转录组仿形物GydF4y2BaElymus sibiricus，GydF4y2Ba一种青藏高原重要的牧草，揭示了可能与种子落粒有关的候选基因的新见解GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

大sibiricusGydF4y2Ba是半干旱地区重要的牧草，但由于种子落粒率高，很难种植用于商业种子生产。为了更好地了解种子落粒的发生机制，并探索可能与种子落粒有关的基因，我们对这两个基因进行了形态学、组织学、理化和转录组分析GydF4y2Ba大肠sibiricusGydF4y2Ba基因型(XH09和zhhn03)的种子落粒率差异较大。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

结果表明，种子的落粒一般是由脱落层的退化引起的。在高落粒基因型XH09中，脱落层的早期降解与落粒增加有关。两种细胞壁降解酶，纤维素酶(CE)和聚半乳糖醛酸酶(PG)，在离层区具有不同的活性，表明它们在离层分化中的作用。分别从XH09和zhhn03抽穗后7 d、21 d和28 d的离断带组织中构建cDNA文库并进行测序。“XH09-7 vs zhhn03 -7”、“XH09-21 vs zhhn03 -21”和“XH09-28 vs zhhn03 -28”共注释了86634个ungenes，预测了7110个差异转录本(DETs)，对应2058个上调的ungene和5052个下调的ungene。利用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)对10个涉及细胞壁降解酶、木质素生物合成和植物激素活性的候选转录本的表达谱进行了验证，其中8个基因在低落粒基因ZhN03中表达上调，提示这些基因可能与降低落粒有关。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

本研究生成的表达数据为今后的分子生物学研究提供了重要的资源GydF4y2Ba大肠sibiricusGydF4y2Ba．GydF4y2Ba

种子破碎被认为是野生植物中种子分散的重要自适应性状，但也是许多谷物作物中种子产量损失的主要原因[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba］．因此，落粒损失被认为是大多数谷物驯化过程中的关键事件之一[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba］．随着其他农艺性状，如千粒重，胁迫耐受性和植物高度，谷物养殖较低的种子破碎是谷物育种计划中的重要农艺性状。GydF4y2Ba

在谷物草中，在脱落区（AZ）中发生种子脱落，并且脱落途径包括四个主要步骤：脱落区形成和发育，响应脱落信号，脱落的激活和脱落层的分化[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba］．以往的研究表明，种子的落粒一般是由脱落引起的，而种子滞留是由于脱落层的损失[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba］．粉碎习惯是一种复杂的多基因特性，由许多基因控制[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba那GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba］．在GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba，疯狂箱转录因子基因GydF4y2BastGydF4y2BabHLH转录因子基因GydF4y2BaHEC3GydF4y2Ba调节种子区形成[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba］．在水稻中，已经鉴定和克隆了几个主要的水稻落粒数量性状位点和基因，包括GydF4y2BaSH4.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba]GydF4y2Ba, qSH1GydF4y2Ba[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba]，GydF4y2Baoscpl1.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba10GydF4y2Ba] 和GydF4y2BaSHAT1GydF4y2Ba[GydF4y2Ba11GydF4y2Ba］．GydF4y2BaSH4.GydF4y2Ba是一个主要的种子破碎QTL，并用MyB3 DNA结合结构域和核定位信号编码转录因子[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba］．GydF4y2BaqSH1GydF4y2BaBEL1-type同源盒基因编码并调控花梗AZ的形成，5 '调控区域的单核苷酸多态性(SNP)GydF4y2BaqSH1GydF4y2Ba由于没有脱落层形成，基因导致种子破碎的丧失[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba］．稻米花梗AZ形成也受到监管GydF4y2BaSHAT1GydF4y2Ba基因是Apetala2（AP2）家族转录因子的成员[GydF4y2Ba11GydF4y2Ba］．的GydF4y2Baoscpl1.GydF4y2Ba该基因编码一种含有保守羧基末端结构域(CTD)磷酸酶结构域的蛋白质，该结构域抑制穗发育过程中脱落层的分化[GydF4y2Ba10GydF4y2Ba］．此外，先前的研究表明，在脱落期间，涉及细胞壁降解和脱落促进植物激素信号传导的各种基因进行上调[GydF4y2Ba12GydF4y2Ba那GydF4y2Ba13GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

相比之下，饲料草中种子破碎的研究有限。在杂交中GydF4y2Balemus.GydF4y2Ba(小麦科)野生干麦，鉴定出一个主效种子保留QTL [GydF4y2Ba14GydF4y2Ba］．MSDS-box基因GydF4y2BaWM8.GydF4y2Ba被克隆了GydF4y2BaElymus nutans.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba15GydF4y2Ba］．然而，在许多饲草中种子粉碎的机理仍未被探索和了解。牧草育种目标主要集中在牧草品质、生物量产量和抗逆性等方面，而对最终用户而言，种子破碎相对不重要。因此，尽管在许多牧草品种和野生牧草中，种子落粒是一种常见的性状，但许多牧草育种家对牧草落粒习性的关注却很少。先前的研究表明，种子保留率的提高并不影响牧草的质量，并认为种子保留率是牧草种子作物的理想性状之一[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba]. 对于种子破碎程度高的牧草而言，选择种子保存和改进种子破碎是至关重要的。GydF4y2Ba

大sibiricusGydF4y2Ba(西伯利亚野生黑麦)，属的模式种GydF4y2Ba大GydF4y2Ba，是一种经济上重要的常年寒冷季节，自我授粉和同种异体一流的牧草草，对北亚北部土着土着[GydF4y2Ba16GydF4y2Ba］．在青藏高原，它广泛用于天然草地和耕种牧场，由于其应力耐受性，良好的饲料质量，对当地环境的适应性，具有低温和高海拔地区的适应性[GydF4y2Ba17GydF4y2Ba］．然而，由于种子碎裂，GydF4y2Ba大肠sibiricusGydF4y2Ba对于商业种子生产难以增长。在中国四川省省份，中国的绝大多数GydF4y2Ba大肠sibiricusGydF4y2Ba每年生产种子（2,400,000千克），平均种子产量仅为690 kg.haGydF4y2Ba^-1GydF4y2Ba由于种子破碎了。实际上，如果由于不利条件延迟收获，种子破碎可能导致高达80％的产量损失[GydF4y2Ba18GydF4y2Ba］．在以前的一项研究中，我们发现了种子碎种群体中的种子倾向的趋势范围广泛GydF4y2Ba大肠sibiricusGydF4y2Ba，籽粒落粒与其他农艺性状无显著相关[GydF4y2Ba19GydF4y2Ba］．这些数据建议种子破碎的遗传变异，并提供了可以研究种子碎片的分子机制的合适群体。尽管基于下一代测序（NGS）的转录组分析允许阐明复杂的遗传调节网络，并为许多与重要农艺性状相关的基因提供功能数据[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba21GydF4y2Ba，这些工具和序列资源的种子粉碎GydF4y2Ba大肠sibiricusGydF4y2Ba仍然缺乏。这是研究这种物种种子碎机制的第一步。GydF4y2Ba

解剖导致种子破碎的机制，并探索与种子破碎相关的推定基因GydF4y2Ba大肠sibiricusGydF4y2Ba，我们进行了形态学，组织学和生理化学测量，与高种子破碎基因型（XH09）和低种子破碎基因型（ZHN03）进行转录组分析。本研究的结果将导致更好地了解种子破碎机制，并有助于培育这种物种种子保留中的改善计划。GydF4y2Ba

植物材料和生长条件GydF4y2Ba

植物材料由两种野生植物组成GydF4y2Ba大肠sibiricusGydF4y2BaXH09基因型和zhhn03基因型分别采自甘肃夏河和卓尼(图2)。GydF4y2Ba1GydF4y2Baa1, a2)。GydF4y2Ba大肠sibiricusGydF4y2Ba不是濒危或保护物种，因此在中国采集这些样本不需要许可。这些样品的正式鉴定工作在甘肃省草地农业生态系统国家重点实验室进行。根据株高、花序、叶、茎和种子等重要的表型特征对样品进行鉴定。本种是小花药和长芒的束草。本研究是在对28个地区种子落粒率进行筛选的基础上进行的GydF4y2Ba大肠sibiricusGydF4y2Ba加入[GydF4y2Ba19GydF4y2Ba］．两个基因型的种子在室温下用塑料盒萌发。萌发后，幼苗在温室条件下生长，直至它们为8周。然后他们被移植到兰州大学实验站的实地地块，甘肃玉仲（纬度35°34'，经度103°34'e，高度1720米）。无任何权限来执行现场实验。GydF4y2Ba

特种种子破碎成果划相物与花梗结构的组织学分析GydF4y2Ba

花序GydF4y2Ba大肠sibiricusGydF4y2Ba是含有15-30分钟的尖峰。每个小尖峰由5-8个通常开发的小花组成，长AWN（图。GydF4y2Ba1 bGydF4y2Ba)．通过测量从花梗脱离种子所需的破裂拉伸强度（BTS）来确定XH09和ZHN03的种子碎片水平[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba］．在第五个发育阶段，0,7,14,21,28天，在出头（DAH）之后28天中的每一个，计算每种植物的三十次随机选择的每种植物。计算它们的平均BTS值。在与种子破碎测量的同一五个发育阶段进行皮套结构的组织学分析。GydF4y2Ba

为了减少由于每个发育阶段的小穗位置导致的变化，使用每个繁殖的三个中央尖峰，并且在每个小穗内，中央小花香与rachilla的一部分解剖一起[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba]. 每次加入的花梗固定在60:5:5:30乙醇：乙酸：福尔马林：水溶液中，并在4°C下储存在15 M乙醇中[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba］．然后分别在乙醇溶液（50,70,90和100％）的梯度中脱水60分钟。在用二甲基苯处理和石蜡中浸泡后，纵向截面为8μm的组织样品，用Safranine-Fast Green（中国上海中海）染色3分钟。在染色之后，然后在尼康缩放式FXA显微镜（Nikon Corporation，Tokyo，Japan）下观察特抚细胞结构。扫描电子显微镜用于在种子分离后检查花梗连接，以检测脱落层开发和各种发育阶段中的每一个的种子破碎程度之间的关系[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

脱落区的物理化学分析GydF4y2Ba

两个基因型(XH09, zhhn03)的离断带组织按照Li等人描述的方法收获[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba］．采用植物CE酶联免疫吸附测定试剂盒和植物PG酶联免疫吸附测定试剂盒分别测定了两种细胞壁降解酶(纤维素酶和聚半乳糖醛酸酶)的酶活性，用于BTS和组织学分析。GydF4y2Ba

RNA提取，cDNA文库施工和RNA-SEQGydF4y2Ba

分别在抽穗后7 d、21 d和28 d的3个发育阶段采集两种基因型的离断带组织。根据种子的落粒、组织学和理化分析结果，选择了3个阶段。根据我们之前的研究，种子落粒发生在14dah，转录组的变化应该在这个时间点之前开始，因此我们将7dah作为落粒相关基因被激活之前的“零时间”。每个采集的花梗结构由花梗约1毫米区域和花的1.5毫米区域组成，其中包括脱落带[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba22GydF4y2Ba］．为每次重复收集约30mg这种脱落区组织。测试用三个生物学重复进行。将该物质立即置于液氮中并储存在-80℃以进行后续RNA提取。根据制造商的说明，使用植物总RNA套件（天根，北京）提取来自每种组织的总RNA。使用Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies，Inc.，Waldbronn，Wally）测量RNA浓度和质量。总RNA样品被送到Biomarker Technologies Corporation（北京，中国），用于cDNA图书馆建设和转录组测序。使用磁性寡聚珠（DT）珠粒从总RNA富集聚（a）mRNA。根据Illumina RNA-SEQ方案进行RNA碎片，双链cDNA合成和PCR扩增。最后，使用Chrysalis 36循环V 3.0测序试剂盒在Illumina Ga-П（Illumina Inc.，USA）上进行纯化的cDNA文库的测序，从片段的两端读出2×101bp的一条车道（“配对结束“）具有180bp插入距离进行组装。GydF4y2Ba

de novo集会和注释GydF4y2Ba

使用FASTX工具包过滤适配器序列和带有模糊的“N”碱基且碱基质量小于Q30的读取后获得干净的读取。使用Trinity程序对高质量reads进行从头转录组组装[GydF4y2Ba23GydF4y2Ba］．利用BLASTX对NCBI非冗余蛋白序列(Nr)、注释蛋白序列数据库(Swiss-Prot)、基因本体论(GO)、蛋白家族(Pfam)、真核同源群(KOG)、京都基因与基因组百科(KEGG)、和COG (Cluster of Orthologous Groups, COG)数据库(e值≤1e-5)检索基于同源性的蛋白质功能注释。关于生物过程、分子功能和细胞成分的GO术语被分配给使用Blast2GO软件注释的每个序列[GydF4y2Ba24GydF4y2Ba］．Wego软件用于绘制成绩单的GO注释的分布[GydF4y2Ba25GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

分析差异表达转录物的功能性富集（DETS）GydF4y2Ba

使用苏达喹氏菌映射到组件，然后根据Mortazavi等人描述的方法测量每百万百万片段的每千碱基映射的每百万片段（FPKM）值。[GydF4y2Ba26GydF4y2Ba］．使用公式日志计算转录折叠变化GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba（FC），以及多次测试的校正使用假发现速率（FDR）控制方法[GydF4y2Ba27GydF4y2Ba］．日志的绝对值GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba（FC）≥ 2和FDR显著性得分≤ 将0.01设为阈值，以调用两个样本之间的显著DET。STEM软件用于将DET与GydF4y2BaP.GydF4y2Ba≤0.05 (GydF4y2Ba28GydF4y2Ba]，利用agriGO对DETs进行GO富集分析和KEGG途径富集分析[GydF4y2Ba29GydF4y2Ba]及KOBAS 2.0 [GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba),分别。GydF4y2Ba

通过定量实时PCR（qRT PCR）验证RNA-seq数据GydF4y2Ba

用于RNA-SEQ分析的总RNA的一部分用于制备QRT-PCR的cDNA。qRT-PCR was conducted using the SYBR Premix Ex Taq™ II quantitative PCR system (Takara, Dalian), following the manufacturer’s instructions, and reactions occurred on a Bio-Rad iQ5 real-time PCR instrument (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Based on the transcriptome results, ten candidate genes involved in seed shattering were selected for the qRT-PCR assays. Gene-specific primers were designed using Primer Express software (Applied Biosystems) and are shown in Additional file1GydF4y2Ba：表S1。计算这些DET相对于参考基因的表达水平GydF4y2BaGAPDH.GydF4y2Ba使用2GydF4y2Ba^{——ΔΔCtGydF4y2Ba}方法(GydF4y2Ba31GydF4y2Ba］．通过三份测试所有样品，并在三种生物学重复上进行实验。GydF4y2Ba

两种基因型种子变化的时序变化GydF4y2Ba

通过测定花梗断裂强度(BTS)表征XH09和ZhN03籽粒破碎程度随时间的变化，BTS与籽粒破碎程度成反比。在抽穗后的前14天，XH09和zhhn03的BTS值没有差异，维持在150 gf以上(图1)。GydF4y2Ba1 cGydF4y2Ba)．在XH09和ZHN03之间发现了显着不同的BTS值。14天后，ZHN03的BTS开始减少，但在28天的28天仍然保持在90 GF以上。相比之下，XH09的BTS值在14天后迅速降低，并且在28dAh下降至50gF以下。XH09的种子通过手动压碎容易脱粒。因此，野生载体ZHN03和XH09分别可以分别表征为低且高种子破碎。GydF4y2Ba

脱落带的组织学及理化分析GydF4y2Ba

具有纵向部分的解剖学研究表明脱落层已经存在于XH09和ZHN03中。它们发生在血管束的两侧，可通过Safranine染色红色。脱落层的细胞小于rachilla中的实质细胞，并且具有椭圆形和有组织的位置。14dAh未观察到脱落层的降解。脱落层的降解在21dAh的XH09中发生（图。GydF4y2Ba2 bGydF4y2Ba)，在28dah处发现脱落层破裂(图。GydF4y2Ba2摄氏度GydF4y2Ba)．相比之下，在ZHN03处在21时未观察到脱落层的严重降解（图。GydF4y2Ba2 eGydF4y2Ba）和28 dah（图。GydF4y2Ba2 fGydF4y2Ba)．在高落粒基因型XH09中，脱落层的早期降解与落粒增加有关。基于这些染色结果，脱落区中的木质素较少，XH09的周围的花梗组织（图。GydF4y2Ba2 bGydF4y2Ba）比在ZHN03中（图。GydF4y2Ba2 eGydF4y2Ba)．此外，扫描电镜显示XH09在28dah处小穗轴有一个光滑的断裂表面(图。GydF4y2Ba2我GydF4y2Ba那GydF4y2BajGydF4y2Ba)，而zhhn03表面粗糙不规则，可见细胞结构(图。GydF4y2Ba2米GydF4y2Ba那GydF4y2BaNGydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

为了研究细胞壁降解酶是如何促进种子粉碎的，研究了纤维素酶比活性的变化(图。GydF4y2Ba3GydF4y2Ba)和聚半乳糖醛酸酶(图。GydF4y2Ba3 bGydF4y2Ba）在XH09和ZHN03的脱落区测定。两种水解酶在种子生长和发育中的不同阶段表现出类似的活性趋势。纤维素酶的平均特异性活性在高种子碎种XH09（415.77 IU / L）中高于低种子破碎基因型ZHN03（266.8 IU / L）。纤维素酶的活性在XH09的21天迅速增加，达到28天的796.38 IU / L，而ZHN03的活性为352.98 IU / L，在28天。聚甲磺酸盐酶的平均特异性活性在XHO 9（149.35pg / ml）中高于ZHN03（115.73pg / ml），特别是在生理成熟时。在28 dah，XHO的聚糖酶活性为186.50pg / ml，而ZHN03的活性为124.77pg / ml。物理化学分析在21DAH和28DAH的XH09和ZHN03之间揭示了脱落区中脱落区中显着不同的细胞壁降解酶活性。GydF4y2Ba

转录组测序显示分离区有差异表达的转录本GydF4y2Ba

目的:探讨种子落粒的分子机制和可能的相关基因GydF4y2Ba大肠sibiricusGydF4y2Ba．CDNA文库由脱落区组织RNA样品构建，并使用Illumina Hiseq™2500平台进行测序。这些Illumina数据可在序列中获取读取档案（SRA），具有登录号SRX2617497。在清洁和检查读取质量后，使用Trinity软件组装高质量的读数。每个样本的序列数为12.2-17.0百万读数（表GydF4y2Ba1GydF4y2Ba)．共鉴定出185,523个unigenes，其中86,634个unigenes在至少一个数据库中被注释(见表)GydF4y2Ba2GydF4y2Ba)．测量每个样本的表达丰度。其中差异表达转录本(DETs)超过30,000个GydF4y2Ba大肠sibiricusGydF4y2Ba在三个发展阶段的图书馆：标题后7天，21天和28天，其中1171（476个上调，695个下调），4421（1151上调，2910次下调），1878（431升）受到限制的，1447尺寸的下调）从“XH09-7 VS ZHN03-7”，“XH09-21 VS ZHN03-21”，“XH09-28 VS ZHN03-28”，“XH09-28 VS ZHN03-28”（表GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

在GO数据库中检索这些基因序列，对基因功能进行分类和标准化。共有2589个DETs被划分为3个主要GO类别(细胞成分、生物过程和分子功能)和53个亚类别(附加文件)GydF4y2Ba2GydF4y2Ba:图S1)。在细胞成分范畴中，“细胞部分”、“细胞器”和“膜”是优势类群。在生物过程范畴中，“代谢过程”、“细胞过程”和“单生物过程”是优势群体。在分子功能范畴中，“催化活性”、“结合活性”和“转运活性”是主导范畴。为了揭示DETs中显著富集的氧化石墨烯项，通过agriGO网站进行氧化石墨烯富集的功能意义分析。在“XH09-7 vs zhhn03 -7”、“XH09-21 vs zhhn03 -21”、“XH09-28 vs zhhn03 -28”中分别发现了11、70、51个显著富集的GO词条GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba：表S2）。GydF4y2Ba

为了表征转录组的复杂生物学行为，我们还对来自三个差异转录组的所有det进行了KEGG通路富集分析。共有1318个DETs被注释并分配到KEGG通路，其中“XH09-7 vs zhhn03 -7”、“XH09-21 vs zhhn03 -21”、“XH09-28 vs zhhn03 -28”中分别发现107、512、699个DETs(补充文件)GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba:图S2)。发现的最具代表性的途径有“核糖体(Ko03010)”、“碳代谢(ko01200)”、“凋亡(Ko4210)”、“内质网蛋白加工(Ko04141)”等。本研究主要围绕过氧化物酶体(Ko04146)、苯丙酸生物合成(Ko00940)、植物激素信号转导(Ko4075)等进行研究。总的来说，在“苯丙酸生物合成”的途径(附加文件GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba：图S3），59个unigenes被注释并编码参与木质素生物合成的推定酶。在“植物激素信号转导”的途径中（附加文件GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba其中，有7个与乙烯生物合成及调控有关，10个与脱落酸有关，17个与生长素有关(见表4)GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

比较转录组分析显示涉及种子破碎的候选转录物GydF4y2Ba

籽粒粉碎测定和理化分析结果表明，XH09和zhhn03在21dah和28dah时脱落带的BTS值和细胞壁降解酶活性存在显著差异。通过比较7 DAH、21 DAH和28 DAH 3个时间点的基因型的det值，确定了种子落粒的候选基因。3个发育阶段共检测到蝇虱7470个，其中“Xh09-7对zhhn03 -7”预测出蝇虱1171个，“Xh09-21对zhhn03 -21”和“Xh09-28对zhhn03 -28”预测出蝇虱较多。在此基础上，我们从“XH09-7 vs zhhn03 -7”、“XH09-21 vs zhhn03 -21”和“XH09-28 vs zhhn03 -28”中分别筛选出18、138和97个可能的种子落粒反应基因(补充文件)GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba:表S3)。从这些DETs的功能推测，我们发现了5个主要的功能群:细胞壁水解或修饰、水解酶活性、植物激素信号传导和响应、转录因子和蛋白激酶活性。8个候选DETs涉及过氧化物酶活性(c60174.graph_c0)，水解酶活性(c72047。graph_c1 c30667。GR.一种P.H_c0, c54680.graph_c1,), ethylene-responsive transcription factor (c23015.graph_c0,), and wall-associated receptor kinase (c34865.graph_c0, c42329.graph_c0, c68413.graph_c0) were found at all the three developmental stages. A total of 58 DETs involved in hydrolase activity were predicted from “XH09-21 vs ZhN03-21”, of which 13, 2 and 12 genes involved in glucosidase activity, polygalacturonase activity and xylanase inhibitor were differentially expressed in the abscission zone of XH09 and ZhN03, respectively (Fig.4.GydF4y2Ba)．特别是在低落粒基因型ZhN03中，与高落粒基因型XH09相比，2个与聚半乳糖醛酸酶活性相关的基因表达下调。在“XH09-28 vs zhhn03 -28”中，97个基因中有18个在低落粒基因型zhhn03的脱落带中表达上调。特别是木聚糖酶抑制蛋白(GydF4y2BaXIPGydF4y2Ba）基因在脱落区中表达，乙烯响应转录因子和乙烯受体基因（GydF4y2BaEIN4.GydF4y2Ba与高落粒基因型XH09相比，ZhN03在28dah表达上调。GydF4y2Ba

定量逆转录PCR (qRT-PCR)验证RNA-seq表达GydF4y2Ba

为了定量地确定我们转录组数据的可靠性，我们选择了10个参与细胞脱落激活的转录本进行qRT-PCR验证。这些候选酶包括苯丙氨酸解氨酶(GydF4y2Ba朋友GydF4y2Ba), beta-glucosidase (GydF4y2BaGLUGydF4y2Ba)、咖啡酰辅酶a o -甲基转移酶(GydF4y2BaCCOAOMT.GydF4y2Ba），过氧化物酶（GydF4y2Ba痘GydF4y2Ba），丝氨酸/苏氨酸 - 蛋白激酶SRK2（GydF4y2BaSNRK2.GydF4y2Ba)、乙烯受体(GydF4y2BaETRGydF4y2Ba)，过氧化氢酶(GydF4y2Ba猫GydF4y2Ba)、内切葡聚糖酶(GydF4y2BaEGLGydF4y2Ba），木聚糖酶抑制剂蛋白1（GydF4y2BaXIP1GydF4y2Ba）和纤维素合成酶（CESA）。结果表明，所有十个转录物在AZ在三个发育阶段表达，7天，21天和在标题后28天。我们使用XH09-7作为相对表达分析的基准。GydF4y2BaCCOAOMT.GydF4y2Ba和GydF4y2Ba中国极限运动协会GydF4y2Ba在XH09和21Dah和28天的ZHN03中被下调。其他8转录物的表达在ZHN03-28中调节（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba)．的相对表达GydF4y2BaXIP1GydF4y2Ba对于ZHN03-28的ZHN03-28比XH09-07高120倍。六个基因（GydF4y2BaGLUGydF4y2Ba那GydF4y2Ba痘GydF4y2Ba那GydF4y2BaEGLGydF4y2Ba那GydF4y2Ba猫GydF4y2Ba那GydF4y2BaETRGydF4y2Ba和GydF4y2BaSNRK2.GydF4y2Ba)在zhhn03 -21和zhhn28中表达，与高落粒基因型XH09比较。通过RNA-seq和qRT-PCR测量的表达倍数变化的线性回归分析显示出正相关(GydF4y2BaR.GydF4y2Ba= 0.76,GydF4y2BaP.GydF4y2Ba< 0.05)。GydF4y2Ba

脱落带的组织学和理化差异GydF4y2Ba

叶片，水果和种子的脱落是一种复杂和高度协调的过程，涉及细胞结构，代谢和基因表达的多种变化[GydF4y2Ba32GydF4y2Ba］．目的:阐明在GydF4y2Ba大肠sibiricusGydF4y2Ba在本研究中，我们对两个基因型（XH09和ZhN03）进行了形态学、组织学、理化和转录组分析，并对比了种子破碎表型。结果表明，高粉碎基因型XH09在种子生理成熟期的BTS值（36.73gf）低于低粉碎基因型ZhN03（96.3gf）。脱落区的组织学分析显示XH09中的小穗轴断裂面光滑，表明降解程度较高。这可能是由于XH09脱落区纤维素酶和多聚半乳糖醛酸酶活性增加所致。在一些系统中，脱落与细胞壁水解酶（包括纤维素酶和聚半乳糖醛酸酶）对细胞壁成分的切割和降解有关；纤维素酶的活性与植物生长发育的许多过程有关，如果实成熟和器官脱落[GydF4y2Ba33GydF4y2Ba］．在植物器官中报道了增加多肢乳突酶活性和细胞分离之间的相关性[GydF4y2Ba34GydF4y2Ba]，因此脱落特异性聚半乳糖醛酸酶可能在脱落过程中分解富含果胶的中层板层并导致分离的过程中发挥重要作用[GydF4y2Ba32GydF4y2Ba］．我们的结果表明纤维素酶和聚乳糖酸酯酶在种子碎片中的参与和作用。GydF4y2Ba

细胞壁水解相关基因GydF4y2Ba

植物细胞壁主要由非淀粉多糖组成，包括纤维素和半纤维素[GydF4y2Ba35GydF4y2Ba］．纤维素酶（1,4， -GydF4y2BaβGydF4y2Ba-葡聚糖酶)是第一个被报道在脱落过程中促进壁松动的酶[GydF4y2Ba36GydF4y2Ba］．我们的Kegg途径对DECS的浓缩分析表明了纤维素酶活性参与的28个unigenes。这些unigenes在标题后28天在两种基因型的脱落区上调。这些结果表明，这些unigenes的表达更高可能导致种子生理成熟度的种子碎片增加。许多植物纤维素酶基因属于糖基水解酶系列，其在组织发育过程中修饰细胞壁结构和组分[GydF4y2Ba37GydF4y2Ba那GydF4y2Ba38GydF4y2Ba］．在水稻中，是基因GydF4y2BaOsCel9DGydF4y2Ba（同义词GydF4y2BaOsGLU1GydF4y2Ba），编码Endo-1,4， -GydF4y2BaβGydF4y2Ba- 葡聚糖酶基因具有纤维素功能，与水稻中的细胞壁组分有关;和GydF4y2BaOsCel9DGydF4y2Ba突变降低了细胞伸长和纤维素含量，增加了果胶含量，从而阻碍了种子落粒的脱落过程[GydF4y2Ba38GydF4y2Ba]. endo-1,4的相对表达-GydF4y2BaβGydF4y2Ba发现水稻中的葡萄糖酶基因与种子破碎相关[GydF4y2Ba39GydF4y2Ba]GydF4y2Ba．GydF4y2Ba在脱落，花和种子的脱落期间，endo-1,4-表达增加GydF4y2BaβGydF4y2Ba- 葡萄糖酶基因可以促进植物官的自然分离[GydF4y2Ba40GydF4y2Ba-GydF4y2Ba42GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

木聚糖是半纤维素的主要成分。木聚糖酶能催化水解GydF4y2BaβGydF4y2Ba-1,4-木糖键在木聚糖中，木聚糖酶抑制剂可抑制木聚糖酶的活性（GydF4y2Ba切除酶GydF4y2Ba) ［GydF4y2Ba35GydF4y2Ba］．据报道，木聚糖酶在对植物防御中发挥着重要作用对抗病原体[GydF4y2Ba43GydF4y2Ba和食草动物[GydF4y2Ba35GydF4y2Ba］．然而，木聚糖酶是否也参与种子粉碎仍是未知数。在水稻中，至少有3个XIP型木聚糖酶抑制基因(GydF4y2Ba大米XIPGydF4y2Ba那GydF4y2BaRIXIGydF4y2Ba和GydF4y2BaOsXIPGydF4y2Ba)，这些基因不同程度地受到压力的诱导[GydF4y2Ba44GydF4y2Ba-GydF4y2Ba46GydF4y2Ba］．在本研究中，12GydF4y2BaXIPGydF4y2Ba在21dAh的两种基因型的AZ中不同地表达基因（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba），并且与高碎种基因型XH09相比，低破碎的基因型ZhN03显示出这些基因的表达得多。这表明该基因可能对评估基因型中的种子破碎作用，并且该基因的表达与种子破碎的减少有关。GydF4y2Ba

植物激素相关基因GydF4y2Ba

植物激素，也被称为植物激素，是植物内部产生的信号分子，在调节植物的广泛生长和发育过程中起着重要的作用，包括植物的脱落。我们KEGG精细的通路富集分析表明54 unigenes参与植物激素信号转导,其中17例与生长素、8 Cytokinine, 1到赤霉素,10脱落酸,7 -乙烯,2 Brassinosteroid,茉莉酸3 - 6水杨酸反应通路。脱落酸、乙烯和生长素是调节植物脱落的重要生长调节剂[GydF4y2Ba32GydF4y2Ba那GydF4y2Ba47GydF4y2Ba］．脱落酸在脱落的器官（如种子）中起着直接作用[GydF4y2Ba48GydF4y2Ba］．脱落酸信号转导受ABA应答基因(如ABA受体)的调控GydF4y2BaPYR /所有GydF4y2Ba，型2C蛋白磷酸酶（GydF4y2BaPP2C.GydF4y2Ba)，一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(GydF4y2BaSNRK2.GydF4y2Ba)和ABRE结合因子(GydF4y2Ba沛富GydF4y2Ba) ［GydF4y2Ba49GydF4y2Ba-GydF4y2Ba51GydF4y2Ba］．以前的研究表明GydF4y2BaPP2CS.GydF4y2Ba是ABA信号的负调控因子[GydF4y2Ba49GydF4y2Ba］．另一方面，GydF4y2BaSNRK2.GydF4y2Ba积极调节ABA反应[GydF4y2Ba50GydF4y2Ba，但其活性可被抑制GydF4y2BaPP2C.GydF4y2Ba．在ABA的存在下，之间的相互作用GydF4y2BaPP2CS.GydF4y2Ba和GydF4y2BaSnRK2sGydF4y2Ba会被GydF4y2BaPYR /所有GydF4y2Ba受体，从而防止GydF4y2BaPP2C.GydF4y2Ba- 介导的去磷酸化GydF4y2BaSNRK2.GydF4y2Ba，导致GydF4y2BaSNRK2.GydF4y2Ba激酶[GydF4y2Ba51GydF4y2Ba］．在目前的研究中，我们发现了其中的四个GydF4y2BaPP2C.GydF4y2Ba基因上调，两个GydF4y2BaSNRK2.GydF4y2Ba基因上调，其中一个已被确认GydF4y2Ba沛富GydF4y2Ba基因在低种子破碎基因型的脱落区上调。我们的结果表明，这些ABA反应基因的相互作用可能是导致种子破碎的原因。GydF4y2Ba

乙烯是一种重要的植物激素，也已知调节花和种子脱落，乙烯生产的升高通常与组织衰老和细胞应力相关[GydF4y2Ba52GydF4y2Ba］．在本研究中，我们发现6个乙烯响应基因（2GydF4y2BaETRGydF4y2Ba基因2GydF4y2BaEIN2.GydF4y2Ba基因和2GydF4y2BaEIN3.GydF4y2Ba基因在低种子破碎基因型的脱落区中进行上调。这些基因的几种同源物已参与衰老GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba和番茄，包括GydF4y2BaETR1GydF4y2Ba[GydF4y2Ba53GydF4y2Ba及其同源基因GydF4y2Baetael.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba54GydF4y2Ba]，GydF4y2Baleetr1.GydF4y2Ba和GydF4y2Baleetr2.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba55GydF4y2Ba]，GydF4y2Ba人队GydF4y2Ba[GydF4y2Ba56GydF4y2Ba那GydF4y2Ba57GydF4y2Ba]， 和GydF4y2BaEIN3 /面纱GydF4y2Ba[GydF4y2Ba58GydF4y2Ba］．乙烯不敏感突变体GydF4y2Barabidopsis etr1GydF4y2Ba显示出花部分脱落的延迟，表明在调节脱落时间的作用。GydF4y2Ba

与乙烯反应一样，许多正常生长素信号传导所需的基因已经被鉴定出来，包括GydF4y2BaAUX / IAA.GydF4y2Ba，小的植物素Up RNA（GydF4y2Ba阿富汗二月GydF4y2Ba），Gretchehagen-3（GydF4y2BaGH3GydF4y2Ba) ［GydF4y2Ba59GydF4y2Ba]. 在本研究中，三个IAA反应基因（1GydF4y2Ba阿富汗二月GydF4y2Ba， 1GydF4y2Ba东盟地区论坛GydF4y2Ba和1GydF4y2BaAUX / IAA.GydF4y2Ba)在低落粒基因型的脱落带中表达上调。在大米中，过度表达GydF4y2Ba阿富汗二月GydF4y2Ba基因导致根系和射击生长和发育的降低，表明它用作养肝合成和运输的负调节剂[GydF4y2Ba60.GydF4y2Ba］．GydF4y2BaGH3GydF4y2Ba，作为IAA浓度的负反馈调节剂，可帮助维持生长素内稳态[GydF4y2Ba61.GydF4y2Ba］．另外，乙烯是蟾蜍蛋白的有效抑制剂，而脱落区的植物素水平显着影响对乙烯的敏感性[GydF4y2Ba32GydF4y2Ba］．乙烯和植物素（IAA）之间的平衡和相互作用可以是调节和确定脱落过程的时序的关键因素。GydF4y2Ba

木质素生物合成相关基因在阿斯利索是假定的种子粉碎基因GydF4y2Ba

木质素是一种复杂的苯丙聚合物，填充细胞壁多糖之间的空间，并赋予细胞壁机械强度[GydF4y2Ba62.GydF4y2Ba］．它被鉴定为细胞壁对消化的重核的主要因素，特别是在酶水解期间[GydF4y2Ba63.GydF4y2Ba］．此前在水稻上的一项研究表明，通过抑制木质素生物合成，即bel1型同源盒基因的过表达，可以诱导水稻的种子落粒GydF4y2BaSH5.GydF4y2Ba在不破碎的“IIpum”品种中，由于脱落区和周围花梗组织中的木质素水平降低，导致种子破碎增加[GydF4y2Ba64.GydF4y2Ba］．在本研究中，抽穗后21天和28天花梗染色表明，XH09的木质素沉积明显低于zhhn03。同时，XH09的BTS值低于zhhn03。这些结果表明，XH09籽粒破碎程度高可能是由于木质素含量降低所致。单酚生物合成至少需要10种酶:苯丙氨酸解氨酶(GydF4y2Ba朋友GydF4y2Ba)，肉桂酸4-羟化酶(GydF4y2BaC4H.GydF4y2Ba)、肉桂醇脱氢酶(GydF4y2Ba计算机辅助设计GydF4y2Ba），肉桂酰基CoA还原酶（GydF4y2BaCCRGydF4y2Ba），咖啡酸/ 5-羟基酸酸GydF4y2BaO.GydF4y2Ba- 甲基转移酶（GydF4y2BaCOMT.GydF4y2Ba)、咖啡酰辅酶a o -甲基转移酶(GydF4y2BaCCOAOMT.GydF4y2Ba)，松柏醛脱氢酶(GydF4y2BaCALDHGydF4y2Ba），GydF4y2BaP.GydF4y2Ba-香豆酸:辅酶a连接酶(GydF4y2Ba4 clGydF4y2Ba），Ferula 5-羟化酶（GydF4y2BaF5HGydF4y2Ba（GydF4y2BaHCT.GydF4y2Ba) ［GydF4y2Ba65.GydF4y2Ba］．通常，抑制在单氯化物生物合成途径的早期基因，例如GydF4y2Ba朋友GydF4y2Ba那GydF4y2BaC4H.GydF4y2Ba那GydF4y2BaHCT.GydF4y2Ba和GydF4y2BaC3'H.GydF4y2Ba，显着降低木质素含量[GydF4y2Ba63.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba66.GydF4y2Ba］．在这项研究中也发现了类似的结果GydF4y2Ba朋友GydF4y2Ba在低种子破碎基因型XH09中，降低调节，木质素含量较低，对应于增加的种子破碎。其他单机生物合成基因的表达水平的变化影响木质素和木质素组合物的量[GydF4y2Ba62.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba67.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba68.GydF4y2Ba］．在本研究中，有两个GydF4y2Ba计算机辅助设计GydF4y2BaXH09基因表达下调。单酰生物合成途径中基因的表达也可以被许多具有MYB DNA结合域的转录因子调控[GydF4y2Ba69.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba70GydF4y2Ba］．我们发现了两个具有MYB样DNA结合结构域的转录因子，其在种子物理成熟时在XH09和ZHN03中不同地表达;一个在ZHN03上调，而另一个是下调的。这些结果表明，这些鉴定的DECs的不同表达模式可能导致木质素含量在脱落区和周围的花梗组织中的差异，这可能影响XH09和ZHN03的种子破碎程度。GydF4y2Ba

种子破碎GydF4y2Ba大肠sibiricusGydF4y2Ba是由在颗粒基部形成的脱落层退化引起的。高落粒基因型XH09在落粒区具有较高的纤维素酶和聚半乳糖醛酸酶活性。在本研究中，共检出3万多枚戊二烯醚GydF4y2Ba大肠sibiricusGydF4y2Ba其中，“XH09-7 vs zhhn03 -7”、“XH09-21 vs zhhn03 -21”和“XH09-28 vs zhhn03 -28”预测了7.470个DETs。GydF4y2Ba．GydF4y2Ba许多参与细胞壁降解酶，木质素生物合成和植物激素（例如亚乙基，制冷素和脱落酸）的基因被差异转录。一些基因的表达（例如，GydF4y2Ba朋友GydF4y2Ba那GydF4y2Ba沛富GydF4y2Ba那GydF4y2BaXIPGydF4y2Ba和GydF4y2BaEGLGydF4y2Ba)与籽粒落粒减少有关，但哪些基因在籽粒落粒差异中起关键作用尚不清楚。这些转录本为进一步检测和发展低粉碎提供了假设GydF4y2Ba大肠sibiricusGydF4y2Ba种质。本研究为种子破碎机制提供了新的洞察力GydF4y2BaE. sibiricus。GydF4y2Ba

AZ：GydF4y2Ba

脱落区GydF4y2Ba

基站：GydF4y2Ba

打破拉伸强度GydF4y2Ba

CE:GydF4y2Ba

纤维素酶GydF4y2Ba

齿轮:GydF4y2Ba

同源群的聚类GydF4y2Ba

长音:GydF4y2Ba

天后标题GydF4y2Ba

DET：GydF4y2Ba

差异表达转录本GydF4y2Ba

罗斯福:GydF4y2Ba

错误发现率GydF4y2Ba

FPKM：GydF4y2Ba

每千级碎片映射每千票次数GydF4y2Ba

去：GydF4y2Ba

基因本体论GydF4y2Ba

Kegg：GydF4y2Ba

京都基因和基因组百科全书GydF4y2Ba

KOG:GydF4y2Ba

真核生物的同源组GydF4y2Ba

ngs：GydF4y2Ba

新一代测序GydF4y2Ba

Nr:GydF4y2Ba

非冗余蛋白质序列GydF4y2Ba

包含了:GydF4y2Ba

蛋白家族GydF4y2Ba

答:GydF4y2Ba

polygalacturonase.GydF4y2Ba

QRT-PCR：GydF4y2Ba

定量实时PCRGydF4y2Ba

QTL：GydF4y2Ba

定量特质基因座GydF4y2Ba

RNA-SEQ：GydF4y2Ba

核糖核酸测序GydF4y2Ba

SNP：GydF4y2Ba

单核苷酸多态性GydF4y2Ba

Swiss-Prot:GydF4y2Ba

注释蛋白质序列数据库GydF4y2Ba

从USDA-FRRL感谢B. Shaun Bushman从USDA-FRRL进行审查，我们还感谢Wenxian Liu进行RNA-SEQ数据分析。GydF4y2Ba

基金GydF4y2Ba

本研究得到了中国国家基础研究计划（973计划）的补助金（2014年3月），中国国家自然科学基金（第3130203号），草原农业生态系统国家重点实验室开放项目计划111计划（B12002），以及中央大学的基本研究资金（Lzujbky-2016-7）。GydF4y2Ba

数据和材料的可用性GydF4y2Ba

NCBI SRA: SRX2617497 (GydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/biosample/6545378GydF4y2Ba)．支持本文结论的其他数据集包含在文章及其附加文件中。GydF4y2Ba

作者的贡献GydF4y2Ba

WX，YW和JZ构思和设计了实验。JZ和ZZ进行了样品收集和种子破碎评估。WX和JZ执行了转录组实验。ZZ和XZ进行了组织学和生理化学实验。WX和JZ分析了数据并起草了稿件。WX，ZZ和YW修订了手稿。所有作者都已经阅读并赞成最终的手稿。GydF4y2Ba

作者的信息GydF4y2Ba

所有作者都与兰州大学牧区农业科学技术学院，兰州，中国兰州大学田园农业科技州的国家重点实验室隶属。GydF4y2Ba

相互竞争的利益GydF4y2Ba

提交人声明他们没有竞争利益。GydF4y2Ba

同意出版物GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

伦理批准和同意参与GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

出版商的注意GydF4y2Ba

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。GydF4y2Ba

作者笔记GydF4y2Ba

隶属关系GydF4y2Ba

1. 兰州大学田园农业科学与技术学院，兰州，兰州兰州农业科学与科技科技重点实验室GydF4y2Ba

   谢文刚，张俊超，赵旭红，张宗宇，王彦荣GydF4y2Ba

相应的作者GydF4y2Ba

对应到GydF4y2BaWengang谢GydF4y2Ba或GydF4y2Ba燕龙王GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

开放获取GydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议(GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/GydF4y2Ba）如果您向原始作者和源给出适当的信用，则允许在任何介质中进行不受限制的使用，分发和再现，提供指向Creative Commons许可证的链接，并指示是否进行了更改。Creative Commons公共领域奉献豁免（GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/GydF4y2Ba)适用于本条中提供的数据，除非另有说明。GydF4y2Ba

再版和权限GydF4y2Ba