全基因组转录谱鉴定两种大豆低植酸突变体籽粒萌发相关差异表达基因gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

种子萌发对大豆（gydF4y2Ba大豆gydF4y2Ba）生长和发展，最终影响大豆产量。较低的种子场出现是植物繁殖低温的主要障碍。尽管可以通过额外的育种和选择来克服这种减少，但不同低植物突变体中的种子萌发机制仍然未知。在这项研究中，我们进行了两种低植物大豆突变体（TW-1和TW-1-M）的比较转录分析，其具有相同的突变，2bp缺失gydF4y2Bagmmips1.gydF4y2Ba，但显示在种子字段出现一个显著差异，TW-1-M比TW-1的高。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

RNA-SEQ分析的许多基因显示在TW-1-M和TW-1突变体之间明显不同的表达水平。每个文库都鉴定了大约30,000-35,000只读映射的基因和〜21000-25000种表达基因。每个造影库中有〜3900-9200个差异表达的基因（DEGS），上调基因的数量与突变体TW-1-1M中的下调基因类似。基因本体功能类别的DEG表明，乙烯介导的信号通路，脱离酸介导的信号通路，对激素的反应，乙烯生物合成过程，乙烯代谢过程，激素水平调节，以及氧化还原过程，黄酮类化合物的调节脱落酸活化的信号通路的过程和调节与种子萌发具有高相关性。总共识别出上述功能类别的2457次参与。具有20个生物学功能的二十两种基因是高场出苗突变体TW-1-M中最高上/下调（绝对值LOG2FC> 5），并且与代谢或信号通路有关。具有36个生物学功能的五十七种基因在发芽相关途径中具有最大的表达丰富（FRPM> 100）。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

大豆低植酸突变体中的种子萌发是一个非常复杂的过程，涉及一系列生理，形态学和转录变化。与TW-1相比，TW-1-M具有非常不同的基因表达谱，包括与植物激素，抗氧化，抗应力和能量代谢过程有关的基因。我们的研究提供了理解发芽机制的分子基础，也是低植酸作物萌发遗传分析的重要资源。植物激素和抗氧化相关基因可能强烈导致TW-1-M突变体中的高萌发率。gydF4y2Ba

种子对于植物的生存和进化成功以及人类培养的发展是重要的。他们的发芽性状是传统农艺性状，对作物演变和发展很重要[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba那gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．对于大豆育种和生产来说，种子发芽率低会降低大豆幼苗密度，最终影响产量。因此，在开发任何生态、农艺或营养性状时，不应影响种子的发芽率和速度。gydF4y2Ba

降低作物种子中植酸含量有利于改善种子营养性状，降低水分磷水平[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba-gydF4y2Ba5.gydF4y2Ba］．因此，产生在种子发育过程中破坏植酸合成的作物具有相当大的意义[gydF4y2Ba6.gydF4y2Ba］．种子的植酸含量可以通过突变或插入转基因来消除。许多低植酸(LPA)突变体已经在水稻、玉米、大豆和小麦等不同作物中产生[gydF4y2Ba7.gydF4y2Ba-gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．然而，这些突变体中出现了一些不良性状，阻碍了LPA突变体在作物育种中的应用。与各自的野生型亲本相比，大多数LPA突变体的籽粒产量较低，种子活力降低或田间出苗率较低。因此，新的LPA作物要投入实际应用还需要进一步的改进[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba-gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．例如，实验室和野外观察表明，LPA水稻的主要突变系与各自的亲本相比，籽粒产量和种子活力都较低[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba那gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．广泛的努力仍然需要有竞争力的收益率LPA选育水稻品种。一些不理想的农艺和质量性状也报道了几种LPA大豆品系，特别是场出现的较低速率gydF4y2Ba8.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba13gydF4y2Ba那gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．由于LPA突变的固有缺陷，阻碍了高产大豆品种的选育。改良种子萌发特性是LPA大豆品种选育的重要目标。然而，大豆可以通过育种和选择来提高粮食产量和田间出苗率[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]，而事实上，一个LPA大麦栽培，CDC Lophy-1（gydF4y2Bahttp://www.inspection.gc.ca/english/plaveg/pbrpov/cropreport/bar/app00006337e.shtmlgydF4y2Ba），已经发布了商业化生产[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

我们以前在大豆中开发了两种LPA突变体，涉及两种非等位基因基因。突变体的LPA特征gydF4y2BaGM-LPA.gydF4y2Ba-TW-1是由于在2-bp缺失gydF4y2BaMIPS1.gydF4y2Ba基因;肌醇磷酸激酶(gydF4y2BaGmIPK1gydF4y2Ba)是该突变的候选基因，与该突变的低植酸特性有关gydF4y2Ba通用汽车gydF4y2Ba-gydF4y2BaLPA.gydF4y2Ba-ZC-2突变。与其他LPA突变体不同，gydF4y2BaGM-LPA.gydF4y2Ba-ZC-2似乎具有良好的种子活力(发芽和田间出苗)[gydF4y2Ba8.gydF4y2Ba］．然而,突变体gydF4y2BaGM-LPA.gydF4y2Ba-TW-1揭示了一个非常低的现场出现率，特别是在中国杭州的春季[gydF4y2Ba8.gydF4y2Ba］．另外，种子贮藏期间种子萌发速度快速降低（未发布数据）。幸运的是，在覆盖自然变化并具有明显更高的现场出现率的个体植物gydF4y2BaGM-LPA.gydF4y2Ba-tw-1行。根据结果gydF4y2BaMIPS1.gydF4y2Ba基因序列分析，个体具有相同的突变位点（2bp删除gydF4y2BaMIPS1.gydF4y2Ba)作为gydF4y2BaGM-LPA.gydF4y2Ba-TW-1突变体(未发表数据)，并命名gydF4y2BaGM-LPA.gydF4y2Ba-TW-1-M。gydF4y2Ba

种子萌发是一个复杂的过程，包括吸胀、搅拌和萌发阶段，涉及一系列生理、形态和转录的变化[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．几次大规模的组学方法，包括转录，蛋白质组学，代谢组学和方法，最近已成立调查种子发芽的机制[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．大豆基因组学的巨大成就导致在mRNA和蛋白质水平中施加大规模基因表达分析，以发现大豆特征的特征。例如，从32,885个注释基因的69,338个不同的转录物在大豆种子中表达，其来自油组合物和总油含量的九条线[gydF4y2Ba21.gydF4y2Ba］．到目前为止，对豆类LPA突变体中的低种子萌发速率负责的机制很少。虽然我们发现了大豆LPA突变体，但种子萌发特征是受许多因素影响的综合特征，包括内在和环境提示，种子发育和储存阶段[gydF4y2Ba22.gydF4y2Ba，这使得种子萌发的遗传分析非常困难。随着高通量深度测序技术的发展，一种研究基因表达谱与基因功能关系的新方法应运而生。这些技术可用于评估不同发育阶段和/或不同组织中的总体基因表达谱。虽然影响大豆种子萌发的生化途径已经被很好地描述，但目前还没有一个完整的模型来描述参与大豆种子萌发的差异表达基因(DEGs)，特别是那些用于大豆LPA突变体种子萌发的差异表达基因。本研究的目的是评估大量的cDNA序列数据，详细研究种子萌发性状，并鉴定可能与LPA大豆萌发有关的候选基因。gydF4y2Ba

在这项研究中，我们使用Illumina测序在不同萌发阶段的大豆LPA突变体种子中探讨基因表达，并与最新释放的比较转录物读数gydF4y2BaG. Max.gydF4y2Ba基因组序列(组装Glyma 1.01)。gydF4y2Ba

植物材料和种子生产gydF4y2Ba

两个LPA大豆突变系，gydF4y2BaGM-LPA.gydF4y2Ba-TW-1（TW-1），gydF4y2BaGM-LPA.gydF4y2Ba以TW-1-M (TW-1-M)及其野生亲本台湾75为材料，对其种子萌发性状进行了评价。台湾75是一种在浙江省广泛种植的菜用大豆品种。TW-1是利用野生型台湾75的伽玛辐照开发的，TW-1- m是TW-1系的一个自然突变体。TW-1和TW-1- m具有相同的植酸水平和突变位点(2-bp在gydF4y2Bagmmips1.gydF4y2Ba，未发表的数据）。用于萌发评估的种子样品从相同领域的相邻图中生长的植物中收获。种子在2012年春季在杭州，浙江省浙江省农业科学院实验农场。gydF4y2Ba

为了进行差异基因表达检测，我们使用了两个LPA突变体TW-1和TW-1- m。为了更好地了解和比较突变体TW-1和TW-1- m在萌发过程中的表达差异，我们使用三个不同的萌发阶段进行分析。这三个阶段包括:第1阶段为浸种期(浸种后约24 h，分别命名为TW-1-1和TW-1-M-1)，第2阶段为代谢激活期(浸种后约30 h)，种子自吸和胚根emergernce(名为TW-1-2和TW-1-M-2)和最后一个阶段是出现的主要根达到1毫米的长度(约36小时后种子浸泡,名叫TW-1-3和TW-1-M-3),三个复制进行构造十八DGE库,他们TW-1-1-1 TW-1-1-2, TW-1-1-3, TW-1-2-1, TW-1-2-2,TW-1-2-3、TW-1-3-1 TW-1-3-2, TW-1-3-3、TW-1-M-1-1 TW-1-M-1-2, TW-1-M-1-3, TW-1-M-2-1, TW-1-M-2-2, TW-1-M-2-3, TW-1-M-3-1, TW-1-M-3-2 TW-1-M-3-3。根据发芽过程的三个阶段(快速吸水、代谢恢复和胚根萌发)，根据我们的发芽实验(如下图所示)和一些报道，选择这三个阶段进行研究[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba那gydF4y2Ba23.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

发芽试验gydF4y2Ba

以2个LPA大豆突变体及其野生型亲本为材料，进行了温萌发和加速老化2种处理的发芽试验。该方法由Meis等人提出，但稍加修改[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．为了温暖的发芽，100每一行的种子被种植在皮氏培养皿中B5琼脂凝胶(每15毫米50种子培养皿),放置在一个25°C在黑暗中发芽室4 d。行用于评估预测领域加速老化测试的有效性后出现长时间存储包括两个LPA突变体(TW-1和TW-1-M)及其野生型品种台湾75。每个株系总共有200粒种子，用400毫升蒸馏水放在一个丙烯酸盒子里，然后盖上。将盒子置于40°C的箱中96 h，将样品从箱中取出，按照温暖萌发时的方式进行种植。皮氏培养皿中种子萌发的定义是根刺穿种皮的点。每株100粒，每个处理3个重复。试验采用随机完全区组设计，各发芽试验数据采用SAS统计软件(发行版8.02)的线性模型程序进行分析。gydF4y2Ba

总RNA隔离gydF4y2Ba

从三个阶段发芽样品本研究中使用。总RNA使用E.Z.N.A.分离根据制造商的方案植物RNA试剂盒（欧米茄生物-TEK，Inc.，美国）。基因组DNA污染用RQ1无RNase的DNase（Promega公司，USA）消除。gydF4y2Ba

cDNA文库构建与测序gydF4y2Ba

采用2100生物分析仪(Agilent, Santa Clara, CA, USA)检测总RNA (OD260/280 = 1.8 ~ 2.2, 28 s/18 s >1.8, RIN >8)的质量，并用琼脂糖凝胶电泳检测。然后，按照Ribo-Zero™rRNA去除试剂盒(植物种子/根)(Epicentre, Madison, WI, USA)的说明从总mrna中去除rRNA，所有RNA样品在定量后最终浓度调整为500 ng/μl。使用SMART™cDNA文库构建试剂盒、Takara生物医药技术(北京)有限公司制备cDNA文库，在Illumina HiSeq 2000平台上生成140-220 bp的配对端reads。(美国Illumina公司)。RNA测序由浙江天科(中国杭州)的工作人员完成。gydF4y2Ba

差异表达基因检测gydF4y2Ba

序列接收的原始图像数据通过base调用转换为序列原始数据，并以FASTQ格式存储。研究中所描述的18家图书馆的原始数据均发表在SRA数据库中。通过Trimmomatic软件对原始数据进行过滤，去除适配器读、低质量读(包含未知核苷酸“Ns”的读)、拷贝数= 1的读和长度小于20 bp的读，得到一个由clean read组成的数据集。对于reads的注释，使用TopHat软件将干净的reads映射到大豆数据库[gydF4y2Ba24.gydF4y2Ba］．在对准中允许不匹配不超过两个碱基的不匹配。计算每个基因的清洁读数的数量，并使用片段/ kB /百万（FPKM）方法的变化来归一化。FPKM方法校正总基因外显子尺寸的偏差，并为每个组织库中获得的总片段序列的标准化为生物导体软件：铆钉和袖带。在该实验中，除了在任何文库中的任何文库中的FPKM <1的值为阈值以计算表达基因的低表达基因。R语言软件包执行关于其基因表达数据集的不同库之间的主成分分析gydF4y2Bahttp://factominer.free.fr/gydF4y2Ba．该方法使用方差稳定数据来获得样本间的距离。gydF4y2Ba

对于具体组织分析，以识别软件包袖扣差异表达的基因，cuffdiff软件被用来执行阶段的成对comparisions，并与修正后的包gydF4y2BaPgydF4y2Ba的0.05 -VALUE和LOG2倍的变化[gydF4y2Ba24.gydF4y2Ba］．基因与gydF4y2BaPgydF4y2Ba-value < 0.05和跨库序列计数中估计的绝对log2倍变化>1被认为是显著差异表达。gydF4y2Ba

使用Smartgo工具（由Tianke公司中国开发的软件包）进行丰富分析，我们使用超距离（Fisher的确切测试）测试来将所有频率映射到Go数据库中的条款（gydF4y2Bahttp://www.geneontology.orggydF4y2Ba)，以寻找明显富集的Go项在dge比较基因组背景。的gydF4y2BaPgydF4y2Ba-Value由Bonferroni纠正，我们选择了一个gydF4y2BapgydF4y2BaValue <0.05为阈值。GO术语(gydF4y2BaPgydF4y2Ba < 0.05) is defined as significantly differentially expressed genes enriched GO term. Pathway enrichment analysis method is the same as that used in the GO analysis. Fisher test was used to check up enrichment gene KEGG pathway with correctedPgydF4y2Ba值为0.05。gydF4y2Ba

定量实时PCR（QRT-PCR）gydF4y2Ba

为了验证Illumina RNA-seq获得的数据，我们对log2FC比值为2 ~ 11的10个基因进行了qRT-PCR。起初，我们选择gydF4y2BaACT11,图阿gydF4y2Ba和gydF4y2BaCYP2gydF4y2Ba3个持家基因分析使用geNorm软件（V3.50）其表达的稳定性。相对最稳定的管家基因gydF4y2BaACT11gydF4y2Ba将所选基因的表达水平归一化。用于qRT-PCR检测的RNA样本与用于DEG实验的相同。SYBR Green Real time PCR Master Mix (TOYOBO Biotech Co.， Ltd)用于罗氏(LightCycler®)gydF4y2Ba^480gydF4y2Ba(美国)仪器根据制造商的说明。每个20 μl反应由2 μl模板、10 μl SYBR Green Realtime PCR Master Mix-Plus、1.2 μl (10 μM)引物、2 μl Plus溶液和3.6 μl ddH2O组成。基因表达水平的量化使用校正的相对-2进行3个重复gydF4y2Ba^{ΔΔctgydF4y2Ba}由数据与内部对照基因比较方法gydF4y2BaAct11gydF4y2Ba［gydF4y2Ba25.gydF4y2Ba］．qRT-PCR的效率通过cDNA的5个串口五倍稀释液，标准曲线可以证实它们在高效率率。用于定量RT-PCR扩增所有引物由引物总理5设计并根据从所述基因的mRNA序列gydF4y2Bahttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/.PrimersgydF4y2Ba在上海桑松生物工程师技术和服务有限公司（中国上海）合成，并在附加档案中提供gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

大豆不同突变体种子萌发的研究gydF4y2Ba

为了探索突变体和野生型父母之间的种子萌发性状，我们在温暖的发芽和加速老化试验条件下评估了大豆线的发芽率和速度。加速衰老试验的目标是鉴定萌发百分比萌发百分比的速率。在加速老化试验中表现良好的线路将预期在长时间储存​​下保持活力。gydF4y2Ba

在温度萌发和加速老化试验中，TW-1-M和TW-1之间的萌发速度差异有统计学显着差异（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.TW-1-M成本约72小时达到最高萌发百分比，而TM-1需要超过96小时达到其最高萌发百分点。TW-1和台湾75的发芽速度在加速老化和温暖的发芽试验中都是相同的。gydF4y2Ba

在温暖的发芽试验，在TW-1发芽率非常相似，其野生型亲台75.根据发芽曲线最终发芽率为80％左右。的发芽率TW-1-M是比其它两行的略高。最终发芽率为约85％（图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.TW-1-M和TW-1之间没有统计学显着差异。在加速衰老试验中，TW-1-M显示出在发芽率（约80％）中具有非常好的性能。TW-1线进行了非常低的发芽率（约45％），台湾75的萌发百分比为约50％（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

TW-1- m的种子萌发特性优于TW-1和台湾75。结果表明，与TW-1突变位点相同的突变体TW-1- m具有明显更好的萌发性状和贮藏稳定性。3个品系的田间出苗率证实了这一结果。TW-1- m在室温贮藏2年后的田间出苗率(约50%)显著高于TW-1和台湾75(不到10%)。gydF4y2Ba

数字基因表达(DGE)文库测序gydF4y2Ba

为了在大豆萌发过程中表征基因表达型材，使用Illumina RNA测序分析仪平台进行大豆幼苗文库的高通读入序列分析。在三种种子萌发阶段分析了两种LPA突变体之间基因调节途径的差异。测序18个DGE文库，并生成了大约802万根原料读取。所有原始数据已在Geo中发布，带有登录号GSM2195640（TW-1-1-1），GSM2195642，GSM2195642（TW-1-1-3），GSM2195643（TW-1-2-1），GSM2195644（TW-1-2-2），GSM2195645（TW-1-2-3），GSM2195646（TW-1-3-1），GSM2195647（TW-1-3-2），GSM2195648（TW-1-3-3），GSM2195649（TW-1-M-1-1），GSM2195650（TW-1-M-1-2），GSM2195651（TW-1-M-1-3），GSM2195652（TW-1-M-2-1），GSM2195653（TW-1-M-2-2），GSM2195654（TW-1-M-2-3），GSM2195655（TW-1-M-3-1），GSM2195656（TW-1-M-3-2）和GSM2195657（TW-1-M-3-3）。过滤低质量读取后，每个图书馆中的清洁读数的总数范围为37.7至62.1million（表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.在大多数图书馆中，干净阅读占原始阅读的比例超过95%。gydF4y2Ba

读取映射到参考转录gydF4y2Ba

TW-1和TW-1- m突变体的88.9-92.3%的转录本被精确定位到大豆参考基因组。被映射到基因上的独特阅读数从2540万到4640万。这些独特读取的百分比约为80%。读映射基因的数量在30,656到34,820之间(表1)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.TW-1-M-3文库中读图基因数量最多，而TW-1-M-1文库中读图基因数量最少。这些数据表明TW-1-M-3文库中表达的基因多于其他5个文库。gydF4y2Ba

在LPA突变体中，DGE谱量化了基因表达水平的变化gydF4y2Ba

在对18个DGE文库进行深度测序的基础上，将每个文库中的clean reads数量归一化到FPKM，得到归一化基因表达水平。18个文库中FPKM值的大豆基因图谱均列于附加文件中gydF4y2Ba2gydF4y2Ba．两万11分别在LPA突变体TW-1-1和TW-1-M-1分别检测和20192（43.1％）表达的基因（在大豆参考基因42.7％）。总体上，在突变体TW-1-2和TW-1-M-2中检测到20618和22746（48.5％）表达的基因（在大豆参考基因44.0％）。另外，在TW-1-3和TW-1-M-3中检测到19884和23307（50.0％）表达的基因（在大豆参考基因42.4％）。总共22018个基因在LPA TW-1突变体在整个发芽过程中表达。一万八千204分别组成性表达，1727是阶段特异性和2087分别在两个阶段（图表示。gydF4y2Ba2AgydF4y2Ba）.在TW-1-M的种子发芽过程中，24934个基因表达。一万八千604被组成型表达，2227是阶段特异性和4103分别在两个阶段（图表示。gydF4y2Ba2B.gydF4y2Ba）.突变体TW-1- 3的阶段特异性表达基因数量显著高于其他突变体，表明TW-1- 3表达的与种子萌发相关的特异性基因更多。与其他TW-1- m和TW-1突变体相比，TW-1- m -3表达的基因种类和总数最多，这表明TW-1- m -3可能表达了一套独特的细胞功能基因，这可能对种子萌发至关重要。gydF4y2Ba

此外，我们分析了不同样品与实验与其基因表达数据集之间的主要成分分析的关系。主成分分析表明，TW-1-3和TW-1-M-2中的基因表达式彼此相似。TW-1-1和TW-1-M-1也具有相同的基因表达模式。与其他四个微型相比，TW-1-2和TW-1-M-3进行了特殊的基因表达，并且彼此具有不同的基因表达（图。gydF4y2Ba2CgydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

筛选来自大规模数据集的DEGSgydF4y2Ba

为了鉴定和比较LPA突变体在不同萌发阶段的DEGs，我们使用cufflinks软件包对两个LPA突变体(TW-1-1 vs. tw -1- m -1, TW-1-2 vs. TW-1-M-2, TW-1-3 vs. tw -1- m -3)的DGE文库进行两两比较。为了判断表达基因差异的重要性，我们采用了两个标准:gydF4y2BaPgydF4y2Ba-value < 0.05和绝对值log2倍变化>1。gydF4y2Ba

总共存在LPA突变体（TW-1和TW-1-M）的每个萌发阶段有3677°。在这些基因中，上调3099（84％），与TW-1相比，将548（16％）下调在TW-1-M中（附加档案gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.与TW-1-1相比，TW-1-M -1中有1354个基因下调，2596个基因上调。TW-1-M-2与TW-1-2相比，上调基因5060个，下调基因4185个。与TW-1-3相比，TW-1-M-3中有3395个基因表达下调，1983个基因表达上调gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba,无花果。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

为了说明不同库之间的差异，使用热图构建了热图。2日志显示软件gydF4y2Ba_10gydF4y2Ba（FPKM）六个对比文库中最差异表达基因的前500个表达值。结果表明，TW-1-M-1中顶部的表达水平不同于TW-1-1（图。gydF4y2Ba4AgydF4y2Ba）.此外，在500度的视角的表达水平TW-1-M-2是从不同TW-1-2。大多数基因的显示在这两个相反库（完全相反的表达水平图。gydF4y2Ba4BgydF4y2Ba）.我们的结论是TW-1-M-2在种子萌发中是不同的，从TW-1-2。与此相反，许多顶DEGS的表达水平彼此TW-1-M-3和TW-1-3库（图之间相似。gydF4y2Ba4C.gydF4y2Ba）.应该注意的是，在这两个突变体中萌发的DEG的表达水平在该发芽阶段中变得相似。gydF4y2Ba

进一步分析两种基因型之间的次数gydF4y2Ba

基于两个突变体的结果，在TW-1和TW-1-M之间进一步比较DEG。总共只有190个基因仅在TW-1-1 VS TW-1-M-1文库中表达，其中大多数在TW-1-1中上调;在TW-1-2 VS TW-1-M -2文库中发现616个基因，其中65.6％在TW-1-M-2中上调;在TW-1-3 VS TW-1-M-3文库中特异性表达169个基因，其中67.5％在TW-1-M-3中上调（附加文件gydF4y2Ba4.gydF4y2Ba）.这些基因可能具有特殊的功能，导致不同的种子萌发特性。gydF4y2Ba

GO功能富集分析LPA突变型不同文库的DEGsgydF4y2Ba

氧化石墨烯包括三个领域:细胞成分、生物过程和分子功能。基本的GO单位是GO术语。每个GO术语都属于一个特定的类别。GO与bonferroni校正的术语gydF4y2BaPgydF4y2Ba-Values <0.05被定义为显着富含DEG。gydF4y2Ba

在我们的研究中，来自不同文库的大多数deg，无论调控方向如何，都涉及细胞核(GO:0005634)、细胞部分(GO: 0044464)、质体(GO:0009536)、膜(GO:0016020)和膜的组成部分(GO:0016021)。在生物过程中，大多数DEGs可分为5类:代谢过程(GO:0044260、GO:0044710和GO:0019538)、氧化还原过程(GO:0055114)、对环境刺激的响应、植物激素信号通路。在分子功能方面，DNA、RNA和蛋白质结合是最大的DEG类别，氧化还原酶活性也是一个非常重要的功能基团(图)。gydF4y2Ba5.gydF4y2Ba额外的文件gydF4y2Ba5.gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

种子萌发是一个复杂的过程，其涉及在一些关键酶的许多活动中糖酵解，戊糖磷酸途径，tricarboxylicacid周期，蛋白质和脂质代谢[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．此外，包括超氧化物阴离子，过氧化氢和羟​​基的反应性氧物质产生可对细胞成分引起氧化损伤，并减少种子萌发能力[gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba27.gydF4y2Ba］．最后，植物激素如脱落酸、赤霉素和乙烯在种子萌发中起着非常重要的作用[gydF4y2Ba28.gydF4y2Ba］．根据上述的研究和在功能类别的当选总监的数字，在此研究中，我们用与种子发芽过程DEGS的功能类别（无论调节方向的）有关。在对比组TW-1-1和TW-1-M-1，最可能与种子发芽来自生物过程类别DEGS：氧化还原过程（GO：0055114），蛋白代谢过程（GO：0019538），碳水化合物代谢过程（GO：0005975），脂质代谢过程（GO：0006629）和激素运输（GO：0009914）。生物过程，这将是负责种子萌发在对比组TW-1-2和TW-1-M-2被归类在氧化 - 还原（GO：0055114），蛋白代谢过程（GO：0019538），脂质代谢过程（GO：0006629），响应于激素（GO：0009725），激素水平（GO：0010817）的调节和碳水化合物代谢过程（GO：0005975）。我们还发现在TW-1-3和TW-1-M-3个基团，其中包括氧化还原过程（GO：0055114）与种子发芽涉及某些生物过程和种子发芽（GO：0009845）。这些生物过程可能是高度相关的种子发芽性状（图gydF4y2Ba5.gydF4y2Ba额外的文件gydF4y2Ba5.gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

途径富集分析gydF4y2Ba

途径富集分析是阐明DGE生物功能的有效方法。通过比较其全基因组背景，可以通过比较它们的全基因组背景，途径的分析可以鉴定显着富集的代谢和信号转导途径[gydF4y2Ba29.gydF4y2Ba］．用于该计算的公式基本上与在去分析中使用的公式，具有途径gydF4y2BaPgydF4y2Ba-Values <0.05定义为大量参数。gydF4y2Ba

在TW-1-1和TW-1-M-1对比文库中发现了80个代谢和信号转导途径的DEG。TW-1-M-1中的主要受调节的途径是TW-1-M-1中最上调的基因数为“次级代谢物”，'植物激素信号转导'，'抗坏血酸和抗坏血酸代谢'和'淀粉和蔗糖代谢'。TW-1-2和TW-1-M-2对比文库中有113条富集途径。Among these pathways, six pathways might be related to seed germination, ‘biosynthesis of secondary metabolites’, ‘starch and sucrose metabolism’, ‘flavone and flavonol biosynthesis’, ‘isoflavonoid biosynthesis’ and ‘plant hormone signal transduction’ and ‘gulutathione metabolism’. These pathways were up-regulated in TW-1-M-2. The most enriched pathways responsible for seed germination in the TW-1-M-3 vs TW-1-3 contrast libraries were ‘plant hormone signal transduction’ and ‘starch and sucrose metabolism’. These two pathways performed two contrast regulation directions, some genes were up-regulated and the others were down-regulated (Fig.6.gydF4y2Ba额外的文件gydF4y2Ba6.gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

关于种子萌发相关的LPA突变体TW-M中的各种类别的DEGS分析gydF4y2Ba

高萌发突变体的GO功能注释和deg(无论方向)通路富集分析表明，富集程度最高的生物过程和通路中的deg最有可能对良好的种子萌发性状起作用。由于我们对与种子萌发相关的生物学过程很感兴趣，因此我们将重点放在了与种子萌发相关的通路和功能类别中。所有这些deg都在附加文件中列出gydF4y2Ba7.gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

TW-1-1和TW-1-M-1对比文库共527个DEGs与7种不同的生物过程相关。在这些基因,下调97度和213度上调突变TW-1-M-1氧化还原过程,其他384 dg都上调TW-1-M-1 hormone-mediated信号通路,auxin-activated信号通路,响应生长素,生长素运输、激素运输,赤霉素介导的信号通路、赤霉素介导的信号通路和赤霉素的生物合成过程。gydF4y2Ba

总体上，TW-1-2和1240个之间TW DEGS-1-M-2对比文库可以分成五个功能类别，包括激素水平的响应于激素，乙烯生物合成过程中，乙烯代谢过程，法规，和氧化 - 还原处理。在TW-1-M-2的激素生物合成过程和69相关的激素代谢过程基因也在TW-1-M-2上调这些中，54个基因上调。最DEGS是在氧化还原处理在TW-1-M-2中发现，与408上调的基因。总共880下调的基因在TW-1-M-2中发现的突变体在十个不同的功能类别，包括激素介导的信号传导途径（225度的视角），响应于激素（202度的视角），响应于脱落酸（111度的视角），乙烯 - 活化的信号通路（83度的视角），脱落酸活化的信号传导途径（81度的视角），响应于乙烯（60度的视角），乙烯生物合成过程（36度的视角），乙烯代谢过程（36DEGs），调节类黄酮生物合成过程（27度的视角）和脱落酸激活信号传导途径的调控（19度的视角）。gydF4y2Ba

TW-1-3和TW-1-M-3对比文库中的690次分为七种功能类别，包括激素介导的信号通路（178次），响应脱钙酸（78℃），乙烯 -介导的信号通路（65℃），氧化还原过程（232℃），脱落酸活化的信号通路（59℃），对乙烯（47℃）和种子萌发（31℃）的反应。其中，所有基因都在TW-1-M-3突变体中下调（附加文件gydF4y2Ba7.gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

对于响应更好的种子萌发特征的主要作用可能进行参数gydF4y2Ba

通过TW-1-M的DGE分析来识别22个大多数DEG（绝对值log2fc> 5）（附加文件gydF4y2Ba8.gydF4y2Ba）.其中13个基因表达上调，9个基因表达下调。其中包括3个转录因子、1个细胞色素基因、2个生长素诱导蛋白基因、4个氧化酶基因、1个异黄酮7-0-甲基转移酶基因、6个碳水化合物代谢相关基因、2个催化谷胱甘肽代谢的基因、1个扩张素基因和2个其他基因。这些基因的功能注释见表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba．这些基因可能是导致在TW-1-M的高种子发芽率和速度是最重要的基因。gydF4y2Ba

在本研究中，我们还分析了一些FPKM值较高的deg (TW-1或TW-1- m库FPKM值大于100)(附加文件gydF4y2Ba9.gydF4y2Ba），这些基因可以被分为8组。第一组包含主要参与碳水化合物代谢（糖基转移酶，葡聚糖酶，半乳糖苷合酶）13个基因。第二组中包括11个基因，它们是一个脱落酸 - 酸受体，二生长素调控的蛋白质，六乙烯应答的转录因子，一个赤霉素2-β-双加氧酶和一个赤霉素调节蛋白。第三组含有10个转录因子。第四组作了九个氧化还原酶（3个carboxylateoxidase，一个酰基-CoA氧化酶，一个抗坏血酸过氧化物酶，一个L-抗坏血酸氧化酶，二过氧化物酶和一个醛 - 酮还原酶）向上。第五组由5个谷胱甘肽S-转移酶。第六组inculded 4倍胚胎蛋白质的基因。第七组由三个黄酮醇基因。最后一组由两个过氧化氢酶基因（表gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

通过QRT-PCR确认读数基因gydF4y2Ba

为验证Solexa/Illumina测序技术的可靠性，选择10个基因进行qRT-PCR检测。大豆gydF4y2BaACT11gydF4y2Ba基因被用作内部对照。尽管QRT-PCR表达数据与来自SOLEXA RNA-SEQ分析的数据不是很吻合，但两种方法都产生了相同的表达趋势（图。gydF4y2Ba7.gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

在本研究中，TW-1- m和TW-1突变体中有许多基因表达水平不同。这些表达差异通过RNA-Seq分析，RNA-Seq是一种基因表达进化的完全定量方法[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]，提供新的平台，了解萌发过程与监管机制之间的关系。在我们的实验中，上调基因的数量显着高于TW-1-M中的下调基因的数量，这表明大多数与更好的发芽过程和调节机制有关的基因是上调的。基于高萌发相关的功能注释基因和途径的详细分析，发现了表达或丰度最大的基因。这些基因主要涉及抗应激，植物激素，活性氧物质和能量代谢过程。这些结果与其他植物的结果部分一致，例如小麦[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，豌豆[gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba]，拟南芥[gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba]和水稻[gydF4y2Ba33.gydF4y2Ba］．根据这些报告[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba那gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba-gydF4y2Ba33.gydF4y2Ba[植物激素和活性氧有关的基因可能在种子萌发中发挥关键作用。在LPA作物的转录组中没有发现报告，特别是在发芽过程中。然而，在LPA玉米中，自由基含量增加，种子抗氧化能力随着植物的还原而减少[gydF4y2Ba34.gydF4y2Ba]，表明，具有抗氧化能力的基因可能是LPA作物中的种子萌发速率的原因。gydF4y2Ba

DGE应激反应gydF4y2Ba

根据外界环境的变化，大豆种子在萌发过程中可以利用不同的机制来应对多种生物和非生物胁迫[gydF4y2Ba35.gydF4y2Ba］．在这项研究中，我们发现，与非生物胁迫，如盐胁迫，应激反应和应对热很多GO功能类别，即使我们执行的所有实验相同的环境条件下。这两个突变体LPA了不同的监管反应机制，发芽环境虽然具有相同的肌醇六磷酸水平和突变基因的种子。与高水平差别表达的十其它转录因子通过在TW-1的DGE分析鉴定。这些也可以参加参与应对应力和种子萌发过程的基因的调控。这些基因在突变TW-1的高表达水平可能表明，TW-1的种子必须克服在发芽阶段与突变体TW-1-M进行比较的应力不同的能力。gydF4y2Ba

DGE对植物激素的反应gydF4y2Ba

种子萌发由内在和环境提示控制，这些提示主要由两个拮抗植物激素，脱落酸（ABA）和胃植物（GA）进行调节[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．GA促进种子萌发，而ABA则相反[gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba］．在我们的研究中，我们还发现了三个候选基因，一个赤霉素2- β双加氧酶，一个赤霉素调节蛋白和ABA受体gydF4y2BaPYL12gydF4y2Ba，参与Ga和ABA新陈代谢和信号转导（表gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.赤霉素调节蛋白可能在激素控制的发育步骤中发挥作用，如种子萌发、开花和成熟[gydF4y2Ba37.gydF4y2Ba］．gydF4y2BaGA2oxgydF4y2Ba在黑暗的吸收期间，负责种子休眠和萌发[gydF4y2Ba38.gydF4y2Ba］．这两个基因在TW-1-M中上调。gydF4y2Ba球菌PylSgydF4y2Ba功能如在ABA信号转导途径的受体ABA [gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba),而gydF4y2Bapyls-gydF4y2Ba介导的ABA信号传导可能在促进植物的应力适应和生长发育方面发挥至关重要的作用[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba］．在我们的结果中，赤霉素调节的蛋白质具有最大的表达丰富，特别是在TW-1-M中，这可能负责TW-1-M的高萌发。gydF4y2Ba

另一种参与调控GA和ABA的植物激素乙烯也可能对种子萌发起作用[gydF4y2Ba41.gydF4y2Ba］．在我们的研究中，我们还发现了一些乙烯调控和生物合成基因(6个乙烯响应转录因子和3个1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶)，这些基因在6个构建的文库中具有高表达丰度。所有乙烯响应转录因子在TW-1-M中均下调，3个1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶基因在TW-1-M中上调。gydF4y2Ba

反应反应性氧气的反应gydF4y2Ba

发芽程序的成功执行在很大程度上取决于种子的氧化内环境平衡[gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba］．在大豆氧化过程中发现了许多功能基因和途径。这些基因维持氧化平衡，减少氧化对多种细胞成分的损害，包括DNA、蛋白质和脂类，并维持种子发芽的能力[gydF4y2Ba42.gydF4y2Ba-gydF4y2Ba44.gydF4y2Ba］．抗坏血酸过氧化物酶基因和l -抗坏血酸氧化酶基因在TW-1-M中表达量高，在成熟干燥种子和萌发早期调控氧化状态、保护种子和保持种子活力方面发挥重要作用[gydF4y2Ba25.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba45.gydF4y2Ba］．TW-1和TW-1- m中差异表达最多的基因是Cytochrome P450。P450家族是一个庞大而多样的同工酶群，介导一系列不同的氧化反应[gydF4y2Ba46.gydF4y2Ba］．多酚氧化酶A1在TW-1-M中高表达，揭示了在萌发和播种发育的敏感早期阶段的重要防御功能和保护作用[gydF4y2Ba47.gydF4y2Ba］．过氧化氢酶，用于确定种子的生存能力[gydF4y2Ba48.gydF4y2Ba[还被鉴定为在突变体TW-1中高表达。鉴定了一些与黄酮代谢相关的次数，例如2-羟基异戊酰酮合成酶，异黄酮还原酶同源物，异黄酮2'-羟化酶和异黄酮还原酶。这些基因参与异黄酮生物合成，异黄酮被认为是大豆种子中的抗氧化化合物。gydF4y2Ba

DGE对能量代谢的反应gydF4y2Ba

呼吸和能源生产在整个种子萌发中发挥关键作用[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．本研究发现了糖基转移酶、葡聚糖酶、半乳糖醇合酶、葡萄糖等碳水化合物生物合成和代谢途径相关的高表达和富集基因。这些基因可能在种子萌发过程中提供能量、翻译信号并参与抗氧化过程。gydF4y2Ba

我们还发现突变体TW-1中一些胚胎发生丰富的蛋白基因高表达。虽然我们比较了大豆LPA突变体的转录本，但我们没有发现任何与植酸代谢过程相关的DEGs。这一结果表明，这两个突变体在种子萌发阶段使用相同的植酸代谢途径。我们在TW-1-M中鉴定了一些可能对种子萌发有重要影响的候选基因。然而，我们仍然需要进行基因分析和基因定位来克隆这些新基因。进一步的研究将有助于了解两个LPA突变体在种子萌发方面的差异。gydF4y2Ba

提高LPA作物种子萌发特性是作物育种的重要目标。LPA大豆突变体的基因表达谱研究对了解LPA作物的萌发机制具有重要意义。gydF4y2Ba

在这项研究中，3,950-9,245 DEGS在每个反衬文库进行了鉴定，与具有类似的上调和下调DEGS与TW-1 TW-1-M。TW-1-M和TW-1显示参与种子发芽许多差异表达的转录，并从种子萌发过程DEGS主要涉及乙烯 - 介导的信号传导途径，氧化 - 还原，脱落酸介导的信号传导途径，响应激素，乙烯生物合成过程中，乙烯代谢过程，激素水平的调节，以及氧化还原过程，类黄酮生物合成过程和脱落酸激活信号传导途径的调节的调节。总之，涉及在上面的功能类别2457个DEGS进行鉴定。20个生物学功能第二十二条基因高发芽相关的代谢或信号传导通路最不同表达。五十七基因与36个生物功能有最大的表达丰度在发芽相关途径。TW-1-M显示出抗氧化，GA生物合成，应激反应和能量代谢过程，但在种子萌发中在乙烯合成低基因表达水平高的基因表达。在两个突变体LPA之间的这些生物过程的差异可为在种子的发芽率的差异的分子基础。gydF4y2Ba

这项研究的结果将让我们进一步了解种子发芽的分子机制LPA作物。这些也可以作为LPA作物发芽性状的遗传分析的重要资源。我们的工作表明植物激素和活性氧相关的基因的表达多元化TW-1-M可能强烈有助于成功发芽。gydF4y2Ba

阿坝:gydF4y2Ba

脱落酸gydF4y2Ba

可见：gydF4y2Ba

差异表达基因gydF4y2Ba

DGE:gydF4y2Ba

数字基因表达gydF4y2Ba

FPKM:gydF4y2Ba

片段/ Kb /百万gydF4y2Ba

GA：gydF4y2Ba

赤霉素gydF4y2Ba

摘要:gydF4y2Ba

低植酸gydF4y2Ba

该研究得到了该计划的支持，形成了中国国家自然科学基金（第31271754号）到FJY。我们衷心的感谢前往匿名审稿人，为改善本文提供循环康复。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

该研究得到了该计划的支持，形成了中国国家自然科学基金（第31271754号）。资助机构支持研究，分析数据并编写稿件。gydF4y2Ba

数据和材料的可用性gydF4y2Ba

支持调查结果的数据可以在稿件，补充文件中找到。在当前研究期间生成的数据集可在SRA存储库中提供，加入号为GSM2195640（TW-1-1-1），GSM2195641（TW-1-1-2），GSM2195642（TW-1-1-3），GSM2195643（TW-1-2-1），GSM2195644（TW-1-2-2），GSM2195645（TW-1-2-3），GSM2195646（TW-1-3-1），GSM2195647（TW-1-3-2），GSM2195648（TW-1-3-3），GSM2195649（TW-1-M-1-1），GSM2195650（TW-1-M-1-2），GSM2195651（TW-1-M-1-3），GSM2195652（TW-1-M-2-1），GSM2195653（TW-1-M-2-2），GSM2195654（TW-1-M-2-3），GSM2195655（TW-1-M-3-1），GSM2195656（TW-1-M-3-2）和GSM2195657（TW-1-M-3-3）。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

FY设计了该研究并起草了手稿。XY参加了数据分析并帮助起草了手稿。DD执行了统计分析并帮助起草稿件。qy开展了QRT-PCR工作。XF参与种植突变体并收集材料。SZ进行了种子萌发实验。DZ参加了设计研究并起草了手稿。所有作者均已读取并批准此稿件。gydF4y2Ba

利益争夺gydF4y2Ba

提交人声明他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

同意出版gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

我们确认这篇文章不包含任何作者对人类参与者或动物进行的任何研究，并符合研究的伦理标准。该声明由浙江省农业科学院作物科学与核技术利用研究所伦理委员会发表。gydF4y2Ba

涉及植物研究gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 浙江省农业科学院作物科学与核技术利用研究所，杭州310021gydF4y2Ba

   袁凤杰，于晓敏，董德坤，杨庆华，傅旭军，朱神龙，朱丹华gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba单华朱gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba)，它允许在任何媒体上无限制地使用、分发和复制，前提是你给予原作者和来源适当的荣誉，提供一个到知识共享许可协议的链接，并指出是否作出了更改。创作共用及公共领域专用豁免书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本条提供的数据，除非另有说明。gydF4y2Ba

重印和权限gydF4y2Ba