蛋白质组学分析揭示了与热疗相关的新型宿主分子机制GydF4y2Ba约GydF4y2Ba亚洲Liberibacter侵染的柑橘植株GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

柑橘黄龙兵（HLB），与细菌病原体相关联GydF4y2Ba约GydF4y2Ba亚洲Liberibacter’(Las)是柑桔属植物中最具破坏性的病害，由于所有栽培的柑桔品种都易感染该病害，因此通过育种或基因工程长期控制该病害的措施难以实施。然而，不同柑橘品种对Las的敏感程度各不相同，这促使人们努力在柑橘植物中识别潜在的Las抗性/耐受性相关基因，以用于育种或基因工程项目。研究表明，植物暴露于一种形式的胁迫会不经意地诱导对其他形式胁迫的固有抗性，最近的一项研究表明，连续的热处理(40至42°C)降低了柑橘幼苗的Las滴度和hlb相关症状。本研究的目的是应用比较蛋白质组学分析通过2-DE和质谱来阐明与热诱导缓解柑橘类植物HLB相关的分子过程。健康或感染las的柑橘柚子植株暴露于室温或40°C连续热处理6天。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

详尽的总蛋白提取过程有助于鉴定107个响应Las和/或热处理的差异表达蛋白，其中包括伴侣蛋白的强上调，包括小(23.6,18.5和17.9 kDa)热休克蛋白，hsp70样蛋白和核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶加氧酶(RuBisCO)结合60kda伴侣蛋白，特别是在热处理反应中。其他由于Las感染而普遍下调但在热处理反应中上调的蛋白包括RuBisCO激活酶、叶绿素a/b结合蛋白、葡萄糖苷酶II亚基样蛋白、推测的脂氧合酶蛋白、铁蛋白样蛋白和谷胱甘肽s -转移酶。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

本研究鉴定的差异表达蛋白突出了逆转las诱导的柑橘植物致病性过程的分子机制的主要特征，因此被建议用于开发顺基因抗/耐las柑橘植物。GydF4y2Ba

柑桔黄龙病(Citrus Huanglongbing, HLB)被认为是威胁全球柑桔生产的最具破坏性的病害[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba那GydF4y2Ba2GydF4y2Ba］．该疾病于19世纪70年代亚洲国家首次发现，现在在全球的许多柑橘种植地区普遍存在，包括U.S.A.，巴西，伊朗和沙特阿拉伯[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba］．在美国，自2005年发生HLB以来，佛罗里达州已经损失了超过35亿美元的收入[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba］．目前，这种疾病正在美国两个主要柑橘生产州加利福尼亚州和得克萨斯州逼近。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

虽然KOCH的假设尚未实现，但HLB在病程上与三种昆虫传播性挑剔，韧皮抑制的α-植物：'GydF4y2BaCandidatusGydF4y2BaLibibacter Asiaticus'（LAS），'GydF4y2Ba加利福尼亚州GydF4y2Ba．L. africanus ' (Laf)和'GydF4y2Ba加利福尼亚州GydF4y2Ba．L. americanus ' (Lam) [GydF4y2Ba2GydF4y2Ba］．在这三种Liberibacter物种中，Las具有最大的地理分布，是美国现存的物种[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba那GydF4y2Ba2GydF4y2Ba］．LAS由亚洲柑橘类氏植物自然传播GydF4y2BaDiaphorina citriGydF4y2BaKuwayama(半翅目:木虱科)[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba］．昆虫进食会同时将细菌传送至韧皮部[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba］．受感染的树木在感染后几年内会逐渐但不可逆地减少，种植者目前除了清除受感染的树木以防止传播给其他树木外，缺乏实际的办法来对付病原体[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba］．一种普遍的预防方法是使用杀虫剂，这必须多次应用一年来抑制腹股沟疟疾[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba］．然而，目前的HLB控制措施带来了沉重的财政负担，特别是对小规模种植者而言，再加上全球HLB发病率和严重程度的增加，强调了需要采取更有效的控制措施。GydF4y2Ba

热疗法用于治疗植物感染已有几十年的历史，早在1936年就有报告显示，使用干热和热水疗法可以消除由病毒感染引起的桃黄和其他褪绿病[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba］．热处理已被用于预防或治疗多种植物病害，包括宿根矮化引起甘蔗的疾病GydF4y2BaLeifsonia Xyli.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba10GydF4y2Ba]和柑橘速度疾病引起的GydF4y2Ba柑桔衰退GydF4y2Ba[GydF4y2Ba11GydF4y2Ba-GydF4y2Ba13GydF4y2Ba］．最近，霍夫曼等人。[GydF4y2Ba14GydF4y2Ba[综合热暴露于40至42℃的连续热暴露于2至7天的时间段显着降低了HLB影响的柑橘幼苗中的LAS滴度。此外，杨等人。[GydF4y2Ba15GydF4y2Ba[表明，柑橘植物中有效地应用抗微生物化合物和热疗（化学热疗法）减去HLB。然而，与化疗不同，与热处理介导的HLB抑制相关的分子机制是未解决的。GydF4y2Ba

几乎所有细菌都建议在其基因组中具有掺入的预言[GydF4y2Ba16GydF4y2Ba]，它是一个有两个原噬菌体在拉斯基因组中发现在感染周期[即可以成为裂解一致GydF4y2Ba17GydF4y2Ba］．热已显示诱导原噬菌体许多的裂解周期，包括GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba和GydF4y2Ba叶缘焦枯病菌GydF4y2Ba预言，导致细菌细胞的快速破坏[GydF4y2Ba18GydF4y2Ba那GydF4y2Ba19GydF4y2Ba］．因此，Hoffman等。[GydF4y2Ba14GydF4y2Ba提示热诱导Las噬菌体的溶解循环可能在热诱导清除hlb影响的柠檬植株Las的过程中起作用。然而，Wang等人[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba]表明，在烟草（GydF4y2Ba烟草GydF4y2Ba),GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba植物，过敏反应-和GydF4y2BaR.GydF4y2Ba- 基因介导的防御反应，GydF4y2Ba假单胞菌含油GydF4y2Ba和病毒诱导子在高温下破坏，允许增加病原体生长。这表明在植物热引起的细菌性病原体抗性，如柑橘，拉斯维加斯的相互作用观察到，可能是比以前思想和其他热诱导工艺中，除了原噬菌体周期更加复杂，可能与此有关。GydF4y2Ba

来自现场、实验室和分子研究的越来越多的证据表明，非生物胁迫(如高温)的存在，可以降低或增强对生物害虫或病原体的敏感性，而不是添加性[GydF4y2Ba21.GydF4y2Ba］．例如，在玉米中，耐旱育种项目偶然培育出了能抵抗寄生杂草的植物GydF4y2BaStriga hermonthicaGydF4y2Ba[GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba23.GydF4y2Ba］．在小麦(GydF4y2Ba小麦GydF4y2Ba)，在6年的实验期间观察到较高的平均温度与对真菌敏感性的增加相关GydF4y2BaCochliobolus sativusGydF4y2Ba[GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

长期防治HLB，不可避免地依赖于通过育种和基因工程开发抗病或耐旱柑橘品种。不幸的是，这一过程受到了阻碍，因为所有已知的柑橘品种都对HLB敏感，而且还没有现成的抗病基因或抗病来源被鉴定出来。然而，不同柑橘品种对HLB敏感性的差异，特别是柠檬植物对Las的高耐受性[GydF4y2Ba25.GydF4y2Ba[建议在柑橘植物中存在潜在的先天HLB抗性和/或耐受相关机制。此外，在热处理后，在HLB受影响的柑橘植物中观察到的病原相关症状的全部恢复[GydF4y2Ba14GydF4y2Ba，并不是所有受细菌感染的植物[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba]，表明热暴露可诱导新颖宿主防御相关的机制，抑制病原体生长[GydF4y2Ba21.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

因此，尽管在苗圃和温室环境中证明了热疗在控制HLB方面是有效的，但目前热疗对野外树木并不实用[GydF4y2Ba14GydF4y2Ba］．因此，假设将热疗法施加到现场植物的可行方式涉及鉴定与热诱导的HLB缓解相关的潜在分子机制/条件的第一步，这将导致植物的下游发育，这些植物可以模仿那些该领域的进程。GydF4y2Ba

另外，由于培养缺乏已知的LAS抗性基因GydF4y2Ba柑橘类GydF4y2Ba属，多数作物发展的研究工作一直旨在产生转基因拉斯维加斯耐柑橘属植物。例如，通过将天然存在的菠菜防卫素基因引入柑橘属植物，Mirkov。和Gonzalez-拉莫斯据说发育的转基因柑橘属植物是完全或高度耐HLB [多个拷贝GydF4y2Ba26.GydF4y2Ba］．虽然转基因和Cisenesis都涉及类似的高度争议的遗传修饰技术，但CISGENACASES对消费者可接受性更好地承诺，因为它涉及从植物或密切相关引入基因，并且这些基因也可以通过传统育种技术转移[GydF4y2Ba27.GydF4y2Ba］．因此，本研究的目的是采用蛋白质组学方法来阐明参与拉斯维加斯感染的柑橘植物在受热响应全球分子机制。本研究涉及构成应用蛋白质组学方法来阐明在柑橘植物热诱导拉斯维加斯抗性相关的全球分子机制的第一份报告。据预计，从目前的研究产生的信息将有助于同源转基因拉斯维加斯抗性或耐受性柑橘属植物的发展。GydF4y2Ba

热诱导的LAS滴度减少GydF4y2Ba

在使用常规的PCR植物叶子拉斯存在的初步屏幕产生LAS-阳性条带在GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba热植物和GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba热植物但不在GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba热或GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba加热植物证实拉斯只存在于受感染的植物中通过进一步分析中存在比较热处理对Las效价的影响在受感染的植物组织中有显著提高的平均Ct值Las感染植物组织在热处理时从23.53 0 h 144 h(图27.86的时间。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.这些结果与Hoffman等人的结果一致[GydF4y2Ba14GydF4y2BaYang等人[GydF4y2Ba15GydF4y2Ba，表明热疗可降低受hlb影响的柑橘植株的Las滴度。GydF4y2Ba

Las感染和热处理均对柑橘叶蛋白质组学产生显着影响GydF4y2Ba

本研究中使用的详尽的总蛋白质提取方法（参见方法部分）产生了超过20mgg的平均蛋白质产率GydF4y2Ba^-1GydF4y2Ba来自柑橘葡萄柚叶，无论las还是热处理（表GydF4y2Ba1GydF4y2Ba)，高于约13 mg g的平均蛋白质产量GydF4y2Ba^-1GydF4y2Ba来自柑橘葡萄柚的叶子在我们之前的研究中[GydF4y2Ba28.GydF4y2Ba］．该结果证实在目前的研究中使用的总蛋白提取方法的功效。另外，使用PDQUEST凝胶图像分析软件，检测斑点的平均数目为超过1250在本研究中（表GydF4y2Ba1GydF4y2Ba)，相比之下，我们之前的研究不到800例[GydF4y2Ba28.GydF4y2Ba］．因此，与我们之前的研究相比，本研究中观察到的更高的蛋白质产量和更高的蛋白质覆盖率是令人鼓舞的，并建议进行更详尽的比较蛋白质组学分析。然而,重要的是要注意,生理因素,包括植物的年龄和发展阶段可能发挥作用在观察到的差异蛋白质产量/覆盖我们目前与早期研究柑橘叶和进一步实验预期充分验证我们增强总蛋白提取方法。GydF4y2Ba

尽管如此，高分辨率的总蛋白分离在一个4 - 7pGydF4y2Ba一世GydF4y2Ba从柑橘柚子植株叶片总蛋白的2-DE凝胶中观察到了10-150 kDa的分子质量。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba）.质谱分析确定了188个蛋白点中的183个在柑橘葡萄柚叶中对Las感染和/或热处理反应的差异表达。多个蛋白质点与同一蛋白质匹配，这可能是由于多种因素，包括多聚体/蛋白质异构体、成熟状态的差异、降解和/或翻译后修饰[GydF4y2Ba29.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba］．因此，基于相同的蛋白质匹配和凝胶上的斑点的接近度，183个识别斑点归纳为130个蛋白质斑点（图GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba)，总结的130个蛋白点经ms生成的匹配肽序列见附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

根据其表达模式、序列同源性和功能相似性，将差异表达的蛋白点与107个独特的蛋白进行匹配，并将其分为8个功能组，即:除了参与光合作用、调节、淀粉代谢、能量生产和一般代谢的蛋白质外，还有与病原体反应和氧化还原稳态相关的蛋白质。GydF4y2Ba4AGydF4y2Ba）.伴侣相关蛋白（例如热休克蛋白）的蛋白质构成的最大官能团，占在该研究中（图中确定的所有差异表达的蛋白质的25％以上。GydF4y2Ba4AGydF4y2Ba）.另外，约7.5％的差异表达蛋白质与未表达蛋白质或蛋白质匹配的差异且具有尚不确定的函数（图。GydF4y2Ba4AGydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

在107个差异表达蛋白中，54个蛋白的体积发生了显著变化(31个上调，23个下调)GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba供热厂相比，GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba加热的植物，表现出单独的Las治疗对蛋白质表达的影响。单独热处理对蛋白质表达的影响通过在74种9蛋白质是突出向上和向下调节的，分别在GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba供热厂相比，GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba热植物(图。GydF4y2Ba4B.GydF4y2Ba）.93个蛋白质改变的体积（83上调和10下调）在GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba供热厂相比，GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba加热植物，表示Las感染和热处理对柑橘葡萄柚植株的联合效应(图。GydF4y2Ba4B.GydF4y2Ba）.进一步的比较显示出84个蛋白质的上调，但下调11个蛋白质GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba供热厂相比，GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba热的植物，而34种19蛋白是上调和下调的，分别在GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba供热厂相比，GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba热植物(图。GydF4y2Ba4B.GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

伴侣显示在柑橘类植物拉斯维加斯大热诱导反应GydF4y2Ba

伴侣蛋白构成了本研究中发现的最大的差异表达蛋白功能组(图。GydF4y2Ba4AGydF4y2Ba）.在GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba供热厂相比，GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba热植物中，11个差异表达伴侣相关蛋白中有6个(55%)表达下调，其中包括小的(23.6、18.5和17.9 kDa)热休克蛋白、一个hsp70样蛋白和一个核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶加氧酶(RuBisCO)结合60kda伴侣蛋白。GydF4y2Ba5AGydF4y2Ba）.然而,在GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba供热厂相比，GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba在热植物中，25个差异表达的伴侣相关蛋白中有24个(96%)表达上调。GydF4y2Ba5AGydF4y2Ba）.随后,在GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba供热厂相比，GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba热的植物，有20分子伴侣相关蛋白质的上调，其中包括一个20kDa的伴侣蛋白样蛋白，小（23.6，18.5和17.9 kDa）的热休克蛋白，一个HSP70样蛋白质，HSP90蛋白，伴侣蛋白GroEL的和的RuBisCO结合60kDa的伴侣蛋白（图GydF4y2Ba5AGydF4y2Ba）.然而,在GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba供热厂相比，GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba热植物中，包括hsp20样伴侣蛋白和蛋白二硫异构酶在内的四种伴侣蛋白的表达无显著差异(图2)。GydF4y2Ba5AGydF4y2Ba）.这表明20个差异表达的伴侣相关的蛋白质GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba供热厂相比，GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba热植物，可能在柑橘类植物对拉斯的热介导抗性中发挥作用。GydF4y2Ba

分子伴侣是参与蛋白质折叠应激反应蛋白，重折叠，装配，重新组装，降解和易位[GydF4y2Ba31.GydF4y2Ba-GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba］．我们的A组之前的研究表明，拉斯维加斯感染引起伴侣相关蛋白在植物柚广泛下调[GydF4y2Ba28.GydF4y2Ba］．柑橘tristeza病毒(CTV)表现出与Las相似的病理系统，Laino等人的蛋白质组学研究[GydF4y2Ba35.GydF4y2Ba表明耐受性强的柑橘类植物普遍过度激活rubisco结合蛋白、伴侣蛋白和其他活性氧清除酶的磷酸化。因此，观察到大多数伴侣相关蛋白的差异表达并不奇怪GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba供热厂相比，GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba热植物被抑制（图。GydF4y2Ba5AGydF4y2Ba）.另一方面，伴侣通常与植物的胁迫反应有关，通常在热胁迫下上调[GydF4y2Ba36.GydF4y2Ba，这与单独热处理导致伴侣相关蛋白普遍上调的观察结果一致(图。GydF4y2Ba5AGydF4y2Ba）.有趣的是，相比于GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba热植物中，6个伴侣相关蛋白，包括小(23.6,18.5和17.9 kDa)热休克蛋白，一个hsp70样蛋白和一个rubisco结合的60 kDa伴侣蛋白，均下调GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba在供热厂，成为上调GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba供热厂和/或GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba热的植物。因此，蛋白质组学结果表明，这6个伴侣相关蛋白可能在柑橘植物对Las的热诱导反应中发挥重要作用。GydF4y2Ba

致病相关蛋白积极参与热诱导的HLB缓解GydF4y2Ba

在GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba供热厂相比，GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba八种差异表达病原体反应相关蛋白质中的热植物，87.5％或7个，包括酸性I丁质酶，凝集素相关的前体，病因相关的PR-4a蛋白和Kunitz型蛋白酶抑制剂，上调（图。GydF4y2Ba5B.GydF4y2Ba）.相比之下，单独热处理(即在GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba供热厂相比，GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba导致57%或7个差异表达的病原体反应相关蛋白中的4个下调(图。GydF4y2Ba5B.GydF4y2Ba）.然而,在GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba供热厂相比，GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba热植物，三种蛋白质，包括凝集素相关的前体，CLP蛋白酶ATP结合亚基和米科素样蛋白1被上调（图。GydF4y2Ba5B.GydF4y2Ba）.这表明在拉斯维加斯一个潜在的积极作用这三个蛋白抑制,因为其他七个pathogen-response相关蛋白质,包括酸性类几丁质酶,半胱氨酸proteinase-like蛋白,一个aspartatic proteinase-like蛋白质,一个pathogenesis-related PR-4A蛋白质和通用stress-protein,哪些表达有差异GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba供热厂相比，GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba加热植物和在GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba供热厂相比，GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba热植物中，没有差异表达GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba供热厂相比，GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba热植物(图。GydF4y2Ba5B.GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

典型病原体反应相关蛋白，包括致病相关(PR)蛋白[GydF4y2Ba37.GydF4y2Ba),几丁质酶(GydF4y2Ba38.GydF4y2Ba，类凝集素蛋白质[GydF4y2Ba39.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba40GydF4y2Ba，类奇迹蛋白[GydF4y2Ba41.GydF4y2Ba、蛋白酶和蛋白酶抑制剂[GydF4y2Ba42.GydF4y2Ba-GydF4y2Ba44.GydF4y2Ba是防御相关的蛋白质，通常由植物诱导以抵抗病原体的攻击。目前,PR蛋白分为17个独立的家庭,PR-1 17, PR-4家庭由类I和II类几丁质酶,不同的存在(一级)或缺失(二类)守恒的氨基端cystein-rich域对应hevein蛋白质、少量抗真菌蛋白首先从橡胶树分离(GydF4y2Ba橡胶树取代巴西橡胶树GydF4y2Ba)乳胶GydF4y2Ba45.GydF4y2Ba］．与凝集素样蛋白在结构上和进化上相关的凝集素样蛋白[GydF4y2Ba46.GydF4y2Ba]，参与血管组织分化[GydF4y2Ba47.GydF4y2Ba]，还可通过堵塞韧皮部筛板来起到抗病原体作用，防止病原体的全身传播[GydF4y2Ba40GydF4y2Ba］．Kim等人。[GydF4y2Ba48.GydF4y2Ba]和achor等。[GydF4y2Ba49.GydF4y2Ba表明，在筛板处聚集的一种类凝集素蛋白与受hlb影响的柑橘植株中易位流的堵塞有关。此外，研究表明，凝集素样蛋白与RNA分子相互作用，并参与长距离运输，提示这些蛋白在受hlb影响的柑橘植物的长距离信号响应中发挥作用[GydF4y2Ba39.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba50.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

Miraculin是一种植物蛋白，可以将酸性味道改性味道味，并抵消果实中的酸性味道[GydF4y2Ba51.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba52.GydF4y2Ba］．虽然在果实中特征上表达，但在非果肉组织中的麦芽糖素样蛋白（即茎，叶或根）诱导与害虫或病原体攻击强烈有关，表明他们对防御的参与[GydF4y2Ba42.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba53.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba54.GydF4y2Ba］．Tsukuda等人。[GydF4y2Ba41.GydF4y2Ba]第一特征不同的奇果状粗柠檬蛋白2（GydF4y2Ba柑橘jambhiriGydF4y2BaRlemMLP1(奇迹素样蛋白1)和RlemMLP2(奇迹素样蛋白2)，并通过微生物攻击诱导了RlemMLP1和/或RlemMLP2。GydF4y2Ba

氧化还原稳态相关蛋白参与诱导热处理对HLB的抑制作用GydF4y2Ba

氧化还原稳态相关蛋白参与了由活性氧(ROS)诱导的氧化应激的预防。ROS是光合作用和呼吸等代谢过程中电子传递和氧化还原反应的副产物。更重要的是，在生物或非生物胁迫条件下，活性氧的产生已被证明显著增加[GydF4y2Ba55.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba56.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

在GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba供热厂相比，GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba热植物，六种差异表达的氧化还原稳态相关蛋白质中有三种调节，包括推定的细胞色素C氧化酶，Zeaxanthin环氧酶样蛋白和过氧化嗪2b样蛋白质（图。GydF4y2Ba5B.GydF4y2Ba）.另一方面，在GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba供热厂相比，GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba在热植物中，所有7个鉴别出的氧化还原稳态相关蛋白均上调表达，包括一个推定的细胞色素C氧化酶、玉米黄质环氧化酶样蛋白和一个过氧化物还原蛋白2b样蛋白，这些蛋白最初在单独的Las感染存在时下调(图)。GydF4y2Ba5B.GydF4y2Ba）.此外，2-半胱氨酸过氧还蛋白和铁氧还蛋白I家族蛋白在细胞中无差异表达GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba供热厂相比，GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba热的植物，被认为是上调的热存在下（即GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba供热厂相比，GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba加热植物)或GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba供热厂相比，GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba热植物(图。GydF4y2Ba5B.GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

虽然还没有建立起来像过氧化物酶，过氧化物酶，细胞色素C氧化，在柑橘属植物玉米黄质环氧和过氧化氢酶的HLB开发氧化还原平衡相关的蛋白质的作用，Monavarfeshani等。[GydF4y2Ba57.GydF4y2Ba]的蛋白二硫异构酶、谷胱甘肽还原酶和Cu/Zn超氧化物歧化酶(SOD)的表达增加GydF4y2BaCandidatusGydF4y2Ba植物浮肿Aurantifolia。此外，Doria等人。[GydF4y2Ba58.GydF4y2Ba[鉴定CTV感染甜橙植物中的SOD，过氧化氢酶和过氧化物酶的上调。抗坏血酸过氧化物酶和过洛昔嗪的差异表达先前已与柑橘葡萄柚植物对LAS感染的反应相关联[GydF4y2Ba28.GydF4y2Ba]以及响应GydF4y2Ba柑橘sinensis.GydF4y2Ba植物GydF4y2Ba黄axonopodisGydF4y2Bapv。Citri和非宿主病原体GydF4y2Ba黄oryzaeGydF4y2Bapv。Oryzae [GydF4y2Ba59.GydF4y2Ba］．拟南芥AtCOX17-1基因的沉默降低了植物对不同胁迫条件的响应相关基因的表达，包括一些由线粒体功能障碍诱导的基因[GydF4y2Ba60.GydF4y2Ba］．玉米黄质环氧化酶催化类胡萝卜素玉米黄质到紫黄质的相互转化[GydF4y2Ba61.GydF4y2Ba］．gholampour等。[GydF4y2Ba62.GydF4y2Ba，表明玉米黄质环氧化酶基因转录本在感染Las的葡萄柚HLB晚期表达上调，并提出玉米黄质环氧化酶的上调是一种光合反应，以保护葡萄柚光合系统免受Las的侵害。GydF4y2Ba

总之，这些结果表明氧化还原相关蛋白质的作用，并突出了该类中的关键活性蛋白，可能参与诱导热处理对HLB的抑制作用。GydF4y2Ba

光合作用/公司GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba经热处理或不热处理拉斯改变的同化相关蛋白GydF4y2Ba

仅存在拉斯感染(即GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba供热厂相比，GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba散热植物），下调包括Rubisco Actioase，PS2氧化增强剂蛋白和Rubisco大亚基蛋白的所有五种差异表达的光合作用蛋白质（图。GydF4y2Ba5B.GydF4y2Ba）.然而，在单独的热处理的存在（即，在GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba供热厂相比，GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba加热植物，其中三种差异表达的光合作用蛋白中的两种包括Rubisco活性酶和叶绿素A / B结合蛋白的蛋白质上调（图。GydF4y2Ba5B.GydF4y2Ba）.在这7光合作用相关的差异表达的蛋白质，虽然有在RUBISCO的表达没有差异ACTIVASE和PS2放氧在增强蛋白GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba供热厂相比，GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba在热植物中，一个含有PsbP结构域的蛋白和一个叶绿素a/b结合蛋白被上调GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba供热厂相比，GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba热植物(图。GydF4y2Ba5B.GydF4y2Ba）.这表明含PSBP域的蛋白质和叶绿素A / B结合蛋白在柑橘植物中HLB的热介导减轻的活性作用。GydF4y2Ba

叶绿素a/b结合蛋白构成光收集复合蛋白的一部分[GydF4y2Ba63.GydF4y2Ba]和含PSBP域的蛋白质被发现是用于光系统必要我组件GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba[GydF4y2Ba64.GydF4y2Ba］．虽然含PsbP结构域蛋白或叶绿素a/b结合蛋白在热介导的HLB缓解中的作用尚不清楚，但叶绿素a/b结合蛋白的转录本在HLB中被上调GydF4y2Ba柑橘auratifoliaGydF4y2Ba植物对CTV感染的反应[GydF4y2Ba65.GydF4y2Ba]，暗示叶绿素A / B结合蛋白在减轻韧皮抑制病原体引起的疾病中的潜在作用。GydF4y2Ba

在热诱导的HLB缓解过程中，调节相关蛋白通常上调GydF4y2Ba

与调节相关蛋白质，例如20S蛋白酶体和核糖核酸酶样蛋白调节剂，与/ / /或热处理相比，通常是上调的GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba热植物(图。GydF4y2Ba6GydF4y2Ba）.随后，一个40S核糖体蛋白、60S核糖体蛋白、DEAD-box RNA解旋酶样蛋白、26S蛋白酶调节亚单位样蛋白、Tu延伸因子上调GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba供热厂相比，GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba热植物(图。GydF4y2Ba6GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

蛋白酶体是多亚基和多催化剂，作为基因表达调节剂，通过泛素依赖或泛素不依赖的蛋白水解途径负责大多数细胞质和核蛋白的降解。莱诺等人[GydF4y2Ba35.GydF4y2Ba]鉴定了一个蛋白酶体亚基α型蛋白，该蛋白在CTV侵染后对CTV敏感的酸橙砧木嫁接Taracco植株后表达上调，而在对CTV敏感的Carrizo citrange砧木嫁接Taracco植株后未观察到类似的反应。此外，一种蛋白酶体亚基α型蛋白在抗氧化活性高于野生型植物的甜橙突变体中被上调[GydF4y2Ba66.GydF4y2Ba］．综上所述，这表明蛋白酶体可能在诱导植物-微生物不亲和过程中发挥作用，并在热处理下抑制柑橘组织Las滴度。GydF4y2Ba

淀粉新陈代谢GydF4y2Ba

在Las侵染过程中，植物组织中淀粉的积累已被充分证明[GydF4y2Ba67.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba68.GydF4y2Ba］．Nwugo等。[GydF4y2Ba69.GydF4y2Ba强调了光合作用和淀粉合成代谢过程之间的反向关系，即las介导的淀粉积累通过负反馈效应抑制光合机制。因此，与之前的研究结果一致，本研究表明，无论热暴露与否，las感染植物的颗粒结合淀粉合酶都在上调(图。GydF4y2Ba6GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

然而，在热处理存在的情况下，葡萄糖苷酶II β亚基样蛋白上调(图。GydF4y2Ba6GydF4y2Ba)，这是值得注意的，因为葡萄糖苷酶通常与淀粉分解代谢有关，但此前已涉及赋予植物抗病能力。Cherif等[GydF4y2Ba70GydF4y2Ba]表明，在黄瓜根增加β-葡糖苷酶活用硅诱导的抗性相关联GydF4y2Ba蟒蛇GydF4y2Ba另一项研究表明，大豆β -糖苷酶与GydF4y2Ba莲花japonicus.GydF4y2Ba防御基因，羟胞嘧啶葡萄糖苷酶，抑制了线虫的寄生活性GydF4y2BaMeloidogyne incognita.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba71GydF4y2Ba］．此外，米凯等。[GydF4y2Ba72GydF4y2Ba]在暴露鉴定推定的内切-1,3-β-d葡糖苷酶，如稻植物的根的茉莉酮酸酯诱导的防御响应蛋白质的一部分的内生菌GydF4y2BaAzoarcusGydF4y2BaBH72 sp。压力。GydF4y2Ba

因此，在热处理厂葡萄糖苷酶的上调相比，非热处理厂可能在负责拉斯维加斯发病柑橘植物进程的逆转热介导分子机制的作用，为基因工程提供了一个潜在可行的目标HLB阻力在柑橘属植物。GydF4y2Ba

能源生产相关蛋白热介导的HLB电阻期间通常上调GydF4y2Ba

蛋白质的生产是一个能量密集型的过程。因此，考虑到由于热处理导致表达水平上调的大量独特蛋白(图。GydF4y2Ba4B.GydF4y2Ba），它是不奇怪的热处理，有几个能源生产相关蛋白质，包括一个磷酸甘油酸激酶蛋白，苹果酸脱氢酶和乌头铁调节蛋白普遍上调（图下。GydF4y2Ba6GydF4y2Ba）.然而，在响应Las和/或热处理而差异表达的8种能量生产相关蛋白中，只有两种蛋白，ATP合成酶CF1亚基和磷酸甘油酸激酶上调GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba供热厂相比，GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba热植物(图。GydF4y2Ba6GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

虽然需要更多的经验信息来描述能量生产/TCA循环相关蛋白在热介导的缓解柑橘HLB过程中的具体作用，但在ras感染的脐橙植物中，苹果酸异丙酯异构酶(将柠檬酸转化为异柠檬酸和丙酮酸脱羧酶)参与发酵，对Las感染的反应上调[GydF4y2Ba73GydF4y2Ba］．此外，Las病理系统和基于病毒的CTV病理系统之间的相似性已经被强调，植物RNA病毒已经被证明以与它们的原始功能无关的方式使用宿主代谢酶和管家蛋白[GydF4y2Ba74GydF4y2Ba］．叶绿体磷酸甘油酸激酶，一种糖异生酶，被证明上调GydF4y2Ba竹花叶病毒GydF4y2Ba乘法GydF4y2Ba尼古利亚娜·宾夕法尼亚州GydF4y2Ba[GydF4y2Ba75GydF4y2Ba］．ATP合酶-γ亚基和Rubisco活化酶分别对烟草花叶病毒的运动和积累起负调控作用GydF4y2Ba烟草GydF4y2Ba[GydF4y2Ba76GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

Las感染和/或热处理反应中差异表达的一般代谢相关蛋白GydF4y2Ba

仅存在拉斯感染(即GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba供热厂相比，GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba在一般代谢相关蛋白(包括脂氧合酶样蛋白和铁蛋白样蛋白)中，10个差异表达的蛋白中有4个下调(图。GydF4y2Ba6 a和bGydF4y2Ba）.然而，在单独的热处理的存在（即，在GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba拉斯维加斯/GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba供热厂相比，GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba热植物)，所有19个差异表达的一般代谢相关蛋白均上调，包括一个推测的脂氧合酶蛋白、一个铁蛋白样蛋白和一个谷胱甘肽s -转移酶(图。GydF4y2Ba6 a和bGydF4y2Ba）.有趣的是,GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba供热厂相比，GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba热的植物GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba热植物中铁蛋白样蛋白、谷氨酰胺合成酶和硫胺噻唑合成酶样蛋白的表达下调，但相同蛋白的表达未下调GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba供热厂相比，GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba热植物，表明热介导的这些蛋白表达的逆转。另外，12种蛋白质，包括脂氧合酶样蛋白，硫胺素噻唑合酶，谷胱甘肽S转移酶，细胞分裂周期蛋白质和气素样蛋白质GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba供热厂相比，GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba热植物(图。GydF4y2Ba6 bGydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

铁蛋白是多聚体铁储存蛋白，建议是由宿主致响应细菌侵袭引起的铁扣防御系统的一部分[GydF4y2Ba77GydF4y2Ba］．通过使用GydF4y2Ba拟南芥蒂利亚纳GydF4y2Ba作为病原细菌的敏感宿主GydF4y2Ba欧文氏菌chrysanthemiGydF4y2BaDellagi等。[GydF4y2Ba78GydF4y2Ba表明铁蛋白在感染过程中积累GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba通过GydF4y2Ba大肠chrysanthemiGydF4y2Ba是一种基础防御机制，主要由细菌铁载体激活。Liu等人的后续研究[GydF4y2Ba79GydF4y2Ba]报道，在病原体攻击期间，反应性FeGydF4y2Ba^3+GydF4y2Ba在玉米细胞壁中积累导致细胞内铁耗尽，从而促进包括铁蛋白在内的致病相关基因的转录。因此，由于Las感染导致了一种铁蛋白样蛋白的下调，铁蛋白样蛋白表达缺乏任何差异GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba供热厂相比，GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba热植物表明la介导过程的逆转，并强调了与热介导的HLB缓解相关的潜在靶机制。GydF4y2Ba

在鉴定的热诱导的一般代谢相关蛋白质中，脂氧酶和谷胱甘肽S-转移酶是值得注意的，因为这些蛋白质先前已涉及植物对病原体的反应。加德纳[GydF4y2Ba80GydF4y2Ba研究发现，谷胱甘肽s -转移酶的上调有助于大麦对芽孢杆菌的防御反应。芽孢杆菌是植物病原真菌产生的一种主要毒素GydF4y2BaFusarium Graminearum.GydF4y2Ba．然而，玉米根表达的9-脂加氧酶基因的破坏被证明可以增强对炭疽病叶枯病的抗性GydF4y2BaColletotrichum graminicola.GydF4y2Ba由于诱导全身性信令的组成型激活。因此，在本研究中，包括脂氧合酶和谷胱甘肽S-转移酶所识别的热诱导的一般代谢相关的蛋白的作用，需要进一步证明。GydF4y2Ba

在病因源性与LAS的HLB是目前最具破坏性的柑橘疾病，所有商业种植的柑橘种类/亲属易受这种疾病的影响。然而，一些柑橘种类，例如柠檬植物，对LAS具有相对高的耐受性，并且最近显示热处理或热疗触发到LAS感染的宿主防御反应。这些观察结果表明，柑橘植物可能具有天生的HLB耐受性/抗性过程，其被非生物因子诱导，例如热量。本研究确定了响应于LAS和/或热处理的107个蛋白质，其包括伴侣，病原体反应和氧化还原性稳态相关蛋白，除了参与光合作用，调节，淀粉代谢，能源生产的蛋白质之外，和一般代谢。在这些蛋白质中，通过热处理强烈地调节，包括小（23.6,18.5和17.9kDa）热冲击蛋白，包括小（23.6,18.5和17.9kDa）热休克蛋白，Hsp70样蛋白和Rubisco结合60kDa伴侣素。另外，发现葡萄绿酶IIβ亚基样蛋白，推定的脂氧基酶蛋白，铁蛋白样蛋白和谷胱甘肽S-转移酶被LAS感染下调，但是在LAS感染下调，但葡萄绿酸酶IIβ亚单位样蛋白质，葡萄糖苷酶蛋白质样蛋白质和谷胱甘肽的S-转移酶降低，但在下调热处理的存在，突出了潜在涉及逆转柑橘植物中LAS感染的影响的分子机制。因此，由于没有培养的任何已知的HLB抗性基因GydF4y2Ba柑橘类GydF4y2BaSPP。，预计本研究中产生的信息将促进Ciscenic LAS抗性或耐受柑橘植物的发展。GydF4y2Ba

生长条件和处理GydF4y2Ba

在USHRL温室制备健康和Las阳性柑橘树，并用在这项研究中，如前所述[GydF4y2Ba14GydF4y2Ba］．通过侧嫁接，用三到四厘米的lasa阳性芽棒来清洁邓肯西柚(GydF4y2Ba柑橘天堂金花蛇GydF4y2Ba)。在佛罗里达州皮尔斯堡的美国园艺研究实验室，健康和受感染的树木都被保存在防木虱的温室里。如前所述，植物按需要灌溉，每3周施肥一次[GydF4y2Ba14GydF4y2Ba］．植物被证实为任一健康或如通过实时PCR [确定基于疾病症状本和Las滴度拉斯感染GydF4y2Ba81GydF4y2Ba］．三岁的体积的健康和Las-infected植物被种植在室温(RT)或暴露于热处理40°C 144 h(6天)在生长室(Conviron CMP5000,温尼伯,加拿大),与荧光灯强度40%,一个12 h光周期,以及85%的相对湿度。每个处理采用3个重复植株。在时间0 h(热处理开始前)和时间144 h(热处理开始后6天)从每个植株收集未硬化和硬化的叶片组织混合物。从暴露于热处理的植物和未暴露于热处理的植物中收集收获的叶片，立即在液氮中冷冻，并在−80°C下保存，直到进一步分析。GydF4y2Ba

拉斯维加斯滴度在植物组织测试GydF4y2Ba

收获的叶子在液氮中被磨成细粉，使用冷冻机(6850 freezer / mill, Wolf Laboratories Ltd.， UK)。从热处理和非热处理的植物组织中进行DNA分离和Las滴度测量，如Hoffman等人先前所述[GydF4y2Ba14GydF4y2Ba］．简而言之，使用CTAB方法从0.1g接地叶组织中提取总基因组DNA [GydF4y2Ba82GydF4y2Ba］．量化来自个体植物的DNA（量子™picogreenGydF4y2Ba^®GydF4y2Ba双链DNA检测试剂盒，Life Technologies公司，美国）和标准化，以30纳克微升GydF4y2Ba^-1GydF4y2Ba．与用作模板，正向（5'-CGGTGAATGTATTAAGCTGAGGCGTTCC-3'）的分离的基因组DNA和反向（5'-TACCCACAACAAAATGAGATACACCAACAACTTC-3'）引物设计成将拉斯基因组内扩增的“延伸因子TS”序列轨迹的段[GydF4y2Ba83GydF4y2Ba，用于qPCR分析，比较不同处理叶片组织Las效价。必要时，使用相同的Las“延伸因子Ts”正、反引物进行常规PCR分析，以确定实验植物中系统是否存在Las。如前所述，内源性柑橘肌动蛋白基因作为对照/正常化剂[GydF4y2Ba84GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

蛋白质提取与定量GydF4y2Ba

从单株植物中收获的叶子在液氮中使用冷冻机(6850 freezer / mill, Wolf Laboratories Ltd.， UK)研磨成细粉。蛋白质提取方法的总蛋白覆盖率存在差异，每种方法往往分离出不同的“提取组”[GydF4y2Ba85GydF4y2Ba］．因此，为了增强总蛋白质覆盖率，涉及两种提取方法的详尽蛋白质提取过程，NWugo等人之后的TCA丙酮方法。[GydF4y2Ba69.GydF4y2Ba王等人后酚提取方法。[GydF4y2Ba86GydF4y2Ba，两种方法的最终产物在进一步分析前进行合并。GydF4y2Ba

对于TCA丙酮萃取，将0.5g接地叶组织悬浮在4.5ml冷却溶液A [90％（v / v）丙酮，9.9993％（v / v）三氯乙酸（TCA），0.0007％（v / v）中β-巯基乙醇]并在-80℃下孵育过夜，然后在4℃下离心20分钟，36,000分钟 GGydF4y2Ba（Optima L-70 K Ultracitifuge，Beckman Coulter Inc.，USA）。将沉淀用4.5ml冷却溶液B中的重悬浮洗涤三次[98.53％（v / v）丙酮，1mM聚甲基磺酰胆晶（PMSF），2mM EDTA，0.0007％（v / v）甲巯基乙醇]，孵育在-80°C下1小时，然后在4℃下离心20分钟，36,000分钟 GGydF4y2Ba．颗粒或粗蛋白提取物被真空干燥(Vacufuge™，Eppendorf，德国)并溶解在0.5 mL的复水/等电聚焦(IEF)缓冲液中[8 M尿素，50 mM DTT, 4% (w/v) CHAPS, 0.2% (v/v) 3/10两性电解质，0.002% (w/v)溴苯酚蓝]。GydF4y2Ba

对于苯酚萃取，将大约0.1g接地叶组织悬浮在800μl的SDS萃取缓冲液中[30％（w / v）蔗糖，2％sds，0.2mm Edta，0.1m Tris HCl（pH8），5％（v / v）β-巯基乙醇和2mM PMSF，通过在4℃下连续涡旋1小时。加入另外800μL苯酚（用三HCl饱和，pH8），并在10,000°离心前短暂混合 GGydF4y2Ba4°C保存10分钟。保留顶部/苯酚相并与5体积的0.1 mM醋酸铵在甲醇中混合，随后在−80°C孵育45分钟，并在18000离心GydF4y2BaGGydF4y2Ba4°C保存20分钟。球团在冰冷的100%甲醇中洗涤一次，在冰冷的100%丙酮中洗涤两次，在18000处进行再悬浮和离心GydF4y2BaGGydF4y2Ba4°C保存20分钟。将沉淀或粗蛋白质提取物在空气中干燥，并在0.1 IEF毫升缓冲液溶解。GydF4y2Ba

为了准确定量从TCA丙酮或苯酚提取方法中提取的蛋白，首先使用Compat-Able™Protein Assay Preparation Reagent kit (Pierce, Rockford, IL, USA)处理5 μL的可溶性蛋白，以去除干扰物质，然后进行bicinchoninic acid (BCA)检测(Pierce, Rockford, IL, USA)。通过三羧酸丙酮和苯酚提取总蛋白的过程以及定量过程重复3次，每株有3个分析重复。调整总蛋白浓度为1.5 mg mLGydF4y2Ba^-1GydF4y2Ba所有样品。总叶蛋白的相应的分析重复使用TCA丙酮分离或酚提取物合并1：1（V / V）之前，二维电泳（2-DE）分析。GydF4y2Ba

2-DE和凝胶图像分析GydF4y2Ba

通过如前所述的2-de实现总提取的蛋白质的分离[GydF4y2Ba69.GydF4y2Ba］．简单地说，从每个样品中提取的300 μg可溶性蛋白被加载在一个11厘米长的pH 4-7 IpG条带上，并通过等电聚焦按电荷分离。凝胶条聚焦蛋白根据大小在SDS-PAGE凝胶上进一步分离，考马斯亮蓝染色生成2-DE凝胶图像。使用PDQuest软件(version 7.3.0, Bio-Rad, USA)检测较本底增加≥10倍的斑点，且每次治疗9种凝胶中至少有6种存在。检测到>1.5倍变化的斑点(GydF4y2BaP.GydF4y2Ba< 0.05)的体积/强度被认为是有差异产生的，并被切除以进行质谱鉴定。GydF4y2Ba

质谱和蛋白质鉴定GydF4y2Ba

如前所述的胰蛋白酶消化了切除的蛋白质斑点[GydF4y2Ba69.GydF4y2Ba]，并通过液相色谱辅助质谱分析(Eksigent nanoLC 1D-plus泵和Autosampler AS-2连接到NanoFlex cHiPLC™，通过NanoSpray®II电喷雾电离器连接到QSTAR Elite QTOF-MS系统，ABSCIEX，美国)。简单地说，tryptic -peptide溶解在试剂A(0.1%甲酸在水中，Sigma, USA)上加载到cHiPLC™二氧化硅捕集柱(200 μm X 0.5 mm packed with ChromXP C18-CL of 3 μm bead size and 300 Å pore size, Eksigent Technologies，美国)和清洗试剂10分钟。保留肽分离的cHiPLC™二氧化硅分析柱(75μm X 15厘米挤满了ChromXP C18-CL 3 120μm珠大小和孔隙大小,Eksigent技术,美国)使用以下优化序列试剂B(美国0.1%的甲酸乙腈,σ):为防止样品携带，100%异丙醇在实际样品之间作为“空白”处理，试剂B的顺序如下:所有的LC分析在40°C色谱柱温度下进行，流速为0.3 μL minGydF4y2Ba^-1GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

对于每个信息相关的采集（IDA）循环，以400至1600 m / z的一个完整的TOF MS以正模式扫描，分辨率为12,000，累积时间为1 s，其次由100到1600 m / z的产品离子扫描在低四边形分辨率设置，监测3个最强烈的峰值，最大累积时间为3 s。数据采集​​的总持续时间为49分钟，每循环10秒。使用已知污染物的排除列表来优化MS谱，并且每12秒排除MS / MS靶离子。使用三架充电（737.7067）和常见的胰蛋白酶自动消化产品的单同位素峰（MH）的双电压（1106.0562）单位异位峰（MH）激活AutoOcal脚本（Absciex，USA），用于自动化的质谱（1106.0562）单位异位峰（MH）GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba：2211.42道尔顿）作为校准物。GydF4y2Ba

对于蛋白质鉴定，使用MASCOT搜索引擎和MASCOT Daemon (Matrix Science, London, UK)自动搜索MS/MS碎片光谱首先针对一个包含柑橘(GydF4y2Ba柑橘sinensis.GydF4y2Ba和GydF4y2Ba柑橘克莱门蒂娜GydF4y2Ba）可在GydF4y2Bahttps://www.citrusgenomedb.org.GydF4y2Ba．同时对NCBI非冗余数据库(GydF4y2Bahttps://www.citrusgenomedb.org.GydF4y2Ba）.所产生的最高得分吉祥物和百分比肽覆盖率对我们的蛋白/多肽查询柑橘基因或登录号为其他植物的PAC数字记录。定期修复和可变修饰（Cys Cys Carbamidomethylation和Met氧化）和一个错过的裂解被考虑在内。与2肽收费GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba和3GydF4y2Ba^+GydF4y2Bawere selected with a peptide mass tolerance of ± 50 ppm for MS scans, while a parent ion tolerance of 0.1 Da was selected for MS/MS scans. A decoy search was done automatically on a randomized database of equal composition and size to limit false detection rate. To gain functional information on identified proteins, homology searches using BLAST_P.GydF4y2Ba（GydF4y2Bahttps://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthomeGydF4y2Ba） 被雇佣。在多个点匹配到相同的蛋白的情况下的光点体积每个治疗组内平均，以表示用于该治疗组的蛋白表达量。然而，当多个不一致差异表达的斑点匹配到相同的预测的/假定的蛋白，例如斑点被视为唯一的蛋白质。GydF4y2Ba

统计分析GydF4y2Ba

从qPCR分析Ct值进行使用的SigmaPlot软件版本11（SYSTAT软件公司，加利福尼亚州，美国）和装置使用的Holm-Sidak方法分离方差分析（ANOVA）在˃95％置信区间（GydF4y2BaP.GydF4y2Ba < 0.05). Proteomic analysis was performed on plant tissues harvested at time 144 h. Tissues were divided into four treatment groups as follows:^−GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba热量，代表没有热暴露的健康植物;GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba热，表示受感染的植物没有受热;GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba热，代表受热照射的健康植物;GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba热，较热暴露感染的植物。成对比较，以确定在处理之间斑点强度显著差异上标准化的日志进行GydF4y2Ba_10GydF4y2Ba使用学生的蛋白质点体积值GydF4y2BaT.GydF4y2Ba-检验分析˃95%置信区间(GydF4y2BaP.GydF4y2Ba< 0.05)，由PDQuest™2-DE分析软件(Bio-Rad, Inc.， California, USA)提供。利用R包生成热图，根据叶中蛋白质生产的折叠变化GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba供热厂相比，GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba热,GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba热或GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba拉斯/GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba热的植物。GydF4y2Ba

2-DE：GydF4y2Ba

二维电泳GydF4y2Ba

Anova：GydF4y2Ba

方差分析GydF4y2Ba

BCA:GydF4y2Ba

Bicinchoninic酸GydF4y2Ba

爆破：GydF4y2Ba

基本的局部对齐搜索工具GydF4y2Ba

家伙:GydF4y2Ba

3 - ((3-cholamidopropyl) dimethylammonio) 1-propanesulfonateGydF4y2Ba

CTV：GydF4y2Ba

柑桔衰退病毒GydF4y2Ba

德勤:GydF4y2Ba

二硫苏糖醇GydF4y2Ba

EDTA：GydF4y2Ba

乙二胺四乙酸GydF4y2Ba

HLB：GydF4y2Ba

HuanglongbingGydF4y2Ba

HSP70:GydF4y2Ba

热休克proteins70GydF4y2Ba

IDA：GydF4y2Ba

信息依赖习得GydF4y2Ba

IEF：GydF4y2Ba

等电点聚焦GydF4y2Ba

KDA：GydF4y2Ba

千达尔顿GydF4y2Ba

拉斯：GydF4y2Ba

'GydF4y2BaCandidatusGydF4y2BaLiberibacter胭脂GydF4y2Ba

NCBI：GydF4y2Ba

国家生物技术信息中心GydF4y2Ba

电点：GydF4y2Ba

等电点GydF4y2Ba

PMSF:GydF4y2Ba

PolymethylsulphonylfluorideGydF4y2Ba

PR：GydF4y2Ba

Pathogenesis-relatedGydF4y2Ba

存在:GydF4y2Ba

定量实时聚合酶链反应GydF4y2Ba

ROS：GydF4y2Ba

活性氧GydF4y2Ba

二磷酸核酮糖羧化酶:GydF4y2Ba

核酮糖1 5 5-bisphosphate羧化酶,GydF4y2Ba

SOD:GydF4y2Ba

超氧化物歧化酶GydF4y2Ba

TCA：GydF4y2Ba

三氯乙酸GydF4y2Ba

三羧酸循环:GydF4y2Ba

三羧基的周期GydF4y2Ba

TOF MS：GydF4y2Ba

飞行时间质谱GydF4y2Ba

作者要感谢Parminder Sahota在样品制备方面的帮助。GydF4y2Ba

资金GydF4y2Ba

该项目的资金由美国农业部，农业研究服务提供。本出版物中的商品名称或商业产品仅用于提供具体信息，并不意味着美国农业部的建议或认可。USDA是一个平等的机会提供者和雇主。GydF4y2Ba

数据和材料的可用性GydF4y2Ba

数据在附加文件中提供GydF4y2Ba1GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

作者的贡献GydF4y2Ba

CCN，MSD，YPD和HL构思和设计了实验。MSD进行实验和收集的样品。CCN处理样本并分析了数据。CCN，MSD，YPD和HL写了论文。所有作者都已读取并批准了稿件的最终版本。GydF4y2Ba

相互竞争的利益GydF4y2Ba

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。GydF4y2Ba

同意出版GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

伦理批准和同意参与GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

从属关系GydF4y2Ba

1. 美国农业部，农业研究服务，圣Joaquin Valley农业科学中心，9611南河南河畔大道，Parlier，93648，USAGydF4y2Ba

   Chika C. Nwugo＆Hong LinGydF4y2Ba

2. 美国农业部，农业研究局，美国园艺研究实验室，皮尔斯堡，34945，佛罗里达州，美国GydF4y2Ba

   Melissa S. Doud &段永平GydF4y2Ba

相应的作者GydF4y2Ba

对应到GydF4y2Ba洪林GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

开放获取GydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议(GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/GydF4y2Ba）如果您向原始作者和源给出适当的信用，则允许在任何介质中进行不受限制的使用，分发和再现，提供指向Creative Commons许可证的链接，并指示是否进行了更改。Creative Commons公共领域奉献豁免（GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/GydF4y2Ba）除非另有说明，否则适用于本文中提供的数据。GydF4y2Ba

再版和权限GydF4y2Ba