一个高白粒发生率的缺口腹突变体对水稻粒白垩白相关途径的代谢组学分析

背景

垩白是一种对稻米外观和碾磨品质极为不利的性状。由于多种基因和生长环境之间的复杂相互作用，白垩质的形成的生理和分子基础仍不完全清楚。

结果

我们报告了一个缺口腹突变体(DY1102)的非靶向代谢组学分析，该突变体具有高比例的白腹，主要发生在胚胎近端底部。在UPLC/MS/MS和GC/MS复合平台上对发育谷物中的代谢物进行分析。花期后5天、10天、15天、20天是白垩质形成的关键时间点。共鉴定出214种代谢物，覆盖了大部分中枢代谢途径和部分次生途径，包括氨基酸、碳水化合物、脂类、辅因子、肽、核苷酸、植物激素和次生代谢物。DY1102发育粒的底部白垩质部分和上部半透明部分进行比较，得到180个与白垩质形成有关的代谢物。

结论

总的来说，与半透明的上部相比，白垩质胚乳中合成贮藏淀粉和蛋白质的碳、氮代谢代谢产物水平较低，伴随而来的是参与活性氧清除、渗透、细胞壁合成和矿物离子稳态的通路受到干扰。在此基础上，探讨了白垩质形成的代谢机制，并强调了胚胎的作用。

垩白是水稻胚乳中淀粉粒和蛋白体松散堆积而形成的不透明部分[1，2］．根据其在胚乳上或胚乳内的位置，白垩质可分为白腹、白核、白背等。垩白是一种非常不可取的性状，对稻米外观质量以及碾磨、食用和烹饪质量都有不利影响。粮食白垩病的高发一直是世界各地许多水稻产区面临的一个主要问题，特别是在气候变暖的情况下[3.］．降低白垩粒率一直是水稻育种者和生产者的主要目标之一。

白垩质是一种复杂的数量性状，受多基因控制，受温度和湿度等环境因素以及施肥和灌溉等文化实践的巨大变化影响[4］．通过对众多定位群体的分子标记QTL分析，在所有12条染色体上鉴定出超过140个QTL，其中大部分在亚洲品种中[2］．其中，染色体1、5、7、8和9上的几个主要qtl在多种环境或不同群体中稳定表达[5］．此外，通过精细定位，还克隆出了几个可能与籽粒垩白有关的候选基因，包括丙酮酸正磷酸盐dikinase，淀粉合酶iii a，UDP-glucose焦磷酸化酶，细胞壁转化酶,H⁺-translocating焦磷酸酶(V-PPase)，由Sreenivasulu等人审阅。[2］．在此基础上，对白垩质形成的分子基础有了一定的了解。李等人。[6的功能Chalk5，它编码V-PPase与无机焦磷酸盐水解H⁺易位的活动。他们发现,Chalk5会扰乱内膜运输系统的pH稳态，导致蛋白体数量和大小的异常减少，导致淀粉粒和蛋白体的形状和空间排列异常。

稻米品质基本上是由淀粉和蛋白质储存的化学成分决定的，这些化学成分来源于灌浆过程中碳(C)和氮(N)的代谢。代谢组学是生物代谢产物综合分析的“组学”研究之一[7］．与基因组学、转录组学和蛋白质组学一起，它是一种强大的工具，可以提供基因型和表型之间的联系，并产生系统生物学的新知识。除了可以了解植物在各种环境下的代谢状态外，它还可以应用于利用目标植物的天然变异或突变体来阐明未知基因的功能，并可能在育种项目中有用，因为味道等品质性状与代谢条件之间的密切关系[8］．在水稻中，代谢组学方法对种子代谢的组成和调节有了新的认识[9]，粳稻和籼稻的代谢表型与地理起源之间的相关性[10]，高温下籽粒灌浆相关代谢[11]、食物质素预测[12]，以及米饭中的生物活性化合物[13］．然而，关于垩白形成的代谢组学分析的资料很少，其代谢基础尚不清楚。此外，灌浆早期是垩白形成的关键时间点，对其代谢变化的研究较少。

利用EMS的化学诱变剂，我们鉴定出一种白腹粒比例高的缺口腹突变体[14］．切口线将籽粒分成两部分，上部几乎全部半透明，而下部靠近胚部，有高发生率的白腹。利用该突变体的成熟颗粒，Lin等人[14]开发了一种新的比较系统，可以最大限度地减少遗传背景和生长环境的影响，并对胚乳蛋白质组学进行了全面的调查，揭示了导致籽粒白垩质的多种但调控良好的途径。在本研究中，我们分析和比较了缺口腹突变体发育粒的上半透明部分和下白垩部分之间的代谢组。共鉴定出214种代谢物，其中180种代谢物丰度在白垩质部分发生了显著变化。这些改变的代谢物表明，白垩质的形成与从C和N代谢到活性氧(ROS)清除、渗透、细胞壁合成和铁稳态的代谢转移有关。白垩质部分次生代谢和植物激素生物合成相关代谢产物水平也发生了显著变化。这些结果扩展了我们对谷物白垩质的代谢机制的理解。

我们获得了一个具有高比例的凹腹突变体。缺口线可以在5 DAA后播种，可能是由于壳对颖果伸长的限制(图。1)．弯曲的收缩改变了颖果的形态，导致上下部分的形状不同，如图所示。1．这种形态上的变化可能直接导致了两半之间代谢的差异，可能是由于代谢产物从下半部分向上半部分的供应受到了限制。事实上，我们实验室在2014年进行的发芽实验显示，在发芽后3周，上半部分保持不变，而靠近胚胎的下半部分已经完全分解(数据未显示)，说明缺口线可能阻止了物质流动。然而，谷粒的两个部分被认为是独立成熟的，因为它们通过背侧的维管束分别从源器官获得同化物[15］．

水稻胚乳的代谢物分析

切腹突变体切腹粒率较高，2014年温室条件下切腹粒率为66.58%(表2)1)．花后5天(DAA)腹侧切口线可见，切口纹的主要部分为白腹，在花后20天(图)可见。1)．其中，温室温室穗中部初级轴白腹粒比例较高，2014年为80.54%(表1)1)．此外，大部分白腹发生在胚近端的下半部分，即缺口线以下，温室中占95.62%。

在之前对该突变体成熟胚乳的蛋白质组学研究中，Lin等人[14]发现，参与碳水化合物代谢(特别是细胞壁合成)和蛋白质合成、折叠和降解的几个关键蛋白质是造成水稻粒白的原因。这些蛋白质组学数据促使我们研究在籽粒发育过程中与白垩质组织形成相关的代谢变化。

通过将在温室中生长的谷物的半透明(Tr)上部和白垩(Ch)下部放在三个分析平台上(优化的UPLC/MS/MS针对基本种，优化的UPLC/MS/MS针对酸性种，优化的GC/MS针对小的，易挥发的，热稳定的分子)，我们鉴定出214个水稻谷物代谢产物(附加文件)1)．214个代谢产物可被划分为8个超级通路(图。2)和随后的39个子路径(附加文件1)根据植物代谢网络(PMN)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)。这些代谢物主要覆盖中枢代谢途径和部分次生代谢途径，包括66种氨基酸、51种碳水化合物、38种脂类、18种CPGECs(辅因子、假体基团、电子载体)、17种核苷酸、12种多肽、10种次生代谢物和2种植物激素。本研究的代谢组表与玉米籽粒的代谢组表相似[16]和稻种[10和anther [7］．对所有214个代谢物进行非监督主成分分析(PCA)。如图所示。2 b在发育的各个时间点Ch和Tr部分都有明显的分离，说明白垩质胚乳的代谢与半透明胚乳的代谢不同。大多数组的紧密分组也证明了组内良好的生物重现性。

发育阶段的代谢变化

在水稻种子发育过程中，胚和胚乳在细胞分裂和分化方面同步发育，在约10 DAA的时间内完成形态分化和发育[17］．在此之后，胚组织在生理上成熟，胚乳在25 ~ 30 DAA时积累了大部分贮藏物质。值得注意的是，据Li等人报道，白垩质的形成始于约5 DAA。[6他证明了Chalk5表达量在5和10 DAA时更高。

我们研究了半透明和白垩质胚乳在种子发育的5天间隔内的代谢组学变化动态，即5、10、15和20 DAA。统计检验比较了每个部分中与时间相关的各种变化，并比较了两个部分在每个发育时间点上的相互比较。每个试验组设6个生物重复。所有数据的热图显示，随着种子的成熟，绝大多数化合物的相对含量明显总体下降。3.)．这是预期的模式，因为碳和氮被并入大分子(淀粉、蛋白质和脂类)，因为种子接近成熟的静止状态。该地图还显示了组内一般良好的生物重现性。

生物学差异的大小，无论是在发育过程中观察到的，还是在两个部分之间观察到的，都可以通过对符合统计截断标准的化合物的简单总结来判断(p≤0.05)。注意，在时间过程的比较中，有更多的化合物随着时间的推移而减少，而不是随着时间的推移而增加2)，与上述热图的观测结果一致。因为在两两比较中，半透明的Tr部分被指定为对照，与垩白的Ch部分进行比较，我们计算了所有情况下Ch/Tr的比值的变化。即白垩质胚乳Ch部分含量增加的化合物较多，而半透明部分Tr部分含量减少的化合物较多。从这些数字来看，Tr部分的化合物在5 DAA时显著升高，但在10和15 DAA时这种趋势减弱，到最后时间点(20 DAA)， Ch部分的化合物升高。这表明两个部分的胚乳发育有明显不同的动力学。

白垩质胚乳中氨基酸代谢的改变

除Gly、Asp和Arg外，白垩质部分的氨基酸含量低于半透明部分(图。4)．氨基酸含量的减少与作为渗透剂和抗氧化剂的衍生物的交替(基本上是增加)相一致。

Glutamate-derived氨基酸

白垩质胚乳中Glu、Gln、His、Pro等氨基酸含量降低，而Arg含量上调(图4)。4)．植物中常见的三种多胺腐胺(Put)、亚精胺(Spd)和精胺(Spm)均在10 DAA后升高。水苏碱(脯氨酸甜菜碱)在所有四次采样中都有所增加。谷氨酸的乙酰化生成n -乙酰谷氨酸(NAG)是谷氨酸转化为精氨酸的第一步。NAG水平的升高伴随着15 DAA和20 DAA时瓜氨酸和精氨酸水平的升高，尽管鸟氨酸在5 DAA时降低。白垩质胚乳中γ-氨基丁酸(GABA)的含量也较低，但随着时间的推移，这一化合物在两部分都在下降，在15 DAA时达到最低。此外，白垩质胚乳在发育中期出现较低的氧化谷胱甘肽(GSSG)水平，提示氧化环境较弱。与此一致的是，还原性谷胱甘肽(GSH)和5-氧脯氨酸(5-OP)水平较低。

Aspartate-derived氨基酸

总体而言，白垩质胚乳中氨基酸Asn、Ile、Thr和Lys呈下降趋势，Asp在15 DAA时增加，Asn在10 DAA时略有增加(图4)。4)．此外，来自赖氨酸的2-氨基己二酸也随着时间的推移而下降。n- 6-三甲基赖氨酸是蛋白质-赖氨酸的降解产物，在采样后期白垩质胚乳中n- 6-三甲基赖氨酸显著升高(15和20 DAA)。

Serine-derived氨基酸

在白垩质胚乳中，Ser在15 DAA和20 DAA时减少，而Gly在10 DAA时略有增加。4)．观察到的最一致和最强的影响之一是，白垩质胚乳倾向于含有较高水平的几种叔氨基化合物(甜菜碱)，这是强渗透剂。这些药物包括葫芦巴碱(尼古丁甜菜碱;无花果。5)、甜菜碱(甘氨酸甜菜碱)、水苏碱、磷胆碱(由脂膜合成或降解产生)和n -6-三甲基赖氨酸(图6)。4)．

芳香族氨基酸

芳香族氨基酸，苯丙氨酸，Tyr和色氨酸，是植物代谢的中心分子，是广泛的次生代谢产物的前体。其前体莽草酯在5 DAA和10 DAA时减少，而在15 DAA时增加。4)．Trp和Phe呈下降趋势，Tyr无明显趋势。相比之下，Tyr的衍生物酪胺被还原了。血清素被认为在植物中具有抗氧化和防御功能。白垩质胚乳从5 DAA下降到15 DAA。此外，石草酸酯生物合成途径的一个分支合成的代谢物quinate在10 DAA和15 DAA上增加。尽管其生理作用尚未完全阐明，但已经在真菌入侵的植物中检测到quinate的积累[18]以及在用抑制氨基酸生物合成的除草剂处理后[19］．

含硫氨基酸

硫是一种必需的宏量营养素，主要用于合成Cys、Met和许多必需和次生代谢物，如5 ' -甲基硫代腺苷(MTA)、s -甲基甲硫氨酸(SMM)和年代腺苷甲硫氨酸(SAM)。白垩质胚乳中的Cys、Met和SMM减少，而MTA在5 DAA下降的情况下呈增加趋势(图1)。4)．甲硫氨酸亚砜(MetO)是Met被活性氧氧化的产物。同样，s -腺苷同型半胱氨酸(SAH)，通过SAM循环参与SAM代谢再生的中间产物，也下降了。此外，Ser向Cys转化途径的中间产物o -乙酰丝氨酸(OAS)在10 DAA时下降。

白垩质胚乳中C代谢的改变

植物中一个重要的代谢物库是磷酸己糖，另一个由磷酸戊糖途径中间体和磷酸三糖——甘油醛3-磷酸和磷酸二羟基丙酮[20.］．己糖磷酸池由三种相互转换的代谢中间体组成:葡萄糖6-磷酸(G6P)、葡萄糖1-磷酸(G1P)和果糖6-磷酸(F6P)，它们来自游离己糖的磷酸化或淀粉和蔗糖的降解。己糖池为糖酵解和许多生物合成过程提供中间产物，包括淀粉和蔗糖的合成，细胞壁的形成和戊糖的氧化反应。

F6P和它的导数

白垩质胚乳中F6P和糖酵解途径和三羧酸(TCA)循环的中间产物发生了改变。白垩质胚乳中F6P和3-PGA的变化趋势相似，在5 DAA和10 DAA上差异不显著，但在15 DAA和20 DAA上高于半透明胚乳(图2)。5)．在白垩质胚乳中，丙酮酸仅在10 DAA时略有增加。在TCA循环中，苹果酸、富马酸、琥珀酸和异柠檬酸4种代谢物在15 DAA或20 DAA的成熟早期阶段升高，而α-酮戊二酸在5 DAA时降低。总的来说，这些中间产物呈现增加的趋势，说明在白垩质胚乳中，糖酵解和TCA循环发生了转移，主要产生参与氨基酸、脂肪酸、次生代谢物和细胞壁代谢的选择性中间产物。

G6P及其衍生物

在白垩质胚乳中，G6P在5 ~ 15 DAA之间无显著变化，但在20 DAA时显著增加(图2)。5)．值得注意的是，G6P显著升高的同时血糖显著降低。葡萄糖，G6P和细胞壁生物合成的前体，在所有四次采样中都减少了。此外，其他植物细胞壁前体，包括葡萄糖酸酯和木糖的丰度也有类似的下降趋势。另一方面，白垩质胚乳中阿拉伯糖醇的变化不明显。在戊糖磷酸途径中，5-磷酸核糖在15 DAA时显著降低，而sedoheptulose-7-磷酸则不显著改变。参与光呼吸的甘油有增加的趋势，在10 DAA和20 DAA时略有增加，在15 DAA时显著增加。此外，白垩质胚乳中核酸的关键成分——核糖和核酮糖含量降低。

G1P和它的导数

白垩质胚乳中的G1P在细胞分裂开始时(5 DAA)下降，此后保持在相当水平(图2)。5)．蔗糖是叶片向籽粒输送碳的主要物质，在10 DAA和15 DAA时下降，表明源器官光合同化物供应不足。尽管麦芽糖的含量显著增加，但葡萄糖和果糖的含量却随之减少，这意味着淀粉的分解速度加快，或者麦芽糖转化为葡萄糖和果糖的速度减慢。

白垩质胚乳积累的棉子糖含量明显高于半透明胚乳。5)．棉子糖前体之一的udp -半乳糖在大多数时间点也较高，而其直接前体半乳糖在大多数时间点的两部分含量相似。与棉子糖的增加相一致的是，两种糖醇，赤藓糖醇和苏糖醇，也显示了这种模式(附加文件1)．

除了棉子糖含量较高外，白垩质胚乳在后期的时间点也比半透明胚乳表现出较高的淀粉中间体和己糖磷酸盐1)．在所有时间点上，除最后一个时间点外，半透明部分的蔗糖和己糖含量都较高。这种模式是否表明了调控碳在这些线上分布的不同定性机制，还是仅仅反映了轻微的动力学变化，目前还不清楚。

随着时间的推移，两种胚乳都积累了植酸(肌醇6-磷酸，I6P)及其前体I5P，在20 DAA时，这一趋势有所加快(图2)。5)．而白垩质胚乳中植酸含量略高，I5P含量在后两个时间点显著增加。白垩质组织中I3P仅在中间时间点略高，而I1P与I5P的模式相似，只是在半透明胚乳中这些化合物在发育过程中没有变化。在白垩质胚乳中，植酸合成的早期步骤可能被加速，从而推动了反应;另外，白垩质胚乳中植酸向最终产物转化较慢可能是中间产物含量较高的原因。

对于细胞壁前体，鼠李糖在5 DAA时减少，而阿拉伯糖没有显著变化(图。5)．此外，海藻糖，一种α， α -1,1-连接葡萄糖双糖，在调节糖的利用中不可或缺，在20 DAA时升高。值得注意的是，甘油和甘油-3-磷酸(G3P)同时减少，两者都与脂质代谢有关。

与白垩质胚乳形成有关的其他代谢物

脂质

一般来说，大部分脂质在白垩质组织中呈下降趋势1)．然而，人们注意到，在几种脂类的发育相关的变化有一些不同的动力学模式。垩质部分的四种游离脂肪酸包括二十醇酸酯、亚油酸酯、亚油酸酯和油酸酯均被还原。同样，在白垩质胚乳中，1-亚麻油酰甘油、2-亚麻油酰甘油、1-油酰蜡磷胆碱、甘油磷胆碱、β -谷甾醇、油菜甾醇及其前体角鲨烯等甘油甾醇的含量也有所降低。植物鞘氨醇在白垩质胚乳发育过程中含量较低，但在早期的半透明部分含量较高，随后下降。其前体鞘氨苷在两种组分中相似。值得注意的是，在胆碱途径中，胆碱减少，而其前体磷酸胆碱和磷酸乙醇胺增加(图1)。4)．

虽然绝大多数脂类物质在种子发育过程中随着时间的推移而减少，但几种氧脂类物质是在种子发育后期增加最快的少数化合物之一。9、10-diHOME、12、13-id-HOME和13-HODE+9- hode的动力学模式都表现出非常相似的模式，在发育初期较高，但在发育中期下降，然后在最后一个时间点急剧上升(图5)。6)．然而，这种模式在白垩质胚乳中稍微早一些。在10 ~ 15 DAA之间增加，20 DAA时增加较大，但在10 ~ 15 DAA之间上部半透明部分保持不变或下降，15 DAA后才开始增加。这表明，在这些化合物的调节过程中，白垩质胚乳大约提前了5天发生了转移。

CPGECs

一般来说，CPGECs随着种子发育的进展而增加1)．CoA代谢中泛酸含量在白垩和半透明部位均升高，其中白垩和半透明部位泛酸含量较高。在烟酸和烟酰胺代谢中，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺在种子发育过程中，烟酸和胡葫芦巴碱(N′-甲基烟酸)含量升高。白垩质胚乳中磷酸盐含量均呈下降趋势，在5 DAA和10 DAA时较低，而在20 DAA时略高。

两部分氧化应激环境存在差异。白垩质胚乳显示出较高的抗坏血酸水平，表明氧化环境更少。与此一致的是，两种抗坏血酸分解产物，脱氢抗坏血酸和苏氨酸的水平较低。此外，两亲性抗氧化剂α -生育酚和γ -生育酚在20 DAA上上调，但在5 DAA和10 DAA上下调。

嘌呤和嘧啶代谢

除腺嘌呤、腺苷、尿囊素、鸟嘌呤-2 '、3 ' -环单磷酸和尿苷外，核酸代谢中检测到的17种代谢物在四次采样期间均减少(附加文件1)．与半透明胚乳相比，白垩质部分的腺苷-2′、3′-环磷酸和5′-GMP含量较高，而腺苷、尿囊素和肌苷含量较低。

肽

在四次采样过程中，两个部分的大部分肽都减少了，而白垩质胚乳显示出较低的水平(附加文件1)．有趣的是，二肽苏酰基苯丙氨酸在白垩质部分明显增加，特别是在15 DAA和20 DAA。

激素

检测到两种植物激素，ABA和IAA，以及两种与植物生理信号相关的化合物，血清素和GABA。4；额外的文件1)．白垩质胚乳在种子发育早期ABA含量较低(虽然变化不大)，而半透明部分在种子发育初期ABA含量较高，随着时间的推移ABA含量逐渐下降。在最后一个时间点，两条曲线上的ABA水平基本相同。两个品系的IAA相似，白垩质胚乳的IAA在15 DAA时略高，并随时间增加而增加。

次生代谢产物

随着种子发育的进展，白垩质和半透明部分的苯4-羟基苯甲酸酯含量逐渐降低，在20 DAA时，白垩质胚乳中苯4-羟基苯甲酸酯含量较高1)．苯丙类化合物在种子发育过程中减少，香豆酸酯除外。另外，在15 DAA和20 DAA的白垩质胚乳中，阿魏酸、槐槐酸和香马罗酰喹酸含量较高。萜类角鲨烯在两组分中均有所增加，其中白垩质组分在10 DAA时含量较低，在15 DAA时含量较高。

notched-belly突变体的

垩白是一种复杂的性状，受多种基因控制，且随生长环境的变化而变化。到目前为止，组学方法已被用于探索导致白垩病的基因或生化途径[2，14，21，我们对白垩质的认识也得到了扩展。然而，目前只有少数qtl或基因被鉴定和功能分析，导致白垩病的代谢机制仍不完全清楚。

我们获得了一个白腹粒比例高的缺口腹突变体。在5 DAA上可以看到缺口线，可能是由于壳对颖果伸长的限制(图1)。1)．弯曲的收缩改变了隆突的形态，导致上下部分的形状不同，如图所示。1．值得研究的是，这种形态的变化是否会导致淀粉代谢、颗粒形成和白垩质的中断。进一步研究有切口的种子与无切口的亲本系在垂直轴上的蔗糖加载路径，对于阐明该突变体的作用机制具有重要意义。

切口线将胚乳分为两个独立的隔室，在约20 DAA时，上部为半透明，下部主要为不透明。这两个部分的谷物独立发育成熟，因为它们分别通过背侧的维管束从源器官获得同化物。因此，缺口线的形成使得追踪白垩质组织形成过程成为可能。以上半部分作为对照，我们比较了半透明和白垩质部分之间的代谢谱变化。有趣的是，这种比较是在相同的遗传背景下进行的，不同于在不同品种之间或在特定品种的垩白粒和完美粒之间进行的比较。因此，碳水化合物代谢、含s氨基酸代谢、ROS清除等生化途径的研究结果与白垩质的形成相关。

很明显，颗粒内的位置导致了两部分垩白发生的差异。由于切口线的存在，上胚乳与胚完全隔离，因此几乎不受胚的影响。相反，底部附着在胚胎上，受胚胎的影响。因此，上下部分的差异主要与白垩白和粒内位置的复合作用(胚的作用)有关，这在我们之前对成熟粒的研究中也有讨论[14，22］．由于无法在早期区分完全粒和垩白粒，目前还无法解剖垩白与胚的复合效应。因此，本研究结果在解释籽粒垩白的形成机制方面存在一定的局限性，胚在籽粒垩白形成中的作用有待进一步研究。

感知和调节C和N的状态

淀粉和蛋白质是水稻C和N代谢产物，是影响稻米品质的主要因素。籽粒白垩白是淀粉颗粒填充不良或应激触发的淀粉降解途径微妙调节失衡的结果[2］．此外，蛋白质生物合成的减少也起着至关重要的作用，最近克隆的特征证明了这一点Chalk5［6]及白垩质组织的显微观察[1］．因此，C和N代谢是垩白形成的重要途径，对其的全面了解是研究籽粒垩白的关键。然而，植物感知与C和N状态相关的信号并对其进行调节的机制仍然是开放的。

在本研究中，我们检测了几个与感知和调节碳氮状态有关的关键代谢物。垩质部分蔗糖含量较低，Glu和Gln含量降低，Asp和Asn含量在15 DAA和5 DAA时增加，每C携带更多的N原子。Glu/Gln和Asp/Asn的反向变化模式表明，用于氨基酸生物合成的C骨架可能局限在白垩质部分，从而使用一种更经济的化合物运输N。支持上述观点的是，高N:C比(4:6)的Arg作为主要的N存储化合物，在白垩质胚乳中被上调。这部分是由于其前体n -乙酰谷氨酸和瓜氨酸水平较高。此外，Arg在种子成熟和发芽、韧皮部和木质部运输中起着主要的代谢作用，并在胁迫条件下积累[23］．

有人认为，氨基丁酸，一种四碳的非蛋白氨基酸，构成了一种易于获取的C和N的无毒储备，用于氨基酸代谢和三羧酸(TCA)循环活性，这在应激事件中特别相关。在拟南芥中，将Glu转化为GABA的GABA分流代谢途径已被证明对种子的C-N平衡有深远影响[24］．结果表明，白垩质胚乳在种子发育过程中GABA含量明显较低，其在白垩质形成中的作用值得进一步研究。

白垩质形成的途径

S-containing氨基酸

硫是合成Cys、Met和其他必要和次生代谢产物如MTA、SAM和SMM的必要条件[25］．由于还原硫的化学性质，Cys具有多种功能。硫化物是一种强亲核试剂，使其成为氧化还原反应的高活性介质。半胱氨酸是所有细胞中所有这些化合物的硫化物供体。MTA是多胺(PAs)、烟胺(NA)和乙烯生物合成的常见副产物[26］．SAM在转甲基化反应中扮演着许多主要甲基基团供体的角色[27］．SMM是一种蛋氨酸衍生物，被认为是还原S的一种重要的长距离运输形式[28］．不考虑MTA的增加，本研究显示大部分含s氨基酸及其衍生物(包括Cys、Met、SMM、MetO、SAH和OAS)的白粉质胚乳减少。7)．这种减少伴随着副产品PAs和NA的显著变化，表明S运输、同化及其下游代谢在白垩质的形成中所起的作用。

ROS清除

ROS的过度产生可能导致植物细胞中的蛋白质、脂类、碳水化合物和DNA的损伤，特别是在干旱、高温和化学毒性等非生物胁迫下[29］．ROS可被抗坏血酸、谷胱甘肽和α-生育酚等非酶促低分子量代谢产物清除，它们是非生物应激反应的重要组成部分[30.］．刘等人。[21]提示参与ROS清除的谷胱甘肽- s -转移酶、乙醛化酶、脂氧合酶-5和硫氧还蛋白可能是造成谷物白垩质的原因。使用iTRAQ, Lin等人[14]鉴定出与水稻垩白胚乳ros清除机制相关的4种蛋白质:过氧化氢酶同工酶B、硫氧还蛋白O、戊烯还蛋白- c8和过氧化物酶2。目前的研究显示GSSG、GSH和5-OP水平较低。8)．与此相一致的是，白垩质胚乳中抗坏血酸和两亲性抗氧化剂α-生育酚和γ-生育酚的水平较高，而两种抗坏血酸分解产物脱氢抗坏血酸和苏氨酸的水平较低。此外，其他具有抗氧化活性的代谢物如PAs (Put、Spd和Spm)均上调。总的来说，这些发现表明在白垩质胚乳中有较少的氧化环境。

渗透调节

渗透液的积累是植物对抗环境胁迫的共同策略。其中甜菜碱具有较强的渗透保护作用，耐盐耐旱[31］．海藻糖也被证明有助于提高非生物胁迫的耐受力[32］．棉子糖在种子耐胁迫方面的潜在作用已被深入研究，特别是在脱水状态下的耐脱水性和寿命方面[33］．三种多胺，即Put、Spm和Spd，被认为参与了对盐和干旱等非生物胁迫的各种生理反应[34］．籽粒打浆期的高温导致垩白的发生，近年来的研究表明，在高温胁迫下，渗透调节与垩白的形成有一定的联系。和田等人[35]评估了干燥风对生长室内白垩质环形成的影响。他们得出结论，渗透调节在淀粉生物合成的下调中起着至关重要的作用，这导致了在短期热风和干风条件下垩白环的形成。此外，在高温条件下对早期颖果进行的磁共振成像显示，胚乳中心周围的含水量较低，而白垩质组织就发生在那里[36］．本研究中白垩质部分和半透明部分的渗透性差异显著。尽管Pro含量降低，但在白垩质胚乳中发现的大部分渗透物质，包括甜菜碱(甘氨酸甜菜碱、葫芦巴碱和水水苷)、海藻糖、棉子糖和PAs均增加，这表明在白垩质胚乳中启动了渗透调节。

细胞壁合成

植物细胞被细胞壁包围，细胞壁在植物生长、结构完整性和防御中起着关键作用。刘等人。[21]表明，细胞壁合成基因(两个纤维素合成酶基因)的下调和细胞壁水解基因(α- l -阿拉伯糖苷酶和α- d -木糖苷酶)的上调与白垩质的发生有关。相比之下，Lin等人之前的蛋白质组学研究[14]的研究结果表明，鼠李糖生物合成酶、udp -葡萄糖4-表异构酶、udp -葡萄糖6-脱氢酶、udp -阿拉伯吡喃糖变化酶和udp -葡萄糖醛酸脱羧酶等5种负责细胞壁合成的酶在白腹粒白垩质胚乳中均上调。细胞壁是一个复杂多样的结构，主要由多糖组成。在目前的研究中，我们发现了五种细胞壁前体(鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、葡萄糖酸酯和木糖)在白垩质部分和半透明部分之间发生显著变化。值得注意的是，它们在白垩质胚乳中表现出类似的下降趋势，但阿拉伯糖没有显著变化。总之，这些研究表明了细胞壁合成与白垩质的形成之间的关系。

矿物离子体内平衡

植物获取矿物质以维持生长和发育。我们发现了几种与矿物质转运和储存有关的代谢物，如植酸、烟胺和植物鞘脂，这些代谢物在白垩质和半透明胚乳之间发生了显著变化。植酸几乎是植物种子中普遍存在的成分，通常是磷酸盐中最丰富的形式[37］．它带负电荷的磷酸盐，使它成为矿物阳离子如K, Mg, Fe, Ca和Zn的有效螯合剂。烟胺负责铁和锰从叶片转移到发育中的种子[38］．鞘脂是一种不同种类的膜脂，构成植物中高达20 - 30%的液泡体和质膜脂[39］．虽然它们的作用尚未明确，但最近的研究表明，它们具有重要的功能，如在矿物离子稳态中发挥重要作用[40］．白垩质胚乳中植酸及其前体含量较高，棉子糖含量也随之增加。在大豆中，一个单一的隐性突变也会导致植酸和棉子糖的同步变化，这可能是由于它们至少共享的事实myo-肌醇-1-磷酸，可能游离myo-肌醇作为一种常见的中间体[33］．此外，烟胺和植物鞘氨醇在白垩质胚乳中均被下调。结果表明，白垩质胚乳和半透明胚乳的矿物动员和储存能力不同，这需要通过矿物组成分析来验证。

综上所述，缺口腹突变体提供了在相同遗传背景下的高效比较，可以最大限度地减少基因型和环境的影响，适合于探索籽粒白垩白的生理和分子基础。利用该突变体，我们观察到白垩质胚乳中用于淀粉、蛋白质和细胞壁合成的C和N代谢活性降低，这与渗透调节、ROS清除和离子稳态等其他途径的干扰相一致，这意味着白垩质部分处于应激状态(氧化或渗透)。目前还不清楚是什么触发了这种代谢转变。此外，我们不能排除两节之间代谢物水平的差异是由于缺口线造成的某种收缩所致的可能性;然而，目前没有证据表明这是事实。显然，白垩质的发展是一种复杂的性状，本研究中的代谢组学分析证实了这一点。为了充分理解这一现象，需要综合使用组学平台和对谷物生理的检查。

植物材料

“五育粳3号”自1992年上市以来，已成为华南地区受欢迎的食用品质优良的粳稻品种[41］．它是一个自交系品种，而不是一个氢化或转基因品种。“武育粳3号”种子由江苏省武进农业科学院育种所提供。2007年，以0.5%甲烷磺酸乙酯处理约2公斤的五育粳3号种子后，作为突变群体播于水田混收。从M2群体中鉴定出一个带白腹的缺口腹突变体(DY1102) [14］．2014年槽肚粒比例较高，为66.58%(温室)~ 75.67%(常温)。结果表明，温室处理下的白腹病发生率较高，其中温室处理下的白腹病发生率为85.12%，夜间高温处理下的白腹病发生率为93.13%1)．值得注意的是，中部初级轴上的籽粒白腹率较高，并取样进行代谢分析。

2014年，5株DY1102植株被人工移栽在一个装满15公斤高30厘米、直径34厘米粘土的塑料花盆里。土壤全氮含量为0.83 g/kg，有效磷含量为10.72 mg/kg，交换态钾含量为69.15 mg/kg₂O₅和0.9 g K₂O/罐，穗起搏期追肥为1.0 g N, 0.6 g P₂O₅和0.9 g K₂O /锅。所有植株苗期均在自然环境条件下生长。大约在开花前2-3天，45个花盆被转移到28/23°C的植物室(12小时昼夜循环;模型FYS-10;中国南京衡宇)，直至成熟。该植物室光照强度高于环境光照条件的75%，通过湿度调节器保持相对湿度为70±5% [42］．颖果在中原轴上有花期标记。采样时间点分别为花后5、10、15、20天(DAA)，上午9:00。用液氮冷冻谷物，然后在- 80°C保存，直到分析。利用立体显微镜(Stemi 2000-C, Zeiss Jena GmbH, Germany)和数码相机(PC1145, Canon, Japan)拍摄正在发育的晶粒光学照片。为了进行代谢组学分析，将发育中的颗粒去壳，并取出胚胎。其余胚乳沿切槽线切成上透明部(Tr)和下白垩部(Ch)。每个样品进行6个生物重复测定。

通过多个分析平台进行代谢物分析

代谢产物分析由SJTU-Metabolon联合代谢组学实验室(http://www.metabolon.com/)的复合平台:UPLC/MS/MS正离子模式，UPLC/MS/MS负离子模式，GC/MS [16］．简单地说，在液氮条件下，将胚乳的上下部分研磨成细粉。用400 μL甲醇内标提取40 mg左右冻干粉中的代谢物。将提取液分成3份，然后进行冻干。UPLC-MS/MS分析包括正离子和负离子模式，产物被重新溶解，然后在Waters Acquity UPLC (Milford, USA)和Thermo LTQ XL MS (Thermo Inc.， Massachusetts, USA)上进行。在GC-MS分析中，样品由双甲甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA)衍生，并在配有电子冲击电离系统(Thermo Inc.， Massachusetts, USA)的Thermo Ultra GC-ISQ平台上进行分析。

代谢图谱的数据分析与构建

利用Metabolon实验室信息管理系统对三个分析平台的原始数据进行提取、峰鉴别和质量控制。代谢物通过与参考库的自动比较来识别，参考库使用代谢物中大约1500个真实标准创建。代谢物定量、数据归一化和显著变化代谢物分析根据Lawton等。[43和Rao等人。[16］．简单地说，进行了数据归一化步骤，以纠正由于仪器日间调谐差异造成的变化。代谢物的定量值由质谱仪的原始检测器计数综合得出。为了保留所有的变化，所有不同原始数据的化合物都直接在相似的图形尺度上进行归一化，归一化强度按每个化合物的中值进行缩放(附加文件1)．显著性检验采用Welch双样本法t参考植物代谢网络数据库(PMN;http://www.plantcyc.org/)和京都基因和基因组通路百科全书(KEGG;http://www.genome.jp/kegg/pathway.html)构建代谢图谱。

5-OP:

5-oxoproline

C:

碳

CPGECs:

辅因子，假体基团，电子载体

DAA:

天开花

F6P:

果糖6-phosphate

G1P:

葡萄糖1-phosphate

G3P:

Glycerol-3-phophosphate

G6P:

葡萄糖6-phosphate

GABA:

γ氨基丁酸酸

谷胱甘肽:

减少谷胱甘肽

GSSG:

氧化谷胱甘肽

I6P:

肌醇6-phosphate

我:

蛋氨酸亚砜

MTA:

5 ' -methylthioadenosine

护士:

氮

唠叨:

N-acetylglutamate

美洲国家组织:

O-acetylserine

ROS:

活性氧

长官:

S-adenosyl-homocysteine

山姆:

S-adenosylmethionine

社交媒体:

S-methylmethionine

柠檬酸:

三羧酸

感谢上海交通大学SJTU-Metabolom联合代谢组学实验室的方诚和盛泉在UPLC/MS/MS和GC/MS分析方面所做的工作。

资金

国家自然科学基金项目(31171485、31470086)、国家高技术研究与发展计划项目(2014AA10A605)、国家科技支撑计划项目(2012BAD04B08、2013BAD07B09)资助。

数据和材料的可用性

支持本文结论的数据集包含在本文及其附加文件中。MS/MS光谱数据处理参数为Metabolon公司商业机密(http://www.metabolon.com/);但MS/MS谱的原始数据(约1g)可通过联系通讯作者(liuzh@njau.edu.cn)获得。

作者的贡献

zin, XZ，和zliu构思和设计了实验;ZW、YJ、AD、GL和SW完成部分实验;林Z、YD、刘Z对数据进行了分析并准备了手稿。所有作者已阅读并认可最终稿。

相互竞争的利益

所有的作者都声明他们没有利益冲突。

同意出版

不适用。

伦理批准和同意参与

不适用。

从属关系

1. 南京农业大学农学院/农业部作物生理、生态与生产管理重点实验室，南京210095

   Zhaomiao Lin新城,Zunxin Wang宇通江,商谈Liu Ganghua Li Shaohua王&延锋叮

2. 福建省农业科学院作物研究所，福州350013

   Zhaomiao林

3. 江苏省现代作物生产协同创新中心，南京，210095

   商谈刘

4. Metabolon公司，达勒姆，北卡罗来纳州，27713，美国

   丹尼·亚历山大

相应的作者

对应到商谈刘．

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