玉米DNA甲基化的个体间变异主要局限于组织特异性差异甲基化区域

背景

在不同的遗传群中的DNA甲基化或响应于特异性生物或非生物刺激的变化通常已经在使用均硫酸氢盐测序，全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）或甲基化敏感扩增的多态性（MSAP）.后者代表样品大小大的或当分析尚未测序的基因组的甲基化变化时，所以有用的改变。在这项研究中，我们将10个单独的叶片和胚胎样品的甲基化进行比较来自玉米杂种和近交系的胚胎样本。除了与WGBS相比，使用合并的与单独的DNA样品，还解决了分析甲基化变异的方法的方法。最后，我们分析了相对于基因组位置的可变和非可变片段的子集，附近横跨叶和胚乳组织的重复元素和表达模式。

结果

平均30%的个体表现出个体间甲基化变异，主要是叶片和胚乳特异甲基化DNA区域。除低频率的去甲基化事件外，大部分的个体间甲基化变异(分别在叶片和胚乳中占84%和80%)都被有效地捕获到DNA中。此外，现有的全基因组甲基化数据在很大程度上证实了MSAP叶片甲基化谱。大多数基因内的可变甲基化与CG甲基化有关，许多这样的基因显示出组织特异性的表达谱。最后，我们发现帽子DNA转座子是最常见的II类转移元素，其靠近可变DNA区域。

结论

我们的研究结果对未来甲基化变异研究的相关性如下:首先，发现个体间甲基化变异很大程度上局限于组织特异性的差异甲基化DNA区域，强调了在分析对特定刺激的甲基化反应时，组织类型的重要性。其次，我们表明基于合并样本的MSAP研究在方法学上适合于研究甲基化变异。第三，当WGBS不需要或不可行时，例如在尚未测序的植物物种中，MSAP是一个强有力的工具。

在植物中，胞嘧啶甲基化发生在对称的5 ' -CpG-3 '二联体(CG)和5 ' -CpG-3 ' (CHG;H是A、C或T)三聚体，此外还有不对称的5 ' - cpph -3 ' (CHH)三聚体[1-3.]．在每种情况下，甲基化是通过不同的DNA甲基转移酶的控制。在拟南芥蒂利亚纳中，主CG，CHG和CHH甲基化酶是METHYLTRANSFERASE1（MET1），CHROMOMETHYLASE 3（CMT3）和CHROMOMETHYLASE 2（CMT2）或结构域重排甲基分别2（DRM2）。在玉米中，相应的同系物是ZMET1和ZMET2或5，CMT2不存在且ZMET3 [4.-10]．此外，在RNA定向的DNA甲基化途径中起甲基转移酶2（或玉米Zmet3）的结构域重新排列的甲基转移酶2（或Zmet3）在[4.那9.那11，最早发现于烟草植物中[12]，在CG、CHG和CHH环境中，胞嘧啶对小RNA信号的从头甲基化反应达到高潮(在[13])。

DNA甲基化的全基因组分布已经在拟南芥和拟南芥中得到了详细的描述[14那15]以及重要的农艺作物，如水稻、玉米、大豆、木薯、大豆、普通大豆、小麦和棉花[16-23]．总的来说，这些研究表明，大部分DNA甲基化位于转座元件(TEs)内，强调了它在调控TE活性方面的重要和特征明确的功能——这是几年前提出的[24那25]．此外，这些数据还发现了基因体内Cg甲基化的患病率。

迄今为止，几乎所有基因组均甲基化研究DNA甲基化的自然变化，无论是在几代人的遗传上相同的群体内，还是在不同的遗传群体或组织类型中，比较合并的个体或少于2个个体的平均DNA甲基化状态每代[18那25-36]．然而，考虑到个体间差异的少数研究表明，自然甲基化和应激诱导的甲基化反应在个体间是异质性的，并且在发育阶段之间会有所不同[37-42]．上述研究均采用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技术进行。尽管该技术仅调查对DNA甲基化敏感的限制性内切酶位点的甲基化状态(例如下丘脑-垂体-肾上腺轴的II)，它确实给出了全基因组甲基化状态的可靠解读。例如，我们证明了玉米胚乳中相对于叶片和胚胎组织的DNA甲基化降低了13%，这在很大程度上是由于母亲的低甲基化[42，这些结果随后被高通量的亚硫酸氢盐测序所证实S.、水稻、高粱、玉米和蓖麻的基因组[34那43-47]．

目前，关于基因相同的后代的个体间甲基化变异(ii-MV)以及这种变异是否在植物组织中存在差异的信息很少。鉴于这方面的研究缺乏，我们利用MSAP分析了两个杂种和一个自交系的单个穗轴的10个单独的叶片和胚乳组织的甲基化谱。此外，由于大多数DNA甲基化变异研究都使用了汇集样本，因此我们讨论了与汇集样本相比，个体样本是否更能反映甲基化变异这一重要的方法学问题。我们的数据表明，ii-MV在叶片和胚乳组织中都很容易检测到，但很大程度上局限于组织特异性差异甲基化区域(tDMRs)。我们发现，通过对合并样本的分析，大多数这种变异都可以检测到，并表明MSAP是分析甲基化变异的可靠替代WGBS的方法。

玉米胚乳和叶片个体间甲基化变异（ii-MV）的MSAP表征

MSAP用于表征II-MV。这种技术是AFLP的修改（一种mplifiedF废墟L.蒜皮的P.紫外线），其基于通常通过消化基因组DNA的限制片段的随机扩增生态国际扶轮和均方误差我限制酶[48]．在MSAP,均方误差I被替换为下丘脑-垂体-肾上腺轴的II，除非在两条链上甲基化甲基化，否则切割ccgg遗址[49]．将适配器连接到消化的限制性位点，随后在两个连续的PCR反应中扩增所得片段，其引物与限制酶的核心序列互补的引物互补。通常，在第二扩增反应中增加在3'末端添加到引物中的选择性核苷酸的数量。另外，一种引物被放射性地标记以通过放射自显影实现限制性碎片的可视化。

10个单独的胚乳在授粉后15天收获（DAP）和十个14天的叶子（W23.采用MSAP和AFLP分别对12和10个选择引物组合进行分析。在这两种情况下，组织样本都来自于单个杂交穗轴。胚乳MSAP和叶片MSAP的13个片段(69/526)和3%(14/440)在个体间存在变异1:表S1)。胚乳中MSAP总片段数高于叶片(IE. 考虑到前者相对于叶片而言是低甲基化的，预计分别为526和440）[42]．相反，AFLP没有检测到变异(结果未显示)。进一步的MSAP分析单个胚乳和叶片MO17./ B73混合，除了来自A69Y自交系的单独的胚乳外，还透露，II-MV没有显着差异，遗传背景和近交和混合线之间也不是（附加文件1:表S1)。随后，我们打进组织特异性或这两种杂交组合的共同MSAP片段的II-MV;MSAP频带即在一个或两个组织，分别（图检测到。1a和表1）.在两种杂种中，ii-MV的组织特异性显著高于普通MSAP条带(P.< 0.0005和P.分别为< 0.0001)。然而，普通MSAP片段和组织特异性MSAP片段在组织间均无显著差异。

接下来，我们通过比较单个胚乳的MSAP谱来评估ii-MV在CG或CHG环境中是否优先发生胞嘧啶W23./A69Y混合使用下丘脑-垂体-肾上腺轴的II或其同分异构体Msp我在初始限制摘要中。这些限制酶对CCGG识别现场的甲基化的敏感性不同：下丘脑-垂体-肾上腺轴的II对任一胞嘧啶残基的甲基化敏感，但对外胞嘧啶残基的半甲基化不敏感，而MspI对胞嘧啶的半甲基化或完全甲基化敏感。我们发现89%的ii-MV发生在CG环境中;也就是说，变化只在以下检测到下丘脑-垂体-肾上腺轴的二，但不是MspI消化（图1b，小组一和小组二）。在37%（28/75）的此类病例中，未检测到任何片段Msp一（第二小组）。这表明CCGG识别位点的外部胞嘧啶残基是半甲基化的，或者存在内部的下丘脑-垂体-肾上腺轴的II位点仅在CG环境下被甲基化。考虑到约20%的MSAP片段有内部CCGG站点，可能是后一种解释[42]．相比之下，仅在CHG上下文中或CG和CHG背景中仅发生11％（8/75）II-MV;即乐队缺席下丘脑-垂体-肾上腺轴的二世和MspI消化（图1b第三,面板)。

为了了解这些变化是否反映了背景依赖的胚乳特异性低甲基化，我们对来自W23自交系的15 DAP胚乳和14日龄叶片组织进行了体外甲基接受试验。这种分析利用了细菌DNA的能力下丘脑-垂体-肾上腺轴的二世和MspI甲基化酶分别甲基化未甲基化CCGG序列的内部和外部胞嘧啶[50]．此外，用总共测量总CG甲基化Sss甲基化酶，它在不依赖序列背景的CpG二核苷酸中对胞嘧啶进行甲基化。虽然CG的甲基化水平相对于CHG的甲基化水平增加了2倍，但与叶片相比，胚乳中的任何一个甲基化水平都减少了5倍(表1)2）.这与来自B73自交系的12个DAP胚乳和叶组织的对比甲基-SEQ分析形成对比，其中叶和胚乳组织之间仅CHG甲基化显着不同[34]．这种差异可能是由于甲基化的近交系或发育特异性差异，或与亚硫酸氢盐处理的DNA扩增相关的技术问题，如未甲基化等位基因的选择性富集[51]．

汇集样本的甲基化状态在很大程度上反映了单个样本的主要甲基化情况

鉴于基因组的研究经常在从几个个体汇集的DNA上进行，我们要求在多大程度上从捕获II-MV的合并个体的DNA样品的甲基化状态在一起。首先，我们进行了MSAP实验，以详细了解特定甲基化型材的检测限。为此，我们通过MSAP分析了近交系MO17和B73及其各自的倒数交叉，并确定了特定于B73自交系的20个MSAP片段。随后，我们在“人工”中划分这些片段的存在或不存在B73/ Mo17杂交物，B73的基因组贡献在10％和100％之间;即10％的10％间隔的10个稀释系列是通过用来自Mo17自交线的DNA掺入B73 DNA而产生的10％。这些实验表明，当B73的基因组贡献高于30％时，始终检测到所有B73特异性带。然而，在10％和20％的B73基因组贡献中，检测的保真度分别下降至70％和85％。将这些结果转换为解释MSAP可变性数据，当甲基化水平> 90％时，发生大部分带缺失，而30至90％之间的甲基化水平是难以区分的。此外，这些数据表明，仅在10-30％的分析的个体中仅存在的片段的离散部分可以代表无法通过MSAP准确确定的简档。这促使我们分析杂种线的叶片和胚乳组织中II-MV的频率。该频率计算为存在带的频带的数量除以分析的个体的总数。在任一组织中，在超过30％的分析 - 即88和64％中，检测到大量可变片段 - I. 88和64％MO17./B73叶片和胚乳MSAP片段，分别为95%和72%W23./ A69Y杂种（图。2）.这表明大多数MSAP II-MV表示真正的生物变化。接下来，我们评估了各个叶子和胚乳上观察到最丰富的甲基化状态是否来自MO17./ B73在组织的汇集样品中精确地捕获杂种。如预期的那样，少于50％个体存在的大多数胚乳和叶片msap片段与汇总型材中的带缺陷有关，而超过40％的个体存在的MSAP片段表现出相反的行为（图。2 b)总的来说，这些片段分别占叶和胚乳可变MSAP片段的84%和80%。在其余偏离预期轮廓的叶片和胚乳MSAP片段中，分别有60%和90%代表低频去甲基化事件(IE。带的存在在不到50％的个体中）（图。2 b）.综上所述，数据表明，MSAP分析合并的样本在捕获个体间低频率去甲基化事件方面不如高频率去甲基化事件有效。

MSAP数据的验证

我们共切除了106个MSAP片段MO17./ B73混合。序列分析后，26个非变量和28个变量片段达到了我们的严格标准，以进行进一步分析（参见方法）。我们还确定了六个变量和八个非变量之前的孤立的MSAP片段[42显示ii-MV在W23./ A69Y杂交。使用所选片段作为Southern印迹分析中的探针，我们证实了胚乳特异性变量MSAP片段显示CG和CHG甲基化在胚乳中的含量减少，而这些轮廓在很大程度上与非可变片段相同（附加文件）2:图S1a，比较组织特异性下丘脑-垂体-肾上腺轴的二世和Msp我配置文件)。此外，我们利用甲基化敏感限制性内切酶比较了两个可变片段和一个非可变MSAP片段在CG和CHG背景下的ii-MV下丘脑-垂体-肾上腺轴的二世和Msp我，分别为（附加文件2：图S1b）。两个可变MSAP片段在CG背景下均显示ii MV，而CHG背景下的变异仅限于可变PMP2带。相反地，在用动物消化后，没有观察到个体间差异的证据埃森我和埃森V限制酶通常被认为是甲基化 - 不敏感的（附加文件2:图印地)。同样，未检测到非变量片段的个体间变异，也未检测到甲基化敏感或甲基化不敏感的限制性内切酶。

我们也验证了可变和不可变的甲基化状态下丘脑-垂体-肾上腺轴的使用来自B73和Mo17的的叶组织中可公开获得的数据WGBS通过MSAP预测II位点自交系[32]．为此，我们成功地将17/26个非变量MSAP片段和24/28个可变MSAP片段定位到B73自交系基因组(B73 RefGen_V4)的独特区域(Additional file)3.）并回收每个甲基化状态下丘脑-垂体-肾上腺轴的二世的网站。剩余的MSAP片段显示出对参考基因组和/或缺乏甲基化数据的部分或含糊不清的重叠。接下来，我们预测映射变量和非变量的甲基化状态下丘脑-垂体-肾上腺轴的II基于胚乳和叶片个体中是否存在MSAP片段的叶片中的位点（补充文件4.：图S2a）。大多数非可变片段（94%）在两种组织中都检测到，并且在所有个体中都检测到，因此预测在叶和胚乳中都未甲基化。相反，在胚乳样品中特异检测到的非可变片段在叶片中被认为是甲基化的。使用类似的参数，79%的变量片段(IE。预期67 + 8 + 4％的叶片在一定程度上显示出一定程度的甲基化，而剩余的21％被预测在该组织中缺乏甲基化（附加文件4.：图S2A）。总体而言，85％的个人甲基化州下丘脑-垂体-肾上腺轴的II位点在CG背景下的胞嘧啶甲基化WGBS数据中得到证实(附加文件)4.：图S2B）。特别地，将预测的未甲基化状态分别确认了两种近交系的至少一种88（15/17）和100％（5/5）的非可变和可变碎片中的至少一种;预测甲基化状态的相应百分比分别为100（1/1）和79％（15/19）。关于CHG甲基化，我们发现不可变量和变量较少HPAII.位点与CHG甲基化有关。此外，CHG甲基化水平显着降低B73和MO17近交系中的Cg甲基化水平（P. < 0.0028 and 0.0003, respectively) (Additional file4.:图S2c)。

总的来说，这些数据证实ii-MV在很大程度上局限于tDMRs，并优先与CG甲基化相关。相反，在任何一个组织中分析的非可变区域大部分未甲基化。

隔离变量和非可变片段的特征

大多数变量和非变量下丘脑-垂体-肾上腺轴的玉米B73 RefGen_V4(分别为TSS和TTS)中注释的转录起始和终止位点的上、下游<2 kb的基因区域内的II位点，特别是基因体内的II位点，定义为TSS和TTS之间的区域(图2)。3）.关于CG和CHG甲基化，后者在非基因区域内更丰富，而CG甲基化大部分限制在非可变和可变的遗传区域上下丘脑-垂体-肾上腺轴的(图二世网站。3 b）.此外，对DNA上、下游延伸10kb的非变量区和变量区进行分析下丘脑-垂体-肾上腺轴的II位点显示它们通常未甲基化和甲基化状态分别是延伸的DNA区域的特征，其尺寸为约1-10kb（图。3 c和额外的文件5.：图S3）。关于窝藏变量和非变量的基因HPAII.分别在玉米中分别在玉米蛋白酶，38（6/16）和56％（9/16），而75％和50％，有一个正直拟南芥蒂利亚纳。这些基因的许多注释功能与动态蜂窝方法如转录和细胞信令（附加文件）有关6.：表S2）。

我们还评估了是否下丘脑-垂体-肾上腺轴的显示II - mv的II位点倾向于更接近重复的DNA区域。作为对照组，我们纳入了非变量下丘脑-垂体-肾上腺轴的二世的网站。在每种情况下，我们将距离最近的重复区域的距离分配并注释其大小和分类。我们发现88％的变量下丘脑-垂体-肾上腺轴的II位点最接近I或II类转置元素（TES），而大多数非变量下丘脑-垂体-肾上腺轴的II位点(53%)更接近串联重复序列(附加文件7.:图S4a)。对于TE，我们发现帽子超家族是最常见的II类TE，与变量非常接近，且仅限于变量HpaII网站(附加文件7.：图S4b）。但是，在变量和非变量之间既不与重复区域的平均距离也不有大小不同下丘脑-垂体-肾上腺轴的二世网站(P.< 0.82和P.分别为< 0.11)。

最后分析了基因是否存在变异HPAII.位点与基因表达的组织特异性差异相关。作为对照组，我们纳入了具有非变量的基因HPAII.网站。这些基因随后被称为v基因和n基因。比较这些组间表达谱的基本原理是基于它们在叶片和胚乳组织中不同的甲基化谱;即不变下丘脑-垂体-肾上腺轴的II位点和它们的侧翼区域通常在两种组织中未甲基化，而大多数可变位点显示出组织特异性甲基化差异。对于每种基因，我们提取了混合幼苗V1阶段的B73转录数据和14个DAP胚乳（ZM37-植物表达数据库）[52])。这些特殊的发展阶段可与MSAP分析中使用的阶段相比较。有9个n基因和13个v基因的表达数据，每组的基因根据相对甲基化状态进一步细分下丘脑-垂体-肾上腺轴的II位点与胚乳相比，除基因定位外下丘脑-垂体-肾上腺轴的二世(图。4）.在所有情况下，通过比较如前所述的单个叶片和endosperm MSAP简档预测相对甲基化状态（参见附加文件4.：图S2A）。

总的来说，我们发现与n基因相比，v基因在叶片中表达水平更高，而在胚乳组织中则没有(P. < 0.008 andP.分别为< 0.123)。此外，大多数v基因(77%)在组织间的表达有显著(或边缘性显著)差异，而n基因只有22%(图)。4）.然而，在组织类型中，我们发现甲基化和表达之间没有具体趋势。例如，与叶片的基因体内更甲基化的七个V-基因与胚乳，两个（V71和V9）显示出相对于胚乳组织的叶片的转录水平增加，而四（V39，V85，V103并且V80）显示相反的轮廓（图。4）.变量也是如此下丘脑-垂体-肾上腺轴的II位点位于TSS和TTS的2kB范围内，或位于胚乳中相对于叶甲基化程度更高的基因体内。为了验证数据库通过直接表达推导的转录谱，我们设计了跨越变量的引物对下丘脑-垂体-肾上腺轴的II MSAP片段v71、v9和v59位于GRMZM2G068392、GRMZM2G097109和GRMZM5G817886的位点(图2)。4 b）.我们证实了前两个的表达谱 - 在B73自交系即其转录增加的叶片相对水平的胚乳组织。然而，V59的转录从预期表达谱差异，由于该基因显示出在相对于胚乳增加的转录水平的叶（图4 b）.除了B73自交系外，我们还分析了Mo17、A69Y和W23自交系的RNA，发现基因特异性表达谱在自交系之间很大程度上是保守的(图)。4 b）.唯一的例外是GRMZM2G068392，其在A69Y自交系中显示出胚乳组织中较高水平的表达。

我们的结果表明，大部分甲基化在下丘脑-垂体-肾上腺轴的在叶II位点（CCGG）穿过从自交或杂交玉米品系的单穗轴种子发芽玉米个体保守的。在叶，只有〜3％MSAP片段的显示II-MV，这是可比 - 尽管略高 - 到小于1％的个体报道拟南芥幼苗的叶组织通过分析MSAP [37]．虽然我们发现叶片和胚乳之间的ii-MV频率没有显著差异，但MSAP变异片段总数增加了后者的4 ~ 5倍。这一发现在很大程度上是由ii-MV和tDMRs之间的紧密联系所解释的，后者在胚乳中相对于叶子更为丰富[42]．有趣的是，一项对基因相同的小鼠ii-MV的研究也发现，超过50%的可变区域与tDMRs重叠[53]．

结果如上所述，相对于胚乳组织的叶片中的变量MSAP片段的大部分均为甲基化。相比之下，大多数不可变性片段未甲基化;即在两种组织中检测到。使用公开可用的WGBS数据玉米叶组织[32，我们确认了这个非变量下丘脑-垂体-肾上腺轴的II遗址缺乏DNA甲基化，而大多数变量下丘脑-垂体-肾上腺轴的II位点在基因区域中显示出不同水平的Cg甲基化，或在非基因区域中的CG和CHG甲基化。此外，这些特定的甲基化状态通常代表延长基因组区域，范围为约1-10kb。在一起，数据表明II-MV优先与甲基化DNA区域相关。根据日本鱼类肝脏组织单细胞甲基化变异的最近分析Oryzias latipes发现甲基化变异增加了DNA高甲基化区域而不是低甲基化区域[54]．重要的是，我们的MSAP甲基化与之前从叶子组织生成的WGBS之间的收敛[32[表示MSAP表示可靠且代表性的甲基化状态。这表明MSAP代表了分析DNA甲基化状态的有价值的替代方案，其在具有不完全或没有基因组信息的植物物种中，或者当最佳样本大小呈现WGBS（或任何其他下一代测序技术）时不实用。

类似于拟南芥之间的甲基化的变化和玉米或大豆自交系[26-28那30.那33[很多II-MV映射在基因体内，并大大限制为CG甲基化。对缺乏和低水平的CHG II-MV的可能解释是这种甲基化在由于盆景甲基化1（IBM1）活性增加而导致的转录过程中仅在转录中存在，该H3K9去甲基酶在基因体内主动预防CMT3介导的CHG甲基化[55那56]．重要的是，在该MSAP研究中，CHG甲基化在CCG背景下进行了分析，这种甲基化在很大程度上依赖于met1，而在CTG和CAG背景下CHG甲基化则相反[57]．但是，鉴于具有高密度CTG和CAG的主动转录的基因优先针对基因体甲基化[58[我们不能排除那些序列上下文中的甲基化可能更容易发生CHG II-MV。类似于其他几项研究，我们发现基因 - 体甲基化与组织的表达之间的复杂关系[14那15那18那43那44那59]．实际上，最近的一项研究表明，缺乏对子植物中的基因体甲基化Eutrema salsugineum似乎没有关于转录调节的功能性结果[58]．

有趣的是，此前MSAP对叶片组织中ii-MV的研究表明，只有少数(17%)ii-MV在两个叶片发育阶段之间保存[60]．这种短暂的或随机的ii-MV可能对解释任何特定压力对表观基因组的长期影响或识别跨代产生的表观等位基因有意义。事实上，对磷酸盐饥饿、热、冷、紫外线或高渗透的应激反应已经被证明是短暂的或异质性的，无论是在个体还是在世代之间[61-63]．由此可见，在大组织上进行的研究或设计的次最佳样本大小的研究中发现的差异甲基化区域(或差异甲基化胞嘧啶)检测到的甲基化变异性既可以是短暂的，也可以是稳定的。这可能与低频率的去甲基化事件特别相关，因为MSAP在合并样本中捕获这种变异的效率较低。无论如何，我们的数据表明，样本池至少可以忠实地反映一部分甲基化变异。

在植物和哺乳动物中进行的几项研究表明，TEs同时具有个体内和ii-MV [53那64-67]，有充分的证据表明，基因型之间和基因型内部由于接近te而存在甲基化变异[30.那32那62-74]．在这项研究中，我们分析了变量吗？下丘脑-垂体-肾上腺轴的与非可变部位相比，II位点与TE更接近。总的来说，我们发现这两组之间没有差异，既不是关于距离，也不是TE的大小。但是，我们确实发现了那种变量下丘脑-垂体-肾上腺轴的II选址优先位于邻近帽子II类转座子超家族。一个明显的警告目前研究的重点是MSAP平台产生的相对较少的片段，显示ii MV。尽管如此，通过全基因组亚硫酸氢盐测序对小鼠ii MV的分析显示，总共只有356个位点显示ii MV。在该研究中，约15%的可变区与I类内源性逆转录病毒（ERV）相关。这些数据支持进一步研究特定环境或发育刺激后TE对ii MV的相关性。

我们的数据表明，ii MV主要局限于tDMRs。重要的是，我们证明了样本池是研究甲基化变化对给定刺激的方法学上合适的设计。此外，对公开数据库的比较分析证实，当WGBS不可行时，MSAP是DNA甲基化分析的有效工具，这可能是由于缺乏基因组学/表观基因组数据，或者是由于大的最佳样本量。

植物材料

A69Y，W23，B73和MO17自交系在进行外交过的领域中生长W23./A69Y和MO17./B73 F1杂种(该杂交的卵子供体下划线)。B73、Mo17种子来自玉米遗传合作砧木中心，A69Y、W23种子来自Angelo Viotti博士的厚礼。每个基因型的种子要么在授粉后15天收割，要么在成熟时收割。从未成熟种子中分离出单个胚乳，成熟种子在温室中发芽2周获得叶片组织。在这两种情况下，组织都来自于单个雄株。

MSAP和AFLP分析

MSAP酶切酶切、连接和预选择性PCR反应如前所述[42]．对于每个样品，进行三个独立的乳房反应;一旦再现，一个样品用于进一步分析。生态国际扶轮和下丘脑-垂体-肾上腺轴的II型预选择引物分别为:5 ' -AGACTGCGTACCAATTC-3 '和5 ' -TCATGAGTCCTGCTCGG-3 '。选择引物与预选择引物相同，包括额外的3′核苷酸。生态RI选择性引物是：生态RI-01 AGT，生态RI-02 ACA,生态RI-03 AGA,生态RI-04 ACC;下丘脑-垂体-肾上腺轴的II选择性引物是：下丘脑-垂体-肾上腺轴的II-02 TAGC,下丘脑-垂体-肾上腺轴的II03 CGAA,下丘脑-垂体-肾上腺轴的II-03A CGTT，下丘脑-垂体-肾上腺轴的II-04 AATT。当MSAP谱带在不同胚乳间表现出差异时，将其评分为变量。只有分辨良好的MSAP谱带被评分。

如前所述进行了AFLP [42]．预选择引物与核心序列互补生态国际扶轮和均方误差1个适配器，包括一个选择性核苷酸生态ri（5'- gactgcgtaccaattca）和均方误差I（5′-GATGAGTCTGTAAC）引物。生态RI选择性引物为:E31 AAA和E32 AAC;有选择性的均方误差I型引物为M47 CAA、M48 CAC、M49 CAG、M50 CAT、M51 CCA。

MSAP片段的分离与分析

如前所述，从丙烯酰胺凝胶中分离MSAP带[42]．在玉米中，从B73和Mo17自交系中分别分离出58和48个甲基化变异片段。再次扩增后，PCR产物被克隆并在双链上进行了三份测序。只有在预期大小、包含适当的选择性引物序列并代表单个DNA序列的片段被选择进行进一步分析。针对更新的玉米B73 RefGen_V4 (http://ensembl.grammene.org/zea_mays/）;可变和非可变的甲基化值下丘脑-垂体-肾上腺轴的II位点从公开可用的甲基化数据中恢复[32]．

DNA提取和Southern blot分析

如前所述，提取基因组DNA、酶切和Southern印迹[42]．

玉米胚乳CG-和CHG甲基化的定量分析

采用s -腺苷- l-[甲基-^3.H]甲硫氨酸（[^3.H] SAM）完全如前所述进行[50]．分析的基本原理是，当使用[^3.H] SAM作为底物，掺入的放射性的量与初始DNA低甲基化的程度成正比。用0.3-0.5μgDNA进行3小时进行反应。在这些条件下，掺入放射性与DNA浓度线性成比例，并对完整性进行反应[50]．考虑到〜2.5和3.5pgs的单倍体玉米和小鼠基因组含量，将原始数据转化为未甲基化靶的拷贝。75使用公式:2.5(DN_一种）/ as d是d是d总成的放射性（DPM），N_一种为阿伏伽德罗数，A为比活性(dpm/mol)， S为底物DNA数量(pg)。

RNA提取和RT-PCR分析

根据制造商的说明用Trizol®Reagent（猫，猫。15596-026寿命技术）提取RNA并用DNASEI（Turbo DNA-Free Kit，Ambion Cat。AM1907）进行治疗。通过1％琼脂糖凝胶电泳评估RNA质量，并使用纳米二玻璃1000分光光度计定量。对于RT-PCR分析，CDNA由1μg总RNA（上标III试剂盒，Invitrogen）合成。随后，在标准PCR反应与基因特异性引物中使用1/20反应体积。通过序列分析证实了引物特异性。

统计分析

采用Kruskal-Wallis检验对杂交种和自交系的MSAP数据进行多重比较。采用两种独立方法的学生t检验比较叶片和胚乳组织的表达谱。

（[^3.H] SAM）：

S-腺苷-1- [甲基 -^3.H]蛋氨酸

妊娠:

扩增片段长度多态性

DAP：

几天后授粉

ii-MV:

Inter-individual甲基化变异

MSAP:

甲基化敏感扩增多态性

n：

不变

tDMRs：

组织特异性差异甲基化区域

TES：

转座的元素

v:

变量

没有任何。

基金

这项工作是由墨西哥科学技术委员会(CONACyT)“Ciencia Básica”资助的。资助机构对研究的设计、数据的收集、分析和解释以及手稿的撰写都没有作用。

数据和材料的可用性

本研究期间生成或分析的所有数据都包含在此已发布的文章中及其附加文件中。

作者的贡献

ML生成和分析MSAP和AFLP数据，RE-N和DR-R克隆变量和非变量MSAP片段并进行了RT-PCR分析。SZ进行了体外甲基接受测定，RE-N和GL进行了生物信息学分析，GL设计和监督该研究并编写了最终的手稿版本。所有作者均已读取并批准此稿件。

利益争夺

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

同意出版

不适用。

伦理批准和同意参与

不适用。

作者指出

从属关系

1. 意大利米兰国家农业生物技术研究所，I-20133

   诺阿Lauria

2. 格特鲁德隆德，基因工程，CINVESTAV系 - 团结报伊拉普阿托，公里。9.6 Libramiento北的Carretera伊拉普阿托 - 莱昂，APDO。邮政629，C. P. 36500，伊拉普阿托，GTO，墨西哥

   罗德里戈·安东尼奥埃切戈延 - 纳瓦，达莉亚·罗德里格斯·里奥斯和格特鲁德·隆德

3. 医学科学系，卫生科学研究科学，瓜纳瓜托大学，墨西哥

   西尔维奥·扎伊纳

通讯作者

对应于Gertrud Lund.。

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