古代allohexaploid中45s和5s核糖体DNA的进化动力学Atropa Belladonna.

背景

多倍体杂交种是研究植物基因和基因组分子进化的丰富资源。本研究采用核生物学和分子生物学相结合的方法，研究了茄属植物的染色体结构、分子结构和核糖体DNA (rDNA)的进化。Atropa Belladonna.(fam)。茄科)那开花植物中已知最古老的四倍六倍体之一。由于45S和5S rDNA的丰富度和特定的分子结构(进化上保守的编码区连接到可变基因间间隔，IGS)，它们被广泛应用于植物分类和进化研究。

结果

分子克隆和核苷酸测序答:颠茄45s RDNA重复揭示了其他溶那种物种的一般结构特征，以及两个长度变体的非常高的序列相似性，具有短IGS亚排的数量唯一的差异。这些结果与单独的染色体上的三对45s rdNA基因座的检测相结合，可能是从四倍体和二倍体祖先种类继承，实施例密集序列均质化，导致替代一个父母的RDNA重复的RDNA重复。染色体银染色显示，六个45s rDNA位点中只有四个常态活性，展示核仁优势。对于5S rdNA，检测到三个尺寸的重复变体，其主要类别由含有转录所需的所有功能性IGS元素表示，中间尺寸重复含有部分缺失的IGS序列，并且短5s在Ig中含有严重缺陷的重复。和编码序列。虽然更短的变体表明基于替代的速率增加，但可能在将其过渡到伪原中，功能5s rdNA变体在序列水平上几乎相同，从单个父母种类指向它们的起源。在两种染色体对上的5S rdNA基因的定位进一步支持来自四倍体祖细胞的装载量遗传。

结论

获得的分子、细胞遗传学和系统发育数据表明，在六倍体物种中rDNA位点具有复杂的进化动态Atropa Belladonna.．这一古老杂交种的45S和5S rDNA位点显示出高度的序列统一，似乎是通过不同的分子机制实现的。

实现大量植物物种，包括许多重要的工业作物，通过杂交和/或多倍化的圆圈演变[1]引起了对多倍体不同方面的深入研究，包括多倍体基因组进化机制[2］．植物基因组和基因组学研究的最新进展清楚地表明，杂交/多倍体化涉及大量的基因组重排，包括基因组之间的交换，以及基因拷贝和表达的丢失或变异。这些分子过程是物种适应进化和表现的基础。

Atropa Belladonna.从茄科与医疗应用史古异源多倍体植物的一个小属的成员，由于其生物碱，阿托品和东莨菪碱[3.那4.］．很长一段时间以来，它的起源和分类学地位一直是个谜。然而，最近的比较DNA分析表明，该属阿特罗帕，由2至5个近缘物种组成[5.那6.起源于约10至15百万年前，是由天球亚目的一种四倍体物种与一种现已灭绝的四倍体物种的姐妹种杂交而成[6.-8.］．关于建国父母一方的不确定性物种进化的跟踪更加复杂。要了解更多关于起源和这个古老的自然多倍体基因组的进化，我们研究的基因组学和分子组织Atropa Belladonna.核糖体DNA（rDNA的）。

在所有真核生物的基因组中发现的Tandemly排列的重复RDNA单元含有用于核糖体RRNA和更快地发展的基因间隔区（IGS）的进化保守序列。由于其在与可变Igs连接的保守编码区的基因组和特殊布置中的高拷贝表示，RDNA成为不同分类群中的重复序列和系统发育研究的分子演化的吸引力的重点[9.-12.］．表示5S RDNA（5S rRNA基因加）和45s rDNA（编码18°F的基因的基因组基因座主要布置在头部到尾部串联重复中。与大多数重复序列相比，其功能主要持续不清楚，5s和45s的活性对于生物至关重要，提供功能性核糖体组装的RRNA种类，其占总细胞RNA的90％以上。在真核生物中，RDNA重复的拷贝数（CN）高于RRNA合成所需的副本（RDNA的冗余拷贝）转录沉默[10.那13.-15.］．可以通过细胞学染色体分析来识别转录活性45s rDNA基因座（也称为核仁组织区域，nors）。活性基因座在中期中耐卫星染色体的相互作用和次级收缩（SC）区域中产生核仁[10.那13.那14.］．维管植物通常只有单个位点的5S和45S rDNA，尽管也观察到多个位点[10.那16.-18.］．

虽然在相同的基因组中有许多RDNA重复拷贝，但由于序列均质化的过程，它们在许多二倍体物种中往往几乎相同[19.-21.]，即重复元素的个别副本不是独立地进化，而是以协调一致的方式进化[22.那23.］．然而，最近积累的数据表明，许多序列相似度不同的rDNA重复单元可以同时存在于同一基因组中[24.那25.］．对于杂交起源的物种来说尤其如此(回顾见[10.那26.)， rDNA的遗传和进化可以遵循不同的情况。通常在第一代杂种中，继承自双亲的45S rDNA位点在结构上保持完整，同时持续差异转录沉默[13.那15.那27.-30.］．在古代的全多肽物种中，通常观察到更复杂的图片，并且父母45s rdna的装载星级遗传和/或结构重排。例如，在0.2 myr旧的天然异种情况下烟草在祖先二倍体染色体上检测到所有亲本45S rDNA位点，n的抗旱性和绒毛状．但是，45s RDNA重复特定于n的抗旱性几乎被完全消除，并被重排的绒毛状[19.那31.］．另一方面，父母5s rdna变体仍然被保守n .烟草[32.］．相比之下，在4.5 Myr老年人烟草所有妇女的异种体。恢复未检测到一个亲本物种的5S和45S rDNA位点及相应的重复变异[33.，表明异倍体基因组年龄可能是决定杂种rDNA性状的重要因素。

在这里，我们提供了45S和5S rDNA基因的染色体定位/活性和分子结构的数据Atropa Belladonna.．基于已发现的45S和5S rDNA重复序列，讨论了多倍体中rDNA进化动态的可能因素和机制。

植物材料

种子Atropa Belladonna.（加入号码986和987）是从杜宾大学植物园的收集获得的。

染色体分析

如前所述进行核科学分析[17.］．简言之，将发芽的种子的初生根分生组织用2mM 8-羟基喹预先处理，在室温下2小时，固定在乙醇 - 冰乙酸（3：1），并存储在-20℃下离体根洗涤in 0.01 M citrate buffer (pH 4.8) prior to digestion in an enzyme mixture of 20% (v/v) pectinase (Sigma), 1% (w/v) cellulase (Calbiochem) and 1% (w/v) cellulase ‘Onozuka R-10’ (Serva) for 1.5–2 h at 37 ° C. Meristems were dissected out from root tips, squashed in drops of 45% acetic acid and frozen. After removal of coverslips, the preparations were post-fixed in 3:1 ethanol : glacial acetic acid, followed by dehydration in absolute ethanol and air-dried.

用CMA（色霉素A3）和DAPI（4'，6-二脒基-2-苯基吲哚）双荧光染色，根据进行[34.］．用CMA溶液（0.5mg / ml，伺服物）染色1小时，在蒸馏水中短暂地漂洗制剂，并风干。然后用DAPI溶液（2μg/ ml，伺服丝）染色30分钟的载玻片，在蒸馏水中短暂漂洗，并安装在避压缓冲液中（Citifluor，Ted Pells Inc.）。利用[筛选方法的银染料测定45s rRNA基因的转录活性。35.］．用硼酸盐缓冲液（pH9.2）处理载玻片并空气干燥。然后将几滴新鲜制备的50％硝酸银施加到每种制剂上。用尼龙网覆盖载玻片，并在42℃下在潮湿室中温育20分钟，在蒸馏水中洗涤，并风干。核心学分析在两者的至少10个载玻片上进行答:颠茄附录986和987。在每个幻灯片中分析了10个中期板。

荧光原位杂交（鱼）

FISH采用以下核糖体DNA序列作为探针:5S rDNA (pTa794) [36.]，用四甲基罗丹明-5- dutp(罗氏)PCR标记，2.3 kb班的25S rDNA的编码区的我亚克隆拟南芥[37.]，用地高辛11- dutp(罗氏)标记。后一种探针用于确定45S rDNA的染色体定位。以下原位探针杂交和使用fitc标记的抗地高辛抗体(罗氏)对地高辛探针进行免疫检测，如所述[17.］．荧光图像是使用奥林巴斯Camedia C-4040Z数码相机连接徕卡DMRB表面荧光显微镜或Hamamatsu C5810 CCD相机连接奥林巴斯Provis AX表面荧光显微镜获得的。

45S rDNA基因间间隔区(IGS)的克隆与序列分析

使用DNEasy植物套件（Qiagen，Valencia，CA），从3个月大植物的叶子中分离出基因组DNA。

我们的早期限制性定位实验揭示了45S rDNA答:颠茄拥有生态在18S和25S rRNA的RI识别位点编码区，而没有生态国际扶轮的网站存在于IGS [38.)(附加文件1:图S1)。因此,生态RI可用于克隆完整的IGS。因此,DNA的答:颠茄（acc。没有。986）被消化了生态RI，连接到pBluescript SK，并转化到大肠杆菌应变XL-blue。图书馆被筛选为45S IGS使用^32.p标记为25s rRNA的3'末端特异性的DNA探针，如早期的描述者[19.]、Ab-IGS-1S、−2S、−1L - 3个克隆。一个克隆(Ab-IGS-1S)，包含两个rDNA重复序列中较短种类的完整IGS [38.被选择用于详细限制性图谱，代亚克隆和测序。in.order to evaluate molecular heterogeneity of the 45S rDNA, the transcribed part of the 45S IGS, i.e. the 5′ ETS (external transcribed spacer, extended from presumptive transcription initiation site (TIS) to 18S rRNA coding region) was amplified by PCR for both accessions of答:颠茄(克隆Ab-ETS-4，−5，−6，−7，−8，−9，−10，−11，−12，−14，−16，−18，−19，−21)[21.］．

5S rDNA分子分析

5S rDNA的单位是答:颠茄利用DNeasy Plant kit (Qiagen, Valencia, CA)从3月龄植株叶片中分离的基因组DNA进行PCR扩增，空斑形成单位DNA聚合酶(Thermo Fisher Scientific, Inc.)和引物Pr5S-L (5 ' -CAATGCGGCCGCgagagtagtactaggcgtgac -3 ') + Pr5S-R (5 ' -CATTGCGGCCGCTTAacttcggagtttttctgatggga-3'）免费到5s rRNA编码区域[20.]用于扩增。对于随后的克隆，不I识别网站(GCGGCCGC以粗体印刷在两个引物的5'端中加入。

The reaction was performed in 50 μl of reaction mixture containing the following components: 0.1 μg of the genomic DNA, 1.0 U of DNA polymerase, 1 × PCR buffer, 4 mM MgCl₂每个DNTPS的0.4mm，每个引物的1μm。在应用以下方案的“标准”或“软”条件下进行扩增：（1）初始DNA聚合酶活化在95℃，4分钟;（2）DNA变性在94°C，40秒;（3）底漆退火在57℃，45℃（标准）或54​​℃，90秒（软）;（4）DNA合成72℃，50秒（标准）或20s（软）;（5）在72℃下放大完成8分钟。扩增循环的总数为35.优化PCR软条件，其兴致扩增5S rDNA重复（见结果有关详细信息），在初步实验中进行。

PCR扩增5S rDNA以三份酸盐进行，并且每种加入的合并PCR产物用于克隆。从凝胶中切出不同长度的片段，用凝胶带纯化试剂盒（QIAGEN）纯化，用不I（Fermentas公司，立陶宛），连接到生态普里特莫斯38号的52号遗址被改造成大肠杆菌应变XL-blue。质粒DNA分离、酶切作图等标准程序按[39.］．使用大染料终止循环测序试剂盒和ABI Prism 310测序仪(PE Applied Biosystems, USA)对选定克隆的插入序列进行测序。序列比对采用CLUSTAL W方法[40］．

5s和45s rdna的染色体组织

染色体数量A. Belladonna，通过DAPI染色的根转神单纯细胞估计了每种体细胞72染色体。对于45s的RDNA，在单独的染色体上检测到45S rDNA簇特异的六种不同的杂交信号（图。1）．类似地，色霉素A3（CMA）染色产生了六个信号，其中两种信号相对轻微。通过银染料互补45s rDNA位置，这些位点的转录活性的指示剂互补。染色体银染色导致每种细胞的四个信号，表明只有四个45s的RDNA位点是转录活性的。

与45S rDNA相比，只有4个5S rDNA特异性信号——两个非常强和两个弱——在中期染色体上被检测到答:颠茄(无花果。1）．经过rDNA探针双FISH后，分别在不同的染色体上观察到5S rDNA和45S rDNA特异的杂交信号，表明5S和45S rDNA基因簇没有共定位。

45S rDNA基因间间隔区的序列组织答:颠茄

在我们的克隆实验我们已经分离出两个短和含有短的IGS区中的一个长的DNA片段和的45S rDNA的重复长变体答:颠茄（附加文件1:图S1)。其中一种短克隆（AB-IgS-1S）的测序显示了3710bp的Igs区域。序列可以细分为六个结构区域（SR I至SR VI;图。2）根据哈尔积分析（图3.)， gc含量计算，并与其他茄科植物45S rDNA IGS比较(见下文)。

SR I(长度222 bp, GC值44.1%)由一个独特的序列组成，与茄科远缘物种代表的序列相似性为48 ~ 53%。茄属植物bulbocastanum和Nicotiana tomentosiformis.(无花果。2）.一个富嘧啶基序CCCTCCCCCTCC出现在SR I的开头(附加文件2:图S2);此前在不同科的高等植物45S rDNA的相应区域也发现了类似的动机[9.那41那42］．在SR I的3 '端有一个GAGGTTTTT基序。该序列在茄科远亲属的代表中有1 ~ 4个拷贝:烟草那茄属植物和辣椒酱[19.那27.那31.那42那43］．显而易见的进化保护表明该图案的功能重要性，例如，转录终止。

下一个IGS区域SR II (2055 bp长，61.8% GC)含有亚重复序列(fig .;2和3.）.该区域可以在两个子区域被细分，SR II-A（162碱基对）和-B（1893碱基对）。所述SR II-B是由短subrepeats的许多份，其中的两个变体的 - Z1（32个碱基长）和Z2（33 bp的） - 可以区分（图4.）.与此相反，没有完美的重复元素，但仅显示出相似于Z-子重复序列的短片段，在SR II-A被发现了。

总之，Z1的37完美或部分缺失的拷贝，Z2的23份和Z1 / Z2-subrepeats的几个短的片段被鉴定SR II-B内。The subrepeats are arranged as dimers Z1 + Z2 in the middle part of SR II-B, whereas the beginning and the end of SR II-B consist of Z1 subrepeats only. Further analysis revealed that some Z-subrepeats contain specific point mutations, which are periodically repeated within the SR II-B. Hence, in course of molecular evolution not only short motives and single Z-subrepeats, but also long arrays composed of several subrepeats were amplified. Such long blocks are shown as “super-repeats” in Fig.4.．在SR II中，c亚重复序列的扩增模式类似烟草[19.］．对克隆的短、长IGS片段进行比较限制性映射，发现两个短克隆看起来是相同的，而长克隆的SR II长度相差0.75 kb(见附加文件)1：图S1和图3。2）.这种差异可能是由于z亚重复的数量不同。

SR III (464 bp长)由一个独特的AT-rich (33% GC)序列表示。它包含假定的启动子区域，包括3 '端转录起始位点(TIS)。在TIS之前也发现了一个类似的at富区茄属植物[11.那27.那42]，烟草[19.那31.]，辣椒酱[43]和其他植物物种[9.那41那44］．

SR III可以进一步细分为两部分，A和B. 185 BP-Long SR III-A答:颠茄与其他茄科植物的45S IGS相似性较低，而SR III-B序列长279bp，特别是假定的TIS附近的区域更为保守(图2)。2和额外的文件3.：图S3）。SR III的两部分显示SR III-A的GC含量的差异为SR III-A对25.1％的44.9％。差异是归因于富含SR III-A的富含份数的九个短GC的动机。

在45年代的IGS中答:颠茄没有subrepeats是TIS的存在下游。根据与其它茄科物种45S IGS的比较中，三个区域 - SR IV，V和VI - 可以区分（图2）.

SR IV（185 bp long，64.3％gc）答:颠茄显示出与相应IGS区域的中等相似性茄属植物和烟草(无花果。2和额外的文件4.：图S4）。在该区域中的中央部短，保守的元素（CE：41碱基对）时，这表明显著相似 - 76-80％ - 与其它茄科。以前它表明CE在马铃薯45S IGS复制马铃薯[21.，并在番茄中繁殖美国lycopersicum和相近的物种[11.］．提出CE可以参与转录调节，因为亲本45s rDNA的差异转录/沉默在三种杂种中茄属植物与CE的数量相关联27.］．与SR IV相比，下列SR V（234bp Long，68.0％GC）与45s Ig没有必要的相似性茄属植物和烟草;序列同一性水平分别为58和41％。

与18S rRNA基因相邻的区域SR VI为550 bp长（68.2％gc）。该区域表现出相对高的序列相似性（71-76％），具有远处相关的溶碱基物种（图。2和额外的文件5.:图S5)。这些片段可能参与了45S rRNA的转录和/或加工调控。

为了评价45S rDNA个体重复序列的基因组内异质性水平答:颠茄我们通过PCR扩增，克隆并测序45s Ig的转录部分（即，从推测TIS至18S rRNA编码区域中的5英寸）。总共获得20 5'ET克隆并进行限制映射。对于所有克隆，获得相同的片段模式（未显示数据）。之后，随机选择10个5克隆，并与上述完整45s Igs的序列进行测序。结果（附加文件6.：图S6）表明，这些11个单个克隆之间的序列相似程度为98.2至100％。在大多数克隆中，与共分序列的偏差分别呈现出1至3个基取代，除克隆AB-ETS-9和-10分别含有11和10个取代。此外，在克隆AB-ETS-14，-16和-12中发现了1-和2-BP长缺失和1-BP长插入。

5S rDNA重复序列的分子结构

琼脂糖凝胶分离的PCR产物表明，5S rDNA的主要类重复在答:颠茄长约260 bp(图。5）.当大量的样品用于电泳分析时检测到另外的较短DNA片段（参见图。5右面板)。数据显示，第二类5S rDNA重复序列约为180 bp，存在于基因组中A.贝拉多纳。图像分析仪的相对强度评估显示，在附加到986和987中，分别为5％至7％且小于2％的5S RDNA重复属于第二个小类。

为了克隆不同长度的5S rDNA变体，我们进行了PCR条件的优化（缩短了伸长时间，延长底漆在较低温度下延长的引物，提高引物浓度）以改善较短的次要180bp片段的扩增。这导致优先扩增效果的5S重复变体。特别地，较高引物浓度LED不仅改善了180bp片段的产生，而且还扩增了具有约120bp的长度的第三类5s rDNA重复的第三类（图。5，左侧面板，变体3）。该类在标准PCR扩增条件下保持不可检测。因此，120bp重复似乎通过非常低的CN在基因组中表示。

应用琼脂糖凝胶电泳分离技术，我们克隆了代表所有三个大小类的5S rDNA重复序列的PCR产物。总的来说，对于两种研究的供试材料答:颠茄，分离得到32个重组克隆，通过限制性内切酶作图确定插入长度后，选择其中20个进行测序。对得到的序列进行比较，得到的序列5S重复答:颠茄可分为三组：长（257-259碱基对;克隆PAB-5S-05，-09，-14，-15，-16，-24，-93），中间体（171-203碱基对;克隆PAB-5S-03，-36，-37，-43，-52，-53，-54，-61）和短（113-121碱基对;克隆PAB-5S-02，-32，-33，-39，1-42）重复（图5 b）.

长重复序列组成的区域编码5S rRNA和一个IGS的。考虑到用于PCR的引物位置帐户我们计算出如在其它真核生物中的rRNA编码区的长度为120bp的。5S IGS的长重复的长度范围为137至139个碱基，相对于茄科，例如其他代表其是较短165-229 bp的茄属植物[20.那45]和310-560碱基在烟草[32.那46]物种。与此相反茄属植物,在中央非转录部分未发现亚重复答:颠茄5 s IGS。

序列比较表明，长5S rdna重复两种accive答:颠茄非常相似（96.4-99.6％的相似性，除了一个克隆，PAB-5S_24 - 见图。5 b）.微小的差异主要是由于偶尔的碱基替换和IGS中的一些单核苷酸插入。的5S rRNA编码区答:颠茄是相同的番茄的茄属植物lycopersicum与其他索尔纳科非常相似（附加文件7.：图S7）。

与其他植物种类相似[20.那32.那47的长5S rDNA重复序列中发现编码区域下游的寡核苷酸- dt基序A.贝拉多纳。这些动机已被证明在Pol III转录终止中的真核5S rRNA基因的终止作用[48］．序列比较还透露，在长5S IGS变种答:颠茄，类似于其他植物物种[20.那32.那47]，一个tata样基序和一个GC双核甘酸分别位于编码区上游−28 ~−24 bp和−14 bp。这些动机-连同内部启动子元件-被提出形成Pol III转录起始位点[48］．因此，长5S rDNA重复答:颠茄含有结构正常的5S rRNA编码区域和转录起始和终止所需的所有已知信号。因此，它们似乎在功能上有效。

与长重复序列相比，中间的5S rDNA重复序列在IGS的中心部分包含一个缺失(53-85 bp)。尽管如此，它们仍然拥有所有的外部启动子元件和保守的5S rDNA编码区(除了克隆pdb -5S-36，编码区序列片段中包含7个碱基替换)。然而，中间重复完全或部分重复(克隆pAb-5S-36)缺乏转录终止所需的oligo-dT序列。这些结构缺陷表明中间重复是无功能的，或者存在一个替代的转录终止选项。

在短期5S rDNA的重复序列，几乎整个IGS丢失，因为是在编码区的3'末端18bp的。此外，短重复累积在5S的残留的片段编码区数个核苷酸的取代，和胞嘧啶残基在位置-1，这是需要的转录起始[48，在所有测序的短克隆中都转化为胸苷激酶。因此，这些短重复看起来很可能代表假基因。

我们计算了与共分序列相比单个5S RDNA重复的基取代数，发现这一参数显着不同地差异（表1具体地，碱基取代的频率分别为每100bp的1.43,2.26和9.74，分别长，中间和短重复。因此，在中间和短重复的碱基取代的频率似乎在约1.6％和6.8倍。

此外，我们已经比较了不同类型突变的频率，发现转变为长，中间和短重复的所有碱基取代的50.0,66.7和74.1％（见表1）.值得注意的是，在检测到的44个过渡中，C 42由C→T和G→A表示，这可能与5-甲基 - 胞嘧啶脱氨基相关。因此，看起来可能是长时间的中间体和短重复高度甲基化，这导致相应的过渡的优先积累。总之，这些数据强烈支持我们的命题，即中间和短次级别代表伪症。因此，在古代六倍体上答:颠茄，冗余的5S rDNA重复并没有以一致的方式进化。它们似乎逐渐转变为假基因，并部分从基因组中消除。

染色体分析与起源答:颠茄

小旧世界多倍体属阿特罗帕拥有独特的形态特征，占据Solanaceae的孤立的分类学态度[5.］．虽然确切的分类立场阿特罗帕仍有争议，大部分可用的数据[8.那49尽管在果实形态上有显著的差异(肉质浆果状的果实阿特罗帕相对于其他Hyascyameae的干胶囊)。在部落内,阿特罗帕是一个姐妹小组到另一个六属的叙事亚亚ee（山莨菪，山莨菪，山莨菪，山莨菪，普氏植物,赛莨菪）.人们普遍认为阿特罗帕一种起源于约10至15 Myr以前的四倍体Hyoscyameae种和已灭绝的与四倍体谱系相关的二倍体祖先之间的杂交[6.-8.］．因此，基因组的构成阿特罗帕可以被呈现为EEH1H1H2H2，其中E和H表示的基因组E.xtinct二倍体和H.亚纲分别为四倍体亲本。

大多数喀里科研究表明阿特罗帕物种具有2n = 72的核型，尽管还报道了2N = 50,60和74（参见在Tropicos数据库的植物染色体数字中提出的参考文献 -http://www.tropicos.org/project/ipcn.）.我们的染色体核型分析的结果答:颠茄与计数2N = 72明显一致（见图。1）.

在可用的出版物中，部落睫毛大米的可用细胞遗传学数据被不同地解释。袁等。[7.]提出了一个基部染色体数x = 12的剖面，该剖面与茄科中有良好支持的麻荚亚科(Hyascyameae)的分类学位置一致，它与烟荚亚科(nictianoideae)一起属于强支持的单系“x = 12”分支[49］．因此,Anisodus那Atropanthe和赛莨菪(2 n = 48),Przewalskia（2n = 44), andPhysochlaina（2n = 42）被认为是四倍体，而Hyoscyamus具有不同的染色体数目和倍性水平[7.那50那51］．与此相反，涂等。[52]认为切片中的基本染色体数为6 (x = 6)。根据这种观点，答:颠茄被认为是十二倍体。本研究通过CMA和FISH染色实验发现，在6条不同的染色体上存在3个45S rDNA位点(3对位点)。这进一步支持了六倍体的结构阿特罗帕袁等人提出。[7.并透露说阿特罗帕每个染色体组具有一个45S rDNA位点。

一般来说，茄科中存在带有随体的单染色体对是很常见的，特别是在“x = 12”分枝中，其中的几个分枝代表存在单个5S和45S rDNA位点(FISH) ([27.那53-55在其中引用）。因此，多个RDNA基因座似乎在“x = 12”的落后罕见，并且仅在展示强烈染色体进化的几个终端片中被发现[50那53那55］．因此，现有的数据表明阿特罗帕大多数可能来自每个染色体套装具有单次5s和45s rdna座的父母种类。因此，可以在现代的allohexaploid中预期5s和45s rDNA中的六个位点答:颠茄．我们的数据显示45S rDNA的6个位点确实存在于A. Belladonna，但发现只有四个5S rDNA的网站，展示两个5S rDNA的位点，因为多倍体形成丢失。

在染色体水平，植物5s和45s rdna的对比进化动力学是一种记录良好的现象。如图所示，对于几个属，45s rdna loci在大小的差异方面，在密切相关的物种，品种甚至个体之间的5s rdna是更具变量的。56-58］．一般来说，在许多植物物种 - 无论是二倍体和多倍体 - 5S位点的数量相比要低45S位点[16.那18.]，可以用作支持其分子演变模式的另一个论点。

45s rdna的分子组织和演化答:颠茄

考虑到植物RDNA序列的高相似性，编码18〜5.8s-25s核糖体RNA [10.，我们集中精力分析进化变量IGS。经酶切分析和序列分析，克隆得到答:颠茄IGS序列代表了先前基于Southern blotting的rDNA定位实验中发现的两个长度分别为9.4和10.2 kb的rDNA变异[38.］．对短克隆Ab-IGS-1S进行测序，得到长约3710 bp的IGS片段。将该IGS序列与Genbank中番茄和马铃薯的18S和25S rRNA编码序列相结合。编号X51576、X67238、X13557)及ITS1-5.8S-ITS2区阿特罗帕由uhink和kadereit描述[6.我们计算出阿特罗帕RDNA单元约为9.45千克，南方分析估计估计为9.45千克。通过限制分析估计，具有长度为6.51kb的较大克隆的Igs片段的尺寸与包含TIS的Z-Subrepeats的区域的大小（附加文件1：图S1和图3。2）显然对应于较长的10.2kb rdna重复。详细的序列表征答:颠茄IGS显示了与其它rDNA间隔体相似的结构结构Solanaceae.物种（图。2)，具体功能细分为(i) rRNA转录终止区，(ii)亚重复长块，(iii) TIS上游AT-rich区和(iv) 18S rRNA编码序列附近的5 ' ETS。

对基因组进化有特殊兴趣的答:颠茄是在两种类型的45s rDNA长度重复之间的高水平IGS序列均质化。根据其透明分离，短和长的RDNA变体位于不同的部位[38.在体细胞杂种中答:颠茄以及父母双方染色体组不完整的烟草[59］．PCR扩增的ETS克隆的15个单个基因组DNA片段的比较显示为98.2至100％序列相似性。即使在5'ETS的中心部分，即在SRV中，也观察到这种高度相似度（图。2），与其他45秒的RDNA区域相比，已知是更可变的。这些数据也与其区域的高序列同质性的结果吻合良好阿特罗帕45s rdna [6.]并且与从相关属的45S rDNA的重复二倍体（98.4至99.9％）和多倍体（93.5至99.6％）物种基因内的相似性茄属植物。为了比较，种间序列相似性变化从81％至88％为远亲的代表茄属植物物种在教派。Petota[11.那22.那28.］．

揭示了45s RDNA单独拷贝的高序列相似性在Allohexaploid中答:颠茄尽管所有三组染色体对所在的位置，但它导致他们源于单个父母的建议。以前的研究表明，在某些情况下，在某些情况下，据称单向rDNA遗传实际上是由亲本45s rdna重复的胚胎均质化[25.那26.］．事实上，我们证明了异源四倍体的45S rDNA重复烟草在结构上不同于亲代二倍体物种的rDNA变异，n的抗旱性和绒毛状[19.那31.］．然而，45S rDNA位点具有相同的染色体位置n .烟草在亲代物种中[60那61］．我们也发现了N. Tabacum，45S rDNA重复源自母系二倍体物种n的抗旱性几乎完全被父系二倍体的结构重排的rDNA所取代绒毛状[19.那27.］．后来在其他异源倍体中报道了亲本45S rDNA的部分或完全转化烟草[33.那62］．基于这些考虑，我们建议答:颠茄,类似于n .烟草[19.]，在序列转换过程中，一个亲本的重复序列被第二个亲本的rDNA覆盖或取代。

在异倍体中45S rDNA序列的分子转化似乎是时间依赖性的。通常，在对称杂交的第一代中，两种亲本的rDNA阵列都存在[26.那27.那30.］．然而，在第一代体细胞杂交中出现了新的45S rDNA变异n .烟草和答:颠茄[38.]和合成烟草[62表明45S rDNA的重排可能在杂交/多倍体化后立即开始。

在年轻的自然异源四倍体杂种中Tragopogon mirus和t . miscellus虽然亲本二倍体的染色体补体是加性的，且未发现染色体重排，但亲本二倍体的45S rDNA部分缺失[63］．in.拟南芥suecica，一种天然的异源四倍体答:芥和答:arenosa，一副答:芥NORs的缺失。同样地，在得到的人工答:suecica样的异源四倍体，对答:芥古称得到德诺维，丢失的，和/或转换为答:arenosa染色体[64］．因此，似乎有可能失去一对答:芥nors在自然观察到答:suecica在多倍化后，在接下来的几代后归因于快速染色体重排。同样，在合成中Triticum / Aegilops.异源多倍体某些亲本NOR位点在几代内完全消除[30.］．

然而，选择性消除亲本NORs和/或45S rDNA变异可能需要更多的时间。老了0.2米n .烟草,剩余的父母结果表明类rDNA在不同品种中占核rDNA总量的2 ~ 10%，在野生烟草中占25% [62]但是，还保留了三对45秒的rdna lociSylvestris-捐赠的染色体。在4.5 Myr老烟草所有妇女的异种体。记录，仅发现母系45S rDNA，这种完全二倍化归因于基因座丢失[33.］．相反，更古老Atropa,谁的年龄似乎至少有10人[6.那8.]，仍有6个双亲45S rDNA基因座均质化，提示除时间外，其他因素也可能导致多余的45S rDNA基因座的消除或均质化。

IGS亚排除被提出为影响植物中RDNA均质化的因素之一。比较45s rdna分子组织芸苔属植物和烟草， Kovarik等人[62]，提示TIS的上游和下游均存在IGS亚重复烟草在异源多倍体中，亲本45S rDNA的有效均质化可能与rDNA重组潜能的增强有关。在五国阿特罗帕，只在TIS的上游发现亚重复，而在TIS的下游未发现亚重复(图2)。2然而，虽然，亲本45s rdNA有效均质化。因此，该过程可能不需要在IGS中存在两个子级别区域。

45s RDNA基因座的差异功能活动答:颠茄

在我们的实验中核型，我们发现，大多只有了三个45S rDNA序列的两个位点似乎是功能活跃在答:颠茄．因此，出现的问题是，哪些分子机制可能是45s RDNA位点的差异活动？

众所周知，在三分之一的杂种/类多聚吡咯中，一种母体物种的RDNA基因座通常在功能上有效。该问题最初被描述为Navashin的核仁优势（ND）[65]，后来的研究证明，在分子水平上，ND意味着由于siRNA介导的胞嘧啶差异甲基化、组蛋白转录后修饰和染色质重塑而导致45S rDNA的转录沉默[13.那15.那27.那28.那30.那66］．还认为，杂种45s rDNA的差异活性可以通过父母rdNA重复的结构特性来控制（特别是通过Igs）的结构特性来控制。特别是，发现在IGS中非洲爪蟾蜍和拟南芥，上游亚重复代表转录增强子[67那68］．后来，还表明了Vigna.[69),茄属植物[27.带有更多亚重复的45S rDNA重复序列在TIS下游表现出更强的转录活性。如果在45S rDNA中没有下游的亚重复，具有更多上游TIS亚重复的变异似乎是显性的(回顾见[10.那13.那15.那26.]）。考虑这些数据，可以假设四个高度活跃的网站阿特罗帕包含了45S rDNA重复序列的长变体，而其他两个位点包含了短变体。另外，45S rDNA的转录差异可能是由于局部染色体环境引起的完全NOR失活[70那71]，可能对45s的RDNA网站不同阿特罗帕染色体遗传自远亲祖先，即两个E-相对于四个h -亚基因组。

异源四倍体的尼古利亚娜，[29.[是否发现参与与骨髓组词的45s rdNA基因座应转录活性，而转录沉默，高度甲基化的RDNA单元逃逸均质化，导致所有多元多肽基因组中的父母rDNA变体的长期持续存在。因此，可以在形成allohexaploid基因组后立即推测阿特罗帕两种父母的45s rdna基因座是活性的，允许互核组转换。结果，将45S rDNA单元除去并被第二父母的RDNA取代，并在后面的两个基因座（可能含有短45s rdNA变体和/或位于e-染色体上）变少或不活跃。目前，在现代的45s RDNA变体的推定差异活性的机制答:颠茄尚未理解，将是未来研究的重点。

分子演变答:颠茄5s rdna.

在我们的Karyological实验中，四个5S RDNA特异性信号 - 检测到两个非常强大，两个弱 -答:颠茄染色体。进一步的分子研究表明，5S rDNA由三个长度的类别表示。长级的5S RDNA重复含有转录所需的所有结构元素，因此似乎在功能上有效。相反，中间体和尤其是短阶层的重复表明了像转录开始所涉及的信号丢失的结构缺陷，甚至是编码区域的部分缺失。此外，它们表现出增加的基取代率，即非功能性假生素的典型特征。值得注意的是，突变率的增加似乎优先归因于胞嘧啶甲基化的长期增加。

短的和中间的5S rDNA重复序列在结构缺陷的特征和碱基替换的速率上明显不同，因此，可以认为是功能性rDNA转化为假基因的早期和晚期阶段。

关于四倍六倍体起源阿特罗帕在美国，人们很容易提出，5S rDNA重复序列的三个结构类可能代表三个亲代基因组，必须分别位于三对染色体上。为了澄清三个5S rDNA类的起源A. Belladonna，我们已经比较了它们的IGS序列，因为众所周知，该区域显示出非常高的分子演化速率，并且即使在密切相关的物种之间也可能不同，例如，在这种属中茄属植物[20.),烟草[32.］．我们已经发现（见图。5.)，三个5S rDNA类在答:颠茄基因组在IGS中显示出高度相似性，可能来自同一个父母。因此，第二个父母的5S rDNA丢失。

为了评估5S rDNA的相对CN重复不同长度的我们量化相应PCR产物的强度电泳分离后，发现长重复是最常见的在的5S rDNA的答:颠茄．分别比较我们的Karyological和分子数据，可以提出两个非常大的5S rDNA位点含有潜在的官能长的重复，而两个弱部位含有中间体重复，即略微受损的假期引发。这种命题与早期的数据吻合良好，在其他Solanacea 5S中，RDNA重复在阵列中非常相似[20.那32.[其他工厂在阵列中的相似性高于阵列之间的相似性[25.］．

短重复序列(即几乎没有损坏的假基因)很可能作为孤儿存在于5S rDNA位点之外，由于它们的低CN，在核学实验中无法检测到。或者，它们也可能与5S rDNA位点内的其他重复序列分散，但在这种情况下，很难解释短重复序列的高分子进化率。类似于答:颠茄，由次要序列类别代表的5S相关的伪原在几种不同的分类学基团中，例如，茄属植物[20.]，Vigna.[12.]，罗莎[47),Thinopyrum[25.］．

在几种单滴体/杂种中研究了5S rDNA的起源;找到了双向或装载量的遗产[12.那20.那24.那32.那33.那64］．在单亲本遗传的情况下，一个亲本5S rDNA重复序列的消除归因于各自染色体位点的丢失，即与45S rDNA相比，没有观察到一个亲本5S rDNA的替换。例如，未改变的亲代变异的5S rDNA仍然存在于n .烟草[32.］．对于Sanquisorba，发现复制的5S rDNA位点在多倍体化后趋于丢失，而45S rDNA位点趋于保守[72］．类似地，Clarkson等人[33.表明在新近形成的(0.2 Myr old)异倍体中烟草而在古代(4.5 Myr old)异倍体中，有一个亲本的5S rDNA位点丢失。根据这些数据，可以预期在10 Myr老答:颠茄父母一方的5S rDNA的位点可能已被淘汰。支持这一假设，我们的研究显示，两名染色体组 - 可能起源于E-二倍体 - 不承担任何5S rDNA的位点。因此，所有的rDNA 5S重复当前存在于阿特罗帕基因组似乎从H-四倍体母体衍生的。

如前所述，四倍六倍体的基因组构成阿特罗帕可以作为EEH1H1H2H2。关于从Hyascyameae亲本遗传GBSSI基因拷贝的非常高的序列相似性[7.，这看起来很可能两个h -基因组副本(即H1和H2)是非常密切的相关。因此，可以预期，位于H1和H2染色体上的5S rDNA重复序列即使不是完全相同，也必须非常相似，我们的测序数据证实了这一点。然而，尽管高度相似，来自h -四倍体亲本的两组5S rDNA重复序列的进化命运似乎是不同的:一组仍然具有功能活性，而另一组转化为假基因。

因此，消除多余的5S rDNA重复阿特罗帕发生在两轮中:e -二倍体捐赠的重复序列的丢失已经完成，而一组h -四倍体捐赠的重复序列的移除仍在进行中。

在5s和45s rdna期间的分子演化的不同模式阿特罗帕代款

综上所述，我们的研究结果表明，在一个古老的六倍体中答:颠茄45s rdna的父母染色体基因座被保守那但在序列水平上，45S rDNA经受了染色体间的转换，从而消除了一个亲本物种的rDNA重复。相反，亲本中的5S rDNA序列要么被简单地从基因组中删除，要么首先转化为假基因而丢失。因此，通过不同的方法实现了5S和45S rDNA的均质:部分删除5S rDNA重复序列vs . 45S rDNA的染色体间转换。这些重排导致了在染色体水平上的显著差异:在进化过程中5S位点的数量减少，而45S rDNA的数量保持不变。

5S和45S rDNA的部分丢失重复在阿特罗帕代表了基因组二倍体化的一个例子，这是多倍体生物进化过程中一个众所周知的现象。这种现象包括在不同层次上的许多功能和结构变化，如冗余基因表达的丢失、重复基因组序列的重排、染色体的丢失等[73-75］．

此前，提出了rDNA的分子进化的几种模式[22.那23.那76］．其中首先是一个协调的演变，其中RDNA阵列以齐心的方式发展，导致个体重复的高相似性。序列均质化的机制尚不完全理解。然而，提出了不平等的过境，基因转化和纯化选择作为协同演变的分子机制[76-78］．这种进化模式可以解释66%植物物种中45S rDNA ITS2的基因组内变异[24.］．in.阿特罗帕齐全的演化似乎已经发生了45s rdna，导致分别位于三种染色体对的基因座中的重复单元的高相似性。

第二种模式是生与死的进化，重复的单位会经历重复、发散和部分损失的循环。生-死进化是解释27%植物物种中ITS2变异的最佳模型[24.］．in.阿特罗帕在美国，5S rDNA似乎已经实现了这一设想。

本研究获得的分子、细胞和系统发育的综合数据表明，在四倍六倍体物种中存在复杂的进化动态或rDNA位点Atropa Belladonna.．我们的研究揭示了这种古代杂种物种中的RDNA序列统一，并显示了45s和5S rDNA基因座的序列均质均匀化的不同分子机制。45s RDNA耐受的间同胞瘤转化率导致消除一种父母物种的RDNA重复。相反，从基因组中除去一个父母的5S rDNA序列，或转化为伪原，然后丢失。这些分子事件导致减少5S rdna座位数A. Bellabonna.45S位点被保留。这些数据进一步有助于更好地理解多倍体植物核基因组形成和进化的分子过程。

这项工作得到了Alexander Von Humboldt基金会（德国）研究奖学金的支持，授予Rav和NVB。我们感谢Taj Arndell（Adelaide大学）仔细阅读稿件和英语的纠正。

可用性数据和材料

本文中的序列数据已在加入NOS：KF492694，KF496929-KF496945，KX196202-KX196207和KY126357-KY126368中沉积了embl / Genbank数据库。

作者的贡献

实验设计由RAV，JM和VH构思。该实验由RAV，IIP，NVB和MHB进行。数据用RAV与NVB和IIP协助分析。该文件是写的RAV，NVB和VH。所有作者均阅读并批准最终手稿。

竞争利益

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

同意出版物

不适用。

伦理批准和同意参与

不适用。

隶属关系

1. 德国埃伯哈德卡尔斯大学植物分子生物学中心(ZMBP)一般遗传学系Tübingen 72076 Tübingen

   罗马A. Volkov，Irina I. Panchuk，Nikolai V.Borisjuk＆Vera Hemleben

2. Chernivtsi Yuriy Fedkovych大学分子遗传学与生物技术系，Kotsiubynski str。2,58012，Chernivtsi，乌克兰

   Roman A. Volkov和Irina I. Panchuk

3. 澳大利亚中心植物功能基因组（ACPFG），阿德雷德大学，哈特利树丛，Urrbrae，SA，5064，澳大利亚

   尼古拉诉Borisjuk

4. 目前的addres：淮阴师范大学生命科学学院，中国淮安223300

   尼古拉诉Borisjuk

5. 植物解剖学和细胞学，西里西亚大学，40032，卡托维兹，波兰系

   玛塔Hosiawa-Baranska＆Jolanta Maluszynska

相应的作者

对应于罗马A. Volkov.．

开放访问本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议(http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)，它允许在任何媒体上无限制地使用、分发和复制，前提是你给予原作者和来源适当的荣誉，提供一个到知识共享许可协议的链接，并指出是否作出了更改。创作共用及公共领域专用豁免书(http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/)适用于本条提供的数据，除非另有说明。

重印和权限