选择性过滤器中的单氨基酸替换呈现gydF4y2Ba注gydF4y2Ba1α水孔蛋白透水gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

水通道蛋白(Aquaporins, AQPs)是一种完整的膜蛋白，促进水和/或其他小中性溶质在所有生命形式中的跨膜运输。X固有蛋白(XIPs)是高等植物中最近被发现的、特征最少的水通道蛋白亚家族。xip1不透水，但可渗透硼酸、甘油、过氧化氢和尿素。然而，关于选择性决定因素的不确定性和缺乏一种容易量化的活性阻碍了功能研究。为了解决这些问题，我们开始引入水的渗透性gydF4y2Ba烟草benthamianagydF4y2BaXIP1; 1α(gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1;1α)，通过交换预测的选择性芳香/精氨酸(ar/R)选择性过滤器的氨基酸残基gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1;1α为构成水渗透ar/R选择性过滤器的残基gydF4y2Ba在gydF4y2BaTIP2; 1。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

在这里，我们提出了关于假设过滤器中的氨基酸替换以及环C和环D的删除的功能结果gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1α。此外，建立了基于高分辨率x射线结构的同源模型gydF4y2Ba在gydF4y2BaTIP2;1对野生型和突变型的功能性质进行合理化gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1α。我们的结果表明，在ar/R滤波器中，thr246比Val 242更适合作为螺旋5位置的残基gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1;1α，表明在异质表达时孔没有被环堵塞gydF4y2Ba毕赤酵母属pastorisgydF4y2Ba．此外，我们的结果表明，螺旋1 (L79G)或螺旋2 (I102H)上的单个氨基酸取代足以呈现gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1α水渗透。基于ar/R滤光片孔径和疏水性的综合模型可以对大多数功能结果进行合理解释。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

水的渗透gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1;1α突变体表明异质表达的蛋白是正确折叠的，并为探索蛋白质的结构和功能特性提供了手段gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1α。我们的结果支持Thr 246是ar/R滤波器的一部分。此外，我们认为，在分支B的XIPs中，螺旋1中一个与酸性残基相连接的盐桥可以指导精氨酸在ar/R选择性过滤器中的方向，并提供了一种新的方法来调节aqp的选择性。gydF4y2Ba

主要内在蛋白(MIPs)，通常被称为水通道蛋白(AQPs)，构成了一个庞大的通道蛋白超家族，可渗透到水和/或小的不带电溶质[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．aqp存在于所有形式的生命中，在植物中含量特别高[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．植物水通道蛋白有7个亚家族，分别是:质膜固有蛋白(PIPs)、液泡体固有蛋白(TIPs)、结节蛋白26样固有蛋白(NIPs)、小碱性固有蛋白(sip)、甘油促进物样固有蛋白(GIPs)、杂交固有蛋白(HIPs)和X固有蛋白(XIPs) [gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

四聚体水通道结构，其中每个单体形成一个功能孔，似乎在所有aqp中是保守的。该单体由6个跨膜螺旋(螺旋1 -螺旋6)由5个环(环A -环E)连接，N端和C端均位于细胞质中(图1)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．环B和环E从相反的方向折叠回膜内，形成两个短螺旋，分别为螺旋B和螺旋E，它们共同在单体的右旋α-螺旋束上增加了第7个α-螺旋跨膜结构。这两个半α-螺旋在其n端包含在蛋白质中间相遇的天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸(NPA)水通道基序。AQPs的基质渗透性受孔隙中两个区域的控制。gydF4y2Ba

首先，两个半螺旋的宏观偶极子有助于在保守NPA区域排斥正电荷[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]其次，可变芳香族精氨酸(ar/R)选择性过滤区域通过提供适合底物的底物特异性孔径和特异性相互作用调节AQPs中的底物特异性[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．这第二个区域最初被认为由四个氨基酸残基组成[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]，然而，最近解决的x射线晶体结构gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2BaTIP2;水通道蛋白1 (gydF4y2Ba在gydF4y2BaTIP2;1)在1.18 Å的原子分辨率下显示了一个扩展ar/R过滤器，在孔隙的特定位置上有5个氨基酸残基[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．除了最初确定的螺旋2,5,E(表示为H2gydF4y2Ba^PgydF4y2Ba, H5gydF4y2Ba^PgydF4y2Ba,他gydF4y2Ba^PgydF4y2Ba)以及循环E (LEgydF4y2Ba^PgydF4y2Ba)，循环C中的一个位置(LCgydF4y2Ba^PgydF4y2Ba)被这个结构所覆盖。此外，在氨和水的渗透gydF4y2Ba在gydF4y2BaTIP2;1 HE位的保守精氨酸gydF4y2Ba^PgydF4y2Baar/R选择性滤波器在一个新的空间位置上被发现，该空间位置是由与组氨酸在H2位置上的氢键稳定的gydF4y2Ba^PgydF4y2Ba．人类AQP1的突变研究表明，可以模拟类似tip2的底物结构[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]，这表明在其他AQPs中也可能会诱导类似的精氨酸取向。gydF4y2Ba

xip很容易与其他aqp区分开来，因为它们分别在C环和E螺旋中有保守的LGGC和NPARC基序[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．迄今为止，XIPs主要在双子叶植物、真菌和原生动物中发现[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．根据系统发育分析，植物XIPs被分为4个亚群(I- iv)，其中I亚群由来自苔藓和穗藓等低等植物的XIPs组成[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．赤藓属的XIPs分为A和B两个分支，分别对应于II亚群和III + IV亚群。很明显，XIP亚家族经历了一个相对较近的谱系特异性扩展，因为一些具有多个平行类群的类群只在密切相关的类群中被发现[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．在gydF4y2Ba烟草benthamianagydF4y2Ba例如，有三个密切相关的基因，gydF4y2BaNbXIP1; 1 - 1; 3,gydF4y2Ba其中gydF4y2BaNbXIP1; 1gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba1、2gydF4y2Ba交替拼接[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．尽管净化选择一直是主要的进化力量，但植物XIPs似乎经历了积极选择的时期[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．因此，植物XIPs的进化史表明，XIPs的不同分支具有不同的功能。根据序列相似性和提出的底物选择性，XIPs最初被认为与NIPs有关[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．然而，在原始植物中，基于H2位组氨酸的存在，已经提出了XIPs和TIPs的功能冗余gydF4y2Ba^PgydF4y2Ba的选择性滤波器[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．此外，一些支持与HIPs, TIPs和动物aqp8的深度矫形(所有的组氨酸在H2gydF4y2Ba^PgydF4y2Ba)是基于系统发育研究提出的[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．总的来说，这表明gydF4y2Ba在gydF4y2BaTIP2;1应该是xip同源建模的合适模板。gydF4y2Ba

在gydF4y2Ba据报道TIP2;1对氨和水具有高渗透性[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．另一方面，人们预测了XIPs，后来发现它不透水，但可渗透硼酸、甘油、尿素和过氧化氢[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．在最近的一项研究中，氨基酸残留在螺旋二位置(H2gydF4y2Ba^PgydF4y2Ba)在ar/R滤波器中显示出XIPs之间的显著差异[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]，提示该位置的残基可能对XIPs的底物特异性有较强的影响。gydF4y2Ba

xip在许多方面与其他aqp不同，这使得对齐它们变得困难，特别是在环和螺旋5对应的区域。基于螺旋5中甘氨酸残基的守恒性，提出了两种可选的排列方式，将缬氨酸或苏氨酸放置在H5上gydF4y2Ba^PgydF4y2Ba大多数双子叶状XIPs的位置，前者的排列受到疏水性图和结构约束的明显释放的支持[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．然而，在位置H5的残留物的身份gydF4y2Ba^PgydF4y2Baar/R滤波器以及侧翼环D和E的长度尚未确定。gydF4y2Ba

如上所述，gydF4y2BaXIP1; 1gydF4y2Bapre-RNA在gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba可以交替拼接导致两个不同的gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1蛋白[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．的gydF4y2Ba注gydF4y2Ba本文研究的XIP1;1α蛋白的n端区域较gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1β蛋白。在最近的一项研究中，我们证明gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1;1α剪接变体在酵母中表达时，对硼酸具有渗透性gydF4y2Ba毕赤酵母属pastoris,gydF4y2Ba通过生长试验和在蛋白脂质体中纯化和重组[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．然而，试图量化硼酸在酵母球质体中的渗透性是不成功的(未发表的结果)。基于中等硼酸渗透率的重构gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1和1α在蛋白脂质体中表达，提示该蛋白是门控的或只有部分活性。有趣的是，经异源表达和纯化的蛋白被发现在n端区域的多个位置被磷酸化，尽管磷酸化水平没有被量化[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．由于C或D环在XIPs中相对较长，因此可以想象孔隙被C或D环堵塞。与其他亚族相比，xip和pip有一个长度相似的D循环，这是发人深省的，因为这个循环是pip门控的中心[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．根据螺旋5的精确排列，XIPs中的D环要么比pip短一个氨基酸残基，要么比pip长三个氨基酸残基。gydF4y2Ba

突变的研究gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1;1α由于在球质体中缺乏一种容易直接量化的活性，从而忽略了在蛋白脂质体中重组AQPs时需要的纯化和重组每个突变蛋白的耗时步骤，而XIP1;1α受到了阻碍。在努力引入水的渗透性gydF4y2Ba注gydF4y2Ba为了深入了解XIP选择性过滤器中不同氨基酸的功能，我们开始交换gydF4y2Ba注gydF4y2Ba1α ar/R滤波器用于gydF4y2Ba在gydF4y2BaTIP2; 1 ar / R滤波器。在这项研究中，我们提出了在过滤器中的氨基酸替换以及环C和D的删除的功能结果gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αgydF4y2Ba．gydF4y2Ba进一步，我们建立和分析了基于的同源模型gydF4y2Ba在gydF4y2BaTIP2;1的晶体结构，使野生型和突变型的功能特性合理化gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1α。gydF4y2Ba

我们对异态表达的表征gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1;1α变异的目的是对各种XIP亚型和一般植物AQPs的分子理解。在植物中阐明XIPs的不同分支在整个植物环境中的生理作用还需要进一步的研究。gydF4y2Ba

建设gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1α突变体gydF4y2Ba

根据Thermo Scientific Phusion Site-Directed Mutagenesis Kit手册，设计了5 ' -磷酸化引物，并在聚合酶链反应中使用修饰的pPICZB载体gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αcDNA [gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]作为模板，生成含有cDNA的pPICZB片段gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1α突变体。修改后的pPICZB授予一个他gydF4y2Ba_10gydF4y2Ba标记和TEV蛋白酶裂解位点的n端gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1;1α氨基酸序列。PCR中使用的引物及其结果gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1;1α突变体见附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S1和表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,分别。得到的PCR产物被循环化，转化成gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba菌株XL1-Blue MRF’和构建物经纯化质粒测序验证。gydF4y2Ba

的变换gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1α突变体gydF4y2Ba毕赤酵母属pastorisgydF4y2Ba

质粒转化为野生型gydF4y2Ba毕赤酵母属pastorisgydF4y2Ba根据EasySelect™电穿孔X-33细胞gydF4y2Ba毕赤酵母属gydF4y2Ba表达套件手册[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．空的pPICZB也被改造成gydF4y2Ba毕赤酵母属pastorisgydF4y2BaX-33细胞为阴性对照。具有潜在高拷贝数的克隆gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1;1α突变体选择在含有不同浓度zeocin的YPDS (1% (w/v)酵母提取物，1% (w/v)蛋白胨，2% (w/v)葡萄糖，1 M山梨糖醇)和YPD (1% (w/v)酵母提取物，1% (w/v)蛋白胨，2% (w/v)葡萄糖)琼脂平板上[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

小规模的表达式gydF4y2Ba

如前所述，为了分析在不同抗生素浓度下选择的X-33克隆的表达水平，我们进行了小规模的表达筛选[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．简而言之,gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1;1α突变克隆培养于5ml BMGY (1% (w/v)酵母提取物，2% (w/v)蛋白胨，100mm磷酸钾pH为6.0,1.34% (w/v)酵母氮碱，4 × 10gydF4y2Ba^{−5gydF4y2Ba}% (w/v)生物素，1% (v/v)甘油)过夜产生生物量。的gydF4y2Ba毕赤酵母属gydF4y2Ba收集细胞，重悬于5ml BMMY (1% (w/v)酵母提取物，2% (w/v)蛋白胨，100mm磷酸钾pH 6.0, 1.34% (w/v)酵母氮碱，4 × 10gydF4y2Ba^{−5gydF4y2Ba}% (w/v)生物素，0.5% (v/v)甲醇)的光密度为600 nm (ODgydF4y2Ba_600gydF4y2Ba) 1。每24小时加入终浓度0.5% (v/v)的甲醇以维持蛋白质诱导。细胞培养在28°C下，以245转/分的转速连续摇动72 h。细胞对应40 ODgydF4y2Ba_600gydF4y2Ba在100 μL冷裂解缓冲液(50 mM NaPO)中，用玻璃微珠旋转裂解gydF4y2Ba_4gydF4y2BapH 7.4, 1 mM EDTA, 5% (v/v)甘油，1 mM PMSF)。裂解液经离心澄清，并对含有粗细胞提取物的上清液进行分析gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1;1蛋白印迹检测。gydF4y2Ba

免疫印迹分析gydF4y2Ba

细胞粗提取物在3.33 × SDS负载缓冲液(250 mM Tris-HCl pH 6.8, 40% (v/v)甘油，8% (w/v) SDS, 2.4 M β-巯基乙醇，0.1% (w/v)溴酚蓝)室温孵育30 min。蛋白质在12% SDS-PAGE凝胶上分离，并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Millipore)上。His-taggedgydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1;1α突变蛋白用小鼠6xHis单克隆一抗(Clontech)探测，以辣根过氧化物酶偶联山羊抗小鼠IgG作为二抗。印迹用增强化学发光法(ECL)显现。用于his标记的定量gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1;1α突变蛋白，用Syngene PXi触控仪扫描膜上的蛋白信号(见附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S1)。扫描图像用ImageJ软件分析[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

功能分析gydF4y2Ba毕赤酵母属gydF4y2Ba原生质球gydF4y2Ba

测试水的渗透性gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1α突变体,gydF4y2Bap . pastorisgydF4y2Bax 33球形体表达gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1;1α突变蛋白如前所述制备[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．简单地说,gydF4y2Ba注gydF4y2Ba转化后可诱导XIP1;1α蛋白的产生gydF4y2Bap . pastorisgydF4y2BaBMMY细胞开始有ODgydF4y2Ba_600gydF4y2Ba= 1，如前所述。诱导26 h后，收集细胞，重新悬浮，在TE-buffer (100 mM Tris-HCl, pH 8.0;1 mM EDTA)和0.5% β-巯基乙醇作用1.5 h使细胞壁不稳定。然后将细胞在20mm Tris-HCl ph8、1.2 M山梨醇中洗涤并平衡至最终外径gydF4y2Ba_600gydF4y2Ba的5。用高渗溶液(20 mM Tris-HCl pH 8, 1.8 M山梨醇)对平衡球体进行挑战，在500 nm处通过在止流装置(SF-61 DX2双混合止流系统，高科技科学公司)中增加的光散射观察混合物的收缩。动能工作室2.28版本(TgK Scientific Limited)用于在将至少15个迹的平均值拟合到一个指数方程后计算速率常数。该功能试验重复三次，计算水渗透率常数的标准偏差。能够比较水的渗透性之间gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1;1α突变体，速率常数除以western blot测定的单个蛋白量。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

未配对gydF4y2BatgydF4y2Ba-test假设高斯分布与Welch校正，用于GraphPad Prism中的数据分析[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

同源性建模gydF4y2Ba

的同调建模gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1;1α采用I-TASSER 4.4版本进行[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba)使用gydF4y2Ba在gydF4y2Ba1结构(PDB ID 5I32) [gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]作为模板。建模中使用的相关AQPs的多序列比对是手动执行的。螺旋的两种不同排列方式gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1;1α提交给I-TASSER服务器，包括对IC的约束gydF4y2BaVgydF4y2BaAR /R选择性滤波器的AR变体(H2中的残基的一个字母代码gydF4y2Ba^PgydF4y2Ba,信用证gydF4y2Ba^PgydF4y2Ba，gydF4y2BaH5gydF4y2Ba^PgydF4y2Ba,勒gydF4y2Ba^PgydF4y2Ba,他gydF4y2Ba^PgydF4y2Ba)．在野生型中引入点突变gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1α(gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1;1αwt)模型使用Coot [gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]，然后使用NAMD将突变残留物和直接环境的能量最小化[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba］．引入的H102在Nδ处单质子化。没有尝试建模截断的循环或进一步优化模型中的循环。所有模型都添加了孔隙中的水，并使用FG-MD进行几何优化[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba］．模型几何验证使用molintegrity [gydF4y2Ba37gydF4y2Ba］．模型中孔隙半径由程序HOLE [gydF4y2Ba38gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

的设计gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1α突变体gydF4y2Ba

结构导向的多序列对准gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1:1α与蛋白数据库(PDB)中沉积的结构的AQPs，导致在ar/R选择性过滤器的残基的两种备选对齐gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1α(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，显示过滤器中五个残基中的最后三个)。因此，它可能由异亮氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、丙氨酸和精氨酸(ICgydF4y2BaVgydF4y2BaAR)或异亮氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、丙氨酸和精氨酸(ICgydF4y2BaTgydF4y2Ba基于“增大化现实”技术;推定残留在H5gydF4y2Ba^PgydF4y2Ba粗体字)取决于螺旋5是如何对齐的。引入水的渗透性gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1;1α，两个假定的选择性滤波器gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1α(I102 C175,gydF4y2BaV242 / T246gydF4y2Ba， A257, R263)gydF4y2Ba在gydF4y2Ba1个过滤器(H63, H131, I185, G194, R200;表格gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

由于C回路对齐的不确定性和LE处残差的守恒gydF4y2Ba^PgydF4y2Ba和他gydF4y2Ba^PgydF4y2Ba只有两个位置的过滤器对应的H2gydF4y2Ba^PgydF4y2Ba和H5gydF4y2Ba^PgydF4y2Ba被认为是。然而，螺旋1上的L79G取代不是选择性过滤器的一部分，因为在AQPs的这个位置上有一个小的氨基酸残基，H2中有一个芳香氨基酸残基gydF4y2Ba^PgydF4y2Ba这似乎是在H2处容纳引入的组氨酸的先决条件gydF4y2Ba^PgydF4y2Ba像TIP2;1的方向。因此,两个主要gydF4y2Ba注gydF4y2Ba构建XIP1;1α突变体;gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αL79G / I102H /gydF4y2BaV242IgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αL79G / I102H /gydF4y2BaT246IgydF4y2Ba(表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba；推测H5中的不同突变gydF4y2Ba^PgydF4y2Ba以粗体显示)。为排除长环C和环D堵塞孔隙导致透水性差的可能性，相应的gydF4y2Ba注gydF4y2Ba在C环和/或D环缺失的XIP1;1α突变体也产生。截断是由两个可选的对齐来实现相同长度的这些循环发现gydF4y2Ba在gydF4y2BaTIP2; 1。为了进一步研究个体替换的贡献，6个额外的突变体(表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，然后根据下面的功能结果构建。gydF4y2Ba

不同的表达gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1α突变体gydF4y2Ba毕赤酵母属pastorisgydF4y2Ba

的突变蛋白gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1;1α剪接变体成功表达于gydF4y2Bap . pastorisgydF4y2Ba，虽然层次不同。因此，为了获得足够的蛋白质含量，蛋白印迹检测，蛋白质诱导gydF4y2Bap . pastorisgydF4y2Ba扩展，与标准协议相比使用了更多的细胞[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．经此改性后，制备的粗细胞提取物gydF4y2Bap . pastorisgydF4y2Ba表达突变蛋白的细胞有相当数量的his标记gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1;1α突变蛋白如图所示。gydF4y2Ba3 a和bgydF4y2Ba．总的来说，含有缺失的结构蛋白表达较低，而细胞表达较高gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αL79G / I102H或gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αI102H /gydF4y2BaV242IgydF4y2Ba(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S1，附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba:表S2，附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba:表S3)。gydF4y2Ba

三突变体gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1;1αL79G/I102H/V242I对水具有渗透性gydF4y2Ba

为了比较表达不同结构的诱导细胞制备的酵母球质体的水渗透性，采用了一种停止流动光谱测定法。如图所示。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba相比之下，对照组之间的收缩率几乎没有差异gydF4y2Bap . pastorisgydF4y2Ba空载体pPICZB的球质体和过表达球质体gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1;1αwt，提示蛋白透水性差或无透水性。表达突变体的球质体的收缩率gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αL79G / I102H /gydF4y2BaT246IgydF4y2Ba的表达略有增加，而gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αL79G / I102H /gydF4y2BaV242IgydF4y2Ba导致了两倍多的高发率。拟合曲线的平均速率常数和标准差为:2.19±0.25 sgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}(空pPICZB质粒)，2.20±0.42 sgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}（gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1;1αwt)， 2.84±0.48 sgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}（gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αL79G / I102H /gydF4y2BaT246IgydF4y2Ba)和5.52±1.21 sgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}（gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αL79G / I102H /gydF4y2BaV242IgydF4y2Ba)．为了补偿表达的差异，背景校正率与蛋白质水平相关，以获得任意单位的特定活性。估计的蛋白质量，速率常数和比活性的第一组gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1;1α突变体见附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2BaS2:表。gydF4y2Ba

考虑到平均的特定活动，gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αL79G / I102H /gydF4y2BaV242IgydF4y2Ba三突变体的透水性几乎是gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αwt。尽管重复之间有相当大的差异，对应的相对比率，设置的比率gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αL79G / I102H /gydF4y2BaV242IgydF4y2Ba为统一，差异显著，如图所示。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba和额外的文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba:表S4 (gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)。相比之下，相对比率gydF4y2Bap . pastorisgydF4y2Ba球形体表达gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αL79G / I102H /gydF4y2BaT246IgydF4y2Ba与gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αwt球形体。然而，相对比率gydF4y2Bap . pastorisgydF4y2Ba球形体表达gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αL79G / I102H /gydF4y2BaT246IgydF4y2Ba明显低于与gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αL79G / I102H /gydF4y2BaV242IgydF4y2Ba．gydF4y2Ba

为了消除C和D环堵塞孔隙的可能性，gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αL79G / I102H /gydF4y2BaV242IgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αL79G / I102H /gydF4y2BaT246IgydF4y2Ba对环C和/或环D截断的突变体进行了工程设计。然而，如图所示。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，截断循环并没有显著提高相对比率，如gydF4y2Bap . pastorisgydF4y2Ba球形体overexpressinggydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αL79G / I102H /gydF4y2BaV242IgydF4y2Ba/ΔC,gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αL79G / I102H /gydF4y2BaV242IgydF4y2Ba/ΔD,gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αL79G / I102H /gydF4y2BaV242IgydF4y2Ba/ΔC /ΔD,gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αL79G / I102H /gydF4y2BaT246IgydF4y2Ba/ΔC或gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αL79G / I102H /gydF4y2BaT246IgydF4y2Ba/ΔD显示出较大的实验变异，其平均值与野生型或gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αL79G / I102H /gydF4y2BaT246IgydF4y2Ba没有循环删除的突变体。gydF4y2Ba

单个替换L79G和I102H足以渲染gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1α水渗透gydF4y2Ba

以确定是否所有三个氨基酸的取代gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αL79G / I102H /gydF4y2BaV242IgydF4y2Ba突变体需要诱导水渗透gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1α,六个额外的gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1;1α突变体构建如表所示gydF4y2Ba2gydF4y2Ba．估计的蛋白质含量，速率常数和比活性gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αwt,gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αL79G / I102H /gydF4y2BaV242IgydF4y2Ba第二组gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1;1α突变体的测定方法与第一组相同，并在附加文件中报道gydF4y2Ba4gydF4y2Ba:表S3。如图所示。gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba，当将比率与三突变体相关联时，所有其他突变体的比率都较低，与三突变体显著不同，除了gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αL79G /gydF4y2BaV242IgydF4y2Ba(附加文件gydF4y2Ba6gydF4y2Ba:表S5)。然而，除了球质体外，所有的都过度表达gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αgydF4y2BaV242IgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1;1αL79G/I102H的相对比率明显高于gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αwt球形体。因此，即使L79G和I102H单独替换也足以增加水的渗透性gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1α。gydF4y2Ba

同质建模与孔隙直径gydF4y2Ba

野生型的gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1α(gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1;1αwt)采用gydF4y2Ba在gydF4y2BaTIP2;1结构作为模板。即使有两种不同的对齐方式(表示为ICgydF4y2BaVgydF4y2Ba基于“增大化现实”技术和集成电路gydF4y2BaTgydF4y2Ba基于“增大化现实”技术;无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)被提交给了I-TASSER，只有ICgydF4y2BaTgydF4y2BaAR变体可以用这种方法建模。无论使用哪一种初始对齐方式，都是类似的gydF4y2Ba注gydF4y2BaThr 246位于H5，得到XIP1;1α模型gydF4y2Ba^PgydF4y2Baar/R滤波器的位置。所有迫使I-TASSER建模器具有不同约束的尝试都将Val 242放在H5上gydF4y2Ba^PgydF4y2Ba这个位置被证明是徒劳的，因为它在能量上更有利的位置苏246在H5gydF4y2Ba^PgydF4y2Ba位置相反。gydF4y2Ba

总的来说，模型与一般的AQP结构是一致的，没有环路出现堵塞孔隙的情况(图1)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．与我们的预期相反，没有一个模型将高度保守的Cys 175放在LC中gydF4y2Ba^PgydF4y2Ba相反，在所有模型中都发现保守度较低的Gly 186在此位置。然而，应该注意的是，长C和D环的折叠和位置是不可靠的，因为没有额外的努力来优化这些区域，无论是在单体模型中还是在四聚体模型中。gydF4y2Ba

该模型的一个意想不到的结果是ar/R选择性滤波器的精氨酸(Arg 263)的新取向。在所有的模型中gydF4y2Ba注gydF4y2Ba1αwt和突变体Arg 263在螺旋1中与Asp 80形成盐桥(图1)。gydF4y2Ba6 bgydF4y2Ba)．此外，在所有模型中，精氨酸与E环主链的羰基形成氢键gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αL79G /gydF4y2BaV242IgydF4y2Ba在这个过程中，它会与环C主链的一个羰基相互作用。由于到Asp 80的盐桥作用，精氨酸和引入的组氨酸在H2处没有形成氢键gydF4y2Ba^PgydF4y2Ba．在模型中gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αL79G / I102H /gydF4y2BaT246IgydF4y2Ba组氨酸采用了类似tip2的取向，但这不足以使精氨酸重新定向到与在结构中发现的类似的位置gydF4y2Ba在gydF4y2BaTIP2; 1。gydF4y2Ba

程序HOLE [gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]用于估算模型中孔隙的半径gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1;1αwt与突变体(图;gydF4y2Ba7gydF4y2Ba额外的文件gydF4y2Ba7gydF4y2Ba:图S2)。结果表明gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αL79G / I102H /gydF4y2BaT246IgydF4y2Bamost narrow后面是gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αI102H和gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αI102H /gydF4y2BaV242IgydF4y2Ba，而孔的gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αwtgydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αL79G /gydF4y2BaV242IgydF4y2Ba似乎更少的限制。的收缩gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αL79G / I102H /gydF4y2BaT246IgydF4y2Ba是由T246I间接形成的，因为异亮氨酸由于空间位阻，它的疏水性引导His 102向tip2 -类取向，同时它通过与Ala 257相互作用改变E环的位置。在这两个gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αI102H和gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αI102H /gydF4y2BaV242IgydF4y2Ba孔隙半径受组氨酸和Leu 79的限制。gydF4y2Ba

的使用gydF4y2Ba毕赤酵母属pastorisgydF4y2Ba在过去的二十年里，膜蛋白，尤其是AQPs的表达系统的研究引起了广泛的兴趣。这是因为，作为一个真核生物，gydF4y2Ba毕赤酵母属gydF4y2Ba具有正确表达和折叠真核蛋白的机制[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba41gydF4y2Ba］．所有13个人类的AQPs和一些植物的AQPs已经被研究gydF4y2Bap . pastorisgydF4y2Ba［gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba］．正如之前的研究所预期的那样gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αwt蛋白(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]，表达所有的gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1;1α突变蛋白gydF4y2Bap . pastorisgydF4y2Ba是成功的。然而，观察到的突变体表达水平的差异可能是由于编码突变蛋白的结构在不同的基因剂量的差异gydF4y2Ba毕赤酵母属gydF4y2BaNordén等人先前展示的克隆。[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

除了环的截断可能会潜在地改变蛋白质的整体折叠和稳定性，突变预计不会对蛋白质的整体结构带来任何不利影响，因为取代构成了孔的微妙变化gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1α。自gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1;1αwt存在于gydF4y2Bap . pastorisgydF4y2Ba先前研究中的质膜[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，很可能是gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1:1α突变体也定位于的质膜gydF4y2Bap . pastorisgydF4y2Ba因此可用于球质体的功能研究。gydF4y2Ba

在本研究中，我们尝试引入水的渗透性gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1:1α，以促进功能研究和探索我们对功能决定因素的理解gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1:1α，这确实完成了。这样的透水突变体支持这样一种观点，即AQP的整体折叠和向质膜的运输在突变体中保留了微妙的变化，并允许不同的性质gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1:1α，就像假定的门一样，需要以建设性的方式进行探索。以同样的方式，可以通过突变来研究ar/R过滤器区域的预测相互作用，从而更深入地了解选择性是如何调节的，这可能也适用于其他异构体。gydF4y2Ba

植物水通道中涉及D环的通道门控已被报道gydF4y2Ba所以gydF4y2BaPIP2; 1 (gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．从球质体试验中截断的突变体可以看出，我们没有发现支持我们担心的长环C和/或环D可能堵塞孔隙的证据。相反，无能为力gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αL79G / I102H /gydF4y2BaV242IgydF4y2Ba具有缩短环C和/或D以促进水运输的突变体表明突变体采用了非功能性构象，可能被截断环所阻断。D环似乎对突变相当敏感，因为这个特殊结构的缺失只有两个氨基酸残基长。然而，由于缺失从蛋白质的胞质侧去除了带正电荷的残基，膜中的折叠也有可能受到损害[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba］gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

止流光谱法分析了水渗透性gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1α突变体gydF4y2Ba毕赤酵母属gydF4y2Ba球质体及其同源建模gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1α突变体gydF4y2Ba在gydF4y2BaTIP2;1为模板，同时进行。虽然从最初的突变研究来看，我们已经成功地通过ar/R选择性过滤器中的三个tip2类取代引入了水的渗透性，但对我们的结果更合理的解释是，V242I是位于过滤器外的中性突变，而T246I位于H5gydF4y2Ba^PgydF4y2Ba与L79G/I102H和透水性不兼容，有利于第二种替代排列(图2)。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)．因此，从实验数据和从gydF4y2Bain-silicogydF4y2Ba模型支持Thr 246而不是Val 242是驻留在H5的氨基酸残基的想法gydF4y2Ba^PgydF4y2Ba位置gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αar / R滤波器。然而，进一步的研究包括x射线晶体结构的测定gydF4y2Ba注gydF4y2Ba需要XIP1;1来明确确认这一点。gydF4y2Ba

的gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1;1αwt在本研究中是不透水的gydF4y2BaPtgydF4y2BaXIP1; 1和gydF4y2BaNtgydF4y2Baxi1;1不能方便水的运输gydF4y2Ba非洲爪蟾蜍光滑的gydF4y2Ba卵母细胞(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．xi1;1s不能促进水的运输主要是由于其选择性过滤器的疏水特性[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．这一发现进一步支持了这一观点gydF4y2BaNtgydF4y2BaXIP1;1s不仅能渗透甘油，还能渗透尿素和硼酸[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．从我们的模型中还不能立即看出原因gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1;1αwt不透水。由于孔隙看起来足够宽，水可以通过，我们假设疏水残基(Ile 102和Ala 257在H2处)的存在gydF4y2Ba^PgydF4y2Ba和勒gydF4y2Ba^PgydF4y2Ba，分别)在ar/R过滤器中防止水渗透所需的氢键网络gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αwt。gydF4y2Ba

的模型gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αL79G / I102H /gydF4y2BaV242IgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αL79G / I102H /gydF4y2BaT246IgydF4y2Ba突变体揭示了在gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1;1α ar/R滤波器，模拟gydF4y2Ba在gydF4y2BaTIP2;1 ar/R过滤器，以促进水的渗透gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1;1α的研究过于简单。为了达到这个目标，似乎需要更多的替换，尤其是LC上的残基gydF4y2Ba^PgydF4y2Ba和H5gydF4y2Ba^PgydF4y2Ba由于可选对齐的可能性，位置不能精确地知道。特别是ar/R过滤器中精氨酸和Asp 80之间的盐桥是有趣的，与其他异构体也相关。有趣的是，在结构中发现了与Asp 80对应位置的酸性残基之间的类似相互作用gydF4y2BaPfgydF4y2BaAQP，甘油促进剂gydF4y2Ba恶性疟原虫gydF4y2Ba［gydF4y2Ba45gydF4y2Ba(图。gydF4y2Ba6摄氏度gydF4y2Ba)．我们注意到，这一位置的酸性残留在所有XIPs组中并不保守，例如在苔藓和穗藓的XIPs中(XIP I;表格gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)， H2中含有组氨酸或谷氨酰胺gydF4y2Ba^PgydF4y2Ba，两者都可能与选择性过滤器的精氨酸形成TIP2-like相互作用。其他XIPs既缺乏盐桥，也缺乏H2残基之间假定的tip2样相互作用gydF4y2Ba^PgydF4y2Ba和他gydF4y2Ba^PgydF4y2Ba这表明在HE中精氨酸至少有三种不同的取向gydF4y2Ba^PgydF4y2Ba这可能会改变xip分化的系统发育群的选择性。还支持对TIP子组中的选择性进行类似的修改gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．被子植物的tip3和裸子植物的tip1都有一个与Asp - 80 in位置一致的谷氨酸gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1α。有趣的是，在tip3的姐妹分支TIP1中，缺少精氨酸的单子叶/双子叶TIP1也缺少Asp 80对应的酸性残基。gydF4y2Ba

与我们naïve的预期相反，只有ar/R过滤器在gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αL79G / I102H /gydF4y2BaT246IgydF4y2Ba突变体模型与gydF4y2Ba在gydF4y2BaTIP2, 1 ar/R滤波器，尽管它是gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αL79G / I102H /gydF4y2BaV242IgydF4y2Ba可渗透水的突变体。后者不能仅仅归因于他102在H2的引入gydF4y2Ba^PgydF4y2Ba位置增加氢键的可能性，但也要引入Gly 79，这使水的渗透空间gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αL79G / I102H /gydF4y2BaV242IgydF4y2Ba．假定V242I代入gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αL79G / I102H /gydF4y2BaV242IgydF4y2Ba不影响水的渗透性，因为根据模型，它位于孔隙深处，不构成ar/R过滤器的一部分。值得注意的是苏246在gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αL79G / I102H /gydF4y2BaV242IgydF4y2Ba突变，因此可以为渗透通道的孔隙水提供氢键的可能性。的无能gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αL79G / I102H /gydF4y2BaT246IgydF4y2Ba因此，这可能是由于Thr 246的缺乏，以及异亮氨酸通过His 102和Ala 257间接造成的小孔，如结果部分所述。gydF4y2Ba

除了gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αgydF4y2BaV242IgydF4y2Ba突变体，所有的单一突变体工程研究的个人贡献的取代gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αL79G / I102H /gydF4y2BaV242IgydF4y2Ba三突变体对水的渗透性比gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αwt。如前所述，这并不奇怪gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αgydF4y2BaV242IgydF4y2Ba突变体的透水性较差或无透水性gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αgydF4y2BaV242IgydF4y2Baar/R滤波器与gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αwt。一致地，V242I在分别与突变L79G或I102H结合时也表现为中性。然而，有趣的是，V242I取代似乎仍然是关键的水渗透性在三重突变体gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αL79G / I102H /gydF4y2BaV242IgydF4y2Ba，自从双突变体gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1;1αL79G/I102H相对比率较低，与的差异不显著gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αwt。我们无法根据模型解释这一结果，也有可能是其他因素，如蛋白质的适当折叠和插入质膜在这里起了作用，但从记录的蛋白质水平来看，没有明确的模式表明稳定性问题。gydF4y2Ba

根据最近对XIPs ar/R过滤残基的研究，残基在H2gydF4y2Ba^PgydF4y2BaXIP异构体之间的位置差异显著[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba因此，该位置的残基可能影响XIPs中的底物特异性。我们的结果证实了Ile 102在H2中的命题gydF4y2Ba^PgydF4y2Ba位置作为I102H替换渲染gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1α水渗透。的模型gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1;1αI102H突变体表明His 102在H2gydF4y2Ba^PgydF4y2Ba在ar/R过滤器中的位置有助于孔隙中的氢键网络。然而，扩展的氢键网络可能会稳定水分子，使它们不太可能在孔隙中移动位置。这可能是水渗透的原因gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1;1αI102H突变体的表达水平不如gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1αL79G / I102H /gydF4y2BaV242IgydF4y2Ba突变体，其中额外的取代增加了孔的半径。gydF4y2Ba

我们的研究结果表明，除了ar/R过滤器的五种氨基酸残基，其他残基，特别是那些排列在孔内的残基，影响底物特异性gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1α。尽管如此，螺旋1中的单氨基酸取代L79G使得gydF4y2Ba注gydF4y2Ba1αL79G突变体透水。叠加的gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1;1αL79G模型上gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1;1αwt模型显示Arg 263在gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1;1αL79G突变，由于L79G取代导致空间位阻缺失。因此，似乎是263采用的新位置和Gly 79提供的额外空间gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1、1αL79G突变体对透水性有利。gydF4y2Ba

细微的变化，如L79G或I102H的单点突变，足以允许水渗透进来gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1α。我们得出这样的结论:gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1;1α在球质体中异源表达时不太可能被阻塞，Thr 246最有可能存在于H5gydF4y2Ba^PgydF4y2Ba的位置。此外，大多数功能结果可以从基于ar/R过滤器直径和疏水性的组合模型解释。我们的模型表明盐桥之间的酸性残留物的位置对应Asp的80gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1;1α调控精氨酸在ar/R过滤器中的取向，为优化AQPs选择性提供了一种新的途径。已发表的结构和模型，加上序列分析，预测精氨酸在不同的XIPs中定位在三个不同的方向。工程透水型将有助于进一步研究的结构和功能性质gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1;1α，如盐桥，预测LC中的残留gydF4y2Ba^PgydF4y2Ba位置，氧化状态，磷酸化和假定的门控可以研究。gydF4y2Ba

6 xhis:gydF4y2Ba

Hexa-histidinegydF4y2Ba

AQP1:gydF4y2Ba

水通道蛋白1gydF4y2Ba

AQP8s:gydF4y2Ba

水通道蛋白8秒gydF4y2Ba

aqp:gydF4y2Ba

水通道蛋白gydF4y2Ba

基于“增大化现实”技术/ R:gydF4y2Ba

芳香族/精氨酸gydF4y2Ba

在gydF4y2BaTIP2; 1:gydF4y2Ba

拟南芥gydF4y2BaTIP2; 1gydF4y2Ba

BMGY:gydF4y2Ba

缓冲glycerol-complex介质gydF4y2Ba

BMMY:gydF4y2Ba

缓冲methanol-complex介质gydF4y2Ba

发射极耦合逻辑:gydF4y2Ba

增强chemiluminiscencegydF4y2Ba

EDTA:gydF4y2Ba

乙二胺四乙酸gydF4y2Ba

FG-MD:gydF4y2Ba

片段导向分子动力学模拟gydF4y2Ba

GIPs:gydF4y2Ba

甘油促进剂样固有蛋白gydF4y2Ba

H2gydF4y2Ba^PgydF4y2Ba：gydF4y2Ba

螺旋2位置gydF4y2Ba

H5gydF4y2Ba^PgydF4y2Ba：gydF4y2Ba

螺旋5的位置gydF4y2Ba

他gydF4y2Ba^PgydF4y2Ba：gydF4y2Ba

螺旋E位置gydF4y2Ba

臀部:gydF4y2Ba

混合内在蛋白质gydF4y2Ba

他的gydF4y2Ba_10gydF4y2Ba标签:gydF4y2Ba

Deca-histidine标签gydF4y2Ba

I102H:gydF4y2Ba

异亮氨酸102取代组氨酸gydF4y2Ba

ICTAR:gydF4y2Ba

Isoleucine-cysteine-threonine-alanine-argininegydF4y2Ba

ICVAR:gydF4y2Ba

Isoleucine-cysteine-valine-alanine-argininegydF4y2Ba

免疫球蛋白:gydF4y2Ba

免疫球蛋白GgydF4y2Ba

I-TASSER:gydF4y2Ba

迭代线程装配改进gydF4y2Ba

L79G:gydF4y2Ba

亮氨酸79取代甘氨酸gydF4y2Ba

信用证gydF4y2Ba^PgydF4y2Ba：gydF4y2Ba

循环C位置gydF4y2Ba

勒gydF4y2Ba^PgydF4y2Ba：gydF4y2Ba

E环位置gydF4y2Ba

LGGC:gydF4y2Ba

Leucine-glycine-glycine-cysteinegydF4y2Ba

MIPs:gydF4y2Ba

主要内在蛋白质gydF4y2Ba

NAMD:gydF4y2Ba

纳米分子动力学gydF4y2Ba

注gydF4y2BaXIP1; 1α:gydF4y2Ba

烟草benthamianagydF4y2BaXIP1; 1αgydF4y2Ba

注gydF4y2BaXIP1; 1β:gydF4y2Ba

烟草benthamianagydF4y2BaXIP1; 1βgydF4y2Ba

注gydF4y2BaXIP1; 1:gydF4y2Ba

烟草benthamianagydF4y2BaXIP1; 1gydF4y2Ba

少量的酒:gydF4y2Ba

结节蛋白26样固有蛋白gydF4y2Ba

NPA:gydF4y2Ba

Asparagine-proline-alanine水通道蛋白的主题gydF4y2Ba

NPARC:gydF4y2Ba

Asparagine-proline-alanine-arginine-cysteinegydF4y2Ba

NtgydF4y2BaXIP1; 1:gydF4y2Ba

烟草gydF4y2BaXIP1; 1gydF4y2Ba

ODgydF4y2Ba_600gydF4y2Ba：gydF4y2Ba

光密度在600纳米处gydF4y2Ba

聚合酶链反应:gydF4y2Ba

聚合酶链反应gydF4y2Ba

PDB标识:gydF4y2Ba

蛋白质数据库标识符gydF4y2Ba

PDB:gydF4y2Ba

蛋白质数据银行gydF4y2Ba

PfgydF4y2BaAQP:gydF4y2Ba

恶性疟原虫gydF4y2Ba水通道蛋白gydF4y2Ba

pip值:gydF4y2Ba

质膜内蛋白gydF4y2Ba

PMSF:gydF4y2Ba

Phenylmethylsulfonyl氟化gydF4y2Ba

pPICZB:gydF4y2Ba

毕赤酵母属pastorisgydF4y2Ba表达蛋白质的载体gydF4y2Ba

PtgydF4y2BaXIP1; 1:gydF4y2Ba

杨树trichocarpagydF4y2BaXIP1; 1gydF4y2Ba

PVDF:gydF4y2Ba

聚乙二烯二氟化物gydF4y2Ba

SDS:gydF4y2Ba

钠十二烷基硫酸盐gydF4y2Ba

sds - page:gydF4y2Ba

十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳gydF4y2Ba

口:gydF4y2Ba

小的基本固有蛋白gydF4y2Ba

所以gydF4y2BaPIP2; 1:gydF4y2Ba

菠菜oleraceagydF4y2BaPIP2; 1gydF4y2Ba

T246I:gydF4y2Ba

苏氨酸246取代异亮氨酸gydF4y2Ba

TE-buffer:gydF4y2Ba

Tris-HCl EDTA缓冲gydF4y2Ba

TEV:gydF4y2Ba

烟草腐蚀病毒gydF4y2Ba

一定要:gydF4y2Ba

膜层固有蛋白1sgydF4y2Ba

TIP2-like:gydF4y2Ba

膜层内蛋白2-样gydF4y2Ba

一句话:gydF4y2Ba

膜层固有蛋白3sgydF4y2Ba

小贴士:gydF4y2Ba

液泡膜内在蛋白质gydF4y2Ba

V242I:gydF4y2Ba

缬氨酸242取代异亮氨酸gydF4y2Ba

XIP1:gydF4y2Ba

X固有蛋白1gydF4y2Ba

XIPs:gydF4y2Ba

X内在蛋白质gydF4y2Ba

YPD:gydF4y2Ba

酵母提取物蛋白胨葡萄糖培养基gydF4y2Ba

YPDS:gydF4y2Ba

酵母提取物蛋白胨葡萄糖与山梨醇培养基gydF4y2Ba

我们要感谢Adine Karlsson的所有帮助和支持。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

Carl Tryggers Stiftelse, Stiftelsen Olle Engkvist Byggmästare和瑞典研究委员会(VR)非常感谢他们的财政支持。gydF4y2Ba

数据和材料的可用性gydF4y2Ba

本文中生成的模型可以通过gydF4y2Bahttp://modelarchive.org/gydF4y2Ba，使用唯一的持久标识符。野生型:10.5452 / ma-afgaz;突变体1:10.5452 / ma-arjyb;突变体2:10.5452 / ma-adeyx;突变体3:10.5452 / ma-a4od5;突变体4:10.5452 / ma-aehn9;突变5:10.5452 / ma-acx2s;突变体6:10.5452 / ma-ajfz7;突变体7:10.5452 / ma-abd3g;突变体8:10.5452 / ma-a3cbx。 See Fig.7gydF4y2Ba变种人1-8的描述。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

UJ, PK, HA-K, YS, AE和AK参与研究设计，HA-K构建gydF4y2Ba注gydF4y2BaXIP1; 1突变体gydF4y2Bap . pastorisgydF4y2Ba克隆，表达结构，进行免疫印迹分析，制备球质体并进行功能研究。HA-K做了所有的统计分析。HA-K和YS设计同源建模研究，YS进行同源建模，UJ、YS和HA-K参与同源建模数据分析。HA-K起草了手稿，UJ、PK、HA-K、YS、AE和AK参与了手稿的修改。所有作者阅读并批准了最终稿件。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者声明他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

同意出版gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 隆德大学生物化学与结构生物学系分子蛋白质科学中心，瑞典隆德124号信箱SE-221 00gydF4y2Ba

   Henry Ampah-Korsah, Yonathan Sonntag, Angelica Engfors, Andreas Kirscht, Per Kjellbom和Urban JohansongydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba城市约翰逊gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文根据创作共用署名4.0国际许可协议发布(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba)，该协议允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是您适当地注明原作者和来源，提供创作共用许可的链接，并说明是否有更改。创作共用公共领域奉献放弃书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)除另有说明外，适用于本条提供的资料。gydF4y2Ba

再版和权限gydF4y2Ba