通过点击标记代谢结合的叠氮单糖对拟南芥根聚糖的直接成像gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

碳水化合物，也被称为聚糖，在植物的健康和发育中起着关键但尚未完全了解的作用。非模板驱动的聚糖的形成使得在体内用基因编码荧光标记和相关分子生物学方法对其成像成为不可能。解决这一问题的一个方法是使用定制的聚糖类似物，由植物代谢结合到其聚糖中。这些代谢结合的探针可以可视化，但迄今为止记录的技术使用有毒的铜催化标记。为了进一步扩大我们对植物糖生物学的认识，通过这种方法直接成像其糖聚糖，需要新的点击兼容的植物糖聚糖类似物，可以通过无铜技术进行生物正交标记。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

拟南芥幼苗与含叠氮的单糖类似物孵育gydF4y2BaNgydF4y2Ba乙酰氨基葡萄糖,gydF4y2BaNgydF4y2Ba-acetylgalactosamine,gydF4y2BalgydF4y2Ba的热点,gydF4y2BalgydF4y2Ba阿拉伯呋喃糖。这些叠氮单糖代谢结合到拟南芥幼苗的植物细胞壁聚糖中。对照实验表明，叠氮单糖类似物在植物细胞壁上通过主动代谢结合到糖聚糖中，而不是通过非特异性的糖聚糖类似物吸收。成功地进行了无铜标记反应，即一个逆电子需求的Diels-Alder环加成反应使用合并gydF4y2BaNgydF4y2Ba-乙酰氨基葡萄糖类似物，以及菌株促进的叠氮-炔咔嗒反应。在正常生长条件下，观察到所有评估的叠氮单糖类似物在所用浓度下是无毒的。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

我们对这些叠氮单糖类似物的代谢结合和荧光标记的结果扩大了通过直接成像研究植物聚糖的可能性。总的来说，我们成功地评估了5个叠氮单糖类似物在拟南芥根中的代谢结合能力和荧光标记后的成像。这扩大了植物中直接糖元成像的分子工具箱，从3个到8个糖元类似物，使未来对各种植物组织和物种中糖元的时空动态进行更广泛的研究成为可能。我们还首次在植物聚糖的代谢标记和成像中展示了两种无铜点击化学方法的潜力，这两种方法是生物正交的，并导致更均匀的标记。这些改进的标记方法可以推广和扩展到拟南芥中已经存在的和未来的点击化学激活的单糖类似物。gydF4y2Ba

所有的植物细胞都被一层被称为糖萼的碳水化合物(聚糖)所覆盖。包括微生物在内的其他细胞首先遇到的是糖萼。在超过50%的植物蛋白质上也发现了聚糖，作为一种重要的翻译后修饰，直接影响蛋白质的功能[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．因此，在植物发育的所有阶段，如细胞-细胞通讯等无数生物过程中，聚糖发挥重要作用就不足为奇了。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]，控制新陈代谢，生长，应激反应[gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba和外部信号，因此也与根际联系在一起[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．因此，聚糖在植物的健康和疾病中起着至关重要但尚未被充分理解的作用。开发技术更好地研究植物聚糖，增加我们对其作用的理解和控制是植物科学的重要下一步。gydF4y2Ba

由于聚糖的形成非模板驱动，因此不可能使用基因编码的蛋白质荧光标记来直接成像和研究聚糖。外部添加的基于蛋白质的探针，通常是荧光标记的凝集素，间接成像聚糖，并且只能成像暴露在细胞表面糖萼最外层的聚糖[gydF4y2Ba7 gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

然而，还有一种方法可以直接成像植物聚糖。聚糖，特别是在植物中，通常具有高度复杂和多样化的结构，包含单糖，如葡萄糖，gydF4y2BaNgydF4y2Ba乙酰氨基葡萄糖,半乳糖,gydF4y2BalgydF4y2Ba阿拉伯糖、木糖gydF4y2BalgydF4y2Ba-聚焦和3-脱氧-gydF4y2BadgydF4y2Ba-甘露-辛-2-超声酸[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．除了从头生物合成外，这些单糖及其衍生物还可被植物细胞循环利用[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．通过胞外单糖的摄取和复杂植物聚糖的胞内分解代谢，这些单糖可以通过聚糖拯救途径回收。通过这种循环途径，单糖再次进入植物细胞表面的聚糖及其糖蛋白[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．糖聚糖及其结合物是由高尔基体和内质网(ER)中的糖基转移酶生物合成的。糖萼和蛋白质中聚糖的组成和水平取决于这些酶及其激活的单糖供体底物的存在和水平[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

通过这些途径，单糖类似物与潜在成像标签的代谢结合将允许植物聚糖的直接成像(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．这些合并的单糖类似物可以通过标记进行可视化和研究，该标记可实现点击化学，这允许使用荧光报告分子对植物聚糖进行快速、特异性和多功能的共价标记[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．这项技术被称为代谢寡糖工程(MOE)，它已经被广泛应用于研究各种生物的糖生物学，但植物除外[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．事实上，直到2012年，Anderson等人首次报道了MOE与点击兼容的单糖类似物在植物中的应用，其中聚焦的植物聚糖被荧光成像gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba(Col-0)幼苗gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．最近还报道了另外两个click-compatible单糖类似物，即6-脱氧烷基酰基葡萄糖，合并在拟南芥根毛尖[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]， 8-叠氮-8-脱氧-KDO，一种类似于KDO的探针，存在于细胞壁果胶多糖鼠李糖半乳糖酸II中[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．为了进一步扩大我们对植物糖生物学的认识，直接成像的糖聚糖，需要点击化学兼容的类似物的其他植物单糖。此外，迄今为止文献记载的植物中click化学兼容的聚糖类似物是使用有毒的铜标记进行标记的，未来的应用将受益于生物正交无铜标记技术。gydF4y2Ba

我们研究了五种聚糖:gydF4y2BaNgydF4y2Ba乙酰-gydF4y2BadgydF4y2Ba葡萄糖胺,gydF4y2BalgydF4y2Ba——植物和gydF4y2Bal -gydF4y2Ba阿拉伯糖-已知都存在于拟南芥的糖萼中[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba),gydF4y2BaNgydF4y2Ba乙酰-gydF4y2BadgydF4y2Ba培养(GalNAc)和gydF4y2BaNgydF4y2Ba乙酰-gydF4y2BadgydF4y2Ba-mannosamine。虽然后两种聚糖尚不知道是否存在于植物聚糖中，但最近发现在拟南芥的ER中存在并运输UDP-GalNAc [gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]，表明GalNAc是由植物代谢的。在这篇技术进步的论文中，我们扩展了单糖模拟工具箱(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)用于拟南芥幼苗中糖的代谢标记。此外，目前在植物中报道的糖基类似物使用Cu(I)催化的环加成，然而，这对拟南芥是细胞毒性的[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]和土壤中的微生物[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba使得这种方法不太适合用活的植物做长期和更复杂的实验。因此，我们研究了拟南芥根系生物正交无铜点击反应的可能性。gydF4y2Ba

叠氮单糖在实验浓度下是无毒的gydF4y2Ba

为了确定当与我们的非天然含叠氮单糖类似物一起孵育时，拟南芥幼苗在正常生长条件下是否表现出不同的行为。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，评估它们的毒性。用单糖类似物对植物幼苗进行代谢标记的早期报道通过在MS板上测量8天龄幼苗的根长来评估毒性[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．该毒性评估将植物幼苗暴露在高水平叠氮单糖中数天，而代谢掺入实验则在较短的时间内(通常为4-24小时)以相同或较低浓度进行。因此，将幼苗暴露在不同代谢掺入实验中使用的浓度(10、25和100 μM)的叠氮单糖中8天。与生长在只有MS培养基的琼脂糖板上的幼苗相比，没有观察到显著差异(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．这说明叠氮单糖对拟南芥的生长和代谢过程没有显著影响。gydF4y2Ba

交流gydF4y2Ba_4gydF4y2BaGlcNAz,交流gydF4y2Ba_{3 gydF4y2Ba}ArabAz和交流gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba富卡兹结合在分化的根细胞壁中gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba

NgydF4y2Ba乙酰氨基葡萄糖通常存在于gydF4y2BaNgydF4y2Ba-植物细胞壁的聚糖[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba并且对…很重要gydF4y2BaN -gydF4y2Ba聚糖的形成，因为它是第一个附着在糖蛋白上的单糖[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．因此，研究了拟南芥细胞壁代谢点击介导的标记gydF4y2BaNgydF4y2Ba-乙酰氨基葡萄糖类似物含有可点击叠氮(AcgydF4y2Ba_4gydF4y2BaGlcNAz;无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．交流gydF4y2Ba_4gydF4y2BaGlcNAz是根据Bertozzi和同事的程序合成的[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．交流gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba将GlcNAz溶解在½MS培养基中，用于培养4天大的拟南芥(Col-0)幼苗。分别用10、25、50和100 μM Ac培养gydF4y2Ba_4gydF4y2BaGlcNAz和对照苗用0.01 % DMSO孵育。24小时后，清洗幼苗，然后转移到含有Alexa Fluor®488-炔和用于铜催化标记的Click-iT工具包溶液的溶液中45分钟。在标记和随后的洗涤步骤后，用共聚焦显微镜监测细胞壁的荧光强度。25 μM Ac孵育幼苗gydF4y2Ba_4gydF4y2BaGlcNAz的标记效果最佳。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba和额外的文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．在更高的浓度下可以增加标记，但不是必需的(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2BaB).对照苗(图5)。gydF4y2Ba3 egydF4y2Ba)用0.01% DMSO处理后，在这些条件下没有自动荧光背景信号，因此用25 μM进行Ac的进一步标记实验gydF4y2Ba_4gydF4y2BaGlcNAz。gydF4y2Ba

确定Ac的亚细胞定位gydF4y2Ba_4gydF4y2BaGlcNAz,交流gydF4y2Ba_4gydF4y2BaGlcNAz-labeled根(图。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)用碘化丙啶反染色(图。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba)(π)。这表明两种信号都有重叠。gydF4y2Ba3 dgydF4y2Ba)，表示Ac的位置gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba细胞壁内或细胞壁上的GlcNAz。在这些标记实验中，我们重点研究了过渡区，因为在这个区域观察到强烈的标记。在这个区域的正上方，可以观察到标记的下降，而分生组织区仅显示标记的轻微下降。gydF4y2Ba

受这些结果的鼓舞，我们决定研究糖类似物的合并和可视化gydF4y2BalgydF4y2Ba阿拉伯糖和gydF4y2BalgydF4y2Ba——热点。这两种单糖通常存在于植物的低聚糖中。更具体地说,gydF4y2BalgydF4y2Ba-arabinose -主要存在于拟南芥中gydF4y2BalgydF4y2Ba阿拉伯糖是最常见的一种gydF4y2BaO -gydF4y2Ba糖元糖是植物细胞壁多糖的重要组成部分[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．此外，一个烷基化的焦点类似物是第一个成功地在拟南芥细胞壁中代谢合并糖[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．因此，我们研究了叠氮类似物是否gydF4y2BalgydF4y2Ba——植物和gydF4y2BalgydF4y2Ba-阿拉伯糖可能被拟南芥幼苗根系代谢纳入糖聚糖。为此，我们合成了这些糖的两个相应的叠氮类似物;交流gydF4y2Ba_{3 gydF4y2Ba}ArabAz和交流gydF4y2Ba_4gydF4y2BaFucAz(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．交流gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba富卡兹是由商品化的6-氮齐酮乙酰化而成gydF4y2BalgydF4y2Ba-专注，而小说AcgydF4y2Ba_{3 gydF4y2Ba}ArabAz是根据5-azido-的改进工艺制备的gydF4y2BadgydF4y2Ba-阿拉伯糖斯梅利和同事[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．有两个叠氮单糖在手，这些化合物合并的可行性进行了研究。类似于AcgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba用不同浓度的Ac确定了GlcNAz的最佳掺入gydF4y2Ba_4gydF4y2BaFucAz(附加文件gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba)和交流gydF4y2Ba_{3 gydF4y2Ba}ArabAz(附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．明确纳入AcgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba在25 μM范围内观察到FucAz。gydF4y2Ba3 fgydF4y2Ba)，而AcgydF4y2Ba_{3 gydF4y2Ba}ArabAz在100 μM浓度下孵育后才被观察到。gydF4y2Ba3 ggydF4y2Ba)．这很可能是由于自然形成的相对较高的丰度gydF4y2BalgydF4y2Ba阿拉伯糖相比,gydF4y2BaNgydF4y2Ba乙酰氨基葡萄糖和gydF4y2BalgydF4y2Ba——热点。因此，浓度相对较高gydF4y2BalgydF4y2Ba-阿拉伯糖在Ac掺入过程中会发生竞争gydF4y2Ba_{3 gydF4y2Ba}这种探针的低浓度ArabAz。gydF4y2Ba

lgydF4y2Ba-阿拉伯糠酰基残基被纳入植物阿拉伯半乳聚糖的UDP-AragydF4y2BafgydF4y2Ba糖基转移酶。这种核苷酸糖供体被认为是完全由同一供体的热力学更稳定的吡喃基形式生物合成的;UDP-AragydF4y2BapgydF4y2Ba．然而，ArabAz不能转化为吡喃糖构型，这意味着相应的吡喃糖UDP-ArabAz不存在。这就提出了如何合并ArabAz的问题。Fincher和同事最近报道了大麦中的一种udp -阿拉伯糖变化酶(UAM)酶的催化性能，它可以催化多步可逆的UDP-AragydF4y2BapgydF4y2Ba→UDP-AragydF4y2BafgydF4y2Ba反应(gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．他们指出，这个反应的关键步骤可能包括从UDP-Ara中分离阿拉伯糖残基gydF4y2BapgydF4y2Ba，它允许吡喃基环的打开，呋喃糖环的形成，阿拉伯氨基呋喃基残基重新连接到UDP分子。类似的UDP-mutase酶(RGP)在其他植物中也有报道，包括拟南芥[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba］．因此，ArabAz可能被这些酶识别并转化为UDP-ArabAz，从而实现代谢结合。gydF4y2Ba

接下来，将三种叠氮单糖的结果与叠氮类似物进行比较gydF4y2BaNgydF4y2Ba乙酰-gydF4y2BadgydF4y2Ba-mannosamine;交流gydF4y2Ba_4gydF4y2BaManNAz(无花果。gydF4y2Ba3 hgydF4y2Ba和额外的文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．交流gydF4y2Ba_4gydF4y2BaManNAz与Ac相比只有一个手性中心不同gydF4y2Ba_4gydF4y2BaGlcNAz，而拟南芥多糖中含有相应单糖(ManNAc)的文献尚无证据。此外，没有证据表明甘露胺可以用作植物中其他糖衍生物生物合成的前体[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba］．事实上，拟南芥幼苗与AcgydF4y2Ba_4gydF4y2BaManNAz没有任何标签。这证实了AcgydF4y2Ba_4gydF4y2BaManNAz确实不存在于拟南芥细胞壁中，支持了上述AcgydF4y2Ba_4gydF4y2BaGlcNAz,交流gydF4y2Ba_4gydF4y2BaFucAz和交流gydF4y2Ba_{3 gydF4y2Ba}ArabAz的合并是由活性代谢介导的。gydF4y2Ba

叠氮单糖的结合具有时间依赖性，由被动转运或主动转运介导gydF4y2Ba

为了研究叠氮单糖的掺入是否需要积极的细胞代谢，将整株幼苗杀死并用4%的多聚甲醛固定。然后，这些固定的幼苗可以用来区分两种情况，一种是通过活性聚糖挽救途径合并[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]，或者另一种情况，叠氮单糖被被动吸收到外部细胞壁上。固定导致背景荧光稍强，但与Ac孵育的固定幼苗的强度gydF4y2Ba_4gydF4y2BaGlcNAz等于固定DMSO对照苗(附加文件gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．这表明AcgydF4y2Ba_4gydF4y2BaGlcNAz是通过植物细胞代谢而不是通过非特异性的叠氮单糖吸收到植物细胞壁而被积极吸收的。拟南芥中的炔单糖和另一种叠氮单糖也报道了类似的结果[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

其次，研究了拟南芥幼苗在25 μM Ac培养基中的最佳培养时间gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba测定GlcNAz(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba和额外的文件gydF4y2Ba7 gydF4y2Ba)．可见公司(无花果。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba)在25 μM Ac孵育4 h后观察gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba而在2 h后未观察到GlcNAz的掺入(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．孵育6和8小时后观察到最亮的荧光(图。gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BadgydF4y2Ba和额外的文件gydF4y2Ba7 gydF4y2Ba)．这支持了一种观点，即Ac的合并需要一个活性聚糖挽救途径gydF4y2Ba_4gydF4y2BaGlcNAz。在被动吸附的情况下，孵育2小时后就会出现弱荧光。荧光在孵育24小时后下降，这很可能是由于Ac的扩散gydF4y2Ba_4gydF4y2BaGlcNAz通过整个拟南芥根或与天然的竞争增加gydF4y2BaNgydF4y2Ba乙酰-gydF4y2BadgydF4y2Ba-由植物自身合成的葡萄糖胺。对Ac的时间依赖性掺入也进行了研究gydF4y2Ba_4gydF4y2BaFucAz和交流gydF4y2Ba_{3 gydF4y2Ba}ArabAz。与Ac相比gydF4y2Ba_4gydF4y2BaGlcNAz, AcgydF4y2Ba_4gydF4y2BaFucAz和交流gydF4y2Ba_{3 gydF4y2Ba}ArabAz在2小时后可见，但在24小时后观察到最佳合并(附加文件gydF4y2Ba8gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

一般认为，与极性更强的非乙酰化单糖探针相比，疏水性更强的乙酰化单糖探针最终通过被动摄取进入植物细胞[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．Roberts等人报告说，高等植物的根组织迅速吸收gydF4y2Bad -gydF4y2Ba葡萄糖胺从水溶液中提取，以纳入根组织[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba］．他们还观察到主动摄取gydF4y2BaNgydF4y2Ba乙酰-gydF4y2BadgydF4y2Ba-葡萄糖胺，虽然速度慢10倍，但通过相同的途径[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba］．因为这表明gydF4y2BaNgydF4y2Ba-乙酰氨基葡萄糖-没有任何羟基乙酰化-被拟南芥的根主动吸收，我们想知道对应的非乙酰化的GlcNAz是否也能像完全乙酰化的类似物Ac一样被吸收gydF4y2Ba_4gydF4y2BaGlcNAz。为此，拟南芥幼苗在25 μM Ac培养基中孵育24 hgydF4y2Ba_4gydF4y2BaGlcNAz或25 μM GlcNAzgydF4y2Ba5gydF4y2Ba而且gydF4y2BabgydF4y2Ba)．合并对Ac和Ac都是可见的gydF4y2Ba_4gydF4y2BaGlcNAz和GlcNAz的荧光强度几乎相似。这表明在24小时后这两种糖类似物的最大吸收。这也表明，由于GlcNAz的极性使通过被动运输的脂肪非极性细胞膜不太可能，它是通过细胞膜运输系统主动被吸收的。2小时后，非乙酰化的GlcNAz摄取和掺入已经可见。gydF4y2Ba5度gydF4y2Ba)，这与先前的观察结果一致[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]，尽管GlcNAz不能直接与gydF4y2BaN -gydF4y2Ba乙酰-gydF4y2BadgydF4y2Ba氨基葡萄糖。确定Ac的位置gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba在铜催化的咔嗒反应后，用碘化丙啶(PI)染色。观察到两个合并的单糖与PI的重叠，表明细胞壁标记(附加文件gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)，而Ac和Ac之间的标记模式无差异gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba观察到GlcNAz和GlcNAz。综上所述，这表明拟南芥具有主动吸收GlcNAz的能力，它可能是通过与Ac相同的途径被回收和整合的gydF4y2Ba_4gydF4y2BaGlcNAz。gydF4y2Ba

公司的交流gydF4y2Ba_4gydF4y2BaGalNAz表明GalNAc在体内代谢gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba

NgydF4y2Ba-乙酰半乳糖胺(GalNAc)没有文献记载存在于拟南芥多糖中[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]，而GalNAc则存在于其他几种高等植物中[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba),在gydF4y2BaN -gydF4y2Ba藻类聚糖[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba］．拟南芥中GalNAc的糖基化作用仅在该植物的基因工程植物细胞系统中有文献记载[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba］．然而，虽然尚不清楚GalNAc是否被整合到聚糖中，但有证据表明，拟南芥中有一种UDP-GlcNAc核苷酸基转移酶能够将GalNAc-1- p转化为相应的UDP-GalNAc [gydF4y2Ba40gydF4y2Ba］．此外，最近在拟南芥中发现了一种能够同时运输UDP-GlcNAc和UDP-GalNAc的转运蛋白[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．UDP-GalNAc转运体和GalNAc兼容转移酶的存在表明，GalNAc可能被拟南芥回收或代谢。出于这个原因，我们研究了这种糖基代谢是否可以用一种galnacc衍生的叠氮单糖进行研究，gydF4y2BaNgydF4y2Ba-azidoacetyl-galactosamine(交流gydF4y2Ba_4gydF4y2BaGalNAz)。交流gydF4y2Ba_4gydF4y2BaGalNAz是根据Bertozzi等人描述的程序制备的。[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]与拟南芥幼苗共孵育24 h，不同浓度(2.5 ~ 100 μM;额外的文件gydF4y2Ba11gydF4y2Ba)．Ac的并入信号gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba24 h后观察GalNAz(附加文件gydF4y2Ba11gydF4y2Ba)．然而，由于我们观察到与使用相同孵育时间的其他叠氮单糖相比，其荧光较低，所以孵育时间延长了。将孵育时间增加到48小时确实改善了掺入(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

这可能预示着Ac的打捞和合并gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba与已知存在于拟南芥多糖中的单糖类似物相比，GalNAz通过一个更长的途径发生。该途径可能包括一种转化的未知表观酶gydF4y2BaNgydF4y2Ba-乙酰半乳糖胺，或其衍生物gydF4y2BaNgydF4y2Ba乙酰氨基葡萄糖差向异构体。在大麦中发现了一种能可逆地相互转化UDP-GalNAc和UDP-GlcNAc的外异构酶，其同源物在拟南芥中存在[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba］．在25 μM Ac下最大掺入量gydF4y2Ba_4gydF4y2BaGalNAz在24小时内被观察到gydF4y2Ba11gydF4y2Bad)，而100 μM AcgydF4y2Ba_4gydF4y2BaGalNAz是必需的(图。gydF4y2Ba6 egydF4y2Ba48 h后所需的相对较高的浓度，与其他较长时间叠氮单糖孵育实验一致。gydF4y2Ba

无铜点击反应是标记拟南芥根聚糖的一种很好的方法gydF4y2Ba

迄今为止报道的使用单糖探针成像植物聚糖的研究的一个缺点是，它们都是使用铜催化的咔哒反应将荧光报告基团附加到代谢结合的聚糖上。催化这一反应所需的铜已知对拟南芥是有毒的，因此可能会影响使用它的标记和成像实验的结果。我们在铜催化咔嗒反应后的轻微不均匀标记中也确实观察到了这种副作用，它破坏了细胞壁，在少数情况下也造成了轻微的内部标记。Anderson及其同事也观察到了铜对拟南芥幼苗的毒性作用[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]，他们应用铜催化反应来标记炔单糖。为了避免使用铜离子，一种替代的无铜点击反应，开发了所谓的菌株促进的炔叠氮环加成(SPAAC)，它是生物正交的，可应用于活细胞[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba］．该方法尚未应用于拟南芥中的叠氮单糖模拟探针。这种反应对于生物应用来说仍然足够快，例如，当含有叠氮化合物的探针与脂肪族环辛(BCN)反应时[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba或二苯并环辛[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45gydF4y2Ba］．标签的azido-monosaccharidesgydF4y2Ba通过gydF4y2Ba与铜催化的咔嗒反应相比，SPAAC有一个优势，因为它不会损伤活细胞。然而，虽然之前报道的炔单糖不能利用SPAAC，但我们的叠氮单糖探针确实有可能通过这种咔哒反应被标记。为了研究利用spac对植物聚糖进行无铜标记的方法，将植物幼苗用Ac孵育后进行标记gydF4y2Ba_4gydF4y2BaGlcNAz (25 μM, 24 h)， AcgydF4y2Ba_4gydF4y2BaFucAz (25 μM, 24 h)， AcgydF4y2Ba_{3 gydF4y2Ba}ArabAz (100 μM, 24 h)或AcgydF4y2Ba_4gydF4y2BaGalNAz (25 μM, 24 h)与含有1 μM dbco - peg4 - ato -488的溶液在MS中作用1 h。gydF4y2Ba7一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BadgydF4y2Ba)．相比之下，用0.01% DMSO培养的幼苗只显示背景荧光(图1)。gydF4y2Ba7 egydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

Ac标记苗的比较gydF4y2Ba_4gydF4y2BaGlcNAz和交流gydF4y2Ba_{3 gydF4y2Ba}ArabAz与碘化丙啶标记的幼苗表现出极好的重叠，表明叠氮单糖合并在细胞壁聚糖中(图。gydF4y2Ba7小时gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BajgydF4y2Ba和额外的文件gydF4y2Ba12gydF4y2Ba)．没有peg间隔的更极性的dbco荧光团和bcn衍生的荧光团的实验都不成功，观察到广泛的非特异性吸收的荧光团(也作为胶束)到细胞壁。gydF4y2Ba

除SPAAC外，其他生物正交无铜点击反应也已知。四嗪与链烯烃/炔之间的逆电子需求Diels-Alder (invDA)反应作为一种快速的生物正交互补反应得到了广泛的关注[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba］．我们研究了这个反应是否也可以用于标记植物聚糖。结合在荧光报告基团上的四嗪通常用于标记，我们选择最小的四嗪反应伙伴，甲基环丙烯，作为一个化学把手gydF4y2BaNgydF4y2Ba乙酰氨基葡萄糖衍生物。已知的与甲基-环丙烯(GlcNCyc)的GlcNAc衍生物，通过Prescher [gydF4y2Ba47gydF4y2Ba和威特曼及其同事[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba］．GlcNCyc孵育24 h后，15 μM tetrazine - ato -488对拟南芥幼苗进行了荧光检测(图1)。gydF4y2Ba7 ggydF4y2Ba)，而DMSO对照没有显示明显的荧光(图。gydF4y2Ba7 fgydF4y2Ba)．此外，与本研究中使用的其他可点击染料相比，我们观察到Alexa®氟四嗪比炔和DBCO染料更不容易粘在细胞壁上，更容易溶于水。这样做的好处是荧光团可以在较高的浓度下使用。这些与SPAAC和invDA无铜点击反应的初步实验导致了更均匀的染色。此外，这些温和的标记反应不需要细胞毒性铜，这使得实验可以超越植物幼苗的快照图像。gydF4y2Ba

在本研究中，可点击的单糖类似物工具箱在拟南芥幼苗糖聚糖标记，允许合并和直接可视化5个相关的植物单糖类似物在复杂的细胞壁结合的糖聚糖。可点击的聚糖类似AcgydF4y2Ba_4gydF4y2BaGlcNAz,交流gydF4y2Ba_{3 gydF4y2Ba}ArabAz,交流gydF4y2Ba_4gydF4y2BaFucAz和交流gydF4y2Ba_4gydF4y2BaGalNAz在拟南芥幼苗根系中被代谢结合并可见。这部小说交流gydF4y2Ba_{3 gydF4y2Ba}ArabAz第一次允许直接成像gydF4y2BalgydF4y2Ba阿拉伯糖，最常见的植物之一gydF4y2BaO -gydF4y2Ba聚糖是植物细胞壁多糖的重要组成部分[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．Ac的加入gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba我们观察到的GalNAz支持在拟南芥中存在一种能将GalNAz转化为GlcNAz的外烯酶的可能性。在这篇稿件的准备过程中，陈和同事报告了代谢合并和成像gydF4y2BaNgydF4y2Ba拟南芥与Ac的-连接聚糖gydF4y2Ba_4gydF4y2BaGlcNAz [gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．我们在这里报道的叠氮单糖的结果与他们的工作一致，并提供了Ac的更多细节gydF4y2Ba_4gydF4y2BaGlcNAz代谢结合和通过糖链挽救途径成像。例如，我们展示AcgydF4y2Ba_4gydF4y2BaGlcNAz在4小时后已经被吸收，而且GlcNAz(非乙酰化)也可以在2小时内通过主动转运被回收。最后，早期关于单糖类似物(包括Ac)的代谢吸收和成像的报道gydF4y2Ba_4gydF4y2BaGlcNAz，完全依靠通过铜催化的点击化学标记。虽然铜催化的咔嗒反应通常很有效，但铜的毒性会导致细胞壁的损伤，这就强调了在长期或时空实验中需要无铜咔嗒类似物。我们在这里首次展示了由菌群促进的叠氮-炔环加成(SPAAC)和逆电子需求的Diels-Alder (invDA)点击反应可以改善我们的叠氮-单糖和环丙烯- glcnac衍生物的代谢标记成像。这些改进的无铜标记方法的应用可以推广和扩展到拟南芥中已经存在的和未来的点击化学激活的单糖类似物。考虑到SPAAC和invDA反应是生物正交的gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba相互正交，这将允许gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba以及双植物聚糖标记应用。总的来说，我们的研究结果和最近发表的其他研究[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]为代谢寡糖工程(MOE)方法学带来了光明的前景，使其能够直接对活植物中的复杂聚糖进行时空成像[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

的增长gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba

野生型gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba(Col-0)种子在商用漂白剂和乙醇(v/v;1/4)浸泡15分钟，然后用乙醇清洗(2次)，晾干。首先对所有灭菌的种子进行冷冲击，将它们放在冰箱(5°C)中至少2天，最多1周，同时在培养皿中滤纸上，预先用2ml milliq水湿润。种子在一半Murashige和Skoog培养基(MS)上生长[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba在架子上飞利浦36 W/840灯(120 μmol/m)照明的气候室里，用培养皿(0.8%植物琼脂)培养维生素gydF4y2Ba^2gydF4y2Bas)在22°C的长日条件下(光照16小时/黑暗8小时)。用4 ~ 5日龄的幼苗进行孵育试验。gydF4y2Ba

孵化的拟南芥gydF4y2Ba

将5株幼苗放在含有偶氮单糖的24孔板的单孔中，半MS孵育时间后，5孔中填充含0.05%吐温20的半MS培养基2ml。将植物浸在每个孔中15秒，以洗去多余的叠氮单糖。幼苗被直接转移到一个新的24孔板上，通过1)铜催化点击标记2)SPAAC标记或3)Diels alder-环加成标记进行标记。gydF4y2Ba

Copper-catalyzed click-labelinggydF4y2Ba

click - it细胞反应试剂盒(供应商:Invitrogen)用于所有铜催化的“click”反应。除反应时间延长至45 min外，其余均按Invitrogen公司手册中的步骤进行标记。对Alexa-fluor 488荧光团来说，0.1 μM的浓度为最佳。用含0.05% Tween 20的2 mL半MS溶液冲洗4×，去除多余的荧光团。连续洗涤时间依次为5、10、5和10分钟。洗涤后，幼苗在半MS(不包括Tween 20)内最多保存2 h，然后用共聚焦显微镜观察。gydF4y2Ba

SPAAC标签gydF4y2Ba

spac反应在2 mL的1 μM dbco - peg4 - ato -488半MS培养基中进行。反应时间为1小时。清洗和储存类似于上述铜催化咔嗒反应。洗涤时间延长至4 × 10 min。gydF4y2Ba

Diels-Alder环加gydF4y2Ba

反应在1 mL 15 μM的tetrazine - ato -488半MS培养基中进行。所有其他过程都类似于上述的SPAAC反应。gydF4y2Ba

用多聚甲醛固定幼苗gydF4y2Ba

作为阴性对照，幼苗固定在4%多聚甲醛溶液PBS(市售)。将5株幼苗放在2ml多聚甲醛溶液中孵育30分钟。随后，用2ml 0.5 MS冲洗幼苗两次，然后用前面讨论的点击相容叠氮单糖孵育。gydF4y2Ba

毒性试验gydF4y2Ba

毒性试验是根据植物的生长情况进行的。含有所述叠氮单糖类似物的琼脂平板用于幼体的生长实验gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba苗期8天。叠氮单糖在培养基杀菌后加入，当培养基冷却到大约60°C，然后将培养基倒入培养皿中。gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba幼苗随后在含有不同叠氮单糖溶液的琼脂平板上发芽和生长，琼脂浓度为0.8%，浓度为½MS。生长8天后，从叶片到根尖测量根的白色部分。gydF4y2Ba

显微镜和图像分析gydF4y2Ba

采用Leica TCS SP8共聚焦显微镜(488 nm激光激发，534-571发射滤光片和600-650发射滤光片为PI)，采用40倍水浸物镜对幼苗根系进行成像。图像J用于处理图像。同一实验中的所有图像都调整为相同的色彩平衡。在图像J (rsbweb.nih.gov/ij)中计算平均荧光，使用徒手工具选择表皮细胞的细胞边界，测量平均像素强度。标准偏差是根据整个幼苗细胞的荧光强度的差异确定的。每次处理从3-4株幼苗中收集这些细胞的数据，并使用相同的曝光设置进行成像。gydF4y2Ba

合成的一般资料和方法gydF4y2Ba

交流gydF4y2Ba_4gydF4y2BaGlcNAz,交流gydF4y2Ba_4gydF4y2BaGalNAz和GlcNCyc按文献程序制备[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．GlcNCyc是按照文献程序由Presher [gydF4y2Ba47gydF4y2Ba和威特曼等人。[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]，而该合成中的一个中间体的合成-环丙烷标签-已在附加文件中进行了改编和描述gydF4y2Ba13gydF4y2Ba．Ac的合成gydF4y2Ba_4gydF4y2BaFucAz,交流gydF4y2Ba_{3 gydF4y2Ba}ArabAz在附加文件中描述gydF4y2Ba13gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

交流gydF4y2Ba_{3 gydF4y2Ba}ArabAz:gydF4y2Ba

1、2、3三倍gydF4y2BaOgydF4y2Ba-acetyl-5-azido-5-deoxygydF4y2Ba-gydF4y2BalgydF4y2Ba阿拉伯呋喃糖gydF4y2Ba

交流gydF4y2Ba_4gydF4y2BaFucAz:gydF4y2Ba

1、2、3,4-tetra -gydF4y2BaOgydF4y2Ba-acetyl-6-azido -gydF4y2BalgydF4y2Ba-gydF4y2Ba植物种子gydF4y2Ba

交流gydF4y2Ba_4gydF4y2BaGalNAz:gydF4y2Ba

1、3、4,4-tetra -gydF4y2BaOgydF4y2Ba-acetyl-N-azidoacetyl -α,β-gydF4y2BadgydF4y2Ba培养gydF4y2Ba

交流gydF4y2Ba_4gydF4y2BaGlcNAz:gydF4y2Ba

1、3、4,4-tetra -gydF4y2BaOgydF4y2Ba-acetyl-N-azidoacetyl -α,β-gydF4y2BadgydF4y2Ba葡萄糖胺gydF4y2Ba

交流gydF4y2Ba_4gydF4y2BaManNAz:gydF4y2Ba

1、3、4,4-tetra -gydF4y2BaOgydF4y2Ba乙酰-gydF4y2BaNgydF4y2Ba-azidoacetyl -α,β-gydF4y2BadgydF4y2Ba-mannosaminegydF4y2Ba

DBCO:gydF4y2Ba

DibenzocyclooctynegydF4y2Ba

DMSO溶液:gydF4y2Ba

二甲亚砜gydF4y2Ba

GalNAc:gydF4y2Ba

NgydF4y2Ba乙酰-gydF4y2BadgydF4y2Ba培养gydF4y2Ba

GlcNAz:gydF4y2Ba

NgydF4y2Ba-azidoacetylglucosaminegydF4y2Ba

GlcNCyc:gydF4y2Ba

1、3、4,4-tetra -gydF4y2BaOgydF4y2Ba乙酰-gydF4y2BaNgydF4y2Ba-methylcyclopropene -α,β-gydF4y2BadgydF4y2Ba葡萄糖胺gydF4y2Ba

PI:gydF4y2Ba

Propidium碘化gydF4y2Ba

SPAAC:gydF4y2Ba

菌株促进叠氮-炔点击化学反应gydF4y2Ba

作者感谢Martijn Fiers在实验期间的支持和Martinus Schneijderberg, Olga Kulikova在实验期间的帮助。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

这项工作得到了荷兰科学研究基金会(NWO)通过ChemThem:化学生物学赠款(728.011.105)和VIDI赠款(723.014.005)的财政支持。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

构思并设计实验:JH、NB、RG、TW。进行了实验并编译了数据:NB, JH和DC。分析数据:JH、NB、RG、TW。撰写论文:JH, NB, RG, HZ, TW。所有作者已阅读并认可此手稿。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者声明他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

同意出版gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 荷兰瓦赫宁根大学有机化学实验室，斯蒂彭能4,6708 WE，瓦赫宁根gydF4y2Ba

   乔林·胡根布姆，Nathalja Berghuis, Han Zuilhof和Tom WennekesgydF4y2Ba

2. 荷兰乌得勒支大学乌得勒支制药科学研究所和Bijvoet生物分子研究中心化学生物与药物发现系gydF4y2Ba

   达里奥·克莱默和汤姆·温尼克斯gydF4y2Ba

3. 瓦赫宁根大学植物科学系分子生物学实验室，荷兰瓦赫宁根1,6708 PBgydF4y2Ba

   雷内·吉尔茨gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba汤姆WennekesgydF4y2Ba．gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文根据创作共用署名4.0国际许可协议发布(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba)，该协议允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是您适当地注明原作者和来源，提供创作共用许可的链接，并说明是否有更改。创作共用公共领域奉献放弃书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)除另有说明外，适用于本条提供的资料。gydF4y2Ba

再版和权限gydF4y2Ba