QTL定位和抗病候选基因镰刀菌素玉米穗腐病与伏马菌素污染

背景

镰刀菌素verticillioides伏马菌素B1 (FB1)真菌毒素是一种常见的玉米病原菌，可引起玉米穗腐病(FER)和谷物污染。对FER和FB1污染的抗性是数量性状，受环境条件的影响，目前完全抗性玉米基因型还不清楚。为了揭示与减少FER和FB1污染相关的基因组区域，并识别辅助选择的分子标记，F_2:3杂交CO441(耐药)和CO354(易感)基因型，共培育出188个子代。对人工接种2年及播期(早播期和晚播期)小麦穗的FER严重程度和FB1污染含量进行了评价f . verticillioides通过使用侧针或牙签接种技术。

结果

天气条件在两个表型季节均有显著变化，FER和FB1含量分布也有显著差异_3.后代根据年份和播种时间而定。显著正相关(P <0.01)，介于FER和FB1污染之间，范围为0.72 ~ 0.81。结果表明，FB1污染与吐丝时间(DTS)呈低正相关。基于41个微卫星标记和从基因分型测序(GBS)中获得的342个单核苷酸多态性(SNPs)，绘制了该杂交的遗传图谱。QTL分析显示FER有15个QTL, FB1污染有17个QTL, DTS有9个QTL。在FER和FB1的连锁群(LG) 1、2、3、6、7和9上有8个qtl是相同的，可以选择低疾病严重程度和低伏马菌素污染的基因型。此外，LGs 1、2、4、5和9上的5个qtl与先前报道的抗其他真菌毒素真菌的qtl位置接近。最后，24个抗病候选基因f . verticillioides结合之前的转录组数据和QTL映射。

结论

本研究确定了一组qtl和候选基因，可以加速抗性玉米品系的育种，显示出较低的疾病严重程度和低真菌毒素污染f . verticillioides．

镰刀菌素穗腐病(FER)是一种常见的玉米病害(玉米L.)，这会降低世界范围内的粮食产量和品质。真菌镰刀菌素verticillioides(Sacc。)Nirenberg是FER的主要致病因子，特别是在南欧[1，2]在美国[3.］．这种病原体是伏马菌素真菌毒素(包括伏马菌素B1 (FB1))颗粒中的主要生产者。福马菌素被归类为可能的致癌物，因为它们被怀疑与人类的食管癌和神经管出生缺陷有关，而在牲畜中，它们会导致马脑白质软化症、猪肺水肿、家禽生长减慢以及牛的肝脏和免疫疾病[1，2］．欧洲联盟制定了伏马菌素含量阈值，即未加工玉米的伏马菌素含量为4,000 ppb，而直接供人类食用的玉米的伏马菌素含量为1,000 ppb [4]，这些疾病往往在对病原体有利的年份被克服。在一项为期3年的研究(2009-2011年)中，90%的南欧玉米样品中检测到伏马菌素污染，平均水平为2,200 ppb，最高水平超过11,000 ppb [5］．

当真菌生长条件最佳时，降低伏马菌素含量的农艺措施是无效的[6］．因此，培育对伏马菌素污染的抗性成为最经济和环境安全的策略[7]，许多研究都集中在寻找耐药性[8- - - - - -13］．这些研究表明，在自交系和杂交种中存在对FER和伏马菌素污染抗性的遗传变异，但没有证据表明对病原体具有完全抗性。尽管有中等的表型相关性(r= 0.40 ~ 0.64)，两个性状的基因型相关性较高(r= 0.87-0.96)，证实对耳腐病的选择意味着对伏马菌素污染较低的基因型的选择[14］．

玉米QTL定位研究表明镰刀菌素抗性和伏马菌素污染是由小效应多基因决定的数量性状[15- - - - - -18］．Perez-Brito及其同事[15]鉴定出16个抗FER的qtl_2:3具有相同易感亲本的群体，解释了11-44%的表型变异，但只有3个qtl在群体中是一致的。罗伯逊-霍伊特和同事们[16]发现了更高效应的qtl，在两个独立的分离群体中，分别解释了FER抗性的31%和47%的表型变异以及伏马菌素浓度的67%和81%。这些qtl在种群中部分一致，并在这两个性状的相似位置上绘制[16］．根据人群的不同，FER抗性的遗传力估计在0.47-0.80范围内，伏马菌素污染的遗传力估计在0.75-0.86范围内[14］．丁及同事[17]对不同环境下的重组自交系(RIL)群体进行了FER抗性的QTL定位，发现了对FER抗性的显著上位效应以及所定位位点与环境的相互作用。最近，在4号染色体上发现了一个影响约18%表型变异的FER抗性QTL，该QTL渗入近等基因系，在纯合子状态下可占表型效应的35% [18］．

这些性状的复杂遗传基础和环境因素的强烈影响阻碍了QTL的精确定位和效应估计，从而降低了标记辅助选择(MAS)的效率[16］．这些限制可以通过增加种群规模和使用的标记物数量、改进耳腐病表型分型方案和整合来自多种环境的数据来克服[19］．特别是以前对这些性状的QTL作图研究是基于含有几百个限制性片段长度多态性(RFLP;［15])和单序列重复标记[16- - - - - -18］．近年来，单核苷酸多态性(SNPs)已成为遗传研究的首选基因分型系统，它是基因组中最便宜和最丰富的标记[20.]，如玉米中的1个SNP/100 bp [21］．随着新一代测序技术的出现，结合SNP发现和基因分型的新方法充分展示了SNP标记的潜力。例如，Elshire和同事[22]已经开发了一种简单的技术，称为基因测序分型(GBS)，该技术通过酶的限制来降低基因组的复杂性，从而构建基于低拷贝基因组区域序列的多重文库，从而最大限度地减少玉米中常见的重复区域的读取[23］．GBS已被应用于多个植物物种的种群研究、种质鉴定、育种和性状定位，包括玉米、大麦、小麦、大豆、柳枝稷和水稻[24- - - - - -28］．最近在玉米中进行了两项全基因组关联研究，以检测与增强对FER抗性相关的等位变异，结果发现三个snp对染色体1、5和9有显著影响[29]和4号、5号和9号染色体上的7个snp [30.］．

这项工作的目的是绘制FER抗性qtl，鉴定候选基因，减少FB1污染_2:3该子代是由一株抗性玉米(CO441)和一株易感玉米(CO354)杂交而成的，以前用于对玉米的抗性反应的分子表征镰刀菌素［31- - - - - -35］．在连续两年的两种不同播种时间进行表型评价，以考虑环境影响造成的变异。在众多已发表的接种方法中，选择牙签(菌丝体接种)和侧针技术(分生孢子接种)对种群进行显型，因为前者以其更强的侵袭性而闻名，后者模仿自然感染[36］．利用GBS衍生的SNPs和SSR标记构建连锁图谱，作为检测玉米FER和FB1污染qtl的基础。最后，基于QTL分析结果与之前人工接种的两个亲本的转录组数据的整合，提出了对病原体抗性的候选基因f . verticillioides［34］．

花期和接种后的疾病发展和天气条件

F_2:3群体(CO441xCO354)在2011年和2012年以及每个表型年的早播(A)晚播(B)日进行表型。

玉米开花期和籽粒干燥期的天气条件对伏马菌素污染籽粒至关重要[2］．附加文件报告了2011年和2012年试验田从开花到收获的最高和最低温度、最高和最低相对湿度和降雨量的周平均值1:图S1。

根据Kruskal-Wallis检验(P <0.05)。特别是在花期，2012A和B的最高气温明显高于2011A(中位数为29.6°C)和2011B(中位数为28.4°C)，最高气温中位数分别为32.8和31.6°C。最大相对湿度在2012年显著降低，中位数分别为75% (2012A)、72% (2012B)、81% (2011A)和88% (2011B)。最小相对湿度和降雨量在4个播期间无显著变化。

接种后相对湿度在2012年显著降低，最大值和最小值分别为73和31% (2012A)、74和31% (2012B)、87和36% (2011A)和87和36% (2011B)。2012年最高气温显著升高，中值高于32°C，而2011年则低于30°C。4个播期的最低气温和降雨量差异不显著。

2012年较高的温度和较低的湿度影响了疾病的发展，因为2011年FER严重程度的种群平均值在3.3至3.6之间，FB1污染的种群平均值在45至60 ppm之间，2012年这两个性状的平均值都达到了较高的水平(分别为3.2-4.2和37-68 ppm)。

FER严重程度和FB1污染的表型分析

CO441和CO354亲本和188 F_3.对后代进行FER严重程度的视觉评分，亲本之间的表型变异如图所示。1．将2011年和2012年播种早期(A)和播种后期(B)采用牙签法(T)和侧针法(F)侵染的穗合并，用近红外光谱法(NIRS)测定FB1含量。

FER和FB1性状在F_3.总体情况如图所示。2．夏皮罗-威尔克检验表明，各性状均无正态分布(P <0.01)，在大多数病例中，他们表现出正偏态，呈瘦峰峰型(图。2)．FER评分的正偏态是由于3的高频率^{理查德·道金斯}和图4^th类别(分别为耳朵感染的4 - 10%和11-25%)，低污染样品(< 50ppm)的FB1污染频率较高。在分析年份和播种时间中，FER和FB1均观察到海侵偏析(图2)。2):与亲本相比，几个家庭表现出较高和较低的FER严重程度和FB1污染水平，有些家庭在年份、接种方法和播种时间上是一致的(数据未显示)。

F . 2年观察到的FER评分和FB1含量的总结_3.家庭和父母在附加文件中显示2:表S1。与CO354亲本(FER和FB1的平均值分别为4.0-6.4和47-116 ppm)相比，CO441亲本在所有条件下都表现出较低的疾病严重程度和伏马菌素含量(FER和FB1的平均值分别为1.0-2.8和7-40 ppm)。两性状在群体中的均值均位于双亲值之间，除FB1 T在2012年A和b有显著差异外，Friedman检验显示显著(P <在FER和FB1性状的接种技术、播种时间和年份决定的组间差异为0.001)2:表S1)。特别是，接种牙签人群的FER中位数显著(P <0.05)低于侧针法，经Bonferroni校正的Wilkoxon符号秩检验。在2011A、2011B和2012A中，感染水平无显著差异，而在2012B中感染水平最高。相比之下，FB1污染Wilkoxon标记秩检验结果表明，2011年两种不同接种技术对伏马菌素含量影响不显著，但2012年侧针接种在两种播种时间的污染程度均较低。与FER的结果一致，2012B样品显示出明显更高的污染(附加文件2:表S1)。

表型性状与接种方式、播期、播年之间的Pearson相关系数见表1．同一播期和同一接种方式内各性状间的关系呈显著正相关(P <为0.01)，范围为0.72 (F_2012B和T_2012A) ~ 0.81 (T_2011B)1我)．在同一播种时间内，接种技术(F和T)与FER (r= 0.58 - -0.77,P <0.01)与FB1污染(r= 0.48-0.59)1我)．同一年内不同播期的相关性较低(r= 0.35 - -0.50,P <0.01)(表1此外，不同年份之间的相关性较低(r= 0.31 - -0.57,P <0.01)，表明季节对结果的影响镰刀菌素感染(表1II)。

除FB1含量和FER严重程度外，每个F还记录了播丝天数(DTS)_3.家庭，以评估可能的相关性抵抗镰刀菌素接种和开花早。DTS呈非正态分布(P <0.01)在2011B, 2012A和2012B，表现出正偏态，呈偏峰型(数据未显示)。数值在2011A为65 - 78天，2011B为59-75天，2012A为61-75天，2012B为54-70天(附加文件)2:表S1)。海侵偏析层的存在仅在2011A有记录。DTS随年份和播期的不同而有显著的统计学差异(Friedman检验，P <0.001)，最高值与2011A相关(中位数= 70)，最低值与2012B相关(中位数= 60)(附加文件2:表S1)。

利用Pearson相关系数(Pearson’s correlation coefficient)评价DTS与FER、FB1积累性状之间的相关性3.:表S2)。重要的(P <0.05)低正相关(r除2011年1月外，其余各播期DTS与FB1污染差异均为0.16 ~ 0.28)。低正相关(P <0.01)，仅在2011 1b检测到DTS与FER的差异(r= 0.25 (f)，r= 0.29 (T)。

综上所述，两种接种方法在4种不同环境下的表型数据显示，CO441xCO354群体的FER严重程度和FB1含量有充分的分离，为抗性性状的遗传解剖提供了理想的基础。

基因分型、连锁图谱构建及QTL分析

在亲本CO441和CO354上筛选出369个SSR标记，共鉴定出95个多态性标记，即只有25.7%的SSR适合进行连锁分析(附加文件)4:表S3)。为了提高图谱密度和QTL分辨率，应用了GBS，平均每个样本提供1,042,757个reads, CO441和CO354亲本分别为717,272和699,275个reads。对参考B73基因组进行变异调用，得到16236个序列变异，包括13292个SNPs和963个INDELs，而其余1981个变异属于复杂或多核苷酸多态性(MNP)等位变异类型。考虑到基因分型数据是在两个不同的代(F₂SSR标记和F₂像F的池_3.GBS患者;详见材料和方法部分)。这导致高比例的标记物被排除。在图谱构建过程中，通过仔细检查其图谱位置并与参考基因组进行比较，人工排除了一些标记。最后，383个标记(342个SNPs和41个SSRs)被包含在最终的连锁图中，覆盖面积为3168.91 cM，平均密度为8.40 cM/标记(附加文件)5:表S4)。

QTL分析采用2年(2011年和2012年)、2个播种时间(记为A和B)、2种接种方法(F或T)记录的表型数据(FER和FB1含量)。此外，对DTS进行QTL分析，以排除影响花期的位点，只考虑与抗性相关的位点。通过置换试验获得的LOD值阈值对于所有考虑的性状都在3.9到4.3之间变化(详情请参阅材料和方法部分)，但如果与另一个年份/播种时间/接种技术确定的另一个QTL或另一个性状的相同位置相对应，则我们认为LOD值接近阈值(与阈值<0.50 LOD的差异)的QTL是“稳定的”QTL。

虽然我们工作中的表型性状与疾病影响直接相关，因此与易感性有关，但育种的目标是提高对病原体的抵抗力。因此，在整个论文中，我们将认为那些减少FER严重程度和FB1污染的等位基因是有益的。FER、FB1和DTS性状在4种环境和2种接种方式下均存在显著相关性。在至少两种接种方法和/或两种播种时间和/或2年，分别检测到FER、FB1污染和DTS的15、17和9个重叠置信区间(2- lod)关联(表2)2；额外的文件6:图S2)。在2-LOD区间内重叠的QTL被称为“集成QTL”，以性状代码后跟该QTL所映射的LG表示，如果同一性状的另一个QTL在同一LG中映射，则以十进制表示。在每个性状的2-LOD重叠QTL中，选择LOD峰值最高和解释表型变异最大的QTL(以及相应的最近的辅因子标记、LOD峰值位置、加性效应和显性效应)作为整合QTL的假定值，并在表中报告2．在每个重叠QTL的2-和1-LOD区间的极值上计算集成QTL的新置信区间(附加文件)6:图S2)。

LG 10未发现整合QTL。DTS qtl分别映射在LGs 1,3,5 - 8上。FER qtl在lg10以外的所有lg10上均有分布，而FB1污染qtl在lg1 ~ 9上有分布，lg8除外。在FER和FB1污染性状间共有8个整合qtl，分布在lg1、2,3,6,7和9上(表2)2；额外的文件6:图S2)。此外，qffer -6和qFB1-6.1集成的QTL与DTS的QTL (qDTS-6)共同映射(表2；额外的文件6:图S2)。

每个整合qtl解释的表型变异的平均值，考虑最大R²值，FER (R²= 9.4%)，其次是DTS (R²= 6.7%)和FB1污染(R²= 6.6%)。

FER、FB1污染和DTS的qtl

在FER的qtl中，2011年和2012年分别检测到11个，各4个，分别为qFER-3、qFER-4、qFER-8和qFER-9.12)．表型变异由qtl (R²)范围在4.5% (qFER-2.1)至18.7% (qFER-9.2)之间。qFER-9.2的变异率最高，分别检测到2011B_F、_T和2012A_T。抗性亲本CO441在lg2、qFER-6、qFER-8和qFER-9.4上的FER qtl携带有利等位基因(降低FER)，而易感亲本CO354则在qFER-1、qFER-3、qFER-4、qFER-5、qFER-7和qFER-9.1- qFER-9.3上提供有利等位基因(表2)2)．qFER-2.1、qFER-2.4、qFER-5、qFER-6、qFER-7、qFER-9.1和qFER-9.3中的有益等位基因部分显性，qFER-2.3中的有益等位基因完全显性。

大多数FB1污染qtl在2012年两次播种中都被检测到(qFB1-1.3, qFB1-3, qFB1-4.1-qFB1-4.3, qfb1 -1 -5, qFB1-9.2和qFB1-9.3)，只有4个qtl (qFB1-1.2, qFB1-6.2, qFB1-7.2和qFB1-9.4)是稳定的(表2)2)．最小R²值与qFB1-6.2相关(R²= 2.9)，最大值为qFB1-2 (R²= 17.2)。大多数FB1污染的qtl来自易感亲本(qFB1-1.1、qFB1-1.2、qFB1-3、qFB1-4.1、qFB1-4.2、qFB1-4.3、qFB1-7.2、qFB1-9.3和qFB1-9.4)， qFB1-4.2、qFB1-4.3、qfb1 -1 -5、qFB1-7.1、qFB1-7.2、qFB1-7.1、qFB1-7.2、qFB1-9.3和qFB1-9.4中的有益等位基因(减少FB1污染)具有部分显性效应。抗性亲本贡献(qFB1-1.3、qFB1-2、qFB1-6.1、qFB1-6.2、qFB1-9.1和qFB1-9.2)在所有病例中均表现为有利等位基因的部分显性效应2)．

所有9个集成的DTS qtl在多年间都是稳定的，尽管只有qDTS-3和qDTS-6在播种时间内也是稳定的。最低的R²值与qDTS-5相关(3.4)，qDTS-4最高(13)。只有2个DTS qtl来自易感亲本(qDTS-3和qDTS-8.2)，表现出部分优势等位基因。在其他7个案例中，抗性亲本对DTS早期性的QTL有贡献，在qDTS-1.1、qDTS-4和qDTS-6中有部分显性效应(表2)2)．

与FER和FB1相同的qtl

根据2- lod置信区间，8个FER和FB1污染的qtl定位于玉米基因组的相似位置，分别位于lg1、2、3、6、7和9上。这些重叠区域中的大多数解释了表型变异的最高百分比。qFER-1和qFB1-1.1 (R²qFER-6和q-FB1-6.1 (R²分别为13.6和3.9)，qFER-7 (R²= 17.5)与qFB1-7.1 (R²= 12.8)和qFB1-7.2²= 12.4)。qfb1 -7、qFB1-7.1和qFB1-7.2在不同年份、播种时间和接种技术中均表现出较好的稳定性，仅在2011B_F和2012B_F中未检测到qtl (qFB1-7.1在2011A_F中也有检测到，但LOD(3.6)略低于显著性阈值)。在这种情况下，qffer -7和qFB1-7.1-7.2的有利部分显性等位基因由易感亲本携带2)．

qFER-3 QTL (R²= 7.5)，并与qFB1-3 QTL (R²= 5.6)，且LOD(3.0)低于置换试验设定的显著阈值(4.2)。有趣的是，LG 9的不同区域显示了FER和FB1污染的相关性，尽管解释的表型变异的百分比较小(平均R²= 5.6): qFER-9.1与qFB1-9.2共映射，qFER-9.3与qFB1-9.3和qFER-9.4与qFB1-9.4共映射。

与SSR bnlg1909相关的qFER-2.4和qFB1-2 qtl分别解释了11.6%和17.2%的FER和FB1表型变异。虽然qFB1-2仅在2011年被检测到，但qFER-2.4多年来一直稳定。有趣的是，与这两个qtl相关的加性效应和显性效应表明，抗性亲本有助于携带部分显性等位基因的抗性(表2)．

FER抗性的候选基因

为了鉴定候选基因镰刀菌素我们考虑了FER和FB1污染之间共同的集成qtl的1-LOD置信区间:qFER-2.4和qFB1-2(解释了FB1性状的最高表型变异)，qFER-7和qFB1-7.1和- 7.2(最稳定的qtl)。特别地，我们重点研究了之前抗性CO441和易感CO354基因型在72小时后的转录组比较中发现的差异表达基因(DEGs)f . verticillioides接种(34］．在上述区域的2-LOD区间和两个性状共有的其他6个qtl中包含的完整的deg列表在附加文件中报告7:表S5。

10个deg位于qFER-2.4/qFB1-2 - 1-LOD置信区间内，125个deg位于qFER-7/qFB1-7.1和-7.2置信区间内7:表S5)。其中，首先根据其表达水平进行筛选，其次根据其已知的植物防御作用进行筛选(表3.)．随后，如果在未接种的CO441和CO354对照样品中表达差异，则将deg分为“构成型”和“调制型”，如果在接种和对照样品中的一种或两种基因型之间表达差异。

在与qFER-2.4和qFB1-2相关的3.0 Mb 1-LOD区间的10个deg中，两个基因在未接种对照组的基因型之间表现出不同的本构表达，8个基因在感染时被特异性调节(附加文件)7:表S5)。除了功能未知的基因(GRMZM2G152141和GRMZM2G179827)、低表达水平的基因(GRMZM2G072984和GRMZM2G112039)和目前不知道与防御相关的基因(GRMZM2G497438)外，还有5个基因可能与防御相关f . verticillioides抗性被鉴定为:一个组成型表达的硫氧还蛋白(YPTM1)和接种后调节的基因，即脂氧合酶LOX8，一种热休克蛋白(HSP) (GRMZM2G331701)参与应激反应，a枣疯病防御基因(GRMZM2G031331)和丝氨酸苏氨酸蛋白激酶样基因(GRMZM2G053111)分别与抗性和信号转导有关(表3.)．与胁迫反应相关的基因在不同基因型中表达差异较大，其中硫氧还蛋白基因在CO441中的组成性表达量是CO354的89倍HSP在易感基因型中，接种2次以上后诱发(表3.；额外的文件7:表S5)。f . verticillioides接种导致LOX8在易感基因型和耐药基因型中分别可诱导2倍和2.4倍。

在79.4 Mb的区间内，共有125个与qFER-7、qFB1-7.1和−7.2相关的deg出现。其中三分之一(43个DEGs)在CO441和CO354基因型之间的本构水平上存在差异调控(附加文件)7:表S5)，很大一部分是假设的蛋白质(20)或功能未知(23)。在总共125个deg的列表中，我们集中在19个基于表达式值和已知函数的deg(表3.)．在应激相关蛋白中，早期响应脱水应激相关蛋白(GRMZM2G153607)、2热休克以及调节其激活的转录因子(GRMZM2G139535)。的Avr9与抗性相关的激发子反应蛋白基因(GRMZM2G133613)和磷酸载体类线粒体基因(GRMZM2G009045)接种后在抗性和敏感基因型中分别增加455倍和188倍。参与信号转导的基因包括一个富含半胱氨酸的受体样蛋白激酶10样(GRMZM2G334165)和一个WRKY转录因子(GRMZM2G139815)，它们都在接种后被调节，以及组成型表达的转录适配器家族蛋白(GRMZM2G025761)。4个aptala2 /乙烯响应元件结合蛋白转录因子(AP2/ERF)在两种基因型(GRMZM2G123119和GRMZM2G141219)中均被组成性表达(GRMZM2G467943)，或仅在敏感基因型(GRMZM2G052667)中诱导。接种CO441后，OCS元素结合因子1 (GRMZM2G092137)显著诱导(最多5次)。其他差异表达的基因编码rna结合蛋白rbp37 (GRMZM2G093947)和碳水化合物跨膜转运蛋白(GRMZM2G075951)，在抗性系中分别表达了227倍和153倍。单甘油酯类脂肪酶(GRMZM2G477743)接种抗性系后表达量增加了一倍，s -腺苷甲硫氨酸脱羧酶(GRMZM2G461159)表达量增加了4倍。值得注意的是，假设的蛋白ZEAMMB73_317354 (ac234166.1 . 1_fg002)在抗性基因型中表达了1400倍。

考虑到LOD峰值附近的2-LOD置信区间，可以获得更多的抗性候选基因(附加文件)7:表S6)。qfe -7和qFB1-7.1和−7.2的2-LOD区间对应于1-LOD极端值，qfe -2.4和qFB1-2相关的2-LOD区域跨度为40 Mb，包括耐药性相关的超敏诱导反应蛋白(GRMZM2G157869)和rpm1相互作用蛋白4样(GRMZM2G027272)和应激相关的抗坏血酸过氧化物酶(APX, GRMZM2G120517)。

在FER和FB1性状之间的其他共同qtl区域中，一些基因因其表达值而值得注意:qFER-1/qFB1-1.1中的应激相关蛋白互作子(GRMZM2G458718)， qFER-3/qFB1-3中的谷胱甘肽s转移酶(GRMZM2G019090)， PLATZ转录因子家族成员(GRMZM2G006585)，乙烯反应因子样蛋白1 (GRMZM2G053503)和FB1-1中的蛋白互作子(GRMZM2G458718)HSPqFER-9.1/qFB1-9.2中的GRMZM2G063988HSP70-2(GRMZM2G324499)和qFER-9.3/qFB1-9.3中的APX (GRMZM2G054187)， qFER-9.4/qFB1-9.4中的vicilin-like抗菌肽2-3 (GRMZM2G078441)(附加文件7:表S6)。

FER疾病发病率与FB1在F_3.人口

FER和伏马菌素污染受许多环境因素影响，需要在疾病压力持续高的试验点对这些性状进行遗传分析[37］．一般而言，开花前后雨量少、温度高，以及收获前雨量多、温度高，均有利于伏马菌素污染[2］．在本研究中，温度和相对湿度在表型的2年内存在显著差异，但在同一年内两次播期之间没有显著变化。其中，2012年开花期和接种后期温度均明显高于2011年，相对湿度明显低于2011年。

FER严重程度和FB1污染程度在不同年份、接种技术和播种时间组间均有显著差异。与气候模式一致，在2012 2b, FER严重程度和FB1污染显著升高，温度升高和相对湿度降低也加速了开花(DTS)。

FER和FB1性状在F_3.人口揭示了越轨隔离者的存在，即在父母范围之外的家庭。在筛选过FER和伏马菌素污染的人群中观察到海侵分离物[14]，也是为了赤霉菌属耳腐病(GER)，由f . graminearum，以及脱氧雪腐镰刀菌醇(DON)及玉米赤霉烯酮(ZEA)污染[38- - - - - -40］．这种现象的发生是因为来自双亲系的有利和不利等位基因的积累(加性效应)和/或上位性相互作用。在本研究中，鉴定表现优于抗性亲本CO441的子代为改进CO441提供了一个起点镰刀菌素和伏马菌素抗性育种项目。

低正显著相关(r在2011年和2012年检测到开花时间(DTS)与FB1污染之间的差异= 0.16-0.30)，表明在少数玉米基因型中，晚开花与较高的伏马菌素含量相关。另一方面，DTS与FER仅在2012年存在显著的低正相关，说明伏马菌素含量比病害严重程度更受植株发育阶段的影响。研究表明，早花杂交种通常表现出较低的穗腐严重程度和真菌毒素污染[36］．尽管如此，2012年出现的高温可能会影响开花和FB1含量。穗腐病和吐丝期之间的相关性是否来自抗性基因和早花基因之间的连锁，还需要进一步的分析。

由于在自然条件下，病原体在野外分布不均匀，人工接种是确保其均匀分布的关键[41］．在我们的研究中，植物用侧针或牙签接种技术人工接种。这两种技术都可以评估籽粒抗性，尽管亲本最初被筛选为丝通道抗性[42]而在某些基因型中，两者之间的相关性较低[36］．此外，通过耳壳注射导致伏马菌素浓度和感染严重程度升高[7，43，44］．在本研究中，两种接种技术均可根据病害水平和伏马菌素含量可靠地区分籽粒抗性的基因型。两种接种技术对FER严重程度的影响明显大于播种日期和年份:牙签侵染植株的病害症状较低，但在2011A、2011B和2012A之间病害水平相似。牙签接种耳朵的FER严重程度较低可能是由于与分生孢子相比，以菌丝体接种时病原体的生长过程较慢，或接种冲头的直径较小。另一方面，伏马菌素的含量没有受到接种技术的明显影响。无论如何，侧针接种技术在基因型筛选中的易用性和相似的效果使其优于牙签。

与大多数植物疾病相比，可以简单地直观地评估，伏马菌素污染抗性的评估需要耗时和昂贵的毒素测定。在本研究中确定的FER严重程度与FB1污染之间的高表型相关性(范围在0.72和0.81之间)表明，很少需要对真菌毒素含量进行分析。罗伯逊和同事[14]在两个群体中确定了这些性状之间较低的表型相关性(0.40和0.64)，但强基因型相关性(0.96和0.87)表明减少穗腐病的选择应经常选择减少伏马菌素污染的品系。因此，在育种计划中，抗耳腐选择可能是选择对伏马菌素污染易感性较低的基因型的有效策略。

FER和FB1抗污染qtl

在CO441xCO354 F中检测到15个FER qtl和17个FB1 qtl_3.群体(综合qtl)。所有鉴定的qtl均具有相对较小的影响，平均解释了7.9%的表型变异，值在2.9 - 18.7%之间，与先前的结果一致[15，16］．亲本中对FER和FB1污染抗性有利等位基因的存在至少可以部分解释后代中存在海侵分离子，分别比CO441和CO354亲本具有更高的抗性或敏感性。其他机制，如上位和支配，也可能在这方面发挥作用。虽然双亲都携带同样有益的FER抗性等位基因，但CO354贡献了大多数FB1抗性qtl，并与一些解释最大比例表型变异的qtl相关，如qFER-7.1 (R²= 12.8)和qFB1-7.2²= 12.4)。除qFER-1、qFER-2.2、qFER-3、qFER-4、qFER-8、qFER-9.2、qFER-9.4、qFB1-1.1、qFB1-1.2、qFB1-3和qFB1-4.1外，大多数等位基因均存在显性效应。

比较FER和FB1的qtl位置，发现很少与先前鉴定的qtl有对应关系[15- - - - - -18]，这可能是由于以前的研究使用了不同的抗性来源[15- - - - - -18］．事实上，其他作者在评估拥有共同父母的不同种群时，已经注意到种群间有限的一致性[15]，或完全不同的父母[16］．特别是，在GEFR (GE440xFR1064)和NCB (NC300xB104)群体中，只有3个FER和2个伏马菌素污染抗性qtl定位在相似位置[16］．

令人惊讶的是，与相关的qtl检测到高度对应f . graminearum引起GER，并用ZEA和DON真菌毒素污染玉米籽粒[38- - - - - -40］．本研究中使用的亲本系最初是为f . graminearum但对FER和普通黑穗病表现出类似的抗性水平(黑粉菌属菌) [42］．事实上，与亲本CO441的杂交最近被用于检测与GER抗性相关的qtl [45］．对多种玉米病原体有抗性的来源，如f . verticillioides，f . graminearum而且答:flavus，表明存在一种共同的遗传机制，调节对不同疾病的抗性[6，10，13］．在筛选的伏马菌素污染耐药和易感基因型中，FER、曲霉属真菌耳腐病(AER)、伏马菌素和黄曲霉毒素污染总是大于表型相关，再次强调了环境因素对表型的中心作用[6］．

有趣的是，本研究中检测到的8个QTL位点在FER和FB1污染之间重叠，这表明存在控制对这两个性状的易感性/抗性的遗传机制。在本研究中发现的两个性状之间的高表型相关性(0.72-0.81)以及在GEFR和NCB群体中发现的高遗传相关性(分别为0.96和0.87)[14]，证明了同时对FER和FB1污染具有抗性的基因型的MAS的可行性。

在两个性状重叠的qtl中，位于lg1、3,7和9上的qtl (qFER-9.3和qFB1-9.4)具有较低的FB1污染，而位于lg2和lg6上的qtl (CO441)具有较好的FB1污染等位基因。qFER-7、qFB1-7.1和-7.2重叠qtl在不同年份和不同播种期表现稳定²从12.4%到17.5%不等。qFER-3和qFB1-3 qtl在不同年份检测到，分别解释了7.5和5.6%的表型变异。据我们所知，这些qtl在lg3和lg7上从未被定位f . verticillioides,也不f . graminearum或答:flavus．这些基因组区域都来源于CO354系，并与多年来对这两种性状的抗性相关，是改进CO354的有希望的靶点f . verticillioides玉米的抗性。

LG 2在qFER-2.1、qFER-2.2、qFER-2.3和重叠qFER-2.4、qFB1-2 4个位点上发现了大量一致的qtl，均与SSR bnlg1909相关。后两个年份均检测到的qtl解释了大量的表型变异，其中R²FER和FB1污染最高分别为11.6%和17.2%。相似的bin位置与GER抗性和ZEA和DON污染减少相关的qtl有关[38- - - - - -40］．特别是，根据IBM2 2008 Neighbors2图谱，bnlg1909定位于距离umc1259不到4 cM的位置，是UH007xUH006双单倍体群体中GER、ZEA、DON抗性qtl的最近侧边标记[39]与bnlg108共定位于UH009xUH007双单倍体抗GER qtl的侧边标记[40]和CO387xCG62 RILs [38］．考虑到该QTL的稳定性，既确定了FER和FB1的污染，也确定了对FB1的抗性f . graminearumSSR bnlg1909周围的基因组区域是进一步解剖和候选基因鉴定的一个有趣的靶点。

LG5基因中存在针对DTS (qDTS-5)、FER (qffer -5)和FB1污染(qFB1-5)的qtl，分别解释了3.4、10.0和7.7%的表型变异。此外，qfer5位于bin 5.02中bnlg565和umc2167标记之间的一个减少DON污染的QTL附近[39]，以及bin 5.01中黄曲霉毒素污染在bnlg143和bnlg565标记之间的qtl [46]，并在bin 5.03中，关联到bnlg1046 [47］．

qFB1-4.2 QTL定位在4.05 bin, 4.04-4.05 bin代表FER抗性QTL的聚集区域[18]， GER抗性[39]以及若干人群对黄曲霉毒素的抗性[48］．此外，在CO441xB73 RIL群体中，与GER抗性相关的snp位于qFER-1/qFB1-1.1、qFER-2.2、qFB1-9.1和qFER-9.3/qFB1-9.3附近[45］．同样，qFB1-1.3、qFB1-4.1、qFER-9.1和qFB1-9.2定位于与GER抗性、ZEA和DON污染减少qtl对应的bin位置[39，40］．

开花相关QTL (qDTS-6)与伏马菌素污染QTL (qFB1-6.1)和FER QTL (qFER-6)同时定位，该QTL均在两年播种后期检测到²的13.6%。此外，qDTS-6在多年和播种中表现出了很大的稳定性，解释了9.9%的表型变异，相比之下，qFB1-6.1只在2012A发现了一个R²等于3.9%。抗病性性状与成熟度相关qtl的相关性已有报道[49]，反映了两个性状之间的低正相关。由于抗性亲本参与了这些qtl，因此在开花提前、FER和减少FB1污染之间可能存在多效基因效应。

在我们的研究中检测到的一些qtl与先前与其他疾病反应相关的基因组区域重叠。这与之前的观察相一致，即不同抗病的qtl倾向于映射到相似的基因组位置，这意味着存在调控这些性状的共同遗传机制[49］．一项meta-QTL分析分析了14项不同研究中87个FER、GER和AER抗性的个体qtl，揭示了29个qtl集群(meta-QTL)的存在，主要定位在染色体3、4和5上[50］．在我们的研究中，qtl与f . verticillioideslg4和lg5的响应与相关qtl重叠或相邻f . graminearum而且答:flavus证实了抗性qtl簇的存在。精细尺度的遗传作图对于区分连锁qtl(如“抗性簇”中的qtl)与影响对多种真菌抗性的多效qtl是必要的。有趣的是，加拿大的CO387自交系，发展为f . graminearum在元qtl分析中，对我们父母的抗性是对FER、GER和AER抗性的主要来源[50］．

最近，对玉米核心多样性面板自交系进行了两项全基因组关联研究，以检测与增强对FER抗性相关的等位变异[29，30.］．在我们的研究中，只有两个与疾病相关的SNP与我们检测到的qtl定位相似:第一个SNP位于151,295,233，位于重叠qFER-9.4/qFB1-9.4的1-LOD区间内，第二个SNP距离qFB1-4.1相关的SNP 2ch2,672,212小于5 Mb。

多因素的性质镰刀菌素和伏马菌素污染抗性对其通过MAS进行遗传改良提出了挑战，当可以确定少数中等-大效应qtl和在育种群体中一致的效应时，这是最有效的[51］．然而，由于与表型相关的高成本，MAS似乎是改进农艺表现系最合适的技术。进一步的研究使用来自CO441xCO354杂交的不同群体，并增加测试环境，将确认FER和FB1污染qtl的存在、位置和影响，最大限度地减少环境对这些性状的影响。

综上所述，本研究所定位的qtl是进一步研究FER和FB1污染的重要来源。选择FER和FB1污染程度不同的亲本，可以在研究人群中充分分离这些特征。此外，选择高产抗性亲本(CO441)为今后育种中选择具有良好农艺性能的抗性杂交种提供了理想的基础。

FER抗性的候选基因

在转录组研究中，比较了敏感和抗性玉米品系对FER的反应，提出了玉米抗FER的候选基因f . verticillioides感染，提示某些基因型的抗性可能主要是由于防御机制的本构性表达[31- - - - - -34，52］．在这项研究中，我们在72小时后对两个亲本进行RNA-Seq实验，扫描了跨越特别感兴趣的qtl的基因组区域，以寻找存在的degf . verticillioides接种(34］．FER和FB1性状之间共有的两个基因组区域被认为是FB1基因的潜在来源f . verticillioides抗性:qFER-2.4和qFB1-2，它们解释了FB1性状的最高表型变异，qFER-7和qFB1-7.1和- 7.2在多年和播种中表现出最大的稳定性。这些区域的1-LOD置信区间共有135个deg，可以认为是潜在的候选区域f . verticillioides其中约三分之一(48/135)具有未知功能。在与这些感兴趣的区间相关的DEGs中，有24个基于高表达水平和已知的防御作用进行了更详细的分析3.)．

在含有qFER-2.4和qFB1-2 qtl的区域，与胁迫反应相关的三个基因可以被认为是有价值的抗性候选基因:YPTM1，LOX8和22 kDaHSP。YPTM1在未接种的抗性系对照中是组成性的，已知硫氧还蛋白可以保护植物组织免受病原体识别后引发的活性氧产生的氧化损伤。在玉米、LOX8，导致后两种基因型均上调f . verticillioides接种(34]，是唯一确认负责生产茉莉酸(JA)的家族成员[53]，一种氧化脂素，与乙烯(ET)一起介导对坏死性病原体的反应[54］．氧脂素是参与信号传递的化合物，与植物-病原体相互作用有关，并调节真菌毒素的产生[55］．的作用液态氧在玉米-f . verticillioides通过使用玉米突变体证明了相互作用和其他病原体交叉对话[56- - - - - -59］．此外,液态氧和其他参与氧脂素生物合成的基因在抗性CO433自交系中比CO354自交系更早、更强地被诱导f . verticillioides接种(60］．在易感系中，一个编码22 kDa的基因HSP，参与蛋白质折叠和稳定，接种后特异性诱导[34］．之后在几个敏感和抗性玉米自交系中也观察到了类似的结果f . verticillioides而且答:flavus接种(61，62］．qFER-2.4和qFB1-2 qtl所在区域的候选基因应被考虑用于进一步的育种研究，以开发对多种真菌病原体具有高度抗性的杂种，因为qtl与qtl接近f . graminearum电阻(38- - - - - -40］．

在含有qFER-7和qFB1-7.1和- 7.2 qtl的较大基因组区域中，几种组成性表达水平或接种后调节的HSPs可被认为是抗性的候选基因。在转录因子中，WRKY74是f . verticillioides对两种基因型都有反应。WRKY家族的许多成员与植物免疫反应相关，开始转录发病相关基因[63，64］．AP2/ERF转录因子超家族的几个成员位于这一区域，已知它们受生物和非生物胁迫诱导，并与应激反应基因的启动子区域结合，包括防御相关基因、发病相关(PR)基因、渗透素、几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶[65］．s -腺苷甲硫氨酸脱羧酶是合成多胺的关键酶，参与了病原体反应[66]并且在CO441基因型中强烈上调[34］．与CO354相比，碳水化合物跨膜转运蛋白抗性基因型的更高的本构表达，可能证实了蔗糖在抗性植物中通过避免病原体强迫的重新分配来增强防御反应的作用[67，68］．

一般来说，亲本对QTL的贡献反映了所含候选基因的表达水平，但也有例外。候选基因在亲本接种前后的表达量在附加文件的E-H列中以FPKM表示7:表S5。例如，抗性亲本贡献了qFER-2.4和qFB1-2 QTL，在QTL区间内的10个deg中，有3个候选基因(包括qFB1-2)YPTM1)在抗性系中表现出明显高于易感系的本构表达。LOX8两种基因型在接种后都发生了诱导，抗性株系发生了更大的倍数变化，另外两个基因仅在接种后在抗性株系中发生了调节(附加文件7:表S5)。此外，在某些情况下，防御机制可能是接种后敏感性基因的下调，而不是抗性基因的上调。在qFER-2.4和qFB1-2 qtl中给出了一个22.0 kDa的例子HSP(GRMZM2G331701)，该基因在抗性系中接种后没有变化，为抗性贡献了有益的等位基因，但在敏感系中显著上调(附加文件)7:表S5)。较小的图谱间隔将允许更精确地识别涉及抗性的基因，并解决亲本贡献的有益等位基因与观察到的基因表达水平不一致的情况。

最后，一项全基因组关联研究在GRMZM2G178880的内含子区域内发现了一个与fer相关的SNP，位于与qFER-9.4/qFB1-9.4相关的辅因子标记的0.7 Mb处[29］．该基因编码纤维素合成酶样家族a蛋白，在接种后72 h, CO354和CO441亲本之间没有差异表达[34]而且，由于多态性的内含子位置，它更有可能与因果变异而不是因果变异本身相连[29］．qFER-9.4/qFB1-9.4的1-LOD区间含有33个deg，可以认为是抗性的候选基因(附加文件)7:表S5)。特别是在CO441系中接种后，可诱导出类邻近霉素抗菌肽2-3 (AMP2-3, GRMZM2G078441)达到极高表达水平(FPKM = 616.42)。此外，与fer相关的SNP距离qFER-9.3/qFB1-9.3 qtl的1-LOD区间不到4 Mb，其中包括许多与胁迫相关的蛋白质，如APX (GRMZM2G054187和GRMZM2G054300)和qtlIN2-1蛋白(GRMZM2G162486)和HSPs (GRMZM2G366532, GRMZM2G324499和GRMZM2G024718)(附加文件7:表S5)。因此，lg9上这些相邻的基因组区域可能是玉米抗FER和FB1污染等位基因变异的有趣来源。

本研究利用SSR标记和GBS在双亲定位群体中鉴定FER和FB1污染相关的qtl。除了绘制个体性状的小效应qtl外，我们还能够发现FER和FB1抗性性状之间的共同qtl，这使得选择低疾病严重程度和低伏马菌素污染的玉米基因型成为可能。值得注意的是，CO441亲本携带的qFER-2.4和qFB1-2重叠qtl可以直接应用于玉米的改良育种项目f . verticillioides抗性，因为这是一个农艺表现的自交系。在本研究中检测到的qtl在某些情况下与抗其他真菌毒素真菌的qtl位置接近，这表明它们可以用于选择抗多穗腐的品系。最后是抗病的候选基因f . verticillioides结合之前的转录组数据和QTL定位，确定了一组基因，可以进一步研究以评估它们在MAS中的作用。

植物材料

利用两种表型差异较大的玉米抗FER基因型:抗性株系CO441和易感株系CO354 [13，31，32］．这两个品系都由加拿大农业和农业食品部(渥太华，加拿大)的东部谷物和油籽研究中心获得，并由位于皮亚琴察(意大利)的可持续作物生产部的兄弟维持。

由CO441xCO354杂交生成分离种群。将抗性自交种CO441(♀)与敏感自交种CO354(♂)杂交1次，得到F₁种子。人口188 F_3.科是通过自花授粉形成的₁和F₂后代。2011年和2012年，F_3.这些家庭和父母是在意大利米兰的塞塔拉长大的，采用的是完全随机的街区设计。每年使用两个播种日期:4月20日^th5月11日^th2011年4月28日^th5月11日^th2012.早播试验称为A，晚播试验称为B。实验单位是家庭。

地块由25株植物组成，每行3米，间隔80厘米。人工疏地，每20厘米留一株，并遵循标准的栽培实践。每块地10株自花授粉，接种f . verticillioides其余植株开放授粉，作为自然侵染评价的对照。

中丝期(从播种日起，即某块地50%的植物出丝日起)被记录下来，称为“中丝期”(day to silk, DTS)。花期从6月24日开始^th至七月七日^th为2011A，由09年7月起^th到25^th2011年6月28日起生效^th至7月12日^th2012A及七月四日起^th到20^th2012 b。

位于距离试验田5公里的罗达诺(MI)的气象站记录了2011年和2012年从开花到收获期间的每日天气条件，包括降雨量(毫米)、最高和最低温度(°C)和相对湿度(%)。

接种和菌丝体生产

f . verticillioidesITEM 294是伏马菌素的高产菌，用于种子接种。该菌株来自意大利巴里国家研究委员会科学和食品生产研究所。在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养皿(直径90毫米)中培养，25°C，光周期12小时，在黑暗中培养14天。

侧针接种法(F):用无菌水冲洗培养物，用手术刀刮取琼脂表面，用无菌布过滤分生孢子悬浮液。将孢子悬液调整至终浓度3.5 × 10⁶分生孢子/ml基于使用Bürker室显微计数。

对于牙签接种法(T)，将双重消毒的牙签径向放置在装有PDA的培养皿上，并在培养皿中央放置真菌接种物的流苏。培养物在25°C的黑暗环境下培养14天，以便让菌丝体生长并覆盖牙签。

接种和疾病严重程度筛选

评价了亲本和188 F对FER的抗逆性_3.现场试验中的家庭。接种与f . verticillioides授粉后15天(DAP)进行。每块地5穗采用牙签法(T)接种，5穗采用侧针法(F)接种，5穗不接种，作为评价自然感染水平的对照。为统计分析，以相同方法接种的耳朵作为重复。

侧针接种装置由三根250毫米长的针安装在塑料手柄上组成。针浸于3.5 × 10的分生孢子悬浮液中⁶微孢子/ml，工具通过壳侧压，进入耳朵的中心，穿透玉米粒5-10毫米的深度。用同样的方法，将被菌丝体覆盖的牙签穿过外壳插入耳朵中部几秒钟。

在成熟时对人工采收和风干的耳朵进行疾病严重程度评估。9月15日进行早、晚播穗收^th2011年和9月11日^th2012.

耳腐病严重程度以1 - 7级为评分标准进行目视评估，其中1 =无感染症状，2 = 1 - 3%，3 = 4 - 10%，4 = 11-25%，5 = 26-50%，6 = 51-75%，7 = 76-100% [69](附加文件8:图S3)。在一个感染F和T的特定地块上，用其中一种方法对五个接种的耳朵的得分进行平均，以确定疾病得分。在评定中，考虑了自然田间条件下的穗腐严重程度，并减去接种条件下的穗腐严重程度。

采用近红外光谱法(Near-Infrared Spectroscopy, NIRS)测定两种接种方法下每块地的FB1含量[70］．随机抽取150-200粒，分为5个重复，用实验室磨粒机(Cyclotec^TM1093样品磨，FOSS)使用1毫米网格。在碾磨过程中特别注意避免不同病度籽粒的交叉污染。每个地块使用6500型光谱仪(FOSS NIRSystems, Inc.， Silver Spring, MD)测量了近4 g的地面颗粒的两个子样品。一个特定地块的FB1含量是通过将两个被视为(技术)重复的子样本的结果平均来确定的。近红外光谱测量在CREA-MAC进行，Unità di ricerca per la maiscoltura(贝加莫，意大利)，并根据[70］．文中给出的FB1值以ppm (mg/kg)表示。

表型数据分析

采用IBM SPSS统计版本20进行统计分析。采用Shapiro-Wilk检验计算了抗FER、FB1和DTS性状频率分布的正态性检验。采用非参数Friedman检验(P <0.05)，其次是事后Wilkoxon符号秩检验(P <0.05)，采用Bonferroni校正进行多重比较。通过计算Pearson相关系数来评价各性状间相关性的显著性。

花期指的是每一播种时间内第一天和最后一天吐丝中段之间的天数。接下来的时间段是指每次播种时间内接种后到收获的天数。采用基于秩次的非参数Kruskal-Wallis H检验(P <0.05)，采用Bonferroni校正进行多重比较。

分子标记和群体基因分型

为了构建CO441xCO354交叉的连接图，我们首先在F₂使用已发表的SSR标记进行子代鉴定。为了进一步丰富分子标记图谱，我们决定使用GBS方法[22］．植物材料的冻干和长期储存产生的DNA不适合GBS，而DNA完整性对GBS至关重要。因为不可能使用F₂对叶片进行基因型重构₂每个F_3.后代。为了确保它们充分代表了相应F的基因型₂植物，F_3.利用3个SSR标记(dupssr13, phi116, umc2118)对DNA库进行基因分型，并将结果与之前对原F . F .的SSR基因分型数据进行比较₂个人(见下文)。如果两代人之间的差异，一个新的F_3.从独立的F_3.个人或相关F₂/ F_3.被排除在地图构建之外。类似的方法被用于散装隔离分析[71]，并已成功应用[72］．因此，这两幅地图是连续两代人绘制的。采用严格的标准，只保留分离一致的标记，最终获得了基于149个基因型的综合图谱(见下文)。

SSR基因分型

根据玉米遗传基因组数据库提供的参考图谱上的染色体位置，筛选出369对SSR引物。http://www.maizegdb.org)(附加文件4:表S3)。最初，这些标记在两个亲本上进行筛选，以确定多态性。聚合酶链反应(PCR)产物在4% (w/v)琼脂糖凝胶中电泳分离，并添加10,000X Sybr®安全DNA凝胶染色(Invitrogen^TM)，并在紫外线下观察。

从157株F幼叶样本中获得SSR基因分型DNA₂个体和亲本植物生长在意大利米兰的塞塔拉。叶子被收获，冷冻干燥，冻干和研磨成细粉。按照制造商的说明(Qiagen, Inc.， Valencia, CA)，使用DNeasy Plant Mini Kit系统从粉末状叶片材料中进行DNA提取。F基因分型₂在意大利洛迪帕达诺科技公园通过间接标记的方式对后代和父母进行研究[73］．用两种不同的荧光染料(FAM和VIC, Applied Biosystems)对每个SSR标记重复标记。10 μl反应液中含有2 ng基因组DNA，每个PCR引物40 nM, PCR缓冲液1X (200 mM Tris-Cl, 500 mM KCl)， 50 mM MgCl₂、10 mM dNTPs、100 nM标记引物、5U/μl TaqDNA聚合酶(Promega, Madison, USA)和按体积的水。PCR扩增条件为:94°C × 5 min, 30个循环×(94°C × 30 s/56°C × 45 s/72°C × 45 s)， 8个循环×(94°C × 30 s/53°C × 45 s/72°C × 45 s)， 72°C × 8 min。PCR产物在ABI 3730 Prism遗传分析仪(Applied Biosystems/Applera, Darmstadt, Germany)上运行，数据用SoftGenetics的1.97版基因标记仪进行分析。筛选缺失数据小于30%的标记，得到包含95个标记的SSR数据集。

Genotyping-by-sequencing

按照制造商的说明，使用NucleoSpin Plant II试剂盒(machery - nagel，德国)从新鲜叶片中提取基因组DNA。使用PicoGreen (Invitrogen, Carlsbad, CA)进行DNA定量，并在96个孔板中归一化至10 μL或10 ng/μL(共100 ng)。协议[22]构建了两个文库，分别包含94和63个子代，加上两个亲本系(即每个文库共96和65个样本)，用于Illumina HiSeq2000平台(Illumina Inc.， San Diego, CA)上的测序。在意大利洛迪帕达诺Parco Tecnologico Padano，使用Illumina HiSeq2000仪器上的100 bp配对端模块，每个池在单个流池通道上运行。

用FastQC对Illumina HiSeq的两条通道的100 bp原始reads进行处理，以检查序列数据的整体质量。读取使用自定义解复用器进行处理，以删除条形码适配器并将每个读取分配给相应的样本。然后用Trimmomatic对每个样品的原始测序数据进行处理[74]，去除低质量的碱基和测序适配器，使用参数ILLUMINACLIP:TruSeq3-PE。发:2:30:10领先:3后拖:3滑动窗口:4:20分钟:36。通过BWA MEM [75在…上玉米基因组(AGP v3.20)从Ensembl数据库下载，所得BAM文件使用SamTools v.0.1.19进行排序和索引[76］．已排序的BAM文件使用Freebayes v9.9.2处理[77]，使用参数-m 30 -q 20 -R 0 -S 0对所有样本进行变分调用。过滤用于排除indel，仅保留亲本系间多态性和缺失数据低于30%的snp。SNP名称缩写为染色体数，后跟参考基因组上的物理位置(AGP v3.20)。

遗传连锁图谱构建及QTL分析

遗传连锁图谱构建基于149个基因型(95个SSR标记和1700个SNPs)的数据集，不包括缺失>30%标记数据的基因型。对于每个标记，CO354和CO441亲本的等位基因分别编码为A和B，在数据矩阵中用于连锁图谱构建和QTL分析。使用JoinMap 4.1的回归映射算法进行地图构建[78]，使用重组频率小于0.5且LOD大于0的连杆，并保持其他默认设置。通过Kosambi 's mapping函数将重组频率转化为以厘米摩根(cM)为单位的遗传距离。构建的图谱也包括表现出分离畸变的标记，但不包括与参考基因组相比定位在不一致位置的标记。最终将342个snp和41个SSRs聚成10个lg。

QTL分析采用MAPQTL 6.0软件[79]为每个表型数据集(即1年性状、播种时间和接种技术)。在对每个性状进行排列测试(排列数固定为1000个)后，全基因组LOD得分对应于P= 0.05为检测到的qtl的显著性阈值。根据该判据，预测的FER性状LOD阈值为2012B_F为4.3,2011A-B_F和2012A_ F为4.1，其他为4.2。将FB1污染性状的全基因组显著性阈值2011A_T、2011B_F-T、2012A_F设置为4.1，将2011A_F、2012B_ T-F设置为4.2，将2012A_T设置为3.9。2012年估计DTS的LOD显著性阈值为4.2,2011年为4.1,2011年为4.3。在第一个分析中，区间映射方法被用于估计QTL基因组区间及其对表型方差的贡献。为了检测哪些标记与qtl显著相关，哪些标记作为辅助因子候选，使用自动辅助因子选择(ACS)。采用多qtl映射(multi - qtl Mapping, MQM)方法，分析了同一LG中出现多个qtl的原因。当与acs验证的辅助因子标记相关的QTL显示LOD低于由置换试验确定的显著性阈值时，如果(a)在另一年、播种时间或接种技术的相应表型性状的同一位置确定了另一个显著QTL并且(b)与LOD阈值的差异<0.5，则该QTL无论如何都被认为是“显著”的。根据公式(mu_A-mu_B)/2和mu_H-[(mu_A + mu_B)/2]，利用MapQTL在辅助因子位置计算加性效应和显性效应，其中:mu_A、mu_B和mu_H分别为“A”基因型(CO354)、“B”基因型(CO441)和“h”基因型相关数量性状分布的估计平均值。QTL位置图采用MapChart 2.1软件绘制，具有1-和2-LOD置信区间[80］．

同一性状QTL的2-LOD置信区间重叠，定义了新的QTL综合极限，统称为“综合QTL”。[中提出的集成QTL修改规则的QTL命名81]，每个QTL的编码为“qTc-LG”。1”，式中:q =数量性状;Tc =性状码(FER/FB1/DTS);LG =联动组号;1 =该LG报告了该性状的第一个时间序列QTL，即在同一LG中对同一性状检测到更多QTL。

候选基因来源

将FER和FB1污染性状重叠的qtl的1-LOD和2-LOD置信限作为筛选候选基因的依据。确定了积分区间极限的物理坐标玉米基因组(AGP v3.20;http://www.maizesequence.org/)．将整合qtl的基因组位置与CO441和CO354之间的deg列表进行比较，这些deg列表来自之前对玉米穗72 h后的RNA-Seq分析f . verticillioides接种(34］．从Blast2GO导出基因注释和功能分类[34］．

ACS:

自动辅助因子选择

ACX:

酰coa氧化酶

爱尔兰:

曲霉耳腐病

AP2 /小块土地:

APETALA2/乙烯响应元件结合因子

APX型:

抗坏血酸盐过氧化物酶

衣冠楚楚的:

授粉后几天

度:

差异表达基因

唐:

Deoxynivalenol

DTS:

丝绸的日子

等:

乙烯

FB1:

Fumonisin B1

带:

镰刀菌素耳朵腐烂

FPKM:

每千碱基中转录本的片段数

蒙古包:

赤霉菌属耳朵腐烂

HSP:

热休克蛋白

是:

茉莉酸

格林:

连锁群

MAS:

标记辅助选择

MNP:

多核苷酸多态性

统一民族运动党:

多QTL映射

检测:

近红外光谱

PDA:

马铃薯葡萄糖琼脂

QTL:

数量性状位点

RFLP:

限制片段长度多态性

瑞来斯:

重组自交系

SNP:

单核苷酸多态性

苏维埃社会主义共和国:

单序列重复

玉蜀黍属:

玉米烯酮

作者非常感谢Antonio Logrieco和Paola Battilani提供的真菌接种物;Matteo Meroni和Mario Lopinto负责现场管理支持;Rita Redaelli, Carlotta阳台和Nicola Berardo在近红外光谱测量方面的合作;Maria Rosaria Stile提供SSR引物;Luca Pasini, Jamila Bernardi和Mauro Bergonti对表型分析的支持。

资金

这项研究得到了意大利伦巴第大区的MDF项目(MDF)的支持;意大利经济发展部的项目“意大利新面食(Qualità da Cereali Italiani, PAQ)， 2015”;由欧盟委员会的KBBE-2007-2-5-05 Mycored项目提供。VM获得了伦巴第大区的“Lombarda抗暗黑病和长叶镰刀菌”(MDF)项目的博士后合同，以及意大利经济发展部的“Pasta e Nuovi Prodotti Alimentari ad Alta Qualità da Cereali Italiani (PAQ)， Industria 2015”项目的支持。AL获得了伦巴第大区的“隆巴达地区抗diabrotica和Pianura镰刀菌”(MDF)项目的博士后合同的支持。资助机构在研究的设计、数据的收集、分析和解释以及手稿的撰写方面没有任何作用。

数据和材料的可用性

支持本文结果的数据包含在本文及其附加文件中。

作者的贡献

VM对该群体进行年份和播期表型分析并进行统计分析，进行基因分型，构建遗传连锁图，进行QTL分析并撰写稿件。CC进行SSR和GBS基因分型、遗传图谱构建和QTL分析。RP对QTL分析和手稿的关键修订做出了贡献。GP为实验设计做出了贡献。FS进行了生物信息学分析。VM和AL鉴定了假定的候选基因。AL有助于基因图谱的构建和QTL分析。AM, LR和AL构思了这项研究，参与了研究的设计和协调，并对手稿进行了批判性的修改。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

发表同意书

不适用。

伦理批准并同意参与

不适用。

作者指出

从属关系

1. 可持续作物生产部，Università意大利皮亚琴察，Emilia Parmense大街84号，29122

   Valentina Maschietto, Adriano Marocco和Alessandra Lanubile

2. 帕达诺科技公园，爱因斯坦大道，洛克。casina Codazza, 26900，洛迪，意大利

   Cinzia Colombi, Raul Pirona, Giorgio Pea, Francesco Strozzi和Laura Rossini

3. CNR农业生物学与生物技术研究所，Via Bassini 15,20133，意大利米兰

   劳尔Pirona

4. 农业与环境科学系生产、景观、农业能源，Università米兰degli Studi di Milano, Via Celoria 2,20133，意大利米兰

   劳拉·罗西尼

相应的作者

对应到劳拉·罗西尼或亚历山德拉Lanubile．

开放获取本文根据创作共用属性4.0国际许可协议(http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)，允许在任何媒介上不受限制地使用、分发和复制，前提是您对原作者和来源给予适当的赞扬，提供到创作共用许可证的链接，并注明是否进行了更改。创作共用公共领域奉献弃权书(http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/)除另有说明外，适用于本条所提供的资料。

转载及权限