两种水稻基因型对褐飞虱侵染的基因表达和植物激素水平gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

褐飞虱(BPH;gydF4y2Ba摘要研究选择性gydF4y2BaStål)是一种破坏性的刺吸水稻害虫。植物激素水杨酸(SA)和茉莉酸(JA)在植物与害虫的相互作用中起着重要作用。许多调控BPH抗性的水稻分离基因参与了SA、JA和乙烯的代谢或信号通路。‘Rathu Heenati’(RH)是一个对所有BPH生物型具有高水平、广谱抗性的水稻品种。本研究以RH为研究材料，以bph易感水稻品种‘台中原生1号’(TN1)为对照。cDNA芯片分析揭示了RH在BPH侵袭下的基因组水平的抗性反应。同时测定了RH和TN1侵染后幼苗SA和JA的含量。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

表达模式聚类分析表明，1467个差异探针集可能与RH的本构抗性相关，67个可能与RH的BPH侵袭响应抗性相关。维恩图分析显示了192个rh特异性和bph诱导探针组。最后通过表达模式聚类和维恩图分析筛选出23个BPH抗性相关基因候选。在RH中，BPH侵染后SA含量显著升高，JA含量显著降低，且前者先于后者。在RH中，SA通路中的差异基因与合成相关，并在BPH感染后上调。JA通路中的差异基因也上调。它们是茉莉酸zim域转录因子，是JA途径的重要负调控因子。相对而言，在RH中，参与ET途径的基因较少受到BPH感染的影响。DNA序列分析表明，大多数BPH侵袭诱导基因可能是由遗传背景以反式作用方式调控的，而不是由它们的启动子调控。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

我们分析了BPH感染下RH和TN1的整体基因表达，以及SA和JA水平的变化。SA在水稻对BPH的抗性反应中起主导作用。我们的研究结果将有助于了解RH抗BPH的分子基础，并有助于鉴定新的抗BPH相关基因以选育抗BPH水稻品种。gydF4y2Ba

作为世界上一半以上人口的主食，大米(gydF4y2Ba栽培稻gydF4y2Ba)是亚洲最重要的作物[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]，害虫是影响水稻产量的主要因素。稻褐飞虱;gydF4y2Ba摘要研究选择性gydF4y2BaStål)，它从植物的韧皮部吸取汁液，具有很强的破坏性[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．除直接危害外，黑穗病作为中间媒介，可通过草矮病毒、糙矮病毒等病原体侵染水稻，进一步导致产量损失[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

自20世纪60年代以来，水稻育种家一直致力于鉴定抗bph的种质并开发抗bph的水稻品种。在水稻中已鉴定出至少30个抗bph的数量性状位点(qtl)。其中21个已确定染色体位置，12个已精细定位。这些抗bph基因大多来自野生水稻，很少来自野生水稻gydF4y2Ba籼稻gydF4y2Ba大米和没有来自gydF4y2Ba粳稻gydF4y2Ba大米(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

四种主要抗bph qtl，gydF4y2BaBph14gydF4y2Ba，gydF4y2BaBph3gydF4y2Ba/gydF4y2BaBph17gydF4y2Ba，gydF4y2BaBPH26gydF4y2Ba/gydF4y2BaBPH2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaBph29gydF4y2Ba，利用基于地图的技术克隆[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．gydF4y2BaBph14gydF4y2Ba而且gydF4y2BaBPH26gydF4y2Ba编码线圈，核苷酸结合和亮氨酸丰富的重复蛋白，类似gydF4y2BaRgydF4y2Ba介导植物对病原体抗性的核苷酸结合-富含亮氨酸重复序列家族的基因[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．gydF4y2BaBph14gydF4y2Ba而且gydF4y2BaBPH26gydF4y2Ba被认为能诱发效应者触发免疫，就像gydF4y2BaRgydF4y2Ba基因，因为它们共享相似的保守蛋白质结构域。的表达式gydF4y2BaBph14gydF4y2Ba是由BPH感染引起的，然后激活水杨酸(SA)信号通路，诱导韧皮部细胞中愈伤组织沉积，并促进胰蛋白酶抑制剂的产生[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．gydF4y2BaBPH26gydF4y2Ba,就像gydF4y2BaBph14gydF4y2Ba，也介导韧皮部筛元的吸吮抑制。的gydF4y2BaBph3gydF4y2Ba基因座是一个由三个基因组成的簇，编码质膜定位的凝集素受体激酶(gydF4y2BaOsLecRK1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaOsLecRK3gydF4y2Ba)．gydF4y2BaBph3gydF4y2Ba由于最近发现的凝集素受体激酶的功能，通过感知食草动物相关或损伤相关的分子模式，在启动模式触发的BPH感染免疫反应中发挥关键作用[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．gydF4y2BaBph29gydF4y2Ba是一种隐性抗性基因，编码B3 DNA结合结构域，该结构域包含在B3结构域具有DNA突变的蛋白质。gydF4y2BaBph29gydF4y2Ba被认为失去了昆虫定居所必需的显性等位基因的功能，因此与花药隐性位点结合赋予抗xenosis抗性[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．主要抗BPH qtl的克隆促进了对水稻抗BPH分子机制的理解，尽管其生物学机制尚不清楚。gydF4y2Ba

除了主要的抗BPH qtl外，许多其他调节BPH抗性的水稻基因(抗性相关基因)，如gydF4y2BaOsHI-LOXgydF4y2Ba［gydF4y2Ba12gydF4y2Ba),gydF4y2BaBphi008agydF4y2Ba［gydF4y2Ba13gydF4y2Ba),gydF4y2BaOsERF3gydF4y2Ba［gydF4y2Ba14gydF4y2Ba),gydF4y2BaOsPLDα4gydF4y2Ba而且gydF4y2Baα5gydF4y2Ba［gydF4y2Ba15gydF4y2Ba),gydF4y2BaOsHPL3gydF4y2Ba［gydF4y2Ba16gydF4y2Ba),gydF4y2BaOsACS2gydF4y2Ba［gydF4y2Ba17gydF4y2Ba),gydF4y2BaOsAOCgydF4y2Ba［gydF4y2Ba18gydF4y2Ba),gydF4y2BaOsr9-LOX1gydF4y2Ba［gydF4y2Ba19gydF4y2Ba),而gydF4y2BaOsJMT1gydF4y2Ba［gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]，最近已被隔离。这些激素大多通过逆向遗传学策略被鉴定出来，它们都参与了植物激素SA、茉莉酸(JA)和乙烯(ET)的代谢或信号通路，表明这些激素在水稻对BPH的防御反应中发挥重要作用。SA通常被认为是积极调节植物对病原体和刺吸昆虫的防御反应，对寄主植物造成最小程度的物理伤害。主要抗bph qtlgydF4y2BaBph14gydF4y2Ba而且gydF4y2BaBPH29gydF4y2Ba增强SA合成相关基因的表达和拟南芥致病相关基因的非表达同源物1，这是BPH侵染后SA依赖的系统性获得性抗性的关键调节因子。它们还抑制了JA合成相关基因和乙烯信号通路受体基因的表达水平gydF4y2Ba乙烯不敏感2gydF4y2Ba［gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

JA与伤害反应有关，并正调控植物对广泛伤害宿主的咀嚼昆虫的防御反应。SA和JA之间的相互作用通常是拮抗的，SA对JA的积累和信号通路有抑制作用。ET被认为可以微调JA诱导的反应，JA和ET具有协同作用。许多水稻基因参与了JA代谢，包括gydF4y2BaOsHI-LOXgydF4y2Ba［gydF4y2Ba12gydF4y2Ba),gydF4y2BaOsPLDa4gydF4y2Ba而且gydF4y2Baa5gydF4y2Ba［gydF4y2Ba13gydF4y2Ba),gydF4y2BaOsHPL3gydF4y2Ba［gydF4y2Ba16gydF4y2Ba),gydF4y2Ba重获gydF4y2Ba［gydF4y2Ba18gydF4y2Ba),gydF4y2BaOsr9-LOX1gydF4y2Ba［gydF4y2Ba19gydF4y2Ba),gydF4y2BaOsJMT1gydF4y2Ba［gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]，可调节BPH抗性。JA及其代谢产物在抗BPH方面具有多种功能。ET途径通常被认为是负向调节水稻的BPH抗性[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．et反应基因gydF4y2BaOsERF3gydF4y2Ba编码一种核定位蛋白，该蛋白在水稻条纹螟虫(SSB;gydF4y2Ba卡勒suppressalisgydF4y2BaWalker)。转基因水稻过表达gydF4y2BaOsERF3gydF4y2Ba表现出更好的SSB抗性，但更容易患BPH。gydF4y2BaOsACS2gydF4y2Ba编码水稻1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶基因，该基因可被SSB和BPH感染诱导。抑制gydF4y2BaOsACS2gydF4y2Ba在水稻中表达降低了乙烯排放和SSB抗性，但增强了BPH抗性[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

' Rathu Heenati ' (RH)， angydF4y2Ba籼稻gydF4y2Ba来自斯里兰卡的水稻品种对所有BPH生物型都具有高而持久的抗性。RH通常用作鉴定抗BPH水稻品种的阳性对照，是水稻育种中重要的抗BPH供体。本研究以bph易感水稻品种“台中原生1号”(TN1)为对照，利用cDNA微阵列技术分析了RH的全基因组表达。所有的水稻植株在自然生长(未经处理)、针刺(模拟简单的机械伤口)和BPH感染三种处理条件下生长，并在处理后6和24 h使用两个采样时间点。在侵染BPH后6、24、48 h，测定RH、TN1幼苗SA、JA水平的变化。由于ET的波动性，其含量难以测量，因此在本研究中未确定。本研究揭示了RH在基因组转录水平上通过JA和SA含量的变化对BPH的抗性反应。本研究结果有助于了解RH抗BPH的生物学基础，并为水稻育种寻找新的抗BPH相关基因提供依据。gydF4y2Ba

BPH感染下RH和TN1差异表达探针组的全基因组比较gydF4y2Ba

试验设计包括2个水稻品种(RH和TN1)， 3个处理(未处理对照、针刺和褐飞虱侵染)和2个采样时间点(侵染后6和24 h)。共12个样品，每个样品3个生物重复。用缩写R6C、R24C、R6N、R24N、R6P、R24P、T6C、T24C、T6N、T24N、T6P和T24P表示这12个样品，其中第一个字母R或T分别表示水稻品种RH或TN1;中间的阿拉伯数字为治疗后6 h或24 h采集时间点;最后一个字母C、N或P分别表示三种不同的处理之一，分别为未处理对照、针刺或BPH感染。包含57,194个探针组的Affymetrix GeneChip水稻基因组阵列被用于微阵列分析，所有36个芯片的结果被提交到NCBI网站(gydF4y2Bahttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/gydF4y2Ba；登录号:GSE74106;额外的文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

本研究共检测到8019个差异表达探针组[fold change (FC)≥2]。其中包括不同处理之间的3682个差分探针组，不同品种(RH和TN1)之间的3339个，不同采样次数之间的5757个，两个非差分变量相同(附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．为了比较RH和TN1之间的基因表达差异，使用Multi-Experiment Viewer将所有8019个差异探针集根据其表达模式聚类到不同的组。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．显著的是，k组785个差异探针组在所有条件下TN1低表达，RH高表达;相比之下，p组的682个差异探针组在所有条件下RH低表达，TN1高表达。因此，k组和p组大致代表RH和TN1的遗传背景差异。与RH构成抗性相关的基因应该包括在这两类。a组和m组分别代表RH中BPH感染特异性表达水平下调(6个差异探针组)和上调(61个差异探针组)的探针组。这两个探针组的基因可能与RH的BPH侵袭反应抗性有关。l、q、r和s组的差分探针集随采样时间呈规律性波动，表明其表达主要受采样时间(昼夜节律或其他环境因素)的控制。这四种表达模式共包含3793个差动探针集，几乎占8019个差动探针集的一半。gydF4y2Ba

BPH抗性研究的最佳参考基因gydF4y2Ba

内参基因是保证特定条件下基因表达分析准确性的关键因素。选择一个在BPH感染下稳定表达的基因作为定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)分析的参考是非常重要的[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．数字gydF4y2Ba2gydF4y2Ba显示了8个常用的内参基因，gydF4y2Baactin-1gydF4y2Ba（gydF4y2BaOs03g50890gydF4y2Ba)，gydF4y2BaLSD1gydF4y2Ba（gydF4y2BaOs12g41700gydF4y2Ba)，gydF4y2BaGAPDHgydF4y2Ba（gydF4y2BaOs02g38920gydF4y2Ba)，gydF4y2BaSDHAgydF4y2Ba（gydF4y2BaOs07g04240gydF4y2Ba)，gydF4y2Ba“gydF4y2Ba（gydF4y2BaOs02g45410gydF4y2Ba)，gydF4y2BaRPS27αgydF4y2Ba（gydF4y2BaOs01g22490gydF4y2Ba)，gydF4y2BaHSPgydF4y2Ba（gydF4y2BaOs03g31300gydF4y2Ba),gydF4y2Ba泛素gydF4y2Ba（gydF4y2BaOs03g03920gydF4y2Ba)，以及它们在不同处理下从微阵列数据中提取的信号值。gydF4y2BaActin-1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaRPS27αgydF4y2BaBPH感染后24 h内TN1和RH均下调;gydF4y2BaGAPDHgydF4y2BaRH与TN1表达差异明显;的表达水平gydF4y2BaLSD1gydF4y2Ba稳定但相对较低。在剩下的四篇参考文献中，gydF4y2Ba真沸点gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba泛素gydF4y2Ba表现出较好的整体一致性gydF4y2BaHSPgydF4y2Ba而且gydF4y2BaSDHAgydF4y2Ba．因此,gydF4y2Ba真沸点gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba泛素gydF4y2Ba确定为BPH抗性研究的合适内参基因。gydF4y2Ba泛素gydF4y2Ba作为本研究所有qRT-PCR分析的内参基因。gydF4y2Ba

为了寻找更多稳定的内参基因用于bph侵袭条件下的基因表达分析，筛选了373个总方差< 5%的探针组。选择两个低表达方差和合适表达水平的探针组Os.1322.1。S1_at (gydF4y2BaOs05g23860gydF4y2Ba)和Os.145.1。S1_a_at (gydF4y2BaOs02g56000gydF4y2Ba)(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，在MSU Rice Genome Annotation Project Release 7中，这两个探针组对应的基因分别被注释为rab GDP解离抑制剂α和26S蛋白酶调节亚基6A (gydF4y2Bahttp://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtmlgydF4y2Ba)．它们也稳定地表达在整个生命周期gydF4y2Ba籼稻gydF4y2Ba水稻品种‘明辉63’和‘镇山97’[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

在基因组水平上，RH和TN1对BPH感染的不同防御反应gydF4y2Ba

针刺后6 h, RH与自然生长下的样品相比，差异探针组有92组，而TN1有211组，说明TN1对简单机械损伤的反应比RH更敏感。然而，在针刺24小时后，RH(27)和TN1(38)均检测到较少的差异探针组(表2)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，表明对简单机械损伤的反应在24 h时基本恢复。gydF4y2Ba

在BPH感染6小时后，RH组(209)比TN1组(173)有更多的差异探针组。高fc的差异探针组(>5)在RH组为35例，TN1组为12例gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．尽管TN1对简单的机械损伤相对更敏感，但在BPH感染后6小时(早期)RH检测到更多的差异探针组，这意味着RH对BPH感染的防御反应比TN1更强烈。在BPH侵染后24 h，相对于6 h, RH检测到更多的差异探针组(614个)，带有FCs > 5的探针组数量也从35个增加到73个，说明BPH侵染信号逐步传递到下游相关基因。然而，BPH感染24小时后，TN1的差异探针组数量急剧增加到3356个，> 5的fc数量也从12个急剧增加到349个(表2)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．因此，在BPH感染后6小时，RH检测到更多的差异探针组;然而，在BPH感染后24小时，TN1检测到更多的差异探针组。在BPH感染后24小时，TN1中检测到的许多差异探针组可能代表了对BPH引起的严重损伤所引起的伤害和各种生理应激的反应，而不是抵抗反应。在RH中，大多数差异探针组在BPH感染后6或24 h上调，这表明抗性相关基因的诱导表达可能是RH对BPH防御反应的主要分子基础。gydF4y2Ba

差分探针集的维恩图分析如图所示。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba．在BPH感染6小时后RH的差异探针组中，针刺6小时后也有53个RH存在。在BPH感染6小时后TN1的差异探针组中，针刺6小时后也有60组存在。在治疗后24小时，大多数针扎下的差异探针组，无论是RH还是TN1，也存在BPH感染。排除针刺下RH和TN1的差异探针组，以及BPH感染下TN1的差异探针组，共确定了192个RH特异性和BPH诱导探针组。这192个探针集可能代表了RH对BPH诱导防御的基础(附加文件)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

基因本体(GO)分析gydF4y2Ba

使用GOEAST软件对针刺下RH和TN1的差异探针组(R6N/R6C和T6N/T6C的差异探针组)或BPH感染(R6P/R6C, R24P/R24C, T6P/T6C和T24P/T24C的差异探针组)进行GO分析，其中包括两个主要的GO类别:生物过程(BP)和分子功能(MF)(附加文件)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．没有对R24N/R24C组和T24N/T24C组进行GO分析，因为在针刺24小时后发现很少有差动探针组。具有显著差异的BP类别和MF类别的第一级以及相关的带有注释的差分探测集的百分比如图所示。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba．正如预期的那样，在针刺组(R6N/R6C和T6N/T6C)中，“对伤害的反应”是GO术语，被发现有显著差异。在BP分类中，“对生物刺激的反应”、“对非生物刺激的反应”、“对损伤的反应”、“对真菌的防御反应”、“细胞壁大分子分解代谢”和“几丁质分解代谢过程”的差异探针集主要上调，而“脂质运输”的差异探针集主要下调(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．在MF类别中，抗性相关项目的差异探针集，如“丝氨酸型内肽酶抑制剂活性”、“几丁质酶活性”、“β -葡萄糖苷酶活性”和“四吡啶结合”主要上调，而“RNA甲基转移酶活性”主要下调(图)。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

在RH中寻找BPH抗性相关基因候选gydF4y2Ba

由于在本研究中识别了太多的差分探针集，无法单独测试它们(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，采用策略减少BPH抗性相关基因的候选数量。一种策略是将微阵列分析与QTL作图相结合。此前报道了四个bph抗性qtl [gydF4y2Ba25gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba27gydF4y2Ba](附加文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．在这项研究中，我们鉴定了106个RH和TN1之间的差异基因，它们位于4个bph抗性QTL区域内(附加文件)gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)，根据其功能注释，其中14个可能与BPH抗性相关(表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．其中，5个基因位于gydF4y2BaQbph3gydF4y2Ba地区，5英寸gydF4y2BaBph17gydF4y2Ba，一个在gydF4y2BaBph3gydF4y2Ba还有三个在gydF4y2BaQbph10gydF4y2Ba地区。一个主要的bph抗性QTL，gydF4y2BaBPH17 / BPH3gydF4y2Ba，映射到gydF4y2BaBph17gydF4y2Ba克隆的，含有3个串联基因编码凝集素受体激酶(gydF4y2BaOsLecRK1-OsLecRK3gydF4y2Ba) [gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．然而，这三个基因的表达水平太低，在本研究中没有检测到。gydF4y2Ba

第二种策略是通过检测基因表达模式来确定BPH抗性相关的候选基因。聚类基因表达模式将差异探针集分为20组(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．m组代表那些仅在RH中可诱导bph而在TN1中不能诱导bph的差异探针组。维恩图分析也有助于去除由机械损伤和BPH感染引起的差异探针组(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．最后通过表达模式聚类和维恩图分析筛选出23个候选基因。这些选择的候选基因具有相似的表达模式(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．它们仅在RH中可被BPH感染诱导，而在TN1中不能被机械损伤诱导。在23个BPH抗性相关的候选基因中，gydF4y2BaOs03g12660gydF4y2Ba该基因编码细胞色素P450蛋白，是唯一也位于BPH抗性QTL区域的基因(gydF4y2BaQbph3gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

BPH侵染下SA、JA水平的动态变化及SA、JA、ET通路相关基因的差异gydF4y2Ba

在BPH感染后6、24和48 h，检测RH和TN1中SA和JA水平(游离状态)。总的来说，在BPH感染后，RH和TN1中的SA水平显著升高(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）;而RH和TN1的JA水平在BPH感染后明显下降(图2)。gydF4y2Ba6 bgydF4y2Ba)．RH中SA含量的变化比TN1中更快。RH中SA含量在BPH感染后6小时有所增加，而TN1中SA含量直到24小时才增加(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

表中列出了bph侵染处理下涉及SA、JA和ET途径的所有差异基因gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba．SA、JA和ET通路所涉及的基因信息参考京都基因和基因组百科全书注释。检测到6个参与SA代谢的差异基因，除1个基因(gydF4y2BaOs02g19970gydF4y2Ba)参与ET和SA代谢。gydF4y2Ba

在42个JA通路相关基因中，有17个在RH或TN1 BPH侵染下表达上调。然而，在RH和TN1之间，JA途径涉及的差异基因的表达水平模式是不同的gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．RH中6个差异基因均上调，且均为茉莉酸ZIM-domain (jasmonate zimm -domain, JAZ)转录因子，是JA信号转导通路的重要负调控因子，提示BPH侵袭下RH中JA通路被抑制(表2)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．11个差异表达基因均为JA代谢相关基因，包括几个与JA合成相关的脂氧合酶(LOX)基因。此外，还检测到16个与ET代谢相关的差异基因。其中大部分存在于TN1，并在BPH感染后24小时下调(表2)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．相对而言，BPH感染后RH的ET通路受影响较小。gydF4y2Ba

分离bph诱导启动子gydF4y2Ba

微阵列分析有助于bph诱导启动子的分离。从23个BPH抗性相关基因候选中筛选出6个具有代表性的BPH诱导基因(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．这6个基因的表达水平仅在RH中被BPH侵染诱导，针刺或TN1中仅被轻度或完全不被诱导。qRT-PCR分析显示，这6个基因在SA或JA处理后也被上调(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

通过PCR从RH和TN1中分离得到6个bph诱导基因的启动子区和编码序列，并进行测序。RH和TN1在这6个基因启动子区域的序列差异不显著。此外，编码区域的DNA序列比较显示RH和TN1之间没有差异。有人假设这些基因在RH中的诱导性不是由启动子序列决定的，而是由遗传背景决定的。gydF4y2Ba

其他水稻品种，包括4个抗bph的品种(“PTB33”、“R644”、“B5”和“IR54751”)和4个易感bph的品种(“Bai56”、“Nipponbare”、“珍山97b”和“9311”)被用于进一步研究。与RH和TN1相似，6个所选基因的表达水平在所有抗性品种中都相对较高，且显著受BPH侵袭诱导，而在所有敏感品种中表达水平相对较低，且几乎不受BPH侵袭诱导(附加文件)gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)．这6个抗性相关基因的基因组序列也从另外8个水稻品种中分离出来并进行了比较。启动子和编码序列在抗性和敏感品种间均无显著差异。gydF4y2Ba

在本研究中，通过微阵列分析，确定并比较了抗药RH和易感TN1在BPH侵袭下的全基因组反应。Wang等人报道的一项类似研究，以RH和TN1作为受虫害影响的水稻材料进行了微阵列分析[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．然而，Wang等人的研究并没有对每个采样时间点(BPH感染后0、8和24小时)进行未经处理的对照，他们只是将0小时收集的样本作为微阵列分析的对照。这种设计是有问题的，因为许多基因的表达水平是由昼夜节律或其他环境因素调节的。我们研究中的表达模式聚类清楚地显示了3793个差分探针集，如图中的l、q、r和s组。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，几乎占所有检测到的差异探针组的一半，明显受到昼夜节律或其他环境因素的影响。这些可能被误认为与BPH感染有关，因为缺乏对每个采样时间的控制。第二，我们的研究包括针刺治疗，而Wang等人的研究没有。水稻对BPH的免疫反应涉及水稻与BPH之间的分子相互作用，BPH唾液中的特定效应物触发水稻的抗性反应，通过喂食传递到水稻细胞中，并被水稻中的特定受体识别[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．针刺治疗可用于排除那些对简单机械损伤有反应的差异基因。gydF4y2Ba

还有其他几项研究也利用RNA测序(RNA seq)或微阵列分析分析了水稻品种对BPH感染的反应基因表达[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．在Lv等人的研究中，BPH易感WT ' 9311 '和抗性' 9311 '的RNA-seq包含gydF4y2BaBPH15gydF4y2Ba是为了帮助识别gydF4y2BaBPH15gydF4y2Ba，位于重组冷点[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．Wang等人的研究比较了两者的基因表达谱gydF4y2Ba英国电信gydF4y2Ba和非gydF4y2Ba英国电信gydF4y2Ba水稻对黑穗病侵扰的反应[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．在这两项研究中，用于基因表达分析的水稻材料的遗传背景均为BPH易感' 9311 ' [gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]或“秀水11”[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba];因此，他们的结果不能反映水稻品种对BPH侵袭的反应。gydF4y2Ba

基因芯片分析显示RH和TN1对BPH感染的反应有显著差异。与TN1相比，RH在BPH感染的早期反应更活跃，因为在BPH感染后6小时，RH比TN1检测到更多的差异探针组(209)。相反，在BPH感染后24小时，TN1检测到的差异探针组(3356)比RH检测到的差异探针组(614)要多。许多24小时的差异探针组反映了TN1在BPH发作时由于缺乏抵抗而引起的生理和代谢变化。GO分析还证实，在BPH感染后24小时，TN1中的许多差异探针组与非生物和生物胁迫有关。RH在BPH感染后6 h或24 h检测到的差异探针组大多上调，这表明防御相关基因的上调可能是RH抗BPH的分子基础。gydF4y2Ba

RH中SA水平的变化比TN1中发生得更快，且SA水平的升高先于JA水平的下降，说明SA通路在触发bph抗性反应中起主导作用。JA含量的下降可能是由于SA的拮抗作用所致，BPH侵染后SA的拮抗作用增加。SA通路的主要变化趋势是SA合成相关基因的上调，这与BPH侵染后SA含量的变化一致。而JA途径的差异基因在RH和TN1之间表现出显著的差异变化模式。RH中6个差异基因均上调，均为JAZ转录因子，是JA途径的重要负调控因子。而在TN1中，参与JA合成的差异基因有11个上调，只有2个是JAZ转录因子。JA也与伤害反应有关。TN1作为易感品种，缺乏抗BPH相关基因，在BPH侵袭下受到更严重的损害。因此，JA合成相关基因的上调可能是对BPH引起的伤害或其他胁迫的反应，而不是抵抗反应。gydF4y2Ba

虽然四个主要的BPH抗性qtl是通过基于图谱的技术克隆的，但许多BPH抗性相关基因，包括gydF4y2BaOsHI-LOXgydF4y2Ba［gydF4y2Ba12gydF4y2Ba),gydF4y2BaBphi008agydF4y2Ba［gydF4y2Ba13gydF4y2Ba),gydF4y2BaOsERF3gydF4y2Ba［gydF4y2Ba14gydF4y2Ba),gydF4y2BaOsPLDα4gydF4y2Ba而且gydF4y2Baα5gydF4y2Ba［gydF4y2Ba15gydF4y2Ba),gydF4y2BaOsACS2gydF4y2Ba［gydF4y2Ba17gydF4y2Ba),gydF4y2BaOsr9-LOX1gydF4y2Ba［gydF4y2Ba19gydF4y2Ba),而gydF4y2BaOsJMT1gydF4y2Ba［gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]，也使用反向遗传学策略进行分离。几乎所有这些BPH抗性相关基因都可诱导BPH或SSB感染，并参与SA、JA或ET途径。在BPH侵袭下对RH和TN1进行cDNA芯片分析，为鉴定新的BPH抗性相关基因奠定了基础。gydF4y2Ba

bph响应启动子在抗bph转基因水稻品种开发中具有潜在应用价值。因此，一些具有代表性的rh特异性和bph诱导基因的上游启动子区域大约2 kb被分离出来，并与GUS报告基因融合。然而，当对BPH敏感的水稻品种进行测试时，这些假定的BPH诱导启动子在BPH侵袭下要么没有诱导，要么诱导效果很差。DNA测序分析表明，这些rh特异性基因和bph诱导基因在抗bph和敏感水稻品种的启动子区和编码区均无显著差异。因此，大多数bph诱导基因的启动子可能不是bph诱导的，它们可能受到bph抗性网络中上游反式调控子的调控。换句话说，它们的表达模式是由遗传背景决定的，而不是启动子序列。gydF4y2Ba

在本研究中，通过cDNA微阵列分析揭示了在BPH侵袭下RH和TN1之间的全基因组响应差异。差异探针集的表达模式聚类表明，1467个差异探针集(p组和k组)可能与RH的本构抗性有关，67个(a组和m组)可能与BPH侵袭响应抗性有关。维恩图分析确定了192个rh特异性和bph诱导探针组。最后，通过表达模式聚类和维恩图分析，筛选出23个BPH抗性相关基因候选。在整体基因表达和SA水平上，RH对BPH感染的整体反应比TN1更迅速。在RH中，SA的显著增加(BPH感染后6小时)先于JA的显著减少(BPH感染后24小时)发生，这表明SA在介导BPH抗性反应中起主导作用。在RH中，SA通路的差异基因在BPH感染后与合成相关并上调。JA途径的差异基因上调，为JAZ转录因子，是JA途径的重要负调控因子。这些结果与黑穗病侵染RH幼苗SA和JA水平的变化一致。相对而言，在RH中，参与ET途径的基因较少受到BPH感染的影响。 The results of this study aid in understanding the molecular foundation of BPH resistance in the RH and facilitate the identification of new resistance-related genes for breeding BPH-resistant rice varieties.

植物材料gydF4y2Ba

水稻品种RH和TN1由华红霞教授提供。RH是一种来自斯里兰卡的籼稻品种，对所有BPH生物型具有高水平的广谱抗性。籼稻品种TN1对所有BPH生物型高度敏感。何玉清教授鉴定并提供了4个抗bph水稻品种PTB33、R644、B5和IR54751。4个bph易感水稻品种“Bai56”、“Nipponbare”、“珍山97b”和“9311”已收集并保存在本实验室。在本研究之前，所有涉及的水稻材料的BPH抗性都在我们的实验室进行了验证。gydF4y2Ba

用于微阵列分析的植物样品制备gydF4y2Ba

使用了抗bph的RH和易感bph的TN1两个水稻品种。本实验的BPH种群采集自中国武汉当地的稻田，并在笼中用TN1饲养。这个BPH种群是BPH生物型1和2的混合，这代表了当地存在的主要天然BPH种群。gydF4y2Ba

RH和TN1的种子在小盆中播种，在自然条件下生长。每罐大约播种15粒种子，2周后，每罐只保留10株生长良好的水稻幼苗。对2周龄的RH和TN1秧苗进行了3种处理，即未经处理(自然生长)、针刺和侵染BPH。针刺时，每株幼苗底部用针扎15次，然后正常生长。对于BPH侵扰，每盆大约引进100只三龄BPH若虫(平均每株幼苗10只若虫)。为了防止仙女逃跑，每个罐子都被放在一个网笼子里。所有处理均采用BPH感染后6和24 h的采样时间点。每个处理和采样时间点均重复3次。从每盆中收集10株幼苗作为复制。处理后收集苗芽(地上部分)，立即置于液氮中，-80℃保存。最后，所有样品都被运送到CapitalBio公司(北京，中国)进行微阵列检测。gydF4y2Ba

RNA提取，微阵列杂交和数据分析gydF4y2Ba

通过CapitalBio进行RNA提取、纯化、微阵列杂交和基因注释。RNA提取后，按照制造商的说明使用nuclespin RNA清理试剂盒(machery - nagel，德国)纯化总RNA。用1%琼脂糖凝胶甲醛电泳法测定RNA质量。生物素标记的cRNA使用MessageAmp™II-Biotin试剂盒(Ambion, TX, USA)合成。在Affymetrix GeneChip Expression Analysis技术手册的指导下，将生物素标记的cRNA线性化成35-300 bp的片段。线性cRNA与Affymetrix水稻基因组阵列在Affymetrix GeneChip 320杂交烤箱中在45°C下杂交16小时。杂交后，芯片在Affymetrix fluics Station 400中洗涤和染色。最后，使用GeneChip Scanner 3000对芯片进行扫描。利用CapitalBio进行单阵列分析、比较分析和分子注释系统。gydF4y2Ba

数据分析gydF4y2Ba

维恩图是在网站上制作的gydF4y2Bahttp://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/gydF4y2Ba．探针集表达模式聚类使用java环境下的Multi Experiment Viewer软件(gydF4y2Bahttp://mev.tm4.org/gydF4y2Ba)．GO分析在网站上进行gydF4y2Bahttp://omicslab.genetics.ac.cn/GOEAST/php/affymetrix.php?#step1_anchorgydF4y2Ba［gydF4y2Ba33gydF4y2Ba］．所有表达差异探针之前都是由CapitalBio使用单向方差分析(one-way ANOVA)识别的。我们分析中使用的基因信息来自网站京都基因和基因组百科全书(gydF4y2Bahttp://www.kegg.jp/kegg/kegg2.htmlgydF4y2Ba)， crep (gydF4y2Bahttp://crep.ncpgr.cn/gydF4y2Ba)、草(gydF4y2Bahttp://grassius.org/grasstfdb.htmlgydF4y2Ba)及RGAP (gydF4y2Bahttp://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtmlgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

植物激素处理后的表达谱分析gydF4y2Ba

RH和TN1植株在25-30°C的温室条件下生长，光周期为14 h /10 h。在三叶期，将RH和TN1植株转入含有0.1 mM SA或JA的水培营养液中。在处理后0、0.5、2、6、12和24 h的每个时间点，收集3 ~ 5株整株植物进行RNA分离和提取。gydF4y2Ba

存在分析gydF4y2Ba

使用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche, Mannheim, Germany)，按照制造商的说明，用2 μg dnase处理过的总RNA进行RT。采用SYBR Premix Ex Taq TM (Takara, Dalian, China)进行实时PCR。反应在体积为20 μL的条件下进行，其中SYBR Premix Ex Taq TM (2×)为10 μL，每个基因特异性引物0.4 μL (10 μM)， ROX参比染料(10 μL)为0.4 μL, cDNA模板为2 μL, ddH为6.8 μLgydF4y2Ba_2gydF4y2Bao .的gydF4y2Ba泛素gydF4y2Ba基因作为内参基因。实时PCR在7500实时PCR系统(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)上进行。每个RNA样本在技术复制中使用两次。本研究中使用的所有引物都列在附加文件中gydF4y2Ba8gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

激素决定gydF4y2Ba

采用液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS 8030 plus, Shimadzu, Beijing, China)测定植物组织中的SA和JA水平，方法如下:将200 mg新鲜样品冷冻在液氮中，用小玻璃杵在2 ml的小瓶中碾碎。加入1.0 mL 80%甲醇后，匀浆在超声波浴中充分混合，然后在4°C保存过夜。经15200 ×离心后gydF4y2BaggydF4y2Ba收集上清液10分钟，然后在Jouan RCT-60浓缩器中真空至干燥。干燥的提取物溶解在200 μL 0.1 mol/L磷酸钠溶液(pH 7.8)中，然后通过Sep-Pak C18药筒(Waters, MA, USA)。用1.5 mL 80%甲醇洗脱，洗脱液再次真空干燥。10 mL 10%甲醇溶解后，取5 μL注入LC-MS/MS体系。LC采用2.0 mm id × 75 mm Shim-pack XR ODSI色谱柱(2.2 μm, Shimadzu)，柱温40℃。流动相为溶剂A (0.02% v/v乙酸水溶液)和溶剂B (100% v/v甲醇)，采用梯度模式[时间/A浓度/B浓度(min/%/%)为0/90/10;5/10/90;6/10/90和6.1/90/10]，洗脱流速为0.3 mL/min。对于SA，采用负离子模式电喷雾电离，将质量体系设置为多反应监测模式。所采用的操作条件为雾化气体流量2.5 L/min，干燥气体流量15 L/min，脱溶温度150℃，热阻滞温度400℃。 The ionization conditions were pre-bias voltages of 10 V for quadrupole 1 and 24 V for quadrupole 3, collision energy of 28 eV, and mass-to-charge ratio of 137/93. For JA, the mass system was set to multiple reactions monitoring mode using electrospray ionization in the negative ion mode. The operation conditions used were a nebulizing gas flow of 3 L/min, drying gas flow of 15 L/min, desolvation temperature of 250 °C and heat block temperature of 500 °C. The ionization conditions were pre-bias voltages of 10 V for quadrupole 1 and 10 V for quadrupole 3, collision energy of 15 eV, and mass-to-charge ratio of 209/59.

良性前列腺增生:gydF4y2Ba

褐飞虱gydF4y2Ba

等:gydF4y2Ba

乙烯gydF4y2Ba

走:gydF4y2Ba

基因本体论gydF4y2Ba

是:gydF4y2Ba

茉莉酸gydF4y2Ba

JAZ:gydF4y2Ba

茉莉酸zimm结构域蛋白gydF4y2Ba

QTL:gydF4y2Ba

数量性状位点gydF4y2Ba

RH:gydF4y2Ba

Rathu HeenatigydF4y2Ba

山:gydF4y2Ba

水杨酸gydF4y2Ba

TN1:gydF4y2Ba

台中人1gydF4y2Ba

感谢国家转基因育种专项重点项目(2016ZX08010002-002)、中央大学基本科研业务费项目(2013PY06)和国家自然科学基金(91317312)的支持。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

转基因育种国家重点专项(2016ZX08010002-002)资助基因芯片检测、数据分析、qRT-PCR和DNA测序。中央大学基本科研业务费项目2013PY06资助水稻材料采集与鉴定。国家自然科学基金(91317312)资助植物激素测定。gydF4y2Ba

数据和材料的可用性gydF4y2Ba

本研究的数据可从NCBI的基因表达Omnibus通过GEO系列登录号GSE81297 (gydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

YL和HC构想并设计了本研究;CL、CL、ZZ制作样品;CL和LX完成激素测定;CL, FL和RW进行分析;CL和HC撰写了手稿。所有作者都已阅读并批准了这篇手稿的最终版本。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者宣称他们之间没有利益冲突。gydF4y2Ba

发表同意书gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室，国家植物基因研究中心(武汉)，武汉430070gydF4y2Ba

   李长岩，罗超，周再辉，王锐，凌飞，林永军，陈浩gydF4y2Ba

2. 湖南农业大学植物激素与生长发育湖南省重点实验室，长沙410128gydF4y2Ba

   Langtao肖gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba陈郝gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文根据创作共用属性4.0国际许可协议(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba)，允许在任何媒介上不受限制地使用、分发和复制，前提是您对原作者和来源给予适当的赞扬，提供到创作共用许可证的链接，并注明是否进行了更改。创作共用公共领域奉献弃权书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)除另有说明外，适用于本条所提供的资料。gydF4y2Ba

转载及权限gydF4y2Ba