一个完整的rna -¹利用核磁共振代谢组学方法了解大豆对根核菌叶枯病的初级代谢调控

背景

辣椒AG1-IA是在世界范围内引起大豆叶枯病(RFB)的一种破坏性植物病原体，产量损失可达60%。植物防御机制复杂，需要从不同的代谢途径了解植物的防御调控和功能。结合不同“组学”水平的信息，如转录组学、代谢组学和蛋白质组学，需要深入了解植物代谢及其调控。因此，我们研究了大豆代谢波动的响应r .以上利用整合转录组学-代谢组学方法研究大豆早期和晚期感染，重点研究大豆初级代谢和氧化应激耐受性的调节。

结果

转录组学(RNAseq)和代谢组学(¹H NMR)数据被单独分析，并通过双向正交投影到潜在结构(O2PLS)的整合来揭示早期和晚期感染阶段代谢组和转录组之间可能的联系。O2PLS分析检测到516个显著转录本，是单变量分析报告的两倍，并且比偏最小二乘判别分析检测到更显著的代谢物。基于所分析大豆叶片的代谢组和转录组的整合，发现了处理的强分离，与在单个数据集上所做的分析中看到的趋势相似，验证了所应用的整合方法。大豆初级代谢的强烈波动发生在糖酵解、TCA循环、光合作用和光合产物的响应中r .以上感染。对一组特定标记以及随机选择的基因进行实时定量PCR验证数据。参与氧化还原反应和ROS信号传导的转录物和代谢物水平显著增加，如过氧化物酶、硫胺素、生育酚、脯氨酸、l -丙氨酸和GABA。感染24 h后，大豆叶片中乙醇含量升高，乙醇脱氢酶(抗利尿激素丧失功能的突变体拟南芥坏死程度高于野生型植物。

结论

作为一项概念验证，该研究为生物学相关性和候选基因和代谢物的鉴定提供了新的见解，这些基因和代谢物可用于大豆的抗性育种r .以上AG1-IA感染。此外，这些发现表明酒精及其相关基因产物抗利尿激素可能对植物抗性有重要作用r .以上引起叶片枯萎病的AG1-IA。

引起的叶枯病(RFB)辣椒IA是一种对大豆造成快速、严重破坏的严重病害。大豆莫尔)[1，2]。在巴西、美国南部各州和中国的大豆上爆发的AG1-IA已造成30-60%的产量损失[3.，4]。由于缺乏可用性，使用较不易感的品种是有限的，因此对RFB的保护是困难的[1]导致使用化学杀虫剂。由于RFB对农业的影响，确定调控植物抗性的因素非常重要;然而，目前还没有关于大豆分子反应的研究发表r .以上AG1-IA感染。理解r .以上AG1基因对大豆防御途径及其调控的影响，将极大地有助于利用生物标记辅助选择培育抗RFB的品种。

人们对将转录组学与代谢组学联系起来越来越感兴趣，这反过来又有助于全面的生物学理解，否则单独进行基因表达研究是无法实现的。大量文献通过微阵列和代谢组学实验的平行或比较分析，报道了由非生物或生物胁迫引起的植物代谢扰动[5，6，7，8]。鉴于最近工具和平台的进步，可以对基因表达和代谢物生物合成之间的联系进行更广泛的分析，以表征植物细胞的各种分子实体，从而深入了解基因表达变化与代谢物水平之间的联系[8，9，10，11，12]。

高通量多组学方法产生的庞大而复杂的数据集必须与感兴趣的生物系统相关，在这种情况下，大豆对RFB的反应。在这种背景下，有必要制定策略，允许相关的生物过程被描述和容易地解释，以便有效地从不同组学分析平台进行的分析中提取生物学重要信息。双向正交预测潜在结构(O2PLS)是一种新的多变量技术，它集成了来自不同数据集或“组学”水平(例如mRNA和代谢物)的数据，并支持多块双向关联[qh]13，14]。O2PLS是对潜在结构(OPLS)的正交投影的扩展，其中OPLS分析单个数据集，O2PLS评估多个数据集的系统趋势。这种可行的统计方法允许将数据与分配给每个数据集的相同权重进行集成，而不管每个数据集的数据点数量是否显着不同。通过观察联合系统变异，可以识别共享反应，并利用该模型预测数据集之间的生物反应[9，14]。不像两两相关分析，可能导致数百个显著的相关性[8，15]， O2PLS模型减少了那些对模型有最主要影响的相关性的数量[9]。此外，结果既可以基于预测(联合变化)来源，也可以基于来自每个数据集的独特的单个变量来解释[9]。迄今为止，使用O2PLS整合植物转录物和代谢物数据的例子相对较少[9，11，12到目前为止，还没有研究使用O2PLS来发现不同“组学”水平之间缺失的功能联系，以监测植物对疾病的多层次反应。

植物病原体感染导致次级代谢(即不直接参与维持生长、发育或繁殖的代谢)和初级代谢(即所有细胞维持正常功能所需的代谢及其产物)的变化，影响植物的生长和发育。虽然防御反应的调节已被深入研究[16，17]，对坏死性病原体感染的影响知之甚少，例如r .以上，在初级代谢。最近，我们已经证明了代谢组学在分析大豆下胚轴和马铃薯芽胞菌根腐病和茎溃疡病期间植物初级代谢的有效性[18，19]，结果表明寄主植物重组其初级代谢以建立防御机制，而病原体可能同时操纵植物代谢以促进感染以支持植物内的复制和传播[20.，21]。参与光合作用、碳水化合物和氨基酸代谢、糖酵解和TCA循环的初级代谢物重定向需求的增加表明，感染组织中发生了重要功能的重编程，这是必要的防御要求[22，23，24，25]。综上所述，研究了叶面病原菌侵染早期和晚期大豆初级代谢的变化r .以上AG1可以为如何培育更具叶枯病抗性的大豆品系提供见解。

在本研究中，我们旨在证明:1)通过整合多个组学水平，我们能够评估大豆初级代谢转录物和代谢物对叶面坏死性真菌病原体的系统和功能趋势;2)在已知代谢调控机制和通路水平调控的背景下，存在紧密协调;3)一种新的防御调节剂的效果可以用功能丧失突变体来检测。

植物代谢的复杂性需要采用多层次的方法和整合所获得的信息，以全面了解其对刺激的调节。最初，对数据集进行了单独分析，以确定大豆对大豆的反应有实质性改变的转录本和代谢物r .以上，随后应用O2PLS发现了两个数据集之间的联合变异，并重点研究了大豆初级代谢的调控(图2)。1)。

先前关于大豆对真菌病原体反应的研究主要集中在次级代谢组分的波动上，如苯丙素、类黄酮和异黄酮途径[17，18，26，27]。在大豆生长过程中观察到这些途径的波动r .以上本研究的相互作用(数据未显示);然而，很少有研究调查了植物初级代谢的波动，以响应r .以上［24]，我们在这项研究中主要关注初级代谢。此外，据我们所知，目前还没有使用集成组学方法研究大豆初级代谢调控对真菌攻击的响应。研究植物对真菌病原体的初级代谢反应表明，某些基因或代谢物的快速启动可能是植物抗性的关键组成部分[21，22，23]，强调初级代谢在植物防御反应中的作用。目前的研究首次检测了大豆对叶绿素的整体代谢反应r .以上导致RFB疾病的AG1-IA。

分析概述

主成分分析(PCA)最初是为了概述¹H NMR和RNAseq数据集，异常值和趋势的检测，以及实验方案的稳健性和可重复性的评估(图2)。2)。PCA未发现异常值(P< 0.05)，并且记录的模拟接种(对照)和根丝胞菌感染叶片的代谢物谱之间存在差异(图2)。2)。接种12小时后，观察到模拟接种(对照)和感染叶片的代谢谱之间存在中度差异(图2)。2)，并反映在对感染的早期反应、疾病迹象和叶片上几个感染垫的发展(图2)。二维然而，在12小时(24 hp .i)后观察到强烈的区别，表明大豆代谢普遍受到干扰（无花果。2 b)，并确定疾病具有全面症状(图2)。2 e)。基于这些发现，选择第二个时间点(24 h.p.i.)进行NMR和RNAseq数据集的整合。同样，对RNAseq数据集(24 h.p.i.)的PCA分析也没有发现异常值(P< 0.05)，并且模拟接种和感染叶片之间有很强的区别(图2)。2摄氏度)，得到疾病进展的支持(图2)。2 e)。

代谢物丰度随RFB变化

分析¹氢核磁共振谱r .以上与坏死病灶表面面积相似的菌丝显示，真菌代谢物对总记录的代谢谱的影响可以忽略不计(附加文件)1:图S1)。然而，为了准确性，从相应的感染叶片剖面记录箱中减去真菌剖面箱。与PCA相比，偏最小二乘判别分析(PLS-DA)具有更好的生物标志物发现能力。3.) [28]。因此，在这里，生物标志物的发现是基于PLS-DA (P< 0.05)来检测大豆在感染早期(12 hp .i)发生的代谢波动，在感染缓冲形成的阶段(图2)。2 f)，以及在感染后期(24 hp)出现坏死病变。两个处理在两个时间点的紧密聚类(图2)。3b)表明该方法的稳健性以及对照和感染叶片代谢组之间的实质性差异。总共126个箱子代表17种唯一鉴定的初级代谢代谢物(附加文件)2:表S1)被映射到代谢途径，以更动态的方式观察感染反应的时间波动(图1)。4)。大豆代谢物在糖酵解途径、TCA循环、淀粉和蔗糖代谢以及氨基酸生物合成方面的波动在感染早期(12 hp / pi)和后期(24 hp / pi)表现出相似的趋势(图2)。4;额外的文件2(表S1) GABA、l -天冬酰胺、l -谷氨酸和脯氨酸除外，与对照相比，它们分别在12和24 hp时先升高后降低。

RFB对大豆转录物丰度的影响

高通量测序允许对基因组或转录组进行深入分析，但是限制了在类似条件下(即在一条通道中)可以测序的生物复制的数量。样品的条形码允许多个重复的池允许使用浅端测序来研究生物系统。由于每个样本的读取数减少，浅端测序可以有效地用于确定差异表达(DE)转录本在更大范围的条件下发生的波动，而不是通常研究的[29，30.]。有研究表明，在拟南芥转录组项目中，分析前2500个转录本实际上可以覆盖80%以上的生物信息[30.]，而在人类研究中，准确预测mRNA波动只需要每个样本10万次读取[31表明浅端RNAseq可以提供大量信息。在这项研究中，浅端RNAseq被用来测定大豆对r .以上每次处理得到3m reads，共表达12926个基因(附加文件)3.表S2)，表达基因定义为每个样本至少有两个reads的转录物，并且在一次处理中6个生物重复中至少有4个被检测到[32，33]。读数与r .以上基因组只占总读取量的不到2%，因此没有进一步分析。低读取计数在双植物-病原体测序项目中很常见，因为通常病原体细胞的数量远低于植物的数量[32，34]。

基于传统的单变量统计分析，在侵染和模拟接种的叶片中共检测到258个DE基因4表S3)。这些结果与其他植物与病原体相互作用的RNAseq分析相似[32]。258个DE基因中，79%在感染反应中上调，其中16%只能在感染植物中检测到，可能是由于检测限制。基因本体(GO)术语的富集测试[j]35]，揭示了DE基因的功能差异r .以上AG1-IA感染:观察到大豆光合作用基因的转录减少，而参与次级代谢、氧化还原反应和碳水化合物代谢的基因则增加。5;额外的文件4表S3)。

定量实时pcr (qRT-PCR)验证了参与初级代谢的基因的RNAseq结果(表2)1)，并显示出与RNAseq相似的转录本表达模式。观察到转录本上调的总体趋势(图2)。4)意味着对其产品或下游产品的需求增加。一个例外是-葡萄糖苷酶，其丰度波动(表1)1;无花果。4)。随机选择转录本的验证也证实了RNAseq数据的结果(附加文件)5:表S4)。

代谢组学和转录组学的整合

为了发现参与大豆抗RFB的标志基因和代谢物，并突出它们之间的功能联系，利用两两相关和O2PLS进行了数据整合。两两相关分析显示有382项相关性非常强(r≥0.9或≤- 0.9)和另外2494个强相关性(r代谢物和转录物之间的差异≥0.8或≤−0.8)。6;额外的文件6表5)。如此大量的相关性导致对哪些是最具生物学意义的解释具有挑战性。因此，对两个数据集进行了O2PLS分析，以减少噪声和主导相关性的数量，从而实现更自信的生物学解释和预测。O2PLS在预测数据集中发现了2个潜在变量，其中转录预测结构占转录数据集中总变异的52.9%，代谢物预测结构占代谢物数据集中总变异的90.9%，累积预测能力(Q²_(和))为61.3%(图2)。7一个)。转录组学-代谢组学联合数据集的O2PLS评分图显示了两种处理的紧密聚类(图2)。7 b)，结果与单独分析数据集时观察到的结果相似。转录物和代谢物的显著性阈值分别设置为99%或90%的置信水平，转录组学数据集确定的负载系数阈值低于代谢组学数据集(附加文件)7表6)。基于负载系数，O2PLS分析在前两个潜在变量中共检测到516个显著转录本(附加文件)8:表S7)，是单变量分析中发现的转录本数量的两倍，同时总共观察到20个实质上改变的代谢物箱(附加文件)9表8)。

作为概念验证，为了更好地可视化代谢组和转录组之间的功能联系(即相关性)，我们创建了一个由参与大豆初级代谢的转录物和代谢物组成的简化数据集，类似于其他地方所做的方法[12]。转录本的选择是基于它们参与初级代谢，使用GO术语和O2PLS变量重要性(VIP)值大于2。共筛选出241个转录本(附加文件)10:表S9)，而¹采用氢核磁共振谱。然后对减少的子集进行O2PLS处理，以提高在使用可变负载的完全集成分析(即126个代谢物箱的12,926个转录本)中产生的相关性的可视化。7 c;额外的文件6表5)。葡萄糖和参与光合作用的转录本之间有很强的相关性(二磷酸核酮糖羧化酶,PSII)，而葡萄糖与硫胺素生物合成转录物呈负相关(这)(图。7 c)。特别令人感兴趣的是α -葡聚糖磷酸化酶(AGP)，与GABA，苯丙氨酸和酪氨酸一起参与淀粉形成的转录物，都以其在应激反应中的作用而闻名[16，18，21]。中等强相关性(r过氧化物酶(每,GLYMA16G27990)和-果呋喃苷酶(永远的好朋友,GLYMA05G04290)与乙醇(图。7 c;额外的文件6:表S5)。它们的重要性可能被忽略了，因为它们的成对相关值低于<0.9，不会被认为是显著的(图2)。7;额外的文件6表5)。这些相关性的确切生物学解释尚不清楚，这些代谢物/转录物是否实际上可以作为彼此的生物标志物，需要在各种生长和生物学条件下进一步验证。

单变量与多变量比较

在对数据集进行独立分析与对一些转录物或代谢物进行综合分析时，在一种分析方法或两种分析方法中都被认为是显著的(图2)。8)，结果与其他地方的报告相似[9]。这可以从图中观察到。4仅使用传统分析或使用O2PLS分析(用黄色星星表示)来协调调节RFB的一些差异表达转录物和代谢物。单变量分析和多变量分析之间的差异并不意外，因为分析计算数据内变化的方法:单变量分析将计算两种处理之间的变化，而O2PLS方法将计算两个数据集(X和Y，或者在本例中分别是转录物和代谢物)中具有最大变异性的方向[9]。尽管存在差异，但在两种方法之间观察到相似的趋势(数据未显示)。

生物学解释

代谢物的波动

在大多数紧密相关的代谢物和DE转录物中发生了不同的时间变化，这表明代谢物被利用的速度比它们合成的速度快，或者它们的生物合成途径正在转向其他产物(图2)。4)。甲酸盐和乙醇是例外，其相关转录本表达，但在反应中没有差异r .以上感染。甲酸盐是一种已知的真菌毒素[36在这两个时间点，其丰度呈上升趋势，可能表明在感染后期发挥了重要作用。乙醇水平，但不包括编码酒精脱氢酶(抗利尿激素)，在坏死灶出现前升高(12 hp . pi)，提示乙醇可能是一种可靠的疾病生物标志物。

为了估计转录物变化和疾病发生的程度，我们选择了ADH功能丧失的拟南芥植物。与对照相比，在突变体中观察到整体坏死的增加(图2)。9提示乙醇脱氢酶和乙醇可能在RFB耐药中起作用。与我们的研究结果一致，暴露于非生物胁迫下的木本和草本植物在有氧条件下积累了大量的乙醇[37]。另一方面，转录本编码大豆抗利尿激素存在于RNAseq数据中，但在r .以上AG1-IA感染(图2)4;额外的文件3.(表S2)，尽管在感染期间乙醇产量增加，这表明转录后修饰或翻译后修饰可能在大豆乙醇生产中发挥作用。

有人可能会说，受感染的大豆叶片中乙醇的存在是厌氧状态的信号，或者是真菌产生的。在我们的研究中，乙醇也存在于模拟接种的叶片样品(对照)中，其中叶片可获得充足的氧气。此外，病原体衍生代谢物的水平低于检测阈值，或在分析相似量的细菌时达到最低水平r .以上利用菌丝对侵染大豆叶片上存在的菌丝进行处理¹H NMR(附加文件1:图S1)。尽管乙醇和乙醇脱氢酶上调的确切起源和机制尚不完全清楚，但这项研究首次证明它们可能在植物防御坏死性病原体中发挥作用。而ADH活性已被报道调节几乎对生物营养性专性寄生虫的敏感性Blumeria茎并可能通过维持病原体胁迫下大麦的糖酵解代谢来支持生物营养[38]，这可能不是坏死性真菌病原体的情况，如r .以上．支持证据表明，植物对不同的坏死性和生物营养性病原体有不同的反应机制[39，40]。综上所述，我们的研究表明乙醇可能在植物对坏死性真菌病原体的抗性中起重要作用r .以上并且可能有助于调节植物对RFB的抗性。

成绩单的波动

尽管部分转录本可以直接与初级代谢途径中的代谢物相关联，但并非所有转录本都是如此。其中包括一些参与防御和应激反应的病原体反应基因4:表S3)，例如谷胱甘肽s -转移酶和谷胱甘肽过氧化物酶，这是两种具有抗氧化能力的基因[16]。有趣的是，没有观察到抗坏血酸相关基因的上调，这表明谷胱甘肽的作用独立于谷胱甘肽-抗坏血酸循环[41或抗坏血酸的增加可以在其转录物丰度没有增加的情况下发生[42，43]。几种大豆过氧化物酶响应RFB上调。这是意料之中的，因为暴露于胁迫下的植物上调了它们的总体过氧化物酶活性，导致植物防御要么被动地通过建立更强的细胞壁，要么主动地通过在氧化爆发期间产生ROS分子[16，21]。

许多化合物在植物中具有ROS猝灭能力，如硫胺素、生育酚和生育三烯醇。硫胺素与拟南芥抗菌核病sclerotiorum,可能是通过限制草酸对ROS信号的抑制作用[44]。硫胺素转录本在r .以上感染(附加文件)4(表S3)，以及这是否是r .以上草酸盐是否对氧化应激引起的坏死反应尚不清楚，值得进一步研究以确定其在大豆防御和对坏死性病原体的反应中的作用。导致生育酚和生育三烯醇(维生素E维生素)生物合成的转录物在感染反应中被上调(附加文件)4表S3)。长期以来，人们一直推测生育酚在保护光合生物免受光氧化应激方面具有重要作用[45]。参与生育酚和生育三烯醇生物合成的基因转录丰度增加r .以上感染可能反映了脂质过氧化，这是植物与病原体相互作用过程中常见的现象[46]。

光合作用、糖酵解和TCA循环对RFB的响应波动

病原菌侵染往往导致叶绿体和坏死区发育，降低光合转录物丰度和光合同化产物产量[47，48]。24 hp . pi时参与光合作用转录本的下调(附加文件)4(见表S3)，表明光合作用下降。与此相对应的是，参与淀粉和碳水化合物分解代谢的基因的转录丰度增加，以及蔗糖裂解产物(即葡萄糖和果糖)水平的降低，早在12 hp . pi时就出现了1;无花果。4)。这表明要么大豆的能量需求增加，这是一种典型的植物对疾病的应激反应，21]，或者病原体操纵植物糖来促进感染。

植物受细菌和真菌感染后，转化酶(如-果糖呋喃葡萄糖苷酶)水平迅速增加，这是一个共同的趋势1我们的研究;［49])。与其他坏死性病原体类似，r .以上以蔗糖或其他双糖作为碳水化合物来源比在它们的裂解产物上生长得更快[50]。因此，从植物的角度来看，调节糖的分配，限制蔗糖的可利用性，从而限制r .以上增长。此外，在感染过程中，转化酶活性引发植物防御反应，如诱导防御相关基因表达、胼胝质沉积和光合作用减少或细胞死亡[49，51]，而转化酶转录物丰度的增加通常与己糖作为防御基因激活的信号分子的作用有关[49]。β -葡萄糖苷酶将β -葡聚糖降解为葡萄糖，其转录物丰度在感染后期增加，可能在调节大豆葡萄糖浓度中起重要作用;然而，我们不能排除它也可能在退化中起作用的可能性r .以上菌丝，如β -葡聚糖是菌丝细胞壁的常见成分[52]。碳水化合物及其作为单糖或双糖的存在如何影响大豆对RFB和其他病原体的抗性，以及它们如何影响微生物生长，需要进一步研究。

在病原体入侵的胁迫反应中，植物防御机制表现出参与糖酵解和TCA循环的基因和代谢物的协调波动，试图适应胁迫[j]。24，25，53]。尽管储存碳水化合物分解代谢基因增加，但参与糖酵解和TCA循环的大多数基因在响应RFB时没有差异表达(图2)。4)。有几个因素可能有助于解释这一点:1)采样时间(24 hp / pi)不是检测转录变化的最佳时间点;2)其他生物学因素，如转录后或翻译后修饰的发生[42，43];3)此时有足够的能量汇来对抗感染;或者4)基因需要更多的时间来检测差异表达。代谢途径的内稳态，特别是初级代谢途径，对生存至关重要，诱导或抑制这些途径的时机很可能对生存至关重要[21]。

氨基酸生物合成的波动对RFB的响应

为了应对感染，获取碳的强烈需求可能会将氨基酸运送到能量产生途径，如TCA循环[21]。有人提出，植物可能会调动一些氮源远离感染部位，以剥夺病原体的营养。这种转移导致源-汇关系的剧烈变化[54]。氨基酸浓度的变化，在植物响应的早期和后期，一些被上调，另一些被下调r .以上感染与其他病理系统的感染相似[55，56]。在本研究中，氨基酸波动(图2)。4)可分为:1)两个时间点谷氨酰胺、丙氨酸、苏氨酸和丝氨酸均上调的;2)苯丙氨酸和酪氨酸在24 hp / pi时下调;3) l -天冬酰胺、谷氨酸、脯氨酸和GABA在12 h.p.i.时表达上调，在24 h.p.i.时表达降低。真菌通过再循环或蛋白质水解从植物中获取氨基酸[57]，本研究中观察到的氨基酸的不同时间波动可能表明不同的氨基酸需求r .以上由于无法合成某些氨基酸，在不同的感染阶段(发病与坏死)对氨基酸的需求不同，或在防御反应期间植物对氨基酸的需求不同。

在许多高等植物中，富氮氨基酸天冬酰胺和谷氨酰胺是氮的中心中间体，因为它们有助于氮的运输，它们的编码基因在生物胁迫下被上调。22，23]。天冬酰胺、脯氨酸、GABA及其前体谷氨酸，以及非极性氨基酸苯丙氨酸和酪氨酸，在真菌感染开始时表现出轻微的增加，在感染后期下降，尽管与它们的生产相关的转录物水平(GABA和酪氨酸除外)在感染后期大量增加(表1)1,无花果。4)。这可能表明，在早期，感染部位代表了强大的局部代谢汇，从未感染的健康区域排出营养物质，随着感染的建立，不同的情况更有利:它们被下游利用，生物合成速率比消耗速率慢[21)，它们被r .以上或r .以上能够操纵宿主的代谢以达到特定的氨基酸稳态[57，58]。

脯氨酸和GABA已被证明是植物胁迫过程中重要的氨基酸信号分子[21，59]。已知GABA在高能量需求时通过GABA分流通路帮助支持能量需求[60]和高氧化应激[61，62]。在感染后期GABA及其前体谷氨酸的减少，加上前面讨论的抗氧化产生基因(仅RNAseq)的增加，表明可以通过GABA分流途径转移这些资源来克服高氧化应激状态。

类似地，脯氨酸是一种与压力相关的代谢物，已被证明在真菌感染期间稳定和保护蛋白质和膜免受细胞ROS的影响[63]。脯氨酸的氧化为线粒体呼吸提供电子，从而增加TCA循环的能量供应[63]。在感染的坏死阶段观察到脯氨酸的减少可能表明在这一阶段能量需求的增加，导致脯氨酸被转移到TCA循环，或者对ROS信号的需求增加，这是植物与病原体相互作用期间的一种常见反应[16，21]。谷氨酰胺和丙氨酸浓度升高r .以上AG1-IA感染。在水稻中也报告了类似的结果，这些水稻感染了亲和型而非不亲和型Magnoportha盘菌压力(23]。丙氨酸还与康科德葡萄的程序性细胞死亡的诱导有关。葡萄属出发)细胞培养[64]。有可能病原体的成功穿透触发丙氨酸水平的增加，从而促进受感染组织的细胞死亡r .以上然后利用它来促进入侵。

除了调节大豆对RFB的防御反应和可能改变氧化应激反应外，主要代谢途径的调节对大豆维持重要功能至关重要。使用O2PLS对转录物和代谢物图谱进行综合分析，为更好地理解基因-代谢物网络提供了一个强大的工具r .以上通过鉴定大豆感染:1)传统分析方法认为不重要的重要转录物和代谢物;2)通过识别共同的系统变异(例如乙醇与β -果糖呋喃苷酶和过氧化物酶转录物)共享调节机制;3)将显著相关的数量减少到对感兴趣的生物系统(如大豆)影响最显著的那些r .以上)。通过验证实验，我们证明了在疾病形成过程中选择的主要生化途径的变化，从而确定了遗传改良和育种辅助计划的相关生物标志物。我们坚信，获得植物与微生物相互作用知识的一个重要方法是结合不同类型分析的结果，就像这里所做的那样。

总之，对大型多组学数据集的分析是理解生物系统分子调控的主要挑战之一[9，12，65]。由于整合组学研究有望扩大我们对生物系统分子调控的理解，包括因果关系和相关生物标志物的鉴定[66]，使用多种分析方法比较不同的数据集是很重要的，这样可以避免忽略潜在的重要信息。

大豆叶片的生物材料与接种

为了研究大豆对RFB病的反应，使用了全测序模型和参考品种Williams 82 (USDA-ARS, Washington, DC, USA)。种子在30%过氧化氢中表面消毒7分钟，然后在无菌水中冲洗三次。发芽的种子种植在5厘米的花盆中，其中含有AgroMix®G10 (Fafard Ltd.)和沙子(1:1，v/v)，每盆一粒种子，置于生长箱中，白昼/黑夜12/12小时，昼夜温度25/23°C, 210光子μm⁻²年代⁻¹，湿度全天保持在65%。完全展开的单叶叶片(种植后约10天)被分离，放在潮湿的无菌滤纸上，放在先前高压灭菌的Pyrex®盘子(25 × 15厘米)中。

探讨乙醇在野生型RFB抗性中的作用拟南芥(生态型Bensheim,是0， TAIR种质#CS964)和突变体(ADH-R002,TAIR种质#CS8102)，含有乙醇脱氢酶蛋白的截断版本(Jacobs等人描述)。[67]和Dolferus等。[68])，从拟南芥生物资源中心(ABRC, Ohio State University, Columbus, OH, U.S.A.)获得。没有过表达的细胞系，因此只检测了ADH的功能丧失。种子在含0.05% Tween®20的2.75%次氯酸钠溶液中表面消毒20分钟，用无菌蒸馏水冲洗7次。野生型或抗利尿激素⁻将突变体移栽到含有Agro Mix®G10 (Fafard Ltd.， St. Bonaventure, Canada)的10厘米盆栽中，并在与大豆相同的条件下生长。种植2周后，将花盆减薄至每盆一株。

一种高致病性的发酵剂辣椒AG1-IA菌株ROS 2A4(来自巴西圣保罗州立大学Paulo Ceresini博士)在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)上生长3天，这些培养基保存在20%甘油中，温度为- 80℃。大豆的接种物包括r .以上从Living World (Baie D ' urf， Canada)公司获得的小米种子去壳、灭菌后单层放置于发酵剂培养的一周龄PDA真菌培养物表面。小米的种子完全被r .以上在24℃下孵育一周后的菌丝。无菌谷子放置在干净的PDA板上一周作为模拟接种(对照处理)。疫苗接种答:芥由3天大的3毫米插头组成r .以上菌株ROS 2A4在PDA上生长。无菌PDA插头作为对照。

大豆叶片接种是通过在离体单叶大豆叶片中间放置一颗侵染或不育(对照)谷子种子来进行的。每个植株的一片单叶叶片用于侵染处理，另一片叶片用于模拟接种(对照)处理。耐热玻璃盘子用保鲜膜包裹，放在一个生长柜里，在与上述植物生长相同的条件下生长。

拟南芥取6周龄植株第二轮叶片，用3日龄植株3 mm的花塞接种r .以上ROS 2A4生长在PDA或模拟接种无菌PDA插头(对照)。利用PDA插头接种拟南芥，而不是定殖的谷子种子，以限制先前暴露于谷子内的硫代葡萄糖苷对拟南芥-的影响r .以上交互。硫代葡萄糖苷对拟南芥防御很重要，因此可能影响了相互作用。大豆中不产生硫代葡萄糖苷，因此不会对大豆产生影响r .以上交互。在96 h内监测拟南芥的疾病进展，并使用ImageJ 1.49版软件每24 h拍摄照片进行坏死分析[69]通过阈值和量化棕黄色像素和总叶面积的数量[70]。总坏死和黄化以叶片的百分比计算(即棕黄像素与总叶面积像素之比)，并使用Student’s对结果进行比较t与JMP软件版本11.0 (SAS Statistics)进行比较。

抽样

研究大豆代谢物和转录物对波动的响应r .以上接种后12和24 h分别收获侵染、侵染和模拟接种的大豆叶片。样品的处理是通过切割含有的叶片区域r .以上菌丝外加外加0.5 cm以上的菌丝用无菌手术刀取出，并冷冻在液氮中。从模拟接种的叶片(对照)中切除相似大小的叶区。6个切除合并为1个生物重复，每次治疗共分析6个重复。从相同的样本中提取转录物和代谢物，以尽量减少代谢组学和转录组学数据集之间的差异。

检测:为检测而控制r .以上12 h和24 h叶片、菌丝代谢产物r .以上在PDA上生长的培养物，其数量代表了大豆叶片上菌丝扩张的面积。菌丝6r .以上与叶子上的样本大小相似的样本被集中在一起。进行了两次生物重复实验r .以上文化控制。

代谢物提取和¹核磁共振代谢组学分析

所有实验所用的化学品和试剂均为市售的最高等级。氧化氘(D₂O)¹氢核磁共振分析从Sigma-Aldirch购买。

为了进行代谢组学分析，使用研钵和杵将样品(12和24 hp及其分别模拟接种的对照叶)在液氮中研磨成细粉。极性代谢物提取自200毫克的新鲜组织叶片，或从总收获r .以上菌丝。样品冻干24 h后加入D₂O (0.6 mL)， Eppendorf管(2ml)。样品在Branson®5510超声波清洗机(Branson Ultrasonics)中在黑暗中超声处理30分钟，然后在室温下以250 rpm的转速在黑暗中提取3小时。最后，样品在21,460 g下，在4°C下离心2次，1小时，去除碎片，上清放入Eppendorf管(2ml)中，在- 80°C下保存，直到核磁共振分析。通过将等体积的样品提取物混合在一起，为每个处理制备两个质量控制(QC)样品。

大豆叶的极性提取物和r .以上菌丝分析采用¹如前所述[71做了一些修改。简单地说，使用瓦里安Inova 500 MHz核磁共振光谱仪(瓦里安)记录核磁共振光谱¹H {¹³C,¹⁵N}三重共振探头。每个样品共采集了128个瞬时态，64k个数据点，采集时间为2s，回收延迟为2s, H预饱和₂在回收延迟期间为0。然后对光谱进行傅里叶变换，使用Spectrus软件v.12.01 (ACD/Labs)自动校正相位和基线。分箱是光谱学中常用的一种数据简化方法，将光谱分成若干段，即所谓的分箱，然后对这些段进行整合。在这里，使用软件的智能装桶选项进行装桶，使用0.04 ppm的桶尺寸和50%的宽度松动。通过智能分桶，可以实现比常规分桶更好的光谱点聚类，增强了数据的鲁棒性。代谢物的鉴定和峰注释是基于位移、耦合常数值以及与同一系统中在相同分析条件下分析的分析标准品的比较。将得到的所有样品的组合NMR矩阵导出到MS Excel®中，最后导出到SIMCA-P+ v.13.0.3.0软件(Umetrics)中进行统计分析。

RNA提取及数据预处理

使用RNeasy植物迷你试剂盒(Qiagen)按照制造商的方案，从100mg感染或对照大豆叶片中提取所有处理和时间点(12和24 hp及其各自的模拟接种对照)的总RNA。在变性甲醛琼脂糖凝胶(2%)上确认RNA质量，并使用NanoDrop ND-100分光光度计(Thermo Fisher Scientific)进行定量。

采用24 h时间点感染和对照样品总RNA (10 μg)分离mRNA进行RNA测序(RNAseq)。RNAseq文库的制备遵循Kumar等人的改进方法。[72]。简单地说，使用DynaBeads®(ThermoFisher Scientific)分离mRNA，并按照Kumar等人的方案进行第一和第二链cDNA合成。[72AMPure®头纯化(Beckman Coulter)。使用Fragmentase (NEB)在37°C孵育20分钟后将cDNA片段化。使用NEB酶混合物和Klenow 3 ' to 5 ' exo (ThermoFisher Scientific)进行末端修复和a -尾化。适配器连接使用2X快速T4 DNA连接酶(NEB)和NEXTflex-96 RNA-seq条形码适配器85至96 (bioscientific)进行。然后使用1X Phusion High Fidelity PCR Master Mix (NEB)对样品进行PCR富集，每个引物PE1/PE2为0.67 μM (Bioo Scientific)，样品为7.5 μL，热循环条件如下:72]，共15个周期。在2%琼脂糖凝胶上评估单个文库的质量，并使用NanoDrop ND-1000分光光度计(Thermo Scientific)进行定量。每个文库的同等数量汇集在一起，使用UC Davis基因组中心(University of California, Davis, CA, USA)的生物分析仪确认质量和数量，并在UC Davis基因组中心(University of California, Davis, CA, USA)的Illumina HiSeq 2000上进行配对端测序150个循环。

序列数据使用Illumina管道过滤，通过与各自的Illumina条形码关联来分离属于不同复制的reads。使用FastQC 0.10.1版本检查每个库(样本)文件的质量[73]。使用Cutadapt 1.2.1版软件删除Illumina适配器和条形码[74]，使用Fastx-toolkit版本0.0.13命令fastq_quality_filter和fastx_trimmer进一步处理，获得累积质量分数在20以上、最小序列长度为40 bp的reads [75]。序列与大豆基因组和JGI基因组门户网站(JGI genome Portal)上的注释v1.1进行比对。http://genome.jgi-psf.org/) (76]和辣椒Rhisol AG1-IA v1.0可在NCBI上获得(taxid: 983,506;BioProject Accession PRJNA51401 [77]。将序列与基因组比对并使用组合程序Bowtie2 version 2.1.0.0进行注释[78]和TopHat2 v2.0.8b [79]使用以下调用:tophat2—segment-length 18，−-segment-mismatches 3，−a 4，−m 1，−p 4，−read-edit-dist 4，−g 1，−g[注释文件的路径][基因组索引的路径][fastq格式的数据文件]。序列与r .以上基因组在与大豆基因组比对之前被移除。为了做到这一点，由于在内部发现的高度遗传多样性，在比对中允许大量的不匹配r .以上吻合组。这确保了任何假定的r .以上大豆基因组比对前的转录本。绘制完成后，将序列和同工型与大豆参考转录组进行比较，并使用HTSeq version 0.5.4 . p3调用进行计数:-m union，−s no，−t exon，−i gene_id[输出相同文件的路径][输入相同文件的路径][注释文件的路径][特征计数文件的路径][80]。

qRT-PCR验证RNAseq

从大豆叶片样品(12和24 hp及其各自的模拟接种对照)中提取总RNA，并以上述相同的方式进行处理。采用iScript先进的qRT-PCR cDNA合成试剂盒(Bio-Rad Laboratories Ltd.)，从侵染和模拟接种大豆叶片的12 h和24 h时间点提取总RNA 2 μg，合成cDNA。根据24 h时间点RNAseq分析的差异表达基因(DE)进行qRT-PCR。简单地说，7(附加文件)5随机选择基因进行RNAseq分析的验证，并在所有处理的所有时间点(接种后12小时和24小时)进行分析。另外选择了14个主要代谢途径的DE基因，研究了RFB对大豆初级代谢的影响，并利用代谢组学数据可视化代谢物波动。qRT-PCR在以下条件下进行:每个20 μL反应含有1X SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories Ltd.)，每个引物0.175-0.25 μM(见附加文件)11(单个引物序列和热循环条件见表S10)，以及600 ng cDNA。热循环曲线在95℃下初始变性3分钟，然后在95℃下变性30秒，退火30秒，在72℃下延长40秒，进行35或40次循环，然后进行解离曲线分析(见附加文件)11(单个引物序列和热循环条件见表S10)。采用Zhao和Fernald的方法分析基因表达[81]与管家基因UKN2的标准化[82]。

统计分析和生物标志物发现

应用代谢组学的多变量分析进行统计分析和生物标志物发现

¹H NMR数据矩阵使用SIMCA-P+ v.13.0.3.0软件进行多变量分析，以检测趋势和生物标志物发现，如前所述，并进行了轻微修改[83]。简而言之，PCA最初是为了概述数据和检测异常值而进行的。转录物和代谢物负荷系数的显著阈值分别为α/2的上下两个百分位数[9]， α = 0.90。所获得的模型的性能是通过提取的成分[Q]可以预测的X的总变化的累积分数来评估的²(cum)]和所有X平方和的分数(R)²X)和Y (R²Y)由当前组件解释。代谢物数据的折叠变化是通过比较单个代谢物曲线下的总百分比面积来分析的t使用JMP软件版本11.0 (SAS Statistics, Toronto, Canada)进行比较测试。

应用qRT-PCR和转录组学的单变量分析进行统计分析和生物标志物发现

使用R版本3.0.2对大豆RNASeq转录本计数进行归一化和两两差异分析[84DESeq版本1.14.0 [85，86]。计数使用DESeq estimateSizeFactors函数归一化，基因分散使用函数estimateDispersions确定。两两比较处理之间归一化计数的差异(每个处理6个生物重复)，使用R包DESeq中的负二项检验计算。采用Benjamini-Hochberg校正多重比较后，显著性阈值设为FDR <0.1 [87]，倍数变化>1.5或< - 1.5作为生物学显著性阈值。为了识别处理中的异常值，使用SIMCA-P+ v.13.0.3.0对RNAseq进行主成分分析(PCA)。

qRT-PCR数据采用效率校准数学模型进行分析[88]，使用Zhao和Fernald的方法计算每个转录本的效率[81]。相对转录物丰度的差异用Student’s测定t测试比较(P< 0.05)，使用JMP软件版本11.0 (SAS Statistics)， fold变化>1.5或< - 1.5具有生物学意义。

数据集成——两两相关和潜在结构的双向正交投影(O2PLS)

使用R统计版本3.0.2的Pearson相关计算代谢物箱与转录本之间的Pearson两两相关[84]。使用R软件包corrplot 0.77版本完成两两相关性的热图可视化[89]。

为了整合转录组学和代谢组学数据集，采用O2PLS建立了一个多变量集成组学模型，该模型的主要目标是通过发现联合变异和独特变异来整合多块数据集(即X/Y) [9]。首先，代谢组学和转录组学数据集在MS Excel中合并到一个矩阵中，然后导入SIMCA-P+ v.13.0.3.0。转录组学数据(12926个转录本)被划分为X组(block 1)，代谢组学数据(126个bin)被划分为Y组(block 2)¹H NMR数据，初步分析表明，对这两个数据集进行定心而不缩放，在获得的模型和负载散射的区分和预测能力方面获得了最好的结果(附加文件)12:图S2;额外的文件13:图S3和附加文件14(表S11)。除了优化缩放方法外，还对模型进行了过拟合和欠拟合的测试，从而导致数据得出不正确的结论。因此，为了验证模型，我们进行了蒙特卡罗交叉验证，共7组，200次迭代[9，90，91]。简而言之，该方法将数据随机分为7组，从n-1组进行预测，最后一组保留。然后将预测值与被排除组的真实值进行比较，并确定预测误差平方和(PRESS)。这一过程反复进行，直到所有的群体都被排除在预测之外。这是针对不同数量的正交成分和基于最准确/预测情景选择的最佳成分数量进行的[9，90，91]。

根据不同的负荷系数选择具有显著意义的变量，转录物和代谢物的显著阈值分别设为α = 0.99或0.90。转录物和代谢物负荷系数的显著阈值分别为α/2的上下两个百分位数[9]。为了更清晰地显示两个数据集之间初级代谢的相关趋势，转录组学数据集被简化为只包含初级代谢相关的转录本，并且包含与代谢组学数据集相似数量的数据点(126个代谢箱)。简化的转录组学数据集包含与初级代谢相关的转录本，其重要值高于2，由O2PLS整合确定(附加文件)10(表S9)，得到241个转录本和126个代谢物箱，用于可视化初级代谢的相关性。当使用综合方法时，将数据集简化为感兴趣的途径，可以更好地观察感兴趣途径中标记物之间的相关性[12]。通过检查简化集O2PLS负载图(SIMCA-P+ v.13.0.3.0)来确定两个数据集在主要代谢途径中的相关性趋势。SoyBase数据库(soybase.org)用于转录物GO项鉴定。

基因-代谢物和代谢物-基因网络分析

的影响r .以上通过重建京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库中的数据，将感染对大豆基因丰度(RNAseq和qRT-PCR)和代谢物通量的影响定位到主要代谢途径上。http://www.genome.jp/kegg/)和之前发表的文献。

¹H NMR:

质子核磁共振

3 pga:

3-磷酸甘油酸或甘油-3-磷酸

抗利尿激素:

乙醇脱氢酶

AG:

吻合组

AGP:

Alpha-glucan磷酸化酶

AGT:

Alanine-glyoxylate转氨酶

Aln:

丙氨酸

艾米:

阿尔法

ASN:

天冬酰胺合成酶

BAMY:

Beta-amylase

BFF:

Beta-fructofuranosidase

BGLUC:

Beta-glucosidase

互补脱氧核糖核酸:

互补脱氧核糖核酸

ChlA / B:

叶绿素A/B结合蛋白

辅酶a:

辅酶A

D₂O:

氧化氘

德:

差异表达

D-gluc:

葡萄糖

DPSC2:

-1-吡咯-5-羧酸合酶

EtOH:

乙醇

F6P:

Fructose-6-phosphate

外籍家庭:

甲酸脱氢酶

罗斯福:

错误发现率

:

甲酸

Fruc:

果糖

嬉笑:

延胡索酸酯

G5K:

Glutamate-5-kinase

G6P:

Glucose-6-phosphate

GABA:

γ-氨基丁酸

Gln:

谷氨酰胺

Glu:

谷氨酸

Gluc:

葡萄糖

走:

基因本体论

销售税:

Glutathione-S-transferase

h.p.i。

小时post-inoculation

KEGG:

京都基因和基因组百科全书

MHz:

兆赫

美国职业足球大联盟:

苹果酸合成酶

O2PLS:

双向正交投影到潜在结构

朋友:

苯丙氨酸解氨酶

主成分分析:

主成分分析

PDA:

马铃薯葡萄糖琼脂

动员:

磷酸烯醇丙酮酸

PEPC:

磷酸烯醇丙酮酸羧激酶

/:

过氧化物酶

法:

苯丙氨酸

PLS-DA:

偏最小二乘判别分析

PR4:

发病相关蛋白

新闻:

预测误差平方和

正方观点:

脯氨酸

PSII:

光系统II

问²_(和)：

累积预测能力

质量控制:

质量控制

存在:

定量实时聚合酶链反应

R²X R²Y:

分别是所有X和Y变量平方和的分数

RFB:

叶枯病

RNAseq:

RNA序列

ROS:

活性氧

爵士:

丝氨酸

SRA:

短读档案

往下:

琥珀酸

Sucr:

蔗糖

柠檬酸:

三羧酸

这:

硫胺生物合成

刺:

苏氨酸

酪氨酸:

酪氨酸

UKN2:

假设蛋白质未知2

贵宾:

变量的重要性

Wt:

野生型

作者们要感谢巴西的Paulo Ceresini慷慨地为我们提供了r .以上压力。我们感谢加州大学戴维斯分校D. Kliebenstein和S. Brady实验室成员提供的技术支持。

资金

这项工作得到了加拿大自然科学与工程研究委员会(NSERC)向S. Jabaji提供的发现基金(RGPIN137135-201和RGPIN-2016-04805)和美国国家科学基金会向D. Kliebenstein提供的IOS基金#1339125的支持。

数据和材料的可用性

原始测序数据可在短读档案(SRA)上获得，登录号为SRP075504，而代谢组学数据包含在文章及其附加文件中。

作者的贡献

本研究的概念和设计:TC和SJ。本研究数据的获取:TC。工作数据分析:TC和KAA。工作数据解释:TC, KAA, DJK和SJ。审稿:TC, KAA, DJK, SJ。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

发表同意书

不适用。

伦理批准并同意参与

不适用。

从属关系

1. 麦吉尔大学植物科学系，魁北克圣安妮德贝尔维尤，加拿大h9x3v9

   Tanya R. Copley和Suha H. Jabaji

2. 雅典农业大学植物科学系，农药科学实验室，希腊雅典11855

   康斯坦丁诺斯A.阿里弗里斯

3. 美国加州大学植物科学系，戴维斯，95616

   丹尼尔·j·克里本斯坦

相应的作者

对应到苏哈·h·贾巴吉．

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