酶(MDP0000142485)。gydF4y2Ba

转录组谱与细胞壁单糖含量和半纤维素酶促释放的低聚糖含量初步相关，以揭示伴随事件(附加文件)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。除阿拉伯糖和鼠李糖含量没有变化外，我们考虑了AIM中总单糖的含量(以%NSP计)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。葡聚糖酶酶解物中低聚糖的相对含量也被认为是半纤维素结构变化的标志。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

葡萄糖和糖醛酸含量与所选基因表达水平的相关性最小。发育早期表达的集群A基因的表达谱与半乳糖、甘露糖含量以及甘露聚糖(Hex4a1、Hex4a2、Hex5a1、Hex5a2、Hex6a1、Hex7a1和Hex8a1)和木聚糖(Pen5U1m1a1、Pen4U1m1和Pen4U1m1a1)的低聚糖含量呈正相关。它们还与焦糖、木糖含量以及木葡聚糖低聚糖(XXG、XLG、GFG、XFG、XLXG、XXFG、XXFGa2、XLFGa2)负相关。与属于簇B的基因的表达谱相反，在成熟阶段表达更高。gydF4y2Ba

在β-半乳糖苷酶的表达谱和半乳糖含量之间观察到很强的相关性。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)，膨胀蛋白的表达谱与木葡聚糖的结构XXG之间(图2)。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)，在苹果发育和成熟过程中，纤维素合酶like-A和糖苷水解酶家族9的表达谱与甘露聚糖Hex6a1结构之间存在差异(图6)。gydF4y2Ba3c和dgydF4y2Ba分别)。gydF4y2Ba

苹果细胞壁多糖在果实发育和成熟过程中化学成分的变化已经被描述[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]以及与成熟有关的酶和基因表达[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]。然而，对苹果发育和贮藏过程中细胞壁多糖化学成分、结构、水分通量等可能参与的基因的更详细的研究，为了解影响质地特征的机制提供了新的见解，并突出了参与这些过程的新的候选基因。gydF4y2Ba

一种表征苹果细胞壁动态的双重方法gydF4y2Ba

通过细胞壁生化分析，评价了苹果果实发育过程中多糖组成特别是半纤维素精细结构的变化。对于后一种分析，果胶被水洗和果胶溶解酶部分去除，因为据报道果胶可以掩盖半纤维素[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]。我们的研究结果表明，与之前的XGos谱图研究相比(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，苹果薄壁细胞壁的果胶对酶对半纤维素的可及性没有重大影响[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]。此外，MALDI-TOF MS观察到的葡聚糖酶水解产物中GgM低聚物相对比例的变化，伴随着果实发育过程中细胞壁甘露糖含量的下降。虽然这些观察表明细胞壁半纤维素酶谱在一定程度上具有代表性，但水解产物的组成可能反映了易于接近的结构，而不是那些强相互作用的结构。此外，果实发育过程中多糖结构和通路的内源修饰可能影响酶解产物的组成。gydF4y2Ba

转录组学分析提供了在苹果发育、成熟和冷藏过程中与细胞壁构建和重塑相关的特定蛋白质和酶的基因编码途径。根据不同数据库的注释选择基因，但各自的生化活性仍有待研究。苹果果实发育的全基因组表达分析已经揭示了基因表达与果实从花芽到成熟的特定发育阶段之间的协调性[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]。果实早期发育过程中表达的基因主要参与细胞增殖和扩增[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]。最近，这种方法揭示了下调gydF4y2BaMdPME2gydF4y2Ba在水果发育过程中，一个早期表达的果胶甲基酯酶编码基因与水果冷藏过程中出现的粉质有关[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。其他一些功能分类也有报道，如溶质转运和细胞壁代谢[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

目前的分析证实，从苹果早期发育到收获阶段，检测到的转录本数量是相似的，并且在冷藏后2个月内不会受到影响[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]。然而，与细胞壁相关的基因明显更多地特异于早期发育阶段，而不是成熟和储存阶段。这可能是由于对不同基因型进行了分析，结果在收获后具有不同的质地演变(附加文件)gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)。基因表达谱的差异突出了基因组在不同表达时间框架下的可塑性和/或其他遗传/环境因素在成熟过程中显著影响代谢途径。事实上，在不同的苹果基因型之间已经观察到的转录谱的变化支持了果实生长和成熟的遗传依赖调控[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba，gydF4y2Ba46gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

果胶在果实发育和冷藏过程中的改性gydF4y2Ba

在苹果早期发育过程中，参与果胶代谢的基因与参与半纤维素代谢的基因共表达，并通过XTH对其进行重塑(表1)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba、附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba和gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。参与生物合成和降解功能的基因的同时表达与观察到的水解机制一致，以实现适当的细胞壁多糖合成和器官发育[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba49gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

在果实发育和成熟过程中观察到细胞壁成分的变化，如半乳糖含量的减少[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba50gydF4y2Ba]。木糖、焦糖和醛酸的增加可能是由于细胞壁中木糖的富集和中性侧链中果胶的消耗。苹果AIM成熟期水洗液中存在的糖醛酸支持了PG解聚HG导致果实硬度降低的假设[j]。gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba51gydF4y2Ba]。去除甲酯有利于PG的作用[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba52gydF4y2Ba]但也有利于细胞粘附和果胶网络的刚性[gydF4y2Ba53gydF4y2Ba]。在桃和番茄中，果胶甲基酯化在发育和成熟过程中降低，而PME活性增加[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba，gydF4y2Ba54gydF4y2Ba，gydF4y2Ba55gydF4y2Ba]。在苹果中，据报道PME活性在成熟过程中下降[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]。在本研究中，果胶酯酶编码基因MDP0000177299、MDP0000212502在苹果发育成熟过程中表达减少。然而，正如先前报道的[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]，果胶甲酯含量在苹果成熟过程中未见全球显著变化。有人认为，这些酶可能在三细胞连接处具有非常局部的活性，其作用无法在整个果实水平上进行评估[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。乙酰酯化反应也是苹果果胶的一个共同特征[gydF4y2Ba56gydF4y2Ba并且可能是这些酯酶功能不明确的目标。后者可能有助于在110 DAF和2 M之间观察到的整体细胞壁乙酰酯化的显著降低。gydF4y2Ba

GAUT编码基因MDP0000609623在成熟阶段特异性表达，UA含量显著增加。这表明即使在发育阶段之后，新的果胶也可能被纳入细胞壁。这与早熟番茄在分解时仍具有细胞壁合成能力的观察结果是一致的[gydF4y2Ba57gydF4y2Ba，gydF4y2Ba58gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

半纤维素在果实发育和冷藏成熟过程中的变化gydF4y2Ba

在果实发育过程中观察到的半纤维素结构域的半定量变化(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)与在其他植物器官或果实上所作的观察结果一致[gydF4y2Ba59gydF4y2Ba，gydF4y2Ba60gydF4y2Ba]。这一变化表明，不同的XyG精细结构在细胞壁膨胀和拉伸力学性能方面的作用不同，其机制尚不清楚[gydF4y2Ba61gydF4y2Ba]。在包括苹果在内的几种水果中，不同的木葡聚糖转糖基化酶/水解酶(XTH)编码基因在幼龄和成熟果实中表达，可能对XyG结构有贡献[j]。gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba62gydF4y2Ba，gydF4y2Ba63gydF4y2Ba]。特别是在本研究中发现，XTH基因的表达在发育早期阶段高度正相关(gydF4y2BaPgydF4y2Ba-value < 0.01)，表达糖苷水解酶GH9 (MDP0000131397)、β-葡萄糖苷酶(MDP0000140817)、β-半乳糖糖苷酶(MDP0000899966)、糖蛋白(FLA: MDP0000525641, AGP: MDP0000893240)、过氧化物酶(MDP0000221335)和糖转运蛋白(MDP0000318992)(附加文件)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。它指出了XyG在细胞壁动力学中的关键作用，以及其他细胞壁事件，包括细胞壁多糖被水解酶重塑、氧化反应和可能的细胞膨胀调节。事实上，木葡聚糖已被证明参与细胞壁力学，作用于微管细胞骨架的稳定性和纤维素微原纤维的生物合成和组织[gydF4y2Ba64gydF4y2Ba]。FLA基因(MDP0000525641, MDP0000658332)与XyG重塑的同时表达表明，FLA蛋白的细胞粘附和植物力学意义[gydF4y2Ba65gydF4y2Ba，gydF4y2Ba66gydF4y2Ba结合特定的木聚糖结构。α- l -阿拉伯糖醛酸苷酶/α -木糖苷酶双编码基因(MDP0000208161)和α- l - focusidase (MDP0000166406)在苹果发育早期也有高表达。这些基因可能参与XyG结构的发育调控，因此需要进一步研究[gydF4y2Ba67gydF4y2Ba]。此外，木糖苷酶/阿拉伯糖烷苷酶也可能参与了果胶、葡萄糖醛酸阿拉伯糖素和/或AGP结构的阿拉伯糖侧链的重塑。gydF4y2Ba

本研究表明，半乳糖葡甘露聚糖(GgM)是苹果半纤维素的一种次要成分，在果实发育早期发生了细微的结构变化。它与一个CSLA基因(MDP0000673496)的高表达同时发生gydF4y2Ba5gydF4y2Ba),其gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba同源基因编码甘露聚糖合成酶[gydF4y2Ba68gydF4y2Ba]并对细胞扩增具有潜在的关键作用[gydF4y2Ba69gydF4y2Ba]。特别是，这种CSLA基因表达与葡聚糖酶消化中Hex6a1结构的检测呈正相关(图2)。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba)，与糖苷水解酶GH9基因(MDP0000131397)的表达(图2)。gydF4y2Ba3 dgydF4y2Ba)。一个CSLA (MDP0000717000)基因表达与β-半乳糖苷酶表达谱(MDP0000310582)的强相关性(gydF4y2BaPgydF4y2Ba-value < 0.01)(附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)表明β-半乳糖苷酶也可能参与控制GgM的合成和在细胞壁的沉积。GgM在初壁中的功能尚不清楚。它们与纤维素的潜在相互作用[gydF4y2Ba70gydF4y2Ba]使它们成为控制微原纤维聚集从而控制细胞壁扩张的候选者[gydF4y2Ba61gydF4y2Ba]。这与甘露聚糖降解酶的存在是一致的，至少在番茄中，其转糖基酶活性(MTH)与XTH活性相似[gydF4y2Ba71gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

果胶裂解酶和鼠李糖半乳糖醛酸酶(PS)共同作用释放大量甘露糖和葡萄糖;表格gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)表明GgM可能与果胶有关。这种关联也会受到成熟的影响，因为与60DAF相比，2m样品中的葡萄糖量减少了。GgM生物合成在果实早期发育和果实扩大过程中的特定时间点表明，它最有可能在细胞分裂期间和/或之后发挥特定作用，与番茄中的细胞粘附有关[qh]gydF4y2Ba72gydF4y2Ba]和/或在果实发育早期第一次观察到的硬度迅速下降[gydF4y2Ba73gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

木聚糖酶谱分析未发现苹果中微量葡萄糖醛酸阿拉伯木聚糖(GAX)含量发生细微的结构变化。这可能是由于木聚糖酶对GAX的部分水解污染了之前水解步骤中使用的甘露聚糖酶，但也可能是由于木聚糖取代阻碍了结合/活性位点。事实上，以下葡聚糖酶所含的木聚糖酶活性能够释放更多的木聚糖低聚物。总体而言，甘露聚糖酶和葡聚糖酶释放的木糖低聚物表明，GAX在60DAF和110DAF特别存在，具有不同的精细结构。目前还没有关于木聚糖基多糖在其他水果中精细结构修饰的报道。对于GgM, GAX在苹果中的作用还有待确定。在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba，木聚糖可以通过AGP与果胶结合[gydF4y2Ba74gydF4y2Ba]和番茄中的葡萄糖醛酸氧化酶(GUX)部分与GgM有关[gydF4y2Ba75gydF4y2Ba]。甘露聚糖酶和木聚糖酶水解产物中阿拉伯糖、半乳糖和鼠李糖的鉴定支持了GAX与AGP/果胶RGI复合物之间的联系。与XTH和MTH一样，果实中存在具有水解酶活性的木聚糖酶，但也存在转糖基酶活性[gydF4y2Ba76gydF4y2Ba]，为木聚糖重塑机制开辟了道路。由于番茄的GUX位于细胞壁，排列在细胞间隙内[gydF4y2Ba72gydF4y2Ba]，在类似的位置寻找苹果GAX，并测试它们在细胞膨胀过程中参与果肉中大细胞间隙的形成，将是一件有趣的事情。gydF4y2Ba

膨胀蛋白也是在细胞膨胀过程中放松xyg -纤维素相互作用的重要蛋白质[gydF4y2Ba77gydF4y2Ba，gydF4y2Ba78gydF4y2Ba]。它们在生长中的水果中被发现，如西红柿[gydF4y2Ba79gydF4y2Ba]，梨[gydF4y2Ba80gydF4y2Ba]，草莓[gydF4y2Ba81gydF4y2Ba]和苹果[gydF4y2Ba82gydF4y2Ba]。结果表明，4个扩展蛋白(EXPA)或扩展蛋白样(EXLA)基因(MDP0000257797、MDP0000259640、MDP0000785413和MDP0000568045)在果实发育早期特异性表达更多(表2)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba;额外的文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)。他们推断的蛋白质序列与其他肉质水果的扩展结构域有不同程度的相似性[gydF4y2Ba79gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba81gydF4y2Ba，gydF4y2Ba83gydF4y2Ba[附加文件gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)。相比之下，在果实成熟过程中鉴定到的3个扩展蛋白样基因(EXL) (MDP0000214811、MDP0000292477、MDP0000906812)的蛋白序列差异很大，表明其生化特性和生物学功能不同(另附文件)gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)。它们的基因表达谱与低聚糖XXG的相对含量相关(图2)。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba;额外的文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)，这表明这种精细结构的目标偏好，或者它们参与了新的XXG结构的细胞壁整合。扩展蛋白基因(MDP0000214811;MDP0000292477;MDP0000906812)的表达也与一种β-半乳糖苷酶(MDP0000416548)的表达相关。这一观察结果表明，XyG结构的半乳糖化可能参与了膨胀蛋白对XyG/纤维素复合物的识别。gydF4y2Ba

两组β-半乳糖苷酶gydF4y2Ba

β-半乳糖苷酶是苹果发育过程中常见的高活性酶，尤其是在成熟阶段[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]。本研究在苹果发育早期表达了11个编码β-半乳糖苷酶的基因，这些基因具有糖苷水解酶35结构域(GH35)。它们与番茄和日本梨中发现的相似，但不同于gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba作用于木葡聚糖的AtBGAL10 [gydF4y2Ba84gydF4y2Ba[附加文件gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)。这些苹果β-半乳糖苷酶中有7种与PpGAL5、PpGAL6和PpGAL7非常相似，它们在果实膨大时表达量最高，但在成熟开始时急剧下降[gydF4y2Ba85gydF4y2Ba]。这些酶可以潜在地靶向几种细胞壁结构，如AGP、果胶RGI半乳聚糖侧链、木葡聚糖或半乳葡甘露聚糖。11种苹果β-半乳糖苷酶的表达谱与半乳糖含量呈正相关(图2)。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba、附加文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)表明RGI半乳糖侧链水解可能不是它们的目标，除非这些酶也像frankov和Fry [gydF4y2Ba86gydF4y2Ba]。在这种情况下，这些酶在细胞壁多糖的重塑中将具有更复杂的功能。它们可能通过调节果胶和半纤维素多糖的侧链结构来控制它们与纤维素的相互作用[gydF4y2Ba87gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba89gydF4y2Ba]，或通过修饰XyG半乳糖基化来调节XTH/XET等重塑酶[gydF4y2Ba90gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba92gydF4y2Ba]。在任何情况下，这些糖苷酶在细胞壁的重塑和细胞扩增中都起着中心作用。gydF4y2Ba

另外三个β-半乳糖苷酶基因在苹果成熟过程中优先表达(图2)。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。这些β-半乳糖苷酶基因表达谱与半乳糖含量呈弱负相关gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。其中两个基因(MD0000416548和MD0000127542)对应于苹果在1°C控制或常规气氛下贮藏过程中上调的β-半乳糖苷酶基因(Mdβ-GAL1和Mdβ-GAL2)。gydF4y2Ba93gydF4y2Ba]。蛋白质分析表明，它们与梨成熟特异性蛋白高度相似gydF4y2BaPpGAL4gydF4y2Ba和gydF4y2BaPpGAL1gydF4y2Ba，分别为(附加文件gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)，这表明它们可能在苹果和梨的成熟过程中起着类似的作用[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba94gydF4y2Ba，gydF4y2Ba95gydF4y2Ba]在RGI半乳糖侧链的剪枝中[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba96gydF4y2Ba]。成熟特异性β-半乳糖苷酶基因在番茄中也有表达[gydF4y2Ba97gydF4y2Ba]而其中一种TBG4的下调导致果实软化程度降低[gydF4y2Ba98gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

这些结果强调了β-半乳糖苷酶家族的复杂性，值得进一步研究，以评估它是否可以分为两组，一组主要作用于细胞壁多糖和糖蛋白半乳糖基化的调节，另一组主要修剪果胶RGI侧链。gydF4y2Ba

细胞壁动力学中潜在的其他参与者gydF4y2Ba

过氧化物酶参与一系列生理过程[gydF4y2Ba99gydF4y2Ba]，例如通过产生活性氧(ROS)裂解多糖键来降解细胞壁[gydF4y2BaOne hundred.gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba104gydF4y2Ba]。编码过氧化物酶的基因大多在苹果发育早期表达。其中一些表达谱与参与细胞壁多糖生物合成、重塑和降解的蛋白质和酶的表达谱相关。这些结果支持了这些酶在细胞发育中的作用gydF4y2BaArabidospisgydF4y2Ba细胞根伸长[gydF4y2Ba105gydF4y2Ba但它们的作用机制尚不清楚。事实上，除了多糖降解外，某些ROS还可以反向促进细胞壁交联，从而限制细胞扩增[gydF4y2Ba106gydF4y2Ba]。本研究结果表明，调控外胞体ROS的产生对苹果发育过程中细胞壁的生物合成和修饰具有重要意义。gydF4y2Ba

在果实生长和成熟过程中，内部胀压的变化导致组织力学性能的改变[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba107gydF4y2Ba]。转运蛋白通过影响渗透压的胞外/细胞溶质浓度和pH值，在调节胀压中起主要作用[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba108gydF4y2Ba，gydF4y2Ba109gydF4y2Ba]。如前所述[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]，发现编码离子和糖转运体的基因在发育早期高度表达(表2)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba;额外的文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)。它们的表达与多糖生物合成和降解相关基因高度相关。4个编码离子和糖通道/转运体的基因在苹果成熟过程中优先表达(表2)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba;额外的文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)，并与果胶降解相关基因相关(附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。这些早表达和晚表达的转运基因在果实膨胀和成熟过程中对胀压的调控作用有待进一步研究。在成熟过程中，苹果的软化与细胞膨胀压力的降低有关[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。评估在后期阶段表达的己糖/糖转运基因对外质体韧皮部下载糖的命运的作用将是很有意义的[gydF4y2Ba110gydF4y2Ba关于在成熟的苹果中观察到的水分区隔的变化[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba]。成熟苹果中渗透物浓度的调节可能导致细胞膨胀压力的变化和果实硬度的丧失，如葡萄浆果所提出的[gydF4y2Ba111gydF4y2Ba]。这种伴随细胞壁多糖重塑和降解的机制也可能参与苹果不同质地的细化，例如那些被认为是粉状和融化的质地。gydF4y2Ba

除了已知的苹果果实发育和冷藏过程中细胞壁果胶的变化外，本研究还揭示了半纤维素精细结构的变化，特别是在果实发育早期。转录组的相关表征突出了可能参与半纤维素代谢和观察到的变化的基因。在成熟阶段，鉴定出的基因数量较少，对果胶代谢更具特异性。本研究还指出，β-半乳糖苷酶在果实生长和成熟过程中的作用，在靶向底物和分子功能方面仍有待研究。观察到离子和糖转运体、过氧化物酶和细胞壁相关基因的表达谱之间的相关性，为进一步研究果实发育过程中细胞壁组装/拆卸机制与细胞膨胀调节之间的相互作用开辟了道路。gydF4y2Ba

植物材料gydF4y2Ba

在INRA Angers实验室完成的由X3259和X3263杂交产生的“HIVW”分离群体中的8个杂交种(H074、H097、I016、I062、I095、V034、V083和W029) [gydF4y2Ba112gydF4y2Ba，gydF4y2Ba113gydF4y2Ba]在与Bois l ' abb域(INRA, Angers) INRA实验室相连的2块试验田(PH和P12)上生长。在开花后60天和110天(DAF)，以及最佳成熟度(Harvest, H)，从树冠的中部和外部采集果实。用果皮颜色和淀粉指数(7-8)来评估收获时果实的成熟度[gydF4y2Ba114gydF4y2Ba]。在最佳成熟期采集的水果也在1°C的冷藏室中保存1个月(1 M)和2个月(2 M)，然后采样。为了提取RNA，采集5个水果的外皮层，采集后立即在液氮中冷冻，1 M和2 M的样品在室温下冷冻24 h。为了进行生化分析，采集每个基因型和每个地块的一个果实的皮质组织，在采集后立即在液氮中冷冻，或在室温下将1 M和2 M样品冷冻24小时(每个基因型和每个地块冷冻3至5个果实)。除2013年PH小区收获的60个DAF和110个DAF果实外，2012年取样。果实从收获到2 M的软化使用自动渗透仪(TA.XT)进行检查。-PLUS, Stable Micro system)配备了Galvez-Lopez等人描述的直径4毫米的凸探头。[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba[附加文件gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

基因表达分析gydF4y2Ba

RNA提取、扩增和微阵列杂交gydF4y2Ba

按照Nobile等人的描述，使用CTAB萃取缓冲液从3g液氮研磨的冷冻果肉组织中提取总rna。gydF4y2Ba，gydF4y2Ba［gydF4y2Ba15gydF4y2BaRienth等人。gydF4y2Ba，gydF4y2Ba［gydF4y2Ba115gydF4y2Ba]。按照Celton等人的方法对mrna进行扩增、标记和共杂交。gydF4y2Ba，gydF4y2Ba［gydF4y2Ba36gydF4y2Ba用Message AmpII aRNA扩增试剂盒(Ambion)从200 ng总RNA中产生aRNAs。然后，对每种aRNAs进行5 μg的反转录，并用Cyanine-3或Cyanine-5荧光染料(Interchim, montluon, France)进行标记。将标记的样品以每种染料30 pmol的比例组合，并与含有135,000个60米寡核苷酸探针的Nimblegen微阵列AryANE v1.0共杂交，如Celton等人所述。gydF4y2Ba，gydF4y2Ba［gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]。使用Deva软件(Nimblegen)从扫描图像中提取配对数据文件，扫描图像由MS200微阵列扫描仪(Roche Nimblegen)获得。gydF4y2Ba

在每个时间点(60 DAF, 110 DAF, H, 1 M和2 M)进行竞争杂交，将4对基因型(I062/V083, V034/W029, H097/I095, I016/H074)进行关联。对PH或P12地块的果实进行了2次独立的生物重复，包括染料交换的技术重复，共38个阵列。gydF4y2Ba

微阵列数据统计分析gydF4y2Ba

所有统计分析均按照Celton等人的描述进行。gydF4y2Ba，gydF4y2Ba［gydF4y2Ba116gydF4y2Ba使用R软件[gydF4y2Ba117gydF4y2Ba]。简而言之，对于每个强度比较数据，使用微阵列之间的Lowess方法进行归一化。然后从背景中减去归一化强度值，以提供转录物表达水平的估计。然后对使用归一化的所有比较的表达式值执行分位数方法的第二次归一化。从R包preprocessCore [gydF4y2Ba118gydF4y2Ba(生物导体项目)。不同时间点之间的差异表达分析使用lmFit函数进行，使用R包LIMMA进行Bayes调节t检验[gydF4y2Ba119gydF4y2Ba]来自Bioconductor项目。基因被认为是差异表达，如果gydF4y2BatgydF4y2Ba以及gydF4y2BaP -gydF4y2Ba在60 DAF和2m之间，样品的值低于1%。为了确定表达的探针数量，仅考虑来自1 - 3类中最特定探针的信号进行后续分析(96,120个探针)[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

微阵列数据已提交给基因表达综合数据库(gydF4y2Bahttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/gydF4y2Ba)，登记号为GSE64079。gydF4y2Ba

RT-qPCR分析gydF4y2Ba

按照Segonne-Mikol等人的描述，对用于微阵列实验的总rna样本进行cDNA合成和qPCR。gydF4y2Ba，gydF4y2Ba［gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。设计引物，利用Primer 3 plus软件(gydF4y2Bahttp://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi/gydF4y2Ba)(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。每个基因型扩增子测序一次以验证引物特异性。每次运行，通过熔化曲线分析确认单产物扩增。采用稀释曲线法在6点稀释序列(从1.10 . 0开始)上检测每个引物对的扩增效率gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}到1.10gydF4y2Ba^{−6gydF4y2Ba})对包含该研究中包括的所有基因型和发育阶段的cdna库进行分析。所选引物的效率在90%以上。在2个不同时间点对7个基因进行RT-qPCR检测。gydF4y2Ba

根据微阵列结果，选择所有样品中表达水平相近的3个内参基因MDP0000645828 (GAPDH)、MDP0000146514和MDP0000207727(分别标注为Protein prenylyltransferase超家族蛋白和DC1结构域蛋白)计算归一化因子。采用公式∆Ct = (Ct)计算相对表达量gydF4y2Ba_{标签gydF4y2Ba}- ctgydF4y2Ba_{裁判gydF4y2Ba})来源于gydF4y2Ba^{−ΔΔgydF4y2BaCgydF4y2Ba}_TgydF4y2Ba方法，其中Ct为阈值周期，tag为目的基因，ref为内参基因[gydF4y2Ba120gydF4y2Ba[附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

序列分析gydF4y2Ba

基于序列相似性的苹果基因注释gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba检索自蔷薇科基因组数据库(GDR)，gydF4y2Bahttps://www.rosaceae.org/gydF4y2Ba)。使用Mapman基因本体进行功能分类和富集。gydF4y2BaPgydF4y2Ba-value < 0.05) [gydF4y2Ba121gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

采用Genesis软件(gydF4y2Bahttp://www.aics.riken.jp/labs/cbrt/gydF4y2Ba) [gydF4y2Ba122gydF4y2Ba]，以平均连锁层次聚类法为聚类规则，距离为基因表达之间的相似度。所选基因表达谱之间的相关性使用cor.test函数和Pearson检验使用R Stats软件包[gydF4y2Ba117gydF4y2Ba]。选取两个基因的表达相关性gydF4y2BargydF4y2Ba> 0.7和gydF4y2BaPgydF4y2Ba值< 0.01。使用Cytoscape软件生成基因网络[gydF4y2Ba123gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

从ProtAnnDB数据库中检索亚细胞定位的蛋白质注释和预测(gydF4y2Bahttp://www.polebio.scsv.ups-tlse.fr/ProtAnnDB/)gydF4y2Ba［gydF4y2Ba124gydF4y2Ba]。潜在的过氧化物酶序列也通过peroxbase数据库(gydF4y2Bahttp://peroxibase.toulouse.inra.fr/index.phpgydF4y2Ba) [gydF4y2Ba125gydF4y2Ba]。使用Kalign工具对蛋白质序列进行多重比对(gydF4y2Bahttp://msa.sbc.su.se/cgi-bin/msa.cgigydF4y2Ba)，并附有默认参数[gydF4y2Ba126gydF4y2Ba]。所有蛋白序列均从GenBank (gydF4y2Bahttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

细胞壁分析gydF4y2Ba

酶gydF4y2Ba

果胶裂解酶(PL) [EC 4.2.2.10]纯化自Peclyve (Lyven, France) [gydF4y2Ba127gydF4y2Ba]。鼠李糖半乳糖醛酸酶(RG) [EC 3.2.1.171]来源于gydF4y2Ba曲霉属真菌aculeatusgydF4y2Ba(Novozyme、丹麦)。endo -1,4-β-甘露聚糖酶[EC 3.2.1.78]来源于gydF4y2Ba黑曲霉gydF4y2Ba(E-BMANN Megazyme，爱尔兰)。endo -1,4-β-木聚糖酶[EC 3.2.1.8]来源于gydF4y2Ba木霉gydF4y2Ba(E-XYTR1 Megazyme)和内切-β-葡聚糖酶[EC 3.2.1.6]来源于gydF4y2Ba木霉属gydF4y2Basp. (E-CELTR Megazyme)对木聚糖和葡甘露聚糖的活性较低。gydF4y2Ba

细胞壁材料的制备gydF4y2Ba

通过在每个果园的每个日期随机采摘每个基因型的一个果实，实现了每个日期8个基因型的池。每个样品被切割并冻干。每个干燥的样品都用研钵和杵还原成细粉。使用自动溶剂萃取器(ASE™350,Thermo Scientific™Dionex™)将细胞壁制备为酒精不溶性物质(AIM)，在100°C下使用80%乙醇，持续15分钟，直到乙醇萃取物不含可溶性糖。AIM在40°C下真空干燥gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_5gydF4y2Ba．使用台式均质机(FastPrep, MP Biomedicals, USA)以6.5 ms的速度将获得的AIM还原成粉末gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}20多岁。gydF4y2Ba

AIM糖成分gydF4y2Ba

根据Hoebler等人的方法，用硫酸水解法从5 mg AIM中鉴定和定量细胞壁中性糖含量。gydF4y2Ba，gydF4y2Ba［gydF4y2Ba128gydF4y2Ba]。AIM在13 M硫酸中30°C搅拌30 min，然后在1 M硫酸中100°C水解2 h。糖被NaBH还原成糖醇gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba(100mg mLgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba},在北半球gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba3.7 N)，在40°C下搅拌1h。然后用乙酸酐和咪唑在室温下乙酰化糖醇20 min [gydF4y2Ba129gydF4y2Ba]。用TG-225MS色谱柱(Thermo Scientific, USA)对二氯甲烷中回收的糖醇乙酸酯进行气相色谱分析(TRACE GC ULTRA, Thermo Scientific, USA)。采用糖和肌醇标准溶液作为内标进行校准。用偏羟基二苯比色法测定尿醛酸含量[gydF4y2Ba94gydF4y2Ba，gydF4y2Ba97gydF4y2Ba用半乳糖醛酸作为标准gydF4y2Ba

淀粉含量gydF4y2Ba

为了定量细胞壁材料中的淀粉含量，将AIM (10 mg)在200 μL MOPS (50 mM, pH7)中室温孵育过夜，然后在120℃下孵育5 min。商品耐热α-淀粉酶gydF4y2Ba地衣芽孢杆菌gydF4y2BaMegazyme, 3000u mLgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})，在100℃下进一步孵育6分钟。冷却后，加入400 μL醋酸缓冲液(200 mM, pH 4.5)将样品调节至pH 4.5。用商品淀粉葡糖苷酶在50℃下孵育30分钟gydF4y2Ba黑曲霉gydF4y2Ba(Megazyme, 3300u mLgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})。在HPAEC-PAD中，葡萄糖释放量采用CarboPac®PA1色谱柱(4 mm × 250 mm, Thermo Scientific, USA)，温度为25°C。500mm NaOH以1ml min的流速等密度洗脱gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}．鼠李糖为内标。gydF4y2Ba

AIM中甲酯和乙酰酯的定量gydF4y2Ba

根据Levigne等人的描述，从5 mg AIM中定量测定甲酯和乙酰酯。gydF4y2Ba，gydF4y2Ba［gydF4y2Ba95gydF4y2Ba]。简单地说，样品在NaOH 1n和CuSO中在4°C下皂化1小时gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba1 mg mLgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}．离心(7400 g, 4°C, 10 min)后，过滤上清(Alltech max - clean IC-H, Grace，美国)，用高效液相色谱法分析，C18柱(4 mm × 250 mm, 5 μm, Interchim，法国)，15°C恒温。4 mM H的等温洗脱gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba所以gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba以1.0 mL min的流速使用gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}．用差示折射仪(2414折射率检测器，Waters, USA)监测洗脱。用含甲醇、乙酸和异丙醇的标准溶液作为内标进行校准。果胶的甲基化度(DM)计算为每100摩尔半乳糖醛酸(GalA)中甲醇的摩尔数。gydF4y2Ba

AIM多糖的酶解结构分析gydF4y2Ba

酶的退化gydF4y2Ba

用去离子水(1ml)在40°C下温和搅拌15分钟，从5mg AIM中部分去除果胶，然后煮沸10分钟，离心(15300)gydF4y2BaggydF4y2Ba， 20°C, 10分钟)。取上清液，将AIM颗粒悬浮在去离子水(1ml)中，用果胶裂解酶和鼠李糖半乳糖醛酸酶(各0.12 U)在40℃下温和搅拌3小时消化。离心(如上所述)后，用1ml去离子水搅拌洗涤3次。然后用endo-1,4-β-甘露聚糖酶(10 U)、endo-1,4-β-木聚糖酶(25 U)和endo-β-葡聚糖酶(10 U)在40°C下温和搅拌17 h，对颗粒进行顺序酶切[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba[附加文件gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)。酶降解之间的三次水洗被丢弃。所有上清煮沸10分钟后过滤(0.45 μm过滤器;Millex-Hv, PVDF, Millipore，法国)和MALDI-TOF ms分析，生物样品进行3次重复。gydF4y2Ba

酶降解产物分析gydF4y2Ba

降解产物采用MALDI质谱法进行分析。每个上清液与离子液体基质N,N-二甲基苯胺/2,5-二羟基苯甲酸(DMA/DHB)结合[gydF4y2Ba130gydF4y2Ba在MALDI抛光钢板上晾干。每个酶水解产物有3个重复。MALDI-TOF质谱分析在Autoflex III (Bruker Daltonics, Germany)和Smartbeam激光(355nm, 1000hz)的阳性模式下进行。仪器使用已知质量的半乳甘露聚糖低聚物(dp3 -9)进行外部校准。光谱记录在质量范围m/z 500-3000。葡萄糖酶、甘露聚糖酶和木聚糖酶水解产物的离子质量和强度分别在m/ z1085 (XXXG低聚糖)、731 (Hex4a1低聚糖)和655 (Pen3U1a1低聚糖)上归一化。木葡聚糖的命名来源于Fry等人。gydF4y2Ba，gydF4y2Ba［gydF4y2Ba131gydF4y2Ba]扩展到标记为a的乙酰酯基团，然后是低聚糖中酯基团的数量。在低聚糖中，Hex指己糖，Pen指戊糖，U指脲酸(UA)， m指甲酯。对于每个字母，下图对应于寡糖中残基或取代基的数量。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

主成分分析使用主成分分析函数，使用R Factominer软件包[gydF4y2Ba132gydF4y2Ba]。化学数据的方差分析使用R Stats软件包中的方差分析函数进行[gydF4y2Ba117gydF4y2Ba]和数据被认为有显著差异gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001。gydF4y2Ba

生化数据集与转录组数据集的相关性分析采用cor函数和Pearson检验(gydF4y2BaPgydF4y2Ba-value <0.01)从R Stats包[gydF4y2Ba117gydF4y2Ba]。将表达数据随机分为3个池(Pool1: V034、I062和V083, Pool2: W029、I095和H097, Pool3: H074和I016)进行平均，以匹配生化数据的3个重复(附加文件)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

支持数据的可用性gydF4y2Ba

支持本文结论的数据集包含在本文及其附加文件中。支持本文结论的微阵列数据集可在Gene Expression Omnibus知识库中获得，登录号为GSE64079 (gydF4y2Bahttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

1米:gydF4y2Ba

冷藏一个月gydF4y2Ba

2 M:gydF4y2Ba

冷藏两个月gydF4y2Ba

AGP:gydF4y2Ba

阿拉伯半乳聚糖蛋白gydF4y2Ba

目的:gydF4y2Ba

酒精不溶性物质gydF4y2Ba

Ara:gydF4y2Ba

阿拉伯糖gydF4y2Ba

Fuc:gydF4y2Ba

植物种子gydF4y2Ba

为:gydF4y2Ba

反义gydF4y2Ba

里昂证券:gydF4y2Ba

类纤维素合成酶AgydF4y2Ba

DAF):gydF4y2Ba

开花后几天gydF4y2Ba

糖尿病:gydF4y2Ba

甲基化程度gydF4y2Ba

EXLA:gydF4y2Ba

Expansin-like一gydF4y2Ba

EXLB:gydF4y2Ba

Expansin-like BgydF4y2Ba

扩展:gydF4y2Ba

α棒曲霉素gydF4y2Ba

EXPB:gydF4y2Ba

β棒曲霉素gydF4y2Ba

佛罗里达州的:gydF4y2Ba

阿拉伯半乳聚糖蛋白gydF4y2Ba

加:gydF4y2Ba

半乳糖gydF4y2Ba

联欢晚会:gydF4y2Ba

酸galacturonicgydF4y2Ba

GATL:gydF4y2Ba

Galacturonosyltransferase-likegydF4y2Ba

GAUT:gydF4y2Ba

GalacturonosyltransferasegydF4y2Ba

GAX:gydF4y2Ba

GlucuronoarabinoxylangydF4y2Ba

药物:gydF4y2Ba

半乳葡甘露聚糖gydF4y2Ba

“大酒店”:gydF4y2Ba

糖苷水解酶gydF4y2Ba

相关:gydF4y2Ba

葡萄糖gydF4y2Ba

GT:gydF4y2Ba

糖基转移酶gydF4y2Ba

GUX:gydF4y2Ba

GlucuronoxylangydF4y2Ba

H:gydF4y2Ba

收获gydF4y2Ba

HG:gydF4y2Ba

HomogalacturonangydF4y2Ba

HRGP:gydF4y2Ba

Hydroxyproline-rich糖蛋白gydF4y2Ba

男人:gydF4y2Ba

甘露糖gydF4y2Ba

m:gydF4y2Ba

甘露聚糖endotransglucosylase /水解酶gydF4y2Ba

NS:gydF4y2Ba

中性糖gydF4y2Ba

规划:gydF4y2Ba

非淀粉多糖gydF4y2Ba

答:gydF4y2Ba

聚半乳糖醛酸酶gydF4y2Ba

中外职业:gydF4y2Ba

果胶methylesterasegydF4y2Ba

PS:gydF4y2Ba

果胶可溶gydF4y2Ba

RGI:gydF4y2Ba

Rhamnogalacturonan我gydF4y2Ba

RGII:gydF4y2Ba

Rhamnogalacturonan二世gydF4y2Ba

Rha:gydF4y2Ba

鼠李糖gydF4y2Ba

ROS:gydF4y2Ba

活性氧gydF4y2Ba

UA:gydF4y2Ba

糖羰酸gydF4y2Ba

WS:gydF4y2Ba

水溶性gydF4y2Ba

XTH:gydF4y2Ba

Xyloglucan endotransglucosylase /水解酶gydF4y2Ba

XyG:gydF4y2Ba

XyloglucangydF4y2Ba

XyGos:gydF4y2Ba

Xyloglucan寡糖gydF4y2Ba

Xyl:gydF4y2Ba

木糖gydF4y2Ba

作者要感谢Sylvain Hanteville、Maryline Bruneau和Jacqueline Vigouroux在果园和实验室分析方面的帮助，Jean-Marc Celton在转录组学分析方面的帮助，INRA园艺实验单元(UEH0449)对果树的维护，SFR QuaSaV的ANAN平台对微阵列设备的访问，BIBS (INRA Nantes)平台对生化和质谱分析的帮助，以及Thomas Baldwin的英语校对。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

这项工作得到了法国国家农学研究所和卢瓦尔大区(人工智能水果项目)的支持。gydF4y2Ba

数据和材料的可用性gydF4y2Ba

支持本文结果的数据集包含在本文及其附加文件中。微阵列数据已提交给基因表达综合数据库(gydF4y2Bahttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/gydF4y2Ba)，登记号为GSE64079。水果材料可从INRA-IRHS Angers获得。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

ED, SLG, JPR, MO, EB和ML构思和设计了研究。ED在MCG和SLG的协助下进行转录组学实验和生化分析。ED, SLG, MO, JPR, EB和ML撰写了论文。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者宣称他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

发表同意书gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. INRA UR 1268生物奥林匹克，相互作用，组装，F-44316，南特，法国gydF4y2Ba

   Emmanuelle Dheilly, Sophie Le Gall, Estelle Bonnin和Marc LahayegydF4y2Ba

2. 法国昂热大学西区农业学院IRHS, INRA, SFR 4207 QUASAV, 42 rue Georges Morel, 49071, beaucouzeodexgydF4y2Ba

   Emmanuelle Dheilly, Marie-Charlotte Guillou, Jean-Pierre Renou和Mathilde OrselgydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba马蒂尔德OrselgydF4y2Ba或gydF4y2Ba马克拉哈伊gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba)，它允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是您要适当地注明原作者和来源，提供到知识共享许可协议的链接，并注明是否进行了修改。创作共用公共领域免责声明(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本文中提供的数据，除非另有说明。gydF4y2Ba

转载及权限gydF4y2Ba