MATE家族的进化趋势在水稻和水稻之间既相似又不同拟南芥

背景

多药和有毒化合物挤出（配偶）转运蛋白存在于所有生物中。尽管在植物中已经研究了一些伴侣基因家族成员的功能，但很少有研究研究了基因膨胀模式，功能性分歧或阳性选择的影响。

结果

从水稻中鉴定出45个MATE基因，从拟南芥中鉴定出56个MATE基因，并分为4个亚科。在水稻和拟南芥中，MATE家族基因具有相似的外显子-内含子结构;MATE基因结构在各个亚家族中都是保守的，但在不同亚家族之间存在差异。在这两个物种中，MATE基因家族主要通过串联和节段复制扩展。转录组图谱显示，这些基因在转录丰富度和正常生长条件下的表达模式方面存在相当大的差异，表明该家族存在广泛的功能差异。在水稻和拟南芥中，MATE基因表现出一致的功能分化趋势，i型分化在每个亚科中都非常显著，而ii型分化主要发生在III亚科中。水稻I/III亚科、II/III亚科和IV/III亚科之间的II型系数均显著大于零，只有拟南芥IV/III亚科之间的II型系数显著大于零。

位点特异性模型分析表明，MATE基因具有相对保守的进化趋势。分支位点模型表明，水稻和拟南芥各亚科的正向选择程度不同:拟南芥亚科II比其他亚科表现出更高的正向选择，而水稻亚科III的正向选择程度最高。此外，分析还发现了18个水稻和7个拟南芥的正向选择位点和i型和ii型功能分化位点;水稻和拟南芥之间没有共同位点。在水稻和拟南芥中分别鉴定出5个和3个共同进化的氨基酸位点;这些位点可能在维持局部结构稳定性和蛋白质功能域方面具有重要作用。

结论

我们证明了MATE基因家族在水稻和拟南芥中通过串联和节段复制扩展。综上所述，我们的研究结果有助于进一步了解植物中MATE基因家族的分子进化和功能。

植物经常暴露在由其他生物体或病原微生物分泌的外源性毒素和由代谢过程产生的内源性毒素中。因此，外源性和内源性有毒化合物的处理和解毒是生存和发展的重要过程。有几种可能的解毒机制:内源性酶对有毒化合物的修饰[1，2];目标改变[3.];滞留在液泡中[4- - - - - -7];转运到细胞外[8，9］．被称为“多药耐药转运体”的完整膜蛋白是重要的耐药泵，因为它们可以从细胞中挤出结构和化学上不同的药物，从而导致多药耐药[10，11］．多药转运体可分为五大类[8，12]：ATP结合盒（ABC），主要促进剂超家族（MFS），抗性促进划分（RND），小型多药耐药性（SMR）转运蛋白和多药和有毒复合挤出（配偶）家族。主要ABC运输司机使用ATP水解的能量来运输药物，而另一个家庭是使用H的二级运输车⁺或na⁺驱动衬底出口的电化学梯度。

多药和有毒化合物挤出（配合）蛋白广泛存在于细菌，真菌，植物和哺乳动物中。伴侣家族的大多数成员包括440-550个氨基酸，虽然它们可以从〜400到700个残留量的范围内。伴侣蛋白没有似乎具有保守的共识序列;但是，所有伴侣蛋白共享〜40％的序列相似性。与细菌和动物王国相比，每个物种具有相对较少的伴侣基因，植物含有许多配合型转运蛋白。例如，拟南芥具有58个MATE同系物，尽管它们的传输特性尚未全部阐明[13］．在水稻中，对基因组数据库的搜索表明，至少有53个MATE基因[14］．

以往的研究表明，植物中的MATE蛋白具有多种功能。例如，拟南芥的缺陷ALF5基因抑制生长在琼脂上的植物的根生长，可能是由于对不明可溶污染物的敏感性增加[15］．的ALF5基因产物可能存在于根表皮的液泡中，而表达ALF5对四乙基铵(TEA)产生抗性[15］．拟南芥透明Testa 12（tt12）基因还编码了配合型运输器[16，17]，在种皮原花青素积累细胞中起液泡类黄酮/H+−反转运蛋白的作用，促进表儿茶素3'- o -葡萄糖苷的液泡摄取，促进原花青素的生物合成Medicago truncatula和拟南芥18，19］．在番茄中也发现了类似的MATE转运体[20.］．拟南芥的MATE转运体DTX1定位于质膜，并介导了茶叶和小檗碱等外源性有毒化合物的输出[21］．伴侣基因HvAACT1和SbMATE分别参与大麦和高粱的铝耐性[22，23］．拟南芥FRD3已被证明是柠檬酸转运体，是铁从根向茎运输所必需的[24，25］．水稻MATE基因分析OsFRDL1这是与大麦最接近的同源物HvAACT1，表明它编码一种定位于中循环细胞的蛋白质，作为柠檬酸盐转运体，作为铁-柠檬酸盐复合物有效地将铁转运到茎尖是必要的[26］．

虽然MATE基因家族成员在不同物种中的功能已经被解决，但从基因组学角度对该基因家族的研究尚未开展。本研究从单子叶植物水稻和双子叶植物拟南芥中鉴定了所有的MATE蛋白编码序列。通过系统发育分析、外显子-内含子结构分析和基因扩展模式分析，探讨两种物种MATE基因家族的异同。我们还分析了MATE基因在水稻和拟南芥不同组织中的表达谱。为了确定水稻和拟南芥的功能进化是否有相似的驱动力，我们分析了两种植物的功能差异和适应进化。此外，通过协同进化分析确定了水稻和拟南芥氨基酸位点之间的协同进化实例。

水稻和拟南芥中MATE基因家族的全基因组鉴定

这里选择的两种植物物种，单子叶奥雅萨苜蓿和双子叶植物拟南芥，代表了两种主要植物谱系的模式生物。Phytozome数据库的BLASTP搜索(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)发现45个MATE基因奥雅萨苜蓿和56 in.拟南芥．PFAM和SMART数据库都证实了MATE基因家族中存在保守结构域。蛋白质序列(附加文件1)，编码序列(附加文件2)和基因组序列(附加文件3.）全部从植物血统数据库中获得。关于额外的文件提供有关水稻和拟南芥的基本信息（包括基因名称，基因座，蛋白质长度，内部数量，PI值和分子量）4和5．45个MATE基因编码392 ~ 644个氨基酸，分子量为41.3 ~ 65.8 kD, pI值为5.14 ~ 10.07。56个拟南芥基因编码的蛋白质氨基酸序列长度为469 ~ 575个氨基酸，分子量为50.8 ~ 63.5 kD, pI值为4.66 ~ 8.67。这些结果表明，水稻和拟南芥MATE蛋白的氨基酸序列长度和理化性质可能发生了变化，以满足不同的功能。水稻和拟南芥的MATE蛋白基因被定位到它们的染色体上。1和2）.在拟南芥中，预测的56 AtMATE (拟南芥伴侣蛋白）基因位于五条染色体上。染色体1具有21型蒸料基因，而分别在染色体2,3,4和5上发现10,7,9和9型蒸气基因。在米饭中，预测的45次渗透物（奥雅萨苜蓿Mate蛋白质）基因位于12染色体上。染色体3,10和6分别含有9,7和5个渗透基因，而染色体2和5各自具有1个渗透基因。染色体4和11含有2个渗透基因，每种渗透基因，染色体7和9含有3个渗透基因，并且染色体1,8和12含有4个渗透基因。

水稻和拟南芥中伴基因的系统发育和结构分析

采用程序肌肉（通过日志期间的多序列比较）来构建所识别的101全长蛋白序列的多次对准[27，28］．利用完成的蛋白质序列多序列比对图谱，利用MEGA6.0构建系统发育树[29］．此外，我们采用邻居连接(N-J)、最小进化(ME)和最大似然(ML)三种系统发育推断方法构建系统发育树来确定拓扑结构。所有这些树都显示出相似的拓扑结构;因为邻居连接(N-J)树比其他两种系统发育树有更高的bootstrap值。采用N-J树进行进一步分析(图。3.）.N-J系统发生树的拓扑结构和最高bootstrap值表明，MATE基因家族可以分为4个主要亚家族:为了探索水稻和拟南芥中MATE基因家族成员的相似性和差异，我们分别利用每个物种的蛋白质序列构建了两棵N-J树。这两棵树的拓扑结构与使用所有101个蛋白质序列构建的拓扑结构相同(附加文件)7和8）.所有四个MATE亚群在水稻和拟南芥中都存在，这表明这四个亚科一定是在大约2亿年前单子叶双子叶分裂之前形成的(Mya)。利用GSDS软件比较预测编码序列(CDSs)和相应基因组序列，检测两个物种MATE基因的外显子-内含子组织(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）;这项分析有望为这两个物种的基因结构进化提供更多的见解[30.］．伴侣II亚家族（35个中的38个，共35％）的大部分基因具有6至8个内含子（图。3.额外的文件4和5）.同样，MATE I亚家族33个成员中有31个成员含有5 ~ 7个内含子，占93.9%。然而，MATE IV亚家族的所有基因要么缺乏内含子，要么只有一个内含子;13个基因无内含子，6个基因有1个内含子。而MATE III亚家族11个基因中有10个基因有11 ~ 13个内含子，占90.9%，其中5个基因有11个内含子，2个基因有12个内含子，3个基因有13个内含子。在同一亚家族中，水稻和拟南芥的MATE基因具有相似的内含子数量。

基于以往的研究结果，并使用蛋白质定位预测器WoLF PSORT [31，我们获得了真实或预测的水稻和拟南芥中MATE基因家族的亚细胞定位信息。如附加文件所示6，预计配偶I和配偶II的大多数蛋白质成员位于质膜中，而伴侣III和配偶IV的一些蛋白质成员分别位于叶绿体封套膜和质膜中[32- - - - - -38］．此外，少量的MATE III和MATE IV蛋白成员可能存在于液泡膜或细胞质中。这些结果表明，不同的MATE亚家族成员的蛋白可能有不同的亚细胞位置。

迄今为止，许多伴侣基因家族成员的功能已在不同的植物物种中得到解决。为了探索不同的伴侣亚家族成员功能特征，我们在本研究中雇用了这些伴侣成员和所确定的101个伴侣成员，构建N-J（邻近）的系统发育树。如附加文件所示9和10，我们发现同一亚家族的MATE基因成员具有相同或相似的功能，而不同亚家族的成员具有不同的功能[14- - - - - -16，18- - - - - -23，26，32- - - - - -37，39- - - - - -62.］．例如，在亚家族III中，一些MATE基因成员聚集成一个簇(GmFRD3a [39] | gmfrd3b [39) | LjMATE1 [40) | At3g08040 [41，42] | ECMATE1 [43HvAACT1 [63.] | loc_os03g11734 [26) | LOC_Os01g69010 [32| BoMATE [44.] | AT1G51340 [45.) | ZmMATE1 [46.) | VuMATE [47.) | LOC_Os10g13940 [48.) | SbMATE [23，49.，50.] | scfrdl1 [51.] | Tamate1b [52.])。该簇中所有的MATE成员都以柠檬酸为底物，在植物铝耐性和铁转运中发挥重要作用。相比之下，已知功能的MATE亚家族II以类黄酮(原花青素、花青素或类黄酮)为底物，参与相应底物的运输。附加文件9和10还证明，相同亚壳的伴侣基因成员具有相同或相似的基质偏好和组织和亚细胞局部;不同的亚家族成员有不同的特点。这一结论与以前的报告一致。这些结果推断出功能性分歧主要发生在不同的伴侣基因亚家族之间，这是通过分歧V3.0程序支持随后的功能性发散分析。

总体上，分析表明，水稻和拟南芥的MATE基因家族的内含子模式变化一致，因此，两种物种在同一亚家族的基因中具有相似的外显子-内含子结构。相反，不同亚家族的基因在外显子-内含子结构上表现出巨大的差异。两种植物的基因外显子-内含子结构特征也支持我们对水稻和拟南芥中MATE基因的分类结果。

MATE基因家族的复制事件

众所周知，节段复制、串联复制和逆位是基因复制的三种重要机制[64.］．然而，虽然已经显示细分重复和串联重复对多岛家族的扩张很重要，但述程仍然尚不清楚[64.］．

因此，在本研究中，我们重点研究了节段复制和串联复制。

在水稻中，15.6%(7 / 45)的MATE家族基因被认为是来源于节段复制(图。1）;在拟南芥中对应值为17.9%(10 / 56)。2）.这些结果表明，节段性重复对两种植物物种中的伴侣基因家族的扩展产生了类似的贡献。

在同一或相邻的基因间区域内，一个家族的多个成员可以通过串联复制事件产生。在本研究中，单个染色体上相邻的同源基因之间不超过10个干预基因被定义为串联复制基因[65.］．在水稻中，45%(9 / 45)的MATE基因成员被鉴定为串联重复(图。1）;在拟南芥中，对应值为35.7%(20 / 56)。2）.这些结果表明，串联复制在稻米和拟南芥中的伴侣基因家族的扩展中起着重要作用。

为了估计片段重复事件的大致年龄，我们使用了同义碱基替代率(Ks值）作为时间的代理。如表所示1从水稻和拟南芥中鉴定出5对片段复制基因。所有5对已鉴定的水稻副同源基因都被预测是由大约48-53.9米的节段复制造成的，这一估计大致与大约40米的水稻基因组中发生的大规模复制事件一致[66.］．5对拟南芥MATE基因均来源于24.5 ~ 26.8 Mya;这一估计大致与28-48 Mya出现的大规模重复相一致[67.］．从该分析的结果来看，我们建议在两种物种演变期间发生的全基因组重复事件后保留水稻和拟南芥中的细分重复基因。此外，每个重复对的两个基因属于同一亚家族，表明它们在重复后没有经历进化分歧。

我们还将推断的串联复制基因的序列提交到植物基因组复制数据库[68.来筛选这两个物种的串联重复对。但未发现同源基因，说明两种物种形成后仍保留了串联复制基因。

总的来说，在水稻和拟南芥中，节段复制和串联复制事件对MATE基因家族的扩展做出了同样重要的贡献。此外，在两个物种中参与节段复制的基因在两个物种全基因组复制后被保留。

MATE基因在水稻和拟南芥中的表达分析

我们利用基因模式程序构建了热图，比较了同源MATE基因在水稻和拟南芥植物生长发育中的可能作用[69.］．表达曲线表明，两个物种的大多数伴侣家族成员在测试组织和器官中显示出不同的表达水平（图。4和5）.此外，MATE基因表现出优先表达:在水稻和拟南芥中，分别有84.4%(45个基因中的38个)和85.7%(56个基因中的48个)的MATE基因在单个组织中表现出显著的转录丰度谱。这些结果表明，MATE蛋白作为组织特异性调节剂，仅限于离散的细胞或器官。在水稻中，约17.8%、17.8%、20%和26.7%的MATE基因在根、花、叶和种子组织中转录本积累量最高。在拟南芥中，约8.9%、25%、12.5%和25%的MATE基因在根、花、叶和种子组织中转录本积累量最高。令人惊讶的是，在水稻茎尖分生组织中，只有一个MATE基因的转录本积累量最高。在拟南芥中，3、3和2基因在雄蕊、成熟花粉和下胚轴中的转录量最高。这两种基因表达模式的巨大差异表明，在正常条件下，MATE基因参与了所有组织或器官的发育。此外，聚集在热图分支中的MATE基因显示出相似的转录本丰度谱。然而，大多数MATE基因在系统发育树中并没有聚类，而是表现出相对不同的系统发育。 A few small phylogenetic clades had similar transcript abundance profiles; these are marked on the heat map by the red outlined boxes (Figs.4和5）.在两个物种中具有高序列相似性和共同表达谱的基因是评价基因功能的良好候选基因。我们认为红色框中的基因可能在相同的组织中具有相似的功能。

如附加文件所示12胁迫条件下，约半数AtMATE成员在根组织中优先表达，其余AtMATE成员在茎组织中优先表达。与拟南芥相反，一些OsMATE成员在干旱或寒冷胁迫下同时在根和芽中表达。此外，在干旱或冷胁迫下，一些OsMATE成员在根和芽中表达水平较低(附加文件)11）.这些结果表明，MATE基因家族可能在植物胁迫反应中发挥重要作用。

众所周知，基因重复增加表达多样性，使组织或发育专业能够进化。Ohno在重复基因的命运上的经典模型[70]，重复退化互补模型(DDC)预测其中一个重复可能获得新的功能(nefunctionalization)，失去其功能(pseudogenization)，或发展重叠的冗余功能和表达模式(subfunctionalization) [71.］．如图1所示。5，一对重复的基因LOC_Os04g48290和LOC_Os10g37920表现出最冗余的表达，并发展出相反的调控作用。LOC_Os04g48290在幼叶中表达量高，而在种子中表达量低。而LOC_Os10g37920在种子中表达量较高，但在幼叶组织中表达量极低。这种效果表明了亚功能化的情况。在剩余的重复基因中也发现了类似的例子。另外，复制的拟南芥基因At5g10420和At5g65380可能发生了假基因化过程。前者在花组织中的表达明显弱于后者。然而，AT5g10420在花组织中仍有一定的表达，这可能表明假胚化尚未完成。在复制的At1g12950和At3g26590基因中也出现了类似的现象。

MATE基因家族的功能差异

I型和在MATE家族簇的II型官能发散使用该发散V3.0程序，以确定是否在MATE基因家族的氨基酸取代造成功能多样化估计[72.- - - - - -74.］．估计是基于邻居连接树(附加文件7和8)，四个主要的蛋白质亚家族明显存在，并得到高度显著的自举值支持。

首先，我们使用似然比检验来确定是否有大量的i型函数发散(θ)_我)发生在水稻或拟南芥中任何一对特定的MATE亚家族基因之间。如表所示26对拟南芥MATE基因亚家族的估计似然比检验(LRT)值为28.564 ~ 133.88;因此，我们可以拒绝原假设(没有功能发散;P < 0.01, d.f. = 1). Rather, the analysis provides statistical support for the hypothesis that there was a highly significant alteration to the selective constraints affecting the six pairs of Arabidopsis MATE gene subfamilies that resulted in subgroup-specific functional evolution after diversification. The rice gene pair OsMATE I/OsMATE II rejected the null hypothesis atP< 0.05;其余5对MATE基因亚家族的LRT值在29.569 ~ 47.732之间，拒绝了零假设(无功能差异)P< 0.01 (d.f. = 1)。

接下来，我们试图确定Type-II函数散度(θ₂)在水稻和拟南芥中发生。如表所示2，type-II（θ₂)亚科间的系数均显著大于零，表明各亚科间氨基酸性质发生了显著变化。其他3对水稻MATE亚科(I/II、I/IV和II/IV)的系数均小于零。而在拟南芥中，除IV/III亚科外，MATE亚科对之间的Type-II系数无显著差异，表明这些亚科之间的氨基酸性质没有显著变化。

对每个氨基酸部位也确定分歧的后验概率（QK），以鉴定稻米和拟南芥在水稻和拟南芥之间的伴侣亚壳之间的功能分歧的那些致力于75.］．QK <0.9的残留物被排除在外，以减少误报。如表所示2和额外的文件8，水稻MATE对i型功能分化的关键氨基酸位点(Qk > 0.9)为1 ~ 8个。相比之下，拟南芥的范围为1 ~ 322额外的文件13）.

有趣的是，在水稻I/III、II/III和IV/III MATE基因亚家族对中发现了225、202和170个II型功能分化的关键氨基酸位点(Qk > 0.99)2额外的文件14）.这些结果表明，水稻中这些组之间的功能性分歧主要是归因于氨基酸理化特性的快速变化和进化率的变化。对于另外的三种稻米伴基因亚家族对（I / II，I / IV和II / IV），鉴定了任何关键氨基酸位点（表2）表明亚组对I / II，I / IV和II / IV之间的功能分歧可能主要归因于进化率的变化。在拟南芥中，II / III和IV / III Arabidopsis Mate基因亚家族对具有160和170个临界氨基酸位点（QK> 0.99）。然而，II / III拟南芥伴侣基因亚家族对具有θ₂系数小于零;这表明所鉴定的ii型相关关键氨基酸位点可能不可靠。因此，我们认为III/IV对之间的功能分化主要是ii型功能分化，其次是i型功能分化。拟南芥II/III对的功能分化主要归因于i型功能分化。其余4对拟南芥MATE基因亚家族对也可能属于i型功能差异，未发现ii型相关的关键氨基酸位点，且均具有θ₂系数小于零。

综上所述，在水稻和拟南芥中，MATE家族表现出一致的功能分化趋势:在每个亚科中都出现了非常显著的i型功能分化;然而，ii型功能分化也发生在亚家族III和其他亚家族之间。此外，在ii型功能分化程度上，水稻与拟南芥之间也存在微小差异。ⅱ型系数(θ₂）在三种稻米亚家族对I / III，II / III和IV / III之间均明显大于零;然而，只有III / IV的II型系数在拟南芥中是显着的。因此，我们推断出在伴侣亚家族III和其他配偶亚属之间发生的功能分歧。

MATE基因家族中的正向选择

我们将位点特异性似然模型应用于水稻和拟南芥的MATE基因家族15和额外的文件16）;这些模型假定在不同位点之间存在不同的选择压力，但在系统发育的分支之间没有差异[76.- - - - - -78.］．我们使用两对模型，形成两个LRTs: M0(单比)和M3(离散)，M7 (beta)和M8 (beta&ω)。当使用水稻和拟南芥数据集进行分析时，M3指标显著优于相应的单比率模型(P < 0.01, d.f. = 4), indicating that one category ω was insufficient to describe the variability in selection pressure across corresponding amino acid sites in rice and Arabidopsis gene families. The model M8 suggested 0.001 % of sites to be under positive selection with ω = 1.163 and 1.539, and identified 2 sites under positive selection in rice and 11 in Arabidopsis. However, the difference between M7 and M8 was not statistically significant in either species. This non-significance might be a consequence of a lack of power of the LRTs. It is worth noting that parameter estimates under model M8 (beta&ω), suggested the presence of sites under positive selection in both rice and Arabidopsis.

“自由比”模型对树中的每一个分枝都采用不同的ω参数，而“单比率”模型对所有谱系采用相同的ω参数。通过比较这两个模型的两倍对数似然差异，我们可以探讨水稻和拟南芥MATE家族谱系之间是否存在可变的ω比。如表格所示3.和4，当这两个模型应用于水稻和拟南芥时，两种模型之间的差异均显著，表明两种植物谱系间的ω比值变化非常大。我们进行了分支位点模型分析，以检验水稻和拟南芥不同亚科个体位点的正选择。在MATE基因树(附加文件7和8)，四个分支(I、II、III和IV)被独立定义为两个物种的前景分支。当每个MATE亚科被定义为水稻和拟南芥的前景分支时，其比值ω₂总是显著大于1，这表明在两个物种中，每个亚群都处于强烈的正选择压力下(表3.和4）.我们还检查了模型A下位点类别的后验概率，以确定每个亚科中哪些位点可能处于正向选择。在OsMATE I、OsMATE II、OsMATE III和OsMATE IV中确定了关键的阳性选择位点(附加文件)17）.在拟南芥中，该分析在AtMATE I、AtMATE II和AtMATE III中确定了关键的阳性选择位点，但在AtMATE IV中没有(附加文件)18）.与前景分支比ω一致₂上述结果表明，在omate I-IV和AtMATE I-III亚群中，有显著的阳性选择(ω > 1)作用于某些位点。

虽然通过分支部位模型分析发现各种亚家族和拟南芥来体验阳性选择，但各种稻草和拟南芥的选择效果不同;因此，拟南芥的伴侣II亚家族亚家族患者比其他三个拟南芥亚组更高的阳性选择，而在水稻中的伴侣III亚组比其他亚属亚群具有更大的阳性选择。此外，考虑到LRT和贝叶斯经验贝叶斯（BEB）的后验概率计算，我们建议积极的选择影响了各种稻草在稻米和拟南芥中的每个伴侣亚家族的演变。

伴侣氨基酸位点的共同区分

蛋白质进化依赖于分子内的协同进化网络，其复杂性与位点之间潜在的功能和结构相互作用成正比[79.］．一个特定位点的共同进化网络越复杂，由于突变可能对其他共同进化的蛋白质区域产生戏剧性的影响，该位点的选择系数就越大。因此，检测位点之间的共同进化是补充分子选择分析并提供更生物学上真实结果的必要步骤。

我们鉴定了一组氨基酸，显示水稻和另一个拟南芥（附加文件）19）.如图1所示。6在拟南芥中，MATE共进化氨基酸有三个关键位点:34v、409Y和454w。这些站点相距很远，说明它们在功能上是相互依赖的。有趣的是，在氨基酸共同进化的水稻中的五个关键位点(图。73个位点(103Q、322R和328G)距离较近，其他位点(286G和425P)距离较近;因此，代偿性突变可能维持局部结构的稳定性，这也可能是功能共同进化的一个指标。

关键氨基酸位点的鉴定

我们在水稻和拟南芥中分别鉴定了18个和7个关键位点，这些位点分别与阳性选择以及i型和ii型功能分化有关。6和7）.这些网站位于相应的三维渗透液和蒸馏结构上。我们进行了多序列对准以进一步研究水稻和拟南芥蛋白质功能（图。8）.在鉴定的18个关键位点中，TM3(跨膜螺旋3)、L3-4 (TM3和TM4之间的连接点)和TM4各存在3个位点;L6-L7、L8-L9和TM10各有两个关键位点;TM8、TM11和TM12各有一个关键站点(图。7和8）.7个拟南芥关键位点中，TM1有2个位点，TM2、L6-7、TM7、TM11各有1个位点;c端也有一个位点。结果表明，这些关键氨基酸可能对MATE蛋白适应水稻和拟南芥的不同功能需求做出了重要贡献。

另外，在L3-4，TM11和水稻中的C末端中的每一个存在一个关键的辅助部位。在拟南芥中，L2-3，T7，T8，L8-9和T11每个都有一个关键的辅助部位。

这些分析表明，水稻中关键氨基酸位点的数量和位置与拟南芥不同。因此，功能差异、正向选择和共同进化可能在水稻和拟南芥不同区域的MATE基因蛋白中起作用。

水稻和拟南芥伴基因家族的比较基因组分析

在这项研究中，我们分别鉴定了来自水稻和拟南芥的45和56个伴侣基因。系统发育树分析（图。3.）表明，这些伴侣基因属于四个主要的亚属，群体I-IV。我们检查了这些基因中的内含子进化，因为这是基因组进化的一个重要特征，以及品种中的自适应过程。有趣的是，结果表明，在同一亚家族中，基因成员表现出类似的外显子系统结构和类似的内含子数，而在不同的亚组中，基因成员显示出显着不同的外显子系统结构。在漫长的进化期内内含子的损失或增益可能是基因结构变异的关键原因。此外，这些结果支持我们在水稻和拟南芥中的MATE基因亚壳分类。我们还得出结论，由于稻米和拟南芥中存在所有四个伴侣亚属亚属，因此在单子叶蛋白质分裂大约200 mya之前，它们必须形成。

串联复制可能是快速变化环境下适应性进化的一个重要过程，尽管参与应激反应的基因在串联复制后可能有很高的保留概率[80］．许多研究报道，来自MATE家族的转运蛋白在植物的代谢物运输中发挥着重要作用，并对作物品种的产量有关键影响[23，53.］．MATE转运体也介导细菌和动物的多药耐药性[81]调节许多药物用于治疗各种疾病的药物的功效[82- - - - - -85］．我们的研究揭示了串联重复事件在20％（45％）的水稻伴基因和35.7％（56％）的拟南芥伴基因中的参与，支持Hanada等人的研究结果。［80］．

水稻和拟南芥全基因组复制后片段复制基因的保留表明，大规模复制可能也参与了这两个物种的MATE基因家族的扩展。此外，这两个物种的MATE基因具有共同的扩展模式。串联复制和节段复制在水稻和拟南芥中发挥着相似的重要作用。有趣的是，由串联复制或节段复制事件衍生的成对基因属于同一亚家族，这表明它们在复制后没有发生进化差异。所有推测的MATE副同源基因对的估计起源日期为53.9 ~ 24.5 Mya(表1)1)，所有推测的串联复制基因可能都是在水稻和拟南芥形成后产生的。综上所述，我们的研究结果清楚地表明，这些复制的MATE基因在单子叶和双子叶之间的分裂发生时间晚于200年。

MATE蛋白表达分析

在水稻和拟南芥中，大多数MATE家族成员在不同的组织和器官中表达不同。4和5）.这些物种间的差异表明，不同的MATE基因可能在正常条件下组织和器官的发育中发挥特定的作用。例如，LOC_Os3g11734主要在根中表达，是铁通过铁-柠檬酸配合物向茎有效转运所必需的[26］．正常情况下，LOC_Os1g69010在不同组织中的表达水平很低[32］．然而，在这里产生的热线图中，该基因表达的相对水平在组织中变化。虽然与其他组织相比，在种子和根中发现了相对高水平的表达，但是表达绝对水平低。在没有Al的情况下，根系中的表达的表达水平非常低，但在短时间暴露于Al时会显着增加[32］．本报告与我们的研究一致，该基因在所有被测组织中均低表达。此前的一项研究表明，MATE基因AT3G59030参与类黄酮生物合成途径，并在胚珠和发育中的种子中特异性表达[16，这证实了我们的研究结果，即AT3G59030的最高转录水平发生在种子中。

yamasaki等。［54.报道AT4G39030特异定位于拟南芥叶绿体包膜，负责将水杨酸从叶绿体运输到表皮细胞的细胞质中。在此，我们发现该基因在下胚轴和衰老叶组织中优先表达。水杨酸是一种在植物免疫中起关键作用的激素，表明AT4G39030可能在植物下胚轴和衰老叶片组织中发挥重要作用。AT3G23560基因的表达是保护根免受抑制化合物侵害所必需的[15］．该基因与b -葡糖醛酸酶报告基因的转录和翻译融合表明，该基因在与外界环境直接接触的根表皮组织中表达强烈。然而，我们的转录本丰度谱显示，AT3G23560在干性种子中表达量最高，在根组织中表达量较低。因此，需要进一步的研究来确定这种MATE蛋白是否在干性种子中起重要作用。

由于MATE基因在水稻和拟南芥中的表达谱在不同组织和器官中存在差异，因此MATE基因的功能区域可能也存在差异。值得注意的是，我们的研究结果还表明，在两个物种的进化过程中，MATE复制基因的表达存在差异。

功能分化、正向选择和共同进化分析

不幸的是，所预测的功能已知的MATE蛋白的三维结构并不合适。因此，我们选择比较LOC_Os01g49120和At1g73700，因为它们具有高质量的预测蛋白质三维结构。在分析正向选择与功能分化的关系时，我们分别在水稻和拟南芥中鉴定出18个和7个关键氨基酸。这些关键部位被放置在三维MATE结构上(如图)。6和7)，并进行多序列比对，进一步研究其功能(图。8）.蛋白质序列NorM_NG，NorM_VC和NorM_VP已经关于结构和功能[先前研究86- - - - - -89];因此，我们将这些蛋白序列与两个MATE参考序列进行多序列比对，以研究两个物种的MATE家族。如图1所示。8，三个氨基酸中发现的氨基酸显示出与底物相互作用，以协调阳离子和8。lu等。［88]显示，向外的药物结合NorM-NG使用了E261和Y294(相当于LOC_Os01g49120)^E274和F309和AT1G73700^E263和W298)开始从细胞外侧装载Na +。随后，D377(等效于LOC_Os01g49120^D392和AT1G73700^D381)参与Na +协调，TM7和TM8接近TM10。NorM_VP^E251和D367和常态_vc.^E255和D371已被认为是Na +−配位残基，而这些位点是与NorM-NG^E261和D377［86，87，89］．具有氨基酸置换e273Q的突变的HMate1是在细菌Norm_ng蛋白中发现的E261的对应物[86］．所有这些结果表明，LOC_Os01g49120的残基^{E274, F309, D392}和AT1G73700^{E263、W298 D381}对阳离子的识别和结合至关重要。当将这些站点映射到相应的3-D MATE结构时(附加文件20.和21)，我们发现这些氨基酸侧链相互延伸，暗示这些关键氨基酸负责阳离子配位。此外，所有8个预计与底物相互作用的氨基酸都位于建议的中心底物结合腔周围，这表明这些氨基酸在底物运输方面的重要性。我们推断AT1G73700^F267与基质相互作用[86- - - - - -89］．有趣的是，我们还发现AT1G73700^F267氨基酸位点经历了功能分化和正向选择。这就是为什么MATE成员具有从细胞中挤出结构和化学上不同的药物的广泛能力的原因之一。

MATE蛋白的共同进化分析在两个物种中发现了一组受影响的氨基酸(附加文件19）.有趣的是，在LOC_Os01g49120共同进化位点(图。7)、103Q、322R和328G虽然在初级结构上距离较远，但均位于中央基底包围腔的基底附近。这表明，这些位点的代偿突变可能维持了空腔底部高度有序的蛋白质结构稳定性，空腔被细胞质屏蔽。然而，这3种关键的共同进化氨基酸在空间上距离286G和425P较远，表明LOC_Os01g49120中这5种共同进化氨基酸之间存在功能依赖关系。与该水稻蛋白相似，AT1G73700的三个共同进化的氨基酸在空间上彼此接近，这也可能导致了重要功能域之间的依赖性。通过积极选择和功能差异分析，发现一些关键氨基酸位点位于MATE蛋白中共同进化的氨基酸周围。这进一步强调了这些氨基酸对实现MATE蛋白生物学功能的重要性。

植物中的伴侣亚美胺可能起源

对于MATE III亚家族，虽然有研究者将这个亚家族分为两组或三组，但我们认为属于一个亚家族更合理。首先，基因结构分析显示，它们具有几乎相同的内含子-外显子结构(该亚家族11个成员中有10个有11 - 13个内含子)，与其他亚家族有明显不同。其次，系统发育树的最高bootstrap值表明MATE III亚家族成员具有极高的序列相似性。第三，除了以水杨酸为底物的At4g39030外，其他已知功能亚家族III成员均以柠檬酸为底物。因此，我们认为我们将MATE III的成员作为一个完整的亚家族是合理的。另外，根据附加文件6，我们可以知道亚家族III中的一些基因成员具有不同的亚细胞定位，表明在该亚家族中发生了功能性分歧。所有上述结果证明了MATE III亚家族成员的基因结构是保守的，但功能分歧可能导致这个亚家族成员功能多样化。

之前的系统发育分析将伴式运输家族分为三个亚属，细菌（家庭1），真核（家庭2）和细菌和古亚亚亚（家庭3）[12，90］．真核生物科2进一步分为酵母和真菌、植物、动物和原生动物4个亚群。有趣的是，本研究中MATE亚科I、II和IV的成员恰好属于植物特异性亚群2 (family 2 plants MATE)，而subfamily III成员则属于细菌/古菌科3 (family 3 plants MATE) [12，90］．这些结果可以通过Yamasaki等人提出的假设来解释。［54.]，推测3科植物MATE转运蛋白可能来源于细菌蛋白，可能是通过内共生基因转移。因此，我们推测在我们的研究中，MATE III亚家族可能与其他MATE亚家族有不同的起源。我们的功能分化分析表明，在水稻和拟南芥中，ii型分化仅存在于MATE III亚科中，这表明该亚科的位点特异性氨基酸理化性质与其他亚科不同。如附加文件所示8和9，在我们的分析中发现了一些II型功能分化的关键氨基酸，尽管我们没有在这两个物种的I、II和IV亚科中发现任何II型功能分化位点。因此，我们的研究结果进一步证明了植物中MATE III亚科可能与其他三个MATE亚科有不同的起源。

在这项研究中，我们确定了Monocot模型中的45％和56个伴侣基因奥雅萨苜蓿，还有双驱车模型拟南芥分别。我们的分析结果表明，两种串联和节段性重复都有助于在这些物种中扩张伴侣基因家族，并且两种物种中发生类似的膨胀过程。这两个物种中的所有推定重复基因都会透露单子叶二十榫分裂。此外，水稻和拟南芥中复制的伴侣基因的差异表达表明蛋白质功能可能已经分歧以满足特殊要求。分支站点模型表明，每个亚家族的成员在两个物种中经历了高阳性选择压力，导致亚家族特异性功能演进。II型功能发散的分析表明，当亚家族III与其他基团进行比较时，始终鉴定临界氨基酸，强烈表明，特异性特异性氨基酸生理学性质的变化可能因两种物种中的亚家族III特异性功能演进而受到归因于亚家族III特异性功能演进．共同进化分析表明，共用部位在维持水稻和拟南芥伴基因家族中蛋白质功能域的局部结构稳定性和功能方面可能具有重要作用。该研究的结果有助于改善对伴侣基因家族的复杂性的理解，并提供对这两种模型植物物种之间的功能和进化相似性和异化的见解。

MATE基因鉴定

56拟南芥MATE蛋白序列从Phytozome数据库下载(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)，并被用于对奥雅萨苜蓿序列(http://rapdb.dna.affrc.go.jp/)，使用BLASTP程序。选取E值≤1e-5的序列作为候选蛋白。简单模块化体系结构研究工具(SMART;http://smart.embl-heidelberg.de/smart/batch.pl）和pfam（http://pfam.xfam.org/)来验证每个预测的MATE蛋白序列。人工去除多余和部分基因。对于每个查询序列，从相应的数据库中收集基因组序列、全编码序列和蛋白质序列的信息。

序列分析、系统发育分析、外显子-内含子结构基序分析和启动子分析

使用MUSCLE程序将识别的MATE蛋白与默认参数进行比对。采用邻域连接法和MEGA6.0进行系统发育树的推断，并采用1000个bootstrap样本评估内部分支的可靠性。在线基因结构显示服务器(GSDS:http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)，利用编码序列(CDS)和基因组序列，探索外显子-内含子结构图。

约会重复事件

相应重复基因对的Ka和Ks直接从植物基因组重复数据库(http://chibba.agtec.uga.edu/duplication/) [68.］．重复基因对的锚点和平均Ks值的详细信息已在前面描述[91，92］．利用T = Ks/2λ的平均Ks值计算复制事件的近似日期[93，假设同义替换的时钟速率(λ)为6.5 × 10⁻⁹大米(66.]和1.5 × 10⁻⁸对拟南芥94］．

正选择试验

在位点模型和分支位点模型下，通过PAML中的“codeml”使用最大似然法确定阳性选择[76.- - - - - -78.］．根据前面描述的方法对MATE族和亚族进行两个模型分析[92］．

函数发散度估计

利用DIVERGE v3.0软件包预测了MATE基因亚家族之间的功能差异和氨基酸残基的重要性[72.- - - - - -74.，95，96，它根据进化速率(i型)或氨基酸性质(ii型)估计了两个平行序列出现后位点特异性转移的显著变化。关于估计函数发散度的详细资料已在前面作了描述[92］．

分析伴侣参数

使用蛋白质序列（盖子）的共区分分析进行鉴定氨基酸位点之间的共区[79.］．关于参数分析的详细信息已描述[97］．

提取微阵列数据

rice eFP浏览器(http://www.bar.utoronto.ca/efprice/cgi-bin/efpweb.cgi.)工具用于从水稻中搜索微阵列数据。我们还使用了来自GSE6893 (Rice Genome Annotation Project)实验的数据，该实验分析了水稻不同组织和生殖发育不同阶段的时空基因表达[98］．在幼叶、成熟叶、茎顶端分生组织、穗期P1 ~ P6、苗根和种子期S1 ~ S5的表达量。实验GSE6893也获得了拟南芥MATE基因在各种胁迫条件下的表达信息[98］．数据由MAS.5.0和RMA方法标准化。使用100的靶强度值，并且所有组织都一式三份取样。

拟南芥的微阵列数据是从Arabidopsis EFP浏览器获得的（http://bar.utoronto.ca/efp/cgi-bin/efpWeb.cgi）工具。数据源是开发地图[99］．检索表达值，并通过GCOS方法标准化数据，目标强度值100.将组织一式三份取样。从AtgenExpress非生物应激系列获得有关各种应激条件下拟南芥伴基因的信息的信息[100.］．使用基因图案程序生成热图（http://www.broadinstitute.org/cancer/software/genepattern/）.

ABC：

ATP绑定盒式磁带

易怒的：

拟南芥MATE蛋白

BEB：

贝叶斯经验贝叶斯

帽子:

使用蛋白质序列的共同进化分析

cd:

编码序列

监护系统:

复制退化互补模型

德牧:

基因结构显示服务器

Ks值:

同义基替代率

轻轨交通:

可能性比率测试

配偶:

多药和有毒化合物挤出

我:

最小进化

MFS:

主要代理总科

ML:

最大似然

肌肉：

多重序列比较的对数期望

米娅:

几百万年前

N-J:

Neighbor-joining

OsMATE:

水稻的MATE蛋白

PGDD:

植物基因组复制数据库

Qk:

后验概率

RND：

抵抗抗性划分

智能:

简单的模块化建筑研究工具

:阶梯短环到超级扁环

小型多药耐药转运体

茶:

四乙铵

TM：

透射扫掠

作者要感谢师范大学生命科学学院的万平博士，以善良地帮助生物信息学。

资金

国家自然科学基金资助项目(no . 30971783);北京市自然科学基金资助项目(no . 5132005)。关键词:边坡，边坡稳定性，边坡稳定性

可用性数据和材料

支持本文结果的数据集包含在本文及其附加文件中。

作者的贡献

LW进行了生物信息学分析并起草了手稿。YH设计了这项研究，并对整个研究提供了指导。XB和JG参与了研究，并帮助起草了手稿。YL和YY协调研究并对手稿进行阐述。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

相互竞争的利益

提交人声明他们没有竞争利益。

同意出版

不适用。

伦理批准和同意参与

不适用。

从属关系

1. 首都师范大学生命科学学院，北京100048

   王丽辉，贝秀娟，高建生，李亚轩，严跃明，胡英考

通讯作者

对应于Yingkao胡．

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