黄瓜的功能特性(Cucumis巨大成功l .)进化枝V枣疯病基因

背景

白粉病(PM)引起的真菌是众所周知的病原体，感染超过10,000种植物，包括经济上重要的作物黄瓜(Cucumis巨大成功l .)。进化枝V的功能缺失突变枣疯病基因先前已被证明在一些物种中导致隐性遗传对PM的广谱抗性。在黄瓜中，有一个进化支V枣疯病同族体(CsaMLO8)先前被确定为PM的易感性因素。另外两个密切相关的同系物(CsaMLO1和CsaMLO11)被发现，但它们的功能尚未被揭示。

方法

CsaMLO1和CsaMLO11从黄瓜中克隆出来并在番茄中过度表达枣疯病突变体。这三个的转录丰度CsaMLO采用qRT-PCR和RNA-seq技术，对接种和未接种黄瓜PM真菌的不同组织中基因进行定量分析Podosphaera xanthii。等位基因变异CsaMLO1和CsaMLO11在测序的黄瓜种质中进行了硅筛选。

结果

这三种基因的异源过表达CsaMLO番茄中的基因枣疯病突变体恢复了对PM的易感性粉孢子neolycopersici，尽管程度不同;而过度表达CsaMLO1或CsaMLO8完全恢复易感性，过度表达CsaMLO11只能部分恢复PM敏感性。此外，通过qRT-PCR和RNA-seq观察到CsaMLO8在未接种的黄瓜中表达量显著高于其他两个枣疯病基因。然而，接种p . xanthii导致的上调CsaMLO1，而不是去上调CsaMLO8或CsaMLO11。

结论

这两个CsaMLO1和CsaMLO11是功能性易感基因，尽管我们根据转录物丰度得出结论CsaMLO8可能是主要进化支V枣疯病黄瓜中提供PM易感性的基因。潜在的功能丧失突变CsaMLO1和CsaMLO11还没有被确认。这些突变体的产生和分析是值得进一步研究的有趣课题。

白粉病(PM)，由子囊菌真菌引起白粉菌目是最知名的植物病害之一[1］．PM真菌能够在近10,000种不同的被子植物物种的叶子、茎、花和果实上引起疾病，包括各种经济上重要的植物，如黄瓜(Cucumis巨大成功l .)。黄瓜中的PM可以由两种不同的物种引起，Golovinomyces orontii和Podosphaera xanthii。在温暖地区的温室和露天栽培中，p . xanthii似乎是葫芦中最常见的PM剂，而g . orontii是寒冷地区露天种植瓜类的主要PM种类[2］．

根据基因换基因的概念，植物主要遗传抗性基因(R -基因)，编码识别相应无毒基因产物的R蛋白(Avr的-基因)，引发防御反应[3.，4］．尽管这可以产生强大的、完全的耐药性，但病原体可能会发生突变，失去或使已识别的病原体沉默Avr的基因破坏了这种抵抗力，导致新的毒力强的病原体，往往在几年内引入新的商业病原体R基因。克隆R在几种植物物种中的基因导致发现它们通常编码具有富含亮氨酸重复序列(LRR)结构域的各种受体蛋白[3.］．的例外R-基因介导的抗性是在20世纪40年代在x射线照射下的夏大麦群体中发现的[5］．观察到一种隐性遗传单基因抗性，该抗性对所有已知的大麦PM分离株都有活性Blumeria茎f . sp。hordei）.后来，在不同的大麦基因型中获得了相同基因座的其他等位基因，包括在抗性埃塞俄比亚大麦地方品种中发现的自然发生的突变等位基因[6］．这种所谓的耐久性枣疯病（发霉位点O)抗性的例证是，自20世纪80年代以来，具有这种抗性的品种被广泛栽培，而没有新的病原体品种打破这种抗性[7］．通过定位克隆，找到了致病基因枣疯病基电阻被隔离[8］．它被发现编码有7个跨膜螺旋的质膜锚定蛋白，让人想起动物g蛋白偶联受体[9］．

大麦过后枣疯病克隆该基因后，发现该基因在其他植物物种中的同源突变也可导致对不同PM致病真菌的隐性遗传抗性。在模式物种中拟南芥三种T-DNA插入突变枣疯病同源物有助于抗PM，尽管三种基因中的一种发生突变(AtMLO2)的影响比其他两种基因(AtMLO6和AtMLO12）.功能丧失的影响AtMLO6或AtMLO12是唯一的加法Atmlo2背景，但检测不到的时候AtMLO2完好无损[10］．在一些作物品种中，例如番茄[11]，豌豆[12]，黄瓜[13]和烟草[14与大麦相比，隐性遗传的PM抗性具有相似的特征枣疯病抗药性确实是由自然发生的突变引起的枣疯病同源染色体。在其他物种中，如胡椒、小麦、苹果和葡萄藤，被击倒枣疯病病毒诱导基因沉默(VIGS)或RNA干扰(RNAi)的同源物导致PM耐药[15- - - - - -18］．这表明枣疯病基于基因的抗性在植物中非常普遍，而不是大麦中出现的特殊现象。事实证明枣疯病。基于抗性取决于植物细胞直接在PM渗透尝试下形成的细胞壁沉积(乳头状物)[19］．的分子基础枣疯病然而，基于耐药的耐药性尚不清楚，尽管已经表明它取决于几种分子成分的功能，例如在控制程序性细胞死亡中起作用的bax抑制剂蛋白(BI-1) [20.];在完整的肌动蛋白细胞骨架上[21]和t-SNARE蛋白PEN1 (拟南芥)和ROR2(大麦)参与靶向胞吐[22］．

自2000年第一个植物基因组序列发表以来，即模式植物基因组序列拟南芥［23]，越来越多的植物基因组被测序。在所有已测序的植物基因组中枣疯病同源物出现在中等大小的基因家族中，有7到39个枣疯病每个植物物种的基因数目[24］．的系统发育分析枣疯病基因家族，已经发现枣疯病基因可分为七个系统发育支系，但并非所有植物物种都有所有支系的代表[25］．苔藓是陆地植物中最基础的分支枣疯病在植物的其他谱系中，特别是在被子植物物种中，同源物只有一个分支，即分支i枣疯病基因家族已经多样化。然而，一些植物物种显然失去了一些基因枣疯病进化过程中的分支，如禾科的单子叶植物科，它没有枣疯病分支V和VI的同源物，或几个双子叶的种，如拟南芥以及失去了进化枝IV的番茄枣疯病同系物，即使是基部被子植物物种，Amborella trichopoda,具有I至VI枝的同源物[25］．

不是所有的枣疯病迄今为止发现的基因已被定性为对PM真菌易感性所必需的。对于大多数枣疯病基因突变表型尚未被描述，尽管有进化支I的例子枣疯病具有根形成缺陷的突变体[26]和进化支III枣疯病花粉管感知缺陷突变体[27]和花粉水合作用[28］．到目前为止枣疯病已发现与PM易感性相关的基因(即易感基因，s基因)可归类于进化支IV(单子叶种)或进化支V(双子叶种)。结果表明，大麦进化枝IV的异源过表达枣疯病基因可以功能性地补充进化枝V的功能突变缺失枣疯病番茄的基因[29]，说明尽管进化枝IV和V MLO蛋白在氨基酸序列上存在显著差异，但它们在功能上是保守的。

在黄瓜中，其基因组序列于2009年发表[30.), 13枣疯病同源物先前已被确定。在这13个同源基因中，有3个基因在进化枝v中被发现在系统发育上分组CsaMLO1，CsaMLO8和CsaMLO11，因此应考虑为黄瓜中潜在的PM s基因[31］．其他瓜类作物，例如甜瓜(Cucumis梅洛)、西瓜(Citrullus lanatus)和南瓜(Cucurbita浆果)，进化枝V的数量相似枣疯病虽然南瓜有四个而不是三个进化支V，但已经鉴定出了这些基因枣疯病基因(32］．系统发育分析表明，这些瓜类作物的最后共同祖先已经至少有三个进化枝V枣疯病基因。

在三个黄瓜分支中，V枣疯病的基因,CsaMLO8已被证明是PM的易感基因，由p . xanthii。从黄瓜基因型中隐性遗传抗PM是自然的Csamlo8克隆突变等位基因[13，33］．而野生型的异源过表达CsaMLO8能在功能上互补吗枣疯病两个番茄的功能缺失突变体[13),拟南芥［33]，突变等位基因未能恢复易感性。基因突变Csamlo8是由基因编码序列中反转录转座元件的整合引起的[13，34］．该突变等位基因在栽培黄瓜种质中经常出现[13]，另外还有两个Csamlo8在耐药基因型中发现了功能丧失突变，原因可能是一个移码indel导致提前终止密码子，或者是一个内含子-外显子连接处的SNP导致前mrna的异常剪接[33］．

黄瓜共定位研究综述枣疯病具有PM抗性qtl的基因，Schouten等。[31]提到了两个先前描述的PM抗性qtl与其他两个黄瓜进化枝V共定位枣疯病的基因,CsaMLO1和CsaMLO11。Fukino等。[35对抗PM基因型CS-PMR1(来自抗PM野生黄瓜品种PI 197088的自交系)和中等易感基因型桑头(日本本土品种)杂交的RIL群体进行了QTL分析。在9个检测到的PM抗性QTL中，1个QTL (pm1.1共定位于CsaMLO1，而另一个QTL (pm6.1共定位于CsaMLO11。与之相关的阻力pm1.1是由CS-PMR1等位基因贡献的，而Santou等位基因贡献了pm6.1轨迹。

本文报道了两个黄瓜进化枝V的功能特征枣疯病的基因,CsaMLO1和CsaMLO11。我们证明了这两种基因在番茄中的异源过表达枣疯病突变体导致对PM敏感性的恢复。此外，我们还研究了三个黄瓜进化枝V的转录谱枣疯病在接种PM引起真菌之前和之后，不同组织中的基因p . xanthii。此外，我们在计算机上筛选了115个经过重测序的黄瓜材料，以寻找在进化枝V中可能丢失的功能突变枣疯病并对另外两种黄瓜基因型进行了重测序，其中两种基因型均含有已报道的抗PM qtlCsaMLO1或CsaMLO11。

黄瓜V枝的功能分析枣疯病基因通过番茄的互补枣疯病突变体

我们放大了进化支V枣疯病基因CsaMLO1(Csa1M085890)和CsaMLO11[Csa6M292430]来自黄瓜自交系的cDNA。PCR产物符合预期大小(分别为1.749 bp和1.782 bp)，序列与PM易感基因型“Chinese Long 9930”的参考基因组相同[30.］．为了测试这些基因是否是易感基因，CsaMLO1和CsaMLO11在番茄中过度表达枣疯病突变体，它对PM具有抗性，这是由于基因突变SlMLO1基因(11］．这是预料之中的CsaMLO1和/或CsaMLO11易感基因在番茄中过度表达吗枣疯病突变体可以恢复对PM的敏感性。经过改造后，从八根(CsaMLO1)或七(CsaMLO11)获得个体变形子并接种粉孢子neolycopersici番茄中PM的致病因子。8株中有5株产孢CsaMLO1变形金刚和七个中的两个CsaMLO11转化株(表1）.

以确认能力CsaMLO1和CsaMLO11为了恢复PM敏感性，通过自花授粉获得T2家族。T2家族从每个基因的两个个体转化体中获得。此外，从先前描述中获得了两个T2家族CsaMLO8[Csa5M623470]过表达转化子[13］．每个T2科播种22 ~ 30株。通过PCR筛选存在过表达构建体的植株。得到的T2居群CsaMLO1和CsaMLO11存在转基因的转化子以接近3:1的比例分离，这表明每个初级转化子有一个转基因插入位点。从(两者)得到的T2种群CsaMLO8转化体表现出倾斜的分离模式，22个个体中有1个(T2-A)或30个个体中有1个(T2-B)没有转基因，这表明每个个体转化中有多个插入。

T2家族接种o . neolycopersici按0 - 3分对PM症状进行评分，0分为完全无PM症状，3分为完全感染。的非转换slmlo1突变体没有表现出任何PM症状(即所有植株的疾病指数均为0)，而在易感对照(Moneymaker)中，75%的植株的最大疾病指数为3,25%的植株的疾病指数为2(图2)。1）.整体分析显示各组之间存在显著差异(Kruskal-Wallis测试，P< 0.05)。Stepdown post hoc分析显示CsaMLO8或CsaMLO1敏感性完全恢复，导致敏感性水平与Moneymaker (P> 0.05)。然而，过度表达CsaMLO11仅部分恢复易感，疾病指数在0 ~ 1之间，显著高于抗性对照slmlo1（P< 0.05)，但显著低于敏感对照(P< 0.05)。

每个科随机选择5株(存在过表达构建体阳性)，使用qRT-PCR测量转基因的表达(附加文件)1）.结果表明，这两种基因均有表达CsaMLO8T2家族明显高于CsaMLO1T2-A族和两个CsaMLO11T2家族(Bonferroni事后检验的方差分析)P< 0.05)，而两组间的转基因表达量无显著差异CsaMLO1和CsaMLO11T2家族(Bonferroni事后检验的方差分析)P> 0.05)。的CsaMLO1与其他T2家族相比，T2- b家族的转基因表达没有显著差异(Bonferroni事后检验的方差分析)。P> 0.05)。在易感的(未转化的)Moneymaker或耐药中未检测到转基因表达枣疯病控制植物。

黄瓜V进化枝转录物丰度分析枣疯病基因

黄瓜V进化枝的相对转录物丰度枣疯病基因CsaMLO1，CsaMLO8和CsaMLO11采用qRT-PCR技术对敏感黄瓜品种希拉(Sheila)的三个不同组织(下胚轴、子叶和叶片)进行了检测。结果发现，在三种组织中，转录本的丰度均为CsaMLO8几个数量级比几个数量级高吗CsaMLO1和CsaMLO11(无花果。2)，发现有统计学意义的差异(Bonferroni事后检验的方差分析，P< 0.05)。为了证实这一点，我们重新检查了先前获得的数据集，该数据集包括从参考品种“中国龙9930”的多种黄瓜组织中获得的RNA-seq数据。结果表明，在所有被检测的空气组织(下胚轴、茎、子叶、叶和果实组织)中，CsaMLO8是否有更高的表达(平均约10倍)CsaMLO1或CsaMLO11，尽管在茎组织中CsaMLO1似乎也表达得非常强烈。对于可获得多个生物重复数据的空中组织(叶片和果实组织)，发现观察到的表达差异具有统计学意义(Bonferroni事后检验的方差分析)。P< 0.05)。然而，在根和根尖组织中，两者都有CsaMLO1和CsaMLO11是高度表达的，而CsaMLO8低表达(图2)2 b)，尽管这种差异没有统计学意义(方差分析，P> 0.05)。为了比较，我们还检查了答:芥进化枝V枣疯病基因(AtMLO2，AtMLO6和AtMLO12)的公开RNA-seq数据集答:芥组织(36］．我们发现AtMLO2表达量远高于AtMLO6或AtMLO12在所有四个样本组织(根、叶、花和果实)中表达，尽管根中的差异小于其他组织(附加文件)2）.

随后，我们研究了该基因在黄瓜组织中的表达谱p . xanthii。分别在接种前、接种后4、6、8和24 h采集黄瓜下胚轴、子叶和叶片组织。的相对表达CsaMLO1，CsaMLO8和CsaMLO11采用qRT-PCR法测定样品的含量(图2)。3.）.我们发现在叶片组织中存在显著差异CsaMLO1时间点间转录丰度(方差分析，P< 0.05)。接种后4、6、8 hCsaMLO1转录物丰度显著高于接种前的转录物丰度(Bonferroni事后检验，P< 0.05)。这种归纳CsaMLO1在接种24 h后不再显著(Bonferroni事后检验，P> 0.05)。CsaMLO11与接种前的转录物丰度相比，在接种后4小时显著下调(Bonferroni事后检验方差分析)。P< 0.05)。在子叶和下胚轴组织方面，进化枝V无显著差异枣疯病任何时间点之间的基因转录丰度(方差分析，P> 0.05)。

由于这些结果与[13),CsaMLO8在接种PM前和接种后4、6、8、12和24 h的黄瓜下胚轴和叶片组织中分别进行独立重复实验。的相对表达CsaMLO8使用qRT-PCR(附加文件3.）.无显著差异CsaMLO8与接种前的转录物丰度相比，在任何时间点观察到转录物丰度(方差分析，P> 0.05)。

黄瓜测序种质潜力筛选CsaMLO1或CsaMLO11突变体

我们预计如果CsaMLO1和CsaMLO11在黄瓜中，如果这些基因的功能缺失突变导致抗性，就会在黄瓜种质中被选择。如Qi等人发表的115个不同黄瓜基因型重测序数据[37，我们决定对这些数据进行筛选，以寻找两者中潜在的功能丧失突变CsaMLO1或CsaMLO11。115个品系中检测到的snp和indel的完整列表可从葫芦基因组数据库下载[38]，并对染色体位置进行筛选CsaMLO1和CsaMLO11。附加文件4和5给出所有检测到的snp和索引的概述CsaMLO1和CsaMLO11地区,分别。snp /indel列表是人工整理的，以获得基因编码区域的变异，对预测的氨基酸序列有影响。为CsaMLO11我们没有观察到对预测蛋白有影响的snp或indels。为CsaMLO1发现3个snp(未发现indel)对预测的氨基酸序列有影响(表2)2）.第一个取代(V170G)位于一个氨基酸残基上，该氨基酸残基在其他进化支V MLO蛋白中被保守为缬氨酸、异亮氨酸或亮氨酸，并已被证明具有易感基因的功能(附加文件)6）.另外两个检测到的替换(V472I和V557I)位于非保守区域。

黄瓜基因型CS-PMR1和桑头重测序寻找潜力CsaMLO1或CsaMLO11突变体

如前所述，先前报道的两个PM抗性qtl与基因组位置共定位CsaMLO1和CsaMLO11［31]，我们假设这些抗性的来源可能有突变的等位基因CsaMLO1和/或CsaMLO11，是观察到的电阻的原因。为了验证这一假设，我们从基因型CS-PMR1和cv的叶片中分离出DNA。桑头，用于QTL分析的亲本基因型[35]，并进行全基因组测序(WGS)。我们将获得的reads与参考基因组(Chinese long 9930 [30.])，并在基因组区域中鉴定出snp和小索引CsaMLO1和CsaMLO11(附加文件7，8和9）.的基因组区域CsaMLO1我们在CS-PMR1中鉴定了23个snp和索引，在Santou中鉴定了4个snp和索引，但这些都没有影响预测的编码蛋白。同样，我们在基因组区域鉴定了23个snp和索引CsaMLO11在CS-PMR1基因中，这两种基因对预测的编码蛋白都没有影响。的CsaMLO11发现桑头的序列与参考基因组的序列相同。

除了调用snp和索引外，我们还在基因型CS-PMR1中鉴定了两个区域，在内含子6CsaMLO1的内含子12CsaMLO11分别观察到本地低读取覆盖率，以及插入大小偏离平均值的侧翼读取对，或者读取对中的一个伴侣无法被映射(附加文件)7和8）.由于这可能预示着更大的结构变化，而这些变化很难用短读测序来表征，我们从CS-PMR1的DNA中扩增出这些区域，并通过Sanger测序对PCR产物进行测序。与参考基因组相比，该基因的内含子6缺失了10 bp，插入了23 bpCsaMLO1(附加文件10A)，并且在的第12内含子有231 bp的缺失CsaMLO11(附加文件10D)在CS-PMR1基因型中发现。为了验证这些大的索引是否存在于CsaMLO1的内含子12CsaMLO11我们也从CS-PMR1和Santou的cDNA中对相应区域进行了PCR扩增和测序，发现两者的PCR产物大小和序列没有明显差异CsaMLO1(附加文件10c)或CsaMLO11(附加文件10E-F)。

正如我们预期的那样，桑头基因型和CS-PMR1基因型的耐药也可能是由基因型的差异引起的CsaMLO1或CsaMLO11表达而不是编码蛋白序列的差异，我们确定了相对转录物丰度CsaMLO1和CsaMLO11以易感基因型Sheila为对照，对两种基因型的叶片组织进行qRT-PCR检测11）.虽然发现CS-PMR1中这两个基因的相对转录丰度略高于其他两个基因型，但发现这些差异在统计学上都不显著CsaMLO1(方差分析,P= 0.156)或CsaMLO11(方差分析,P= 0.239)。

所有三个黄瓜枝V MLO基因的过表达恢复了番茄对PM的敏感性枣疯病突变体

以前，已经证明对PM的易感性丧失导致真菌由于突变枣疯病基因可以通过功能性过表达而恢复枣疯病基因，通过克隆和枣疯病来自同一种植物的易感个体的基因[10- - - - - -12]以及V枝的异源表达枣疯病其他双科植物的基因[13，15，39]，甚至通过IV支系的异源表达枣疯病单子叶植物的基因[29］．这表明尽管MLO蛋白之间的氨基酸序列存在较大差异，但它们在植物物种之间具有功能保守性。这使我们能够研究黄瓜进化枝V的功能枣疯病基因在番茄中的异源表达slmlo1突变体的背景。我们已经证明了三个分支V的过表达CsaMLO基因恢复了对o . neolycopersici在番茄中，PM引起真菌，尽管程度不同。过度表达CsaMLO1或CsaMLO8导致PM敏感性完全恢复到野生型水平。过度的CsaMLO11另一方面只能部分弥补损失SlMLO1函数(无花果。1）.这表明，至少在某种程度上，这三个基因在功能上是保守的。

过度的CsaMLO11与另一种相比，在恢复PM敏感性方面似乎效率较低CsaMLO基因(图。1）.虽然这三个基因编码的蛋白质并不完全相同，但它们彼此之间以及与进化枝V高度相似枣疯病其他物种的基因(附加文件)6）.似乎很难将…的低效率归因于CsaMLO11与另一个相比CsaMLO基因恢复PM对特定氨基酸序列差异的易感性。

CsaMLO8主支是V支吗枣疯病在空气组织中的基因，而CsaMLO1和CsaMLO11主要的进化支V基因在根中吗

易感基因的定义是那些促进感染和支持与植物病原体相容的基因[40］．在枣疯病基因家族中，来自进化支IV(单子叶植物种)和V(双子叶植物种)的同源物已被发现是易感基因[24］．然而，并不是所有的进化枝V枣疯病在所有双子叶植物物种中都发现了s基因。例如，在grapevine (葡萄)，发现有四个进化支V枣疯病基因。让其中一人噤声(VvMLO7)通过RNAi构建物转化导致PM抗性增加，而其他两个同源物的沉默只会增加抗性VvMLO7已经沉默了。第四个同源物的沉默对抵抗完全没有帮助[16］．这种不平等的基因冗余先前也在拟南芥只有一个专业枣疯病e基因(AtMLO2)和两个次要的枣疯病S -基因(10];在番茄里，用一个专业枣疯病e基因(SlMLO1)，二小调枣疯病s基因和一个进化枝V枣疯病似乎在PM易感性中不起作用的同源物[41］．

我们已经证明，使用qRT-PCR数据(图2)。2)和RNA-seq数据(图2)。2 b)，在空中黄瓜组织(下胚轴、茎、子叶、叶和果实组织)中CsaMLO8是否比其他黄瓜枝高几倍的表达量枣疯病的基因,CsaMLO1和CsaMLO11。这让人想起郑等人在番茄上的发现。[41他的研究表明，主要进化支V枣疯病的基因,SlMLO1在没有PM的情况下，其表达量明显高于其他V进化支同源物。有趣的是，他们发现沉默SlMLO1通过用RNAi结构体转化导致获得抗性，而另一种则沉默枣疯病同系物则没有。的确，天生的slmlo1功能丧失突变体先前被描述为对PM具有抗性[11]，尽管另一个分支V枣疯病基因大概仍然完好无损。此外，我们已经在一个公开可用的拟南芥RNA-seq数据集1进化支V枣疯病同族体,AtMLO2的表达量比其他V进化支同源物高得多，AtMLO6和AtMLO12(附加文件2）.先前已经证明，功能丧失突变在AtMLO2，但不是。AtMLO6或AtMLO12导致(部分)抗PM，虽然加倍AtMLO2/6或AtMLO2/12和三倍AtMLO2/6/12突变体表现出更高的抗性[10］．

最近，研究人员研究了枣疯病基因来自于大量的组织拟南芥而大米，基于微阵列数据42］．这里给出的数据是拟南芥枣疯病基因与我们的发现一致(附加文件)2)，因为他们报告说在大多数组织中枣疯病e基因AtMLO2比其他两个进化支V枣疯病基因(42］．水稻有两个进化支IV枣疯病的基因,OsMLO3和OsMLO6［25]，在大多数水稻组织中发现OsMLO3转录率远高于OsMLO6转录(42］．基于这一发现，作者得出结论OsMLO3很可能是主要的第四支枣疯病在米，而不是OsMLO6。

综上所述，这表明功能丧失突变在表达最丰富的基因中枣疯病与表达较少的基因的功能丧失突变相比，基因有很大的影响。这意味着在黄瓜中，CsaMLO8会是主要的进化支V枣疯病与PM易感性有关的基因，在功能上与例如。SlMLO1西红柿和AtMLO2在拟南芥。我们假设不同进化枝V之间的转录效率差异枣疯病一个物种的基因是观察到的不平等遗传冗余的主要原因，并表征相对转录丰度的进化枝V枣疯病一个物种的基因可能有助于识别主要物种枣疯病关于易感性的基因。据我们所知，这两个国家都没有尝试过拟南芥或番茄来表达次要分支V枣疯病基因在强组成启动子下。根据我们的研究结果，我们可以预期例如。AtMLO6或AtMLO12在Atmlo2如果是转录物丰度而不是氨基酸序列的差异决定了V枣疯病s基因是主要的s基因。

相反，RNA-seq结果显示CsaMLO1和CsaMLO11在根组织中高度表达，而CsaMLO8不是(图2)1 b）.有趣的是，这三个拟南芥进化枝V枣疯病基因也被发现在根组织中高度表达(附加文件)2）.由于PM引起的真菌是叶面病原菌，不感染根，因此一些分支V枣疯病黄瓜和黄瓜的基因拟南芥在根中高度表达的基因可能不会对植物与PM真菌的相互作用产生太大影响。然而，我们应该注意到，很可能CsaMLO1和CsaMLO11在黄瓜根中发挥重要但未知的作用。

功能丧失突变HvMLO大麦和AtMLO2/AtMLO6在拟南芥导致易感性增加，易受坏死性和半营养性致病菌如叶斑病所引起Bipolaris sorokiniana［43稻瘟病对大麦造成的稻瘟病菌［44]、叶斑病引起的链格孢属引起的晚疫病5种［10］．这表明枣疯病-基因在某些情况下有助于抵抗坏死性和半生物营养性病原体，而不是作为(生物营养性)PM引起真菌的易感基因。因此，研究功能丧失突变对根表达的影响可能是有趣的CsaMLO1和CsaMLO11研究了黄瓜枯萎病等土壤传播的黄瓜坏死性病原菌与枯萎病的相互作用尖孢镰刀菌f . sp。法测定或由坏死性卵菌引起的根腐病腐霉属此外，众所周知，大麦枣疯病互生的丛枝菌根真菌对突变体的定殖效率较低[45，看到……的效果也会很有趣CsaMLO1和CsaMLO11黄瓜与丛枝菌根真菌相互作用的功能丧失突变。

CsaMLO1接种PM诱导表达CsaMLO8和CsaMLO11不

在一些植物物种中，已经证明枣疯病在接种PM引起的真菌(如[46- - - - - -48])，可能是由于真菌主动上调这些基因的表达以诱导易感性。之前的报道是基于RNA-seq数据p . xanthii接种过的黄瓜叶片CsaMLO1，但不是CsaMLO8或CsaMLO11在接种后叶片中表达量上调，接种后8 h表达量上调约3.5倍[31］．数字3 c证实了这一发现，因为我们发现显著(约四倍)的上调CsaMLO1接种后4、6和8 h叶片表达量P。xanthii。的上调枣疯病由于接种PM引起的真菌引起的基因表达通常被认为是作为易感基因作用的推定证据，有人可能会认为这表明CsaMLO1是功能性易感基因吗CsaMLO8或CsaMLO11不是。然而，我们想指出的是，即使CsaMLO1相对于接种前的表达，接种PM后叶片中的表达被显著诱导(图2)。3 c的表达CsaMLO1接种前比接种前低得多CsaMLO8其本构高表达(图2)。2)，因此，即使接种后，转录物丰度CsaMLO8还是比的高CsaMLO1。

以前我们观察到黄瓜接种p . xanthii导致的上调CsaMLO8在下胚轴组织中，但不在叶或子叶中[13］．令我们惊讶的是，我们无法在这里描述的实验中重现这一结果，即使使用相同的黄瓜基因型，p . xanthii使用相同的qRT-PCR引物和接种方案(图2)。3）.尽管我们确实观察到一个小的CsaMLO8下胚轴在接种后4和6 h的表达量差异CsaMLO8不同时间点间下胚轴组织的转录物丰度远不显著(方差分析，P= 0.389)。值得注意的是，在不同的生物复制之间，转录本丰度的差异是相当高的，无论是在我们这里描述的实验中，还是在我们之前发表的结果中。由于目前的实验样本量更大(每个时间点有4 - 8个独立的生物重复，而不是[13])，并重复了类似的结果(附加文件3.)，我们得出的结论是CsaMLO8在下胚轴组织中[13可能是由于生物复制数量少而造成的人工产物。

我们之前描述了一个功能缺失的等位基因CsaMLO8导致对PM的下胚轴特异性抗性，在叶组织中有部分抗性，并将这种组织特异性归因于假定的组织特异性上调CsaMLO8［13］．现在我们已经证明了这一点CsaMLO8实际上在下胚轴组织中并没有上调，我们必须对观察到的组织特异性提出不同的解释Csamlo8的阻力。从这个意义上说，值得注意的是CsaMLO1基础表达非常低(图2)。2)，而在叶片组织中接种PM诱导，而在下胚轴组织中不诱导(图2)。3.）.假设两者CsaMLO1和CsaMLO8功能易感基因，我们可以假设Csamlo8功能缺失突变体，表达功能CsaMLO1，几乎没有任何泛函的表达式枣疯病易感基因在下胚轴组织中表达，而诱导表达CsaMLO1在叶组织中，导致下胚轴组织完全抗性，而在叶组织中仅部分抗性。如果这是真的，那就是双精度Csamlo1/Csamlo8功能缺失突变体预计在叶片和下胚轴组织中都具有完全的抗性。

没有假定的功能丧失CsaMLO1或CsaMLO11突变体可以在重测序的黄瓜种质中鉴定出来

由于功能易感基因的功能丧失突变可导致持久抗性[40]，获得V进化支突变的黄瓜品系是值得的枣疯病基因。它以前已经描述了一个自然突变的等位基因CsaMLO8，由插入反转录转座元件引起，导致对p . xanthii。这种突变等位基因在育种材料中出现的频率相当高，可能是因为它对抗PM的有益作用[13］．此外，还有其他几个突变等位基因CsaMLO8抗性黄瓜基因型[33］．因此，我们有理由假设，如果功能丧失的突变发生在CsaMLO1和/或CsaMLO11对抗PM有贡献，在黄瓜育种中也会被选择。因此，我们决定筛选一个公开的115个黄瓜基因型的snp和索引数据集[37的编码区假定的功能缺失等位基因CsaMLO1和CsaMLO11(附加文件4和5）.我们没有发现任何证据表明变异等位基因对其中任何一个基因的氨基酸序列有很大的影响(例如，一个SNP导致获得一个早期终止密码子或一个移码indel)，尽管我们在基因组中观察到三个SNPCsaMLO1导致氨基酸取代(表1)2）.在这三个snp中，有两个被预测会导致从缬氨酸到异亮氨酸的氨基酸替换，这两个氨基酸残基具有非常相似的物理化学性质。此外，这些氨基酸残基位于CsaMLO1蛋白的c端结构域，与其他进化枝V MLO蛋白相比，该区域并不保守6）.第三个SNP被预测导致第170个氨基酸残基(缬氨酸)被替换为甘氨酸残基，在其他进化枝V MLO蛋白中保守为缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸的位置(附加文件)6）.由于甘氨酸和缬氨酸都是相对较小的脂肪族非极性氨基酸，这种取代可以被认为是相当保守的突变。如果没有进一步的证据，这个SNP似乎不太可能代表一个功能缺失的等位基因CsaMLO1。总之，我们没有在这个数据集中找到强有力的证据证明可能的功能缺失等位基因CsaMLO1和/或CsaMLO11尽管应该注意的是，通过关注SNPs和indel，我们可能忽略了通过短读重测序难以找到的突变等位基因，例如在CsaMLO8这可能对基因的功能产生深远的影响。

另一种方法是试图识别可能的突变等位基因CsaMLO1或CsaMLO11我们对另外两个黄瓜基因型CS-PMR1和cv进行了重测序。之前提到的具有PM抗性qtl的三头猪，与三头猪的基因组位置共定位CsaMLO1和CsaMLO11［31，35］．虽然我们发现了几个snp, indels和结构变异CsaMLO1和CsaMLO11这些基因位点，特别是在更耐PM的基因型CS-PMR1中，预计都不会导致编码的CsaMLO1或CsaMLO11蛋白的任何变化(附加文件)7，8，9和10）.此外，我们验证了转录本的丰度是否为CsaMLO1和CsaMLO11在这些黄瓜基因型之间存在差异(附加文件11)，但我们认为它们之间没有显著差异。因此，我们认为Fukino等人观察到的耐药性[35可能是由其他基因引起的，而不是CsaMLO1或CsaMLO11。

事实上，我们无法找到令人信服的功能丧失等位基因CsaMLO1或CsaMLO11在不同的黄瓜基因型中，这意味着这些基因中的任何一个的功能丧失突变显然都没有在黄瓜育种中被选择。对这一发现的一种解释可能是Csamlo1和Csamlo11基因敲除突变可能仅对菌株的PM抗性产生很小的加性影响Csamlo8变种人的背景，对CsaMLO8背景，可比性的情况在拟南芥［10］．此外，也有可能在CsaMLO1和CsaMLO11对植物适应度有多效效应，因此被选择反对。

在我们看来，研究基因突变的影响是很有趣的CsaMLO1和CsaMLO11例如，通过使用日益流行的CRISPR-Cas9技术进行靶向突变[49，比如已经在面包上做过的小麦TaMLO-A1基因(50］．这可能会在黄瓜中产生一种新的、持久的抗PM源，特别是当与已有的抗PM源结合使用时Csamlo8部分电阻[13］．

在本研究中，我们分析了黄瓜进化枝V的作用枣疯病对PM易感性的基因。我们通过黄瓜的异源过表达证明了这一点枣疯病基因CsaMLO1，CsaMLO8和CsaMLO11这三个基因都能恢复易感性枣疯病番茄虽有功效CsaMLO11过表达较弱CsaMLO1或CsaMLO8超表达。此外，我们还研究了这些基因在接种和未接种PM真菌的黄瓜不同组织中的转录水平。p . xanthii表明CsaMLO8是否比CsaMLO1和CsaMLO11但是在所有的空中组织中CsaMLO1叶片中的表达是通过接种p . xanthii。我们会讨论这个CsaMLO8因此很可能是主要进化支V枣疯病黄瓜中与PM易感性有关的基因，可能对CsaMLO1和CsaMLO11，与早期的研究结果相当枣疯病基因在拟南芥和番茄。然而，在根上，CsaMLO1和CsaMLO11这可能与黄瓜与根系病原菌或有益微生物的相互作用有关。两者都没有潜在的自然功能丧失突变CsaMLO1或CsaMLO11已经被发现了。生成它会很有趣Csamlo1和Csamlo11例如，通过CRISPR-Cas9技术，来研究这些突变是否对PM抗性有额外的影响Csamlo8。

克隆CsaMLO1和CsaMLO11

黄瓜纯合子育种系是由黄瓜的亲本系衍生而来的。Anaxo是在荷兰瓦赫宁根的一个温室里种植的。生长条件为20°C(白天)和16°C(夜间)，昼夜循环16 h/8 h，相对湿度70%。按照之前的描述进行RNA分离和cDNA合成[13］．

的编码序列CsaMLO1引物为5’-caccTTCCTTCCACACCCCTAAGA-3’(正向)和5’-TGAATGGTGTAAACGAGATTGC-3’(反向)。以50 ng cDNA为模板，利用Advantage 2聚合酶(Takara Bio, usa)进行50 μl反应。循环条件为:95℃下初始变性1 min, 95℃下变性30 s, 68℃下退火延伸3 min，循环35次。在68°C下孵育3分钟，反应结束。随后将PCR产物稀释100倍，并使用Phusion高保真聚合酶(ThermoFisher Scientific, usa)作为模板进行50 μl的反应。循环条件为:98℃下初始变性30 s, 98℃下变性20 s, 55℃下退火30 s, 72℃下延伸30 s，循环25次。在72°C下孵育10分钟，反应结束。

的编码序列CsaMLO11由cDNA扩增而来，如前所述[13]，使用引物5 ' -caccTTTGTTTCCCTACGCGTTCT-3 '(正向)和5 ' -TATACCAACCCCCAACCTCA-3 '(反向)。

克隆CsaMLO1和CsaMLO11PCR产物通过gateway兼容载体pENTR/D-TOPO (ThermoFisher Scientific, usa)转化为二元载体pK7WG2，其中含有组成活性的35S花菜花叶病毒启动子和nptII卡那霉素耐药选择性标记基因[51]，如前所述[13］．

互补的ol-2黄瓜番茄枣疯病基因

的子叶外植体ol-2用CsaMLO1和CsaMLO11如前所述的过表达结构[13］．的ol-2突变体携带功能丧失突变SlMLO1基因(11］．用与克隆番茄所用的引物相同的PCR方法对获得的番茄转化体进行转基因鉴定CsaMLO1和CsaMLO11(见上文)和nptII引物标记基因5 ' -GAAGGGACTGGCTGCTATTG-3 ' (nptII5 ' -AATATCACGGGTAGCCAACG-3 ' (nptII反向)。对于具有不同构造的两个转换中的每一个，七个(CsaMLO11)或八(CsaMLO1)的独立转基因植株，利用特异性引物对进行qRT-PCR的转基因表达评估CsaMLO1: 5 ' -tgaaagtttccggcggagtt-3 ' (CsaMLO1 -5 ' -AGGAAGCTTTACCCTTGGCG-3 ' (CsaMLO1 -(反向)或特定于CsaMLO11: 5 ' - gcgacggcgttgagaattg -3 ' (CsaMLO11 -5 ' -GGGTGACAAGTGGTGGGAGG-3 ' (CsaMLO11 -反向)。作为归一化的管家基因CsaMLO1或CsaMLO11用番茄表达，通过-α引物对为5 ' -ATTGGAAACGGATATGCCCCT-3 ' (SlEF-α正向)和5 ' -TCCTTACCTGAACGCCTGTCA-3 ' (SlEF-α反向)。按照前面的描述进行qRT-PCR [13］．

耐PM的评价CsaMLOoverexpressingol-2番茄

从每一个单独的变换CsaMLO1和CsaMLO11overexpressingol-2植株，两根插条接种一株粉孢子neolycopersici如前所述，在荷兰瓦赫宁根的一个气候室中，在易受影响的番茄植株上维持[13］．

对于每个过表达构建的两个T1转化个体，收获自花授粉植物的种子。原则上选择转基因表达最高的T1转化子作为T2家族的代，尽管作为T2家族的代CsaMLO11表达量最高的转化体不产生活籽，随机选择另一个有足够活籽的T1转化体。另外，两种种子自花授粉CsaMLO8[13收获了。将6个T2科各22 ~ 30粒种子播撒在土壤上，测定植株中是否存在细菌nptII如上所述的PCR标记基因。作为感感对照，播下了12粒“造钱者”种子。作为抗性对照，选用12个抗性突变系种子ol-2，为补充所使用的背景。对T2家族的5株植株和5株感病对照和抗性对照，采集叶片样品并立即在液氮中冷冻。利用上述引物和条件，采用qRT-PCR方法测定转基因在这些植物中的表达效率。为了分析T2家族之间转基因表达效率的差异，对dCt值进行了单向方差分析检验，然后进行了Dunnet的T3事后检验。方差的齐性采用Levene检验。所有统计分析采用SPSS v23软件(IBM)进行。T2家族和对照组分别接种o . neolycopersici如上所述。两周后按0-3分对植物的敏感性/抗性进行评分，如前所述[11］．使用SPSS v23软件(IBM)，采用非参数Kruskal-Wallis检验和逐步降阶多重比较事后检验分析T2家族与对照组之间PM易感性的差异，以确定同质子集。

的表达分析枣疯病利用qRT-PCR技术对黄瓜基因进行分析

的表达分析枣疯病在PM接种的黄瓜组织中，培养了PM敏感的黄瓜品种“Sheila”，并接种了一种p . xanthii如前所述[13］．在接种前和接种后4、6、8和24 h (hpi)，分别从每个时间点的8个单株中收获下胚轴、子叶和(第一个)真叶样品，并立即在液氮中冷冻。按照之前的描述进行RNA分离、cDNA合成和qRT-PCR [13］．用于量化CsaMLO1和CsaMLO11分别用引物序列进行表达CsaMLO1 -向前,CsaMLO1相反,CsaMLO11 -向前,CsaMLO11 -相反，如上所述。黄瓜管家基因特有的引物对TIP41和EF -α，如Warzybok等人所述。[52]，用于表达式的规范化。

技术重复之间的Ct值差异大于1.0，或一个或两个技术重复未达到检测阈值的样本被排除在分析之外。每个样本的Ct值通过减去两个管家基因Ct值的几何平均值进行归一化，得到deltaCt，缩写为dCt。在接种黄瓜组织的时间序列中，dCt值随后用0 hpi时每个基因/组织组合的平均dCt值归一化，得到dCt值。计算每个基因/组织/时间点组合在4至8个生物重复中ddCt值的平均值和标准误差。使用Shapiro-Wilk检验检验ddCt分布的正态性(P> 0.05)。用方差分析分析不同时间点间ddCt值的差异。方差齐性采用Levene检验。如果方差分析检验显示时间点(P< 0.05)，进行Bonferroni事后检验来分析哪些时间点彼此之间存在显著差异。所有统计分析采用SPSS v23软件(IBM)进行。相对转录物丰度计算为2^-ddCt。

在第2个试验中，栽培对PM敏感的黄瓜品种‘Sheila’并接种p . xanthii在上述相同的条件下。在接种前和接种后4、6、8、12和24 h (hpi)采集叶片和下胚轴组织样本，每个时间点采集8株单株。总RNA的分离采用基于苯酚的方案，描述如下[53］．如上所述进行cDNA合成和qRT-PCR。

在另一项实验中，在荷兰瓦赫宁根的一个温室里种植了基因型为“Sheila”、“Santou”和“CS-PMR1”的黄瓜。播种五周后，收获叶片样本，并立即在液氮中冷冻。总RNA采用RNeasy植物迷你试剂盒(Qiagen, Germany)分离。使用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad Laboratories, usa)，用500 ng RNA样品合成cDNA。在使用qRT-PCR之前，将cDNA样品稀释2倍。量化…的表达CsaMLO1和CsaMLO11，按照上述条件和随后的数据分析进行qRT-PCR，使用“Sheila”样本的平均dCt值对dCt值进行归一化。

分析枣疯病RNA-seq数据集中的数据

黄瓜基因型“中国长”自交系9930在标准温室条件下(20°C(白天)和16°C(夜间)，16 h/8 h日夜循环，相对湿度为70%)进行栽培。收集根、根尖、下胚轴、子叶、茎、叶和果实的分离样本，并立即在液氮中冷冻，每个组织使用一个(下胚轴、子叶和茎)、两个(根和根尖)或三个(叶和果实)单独样本。材料送往荷兰KeyGene b.v.进行rna测序。使用RNeasy植物迷你试剂盒(Qiagen，德国)从每个样品中分离总RNA。随后，按照TruSeq RNA Sample Preparation v2 Guide协议制作RNA-seq文库。经qPCR测定浓度(LightCycler 480;根据制造商的建议，将PhiX(~0.6%)加标作为对照。将这些文库汇集在一起，使用Illumina HiSeq 2000测序仪进行测序。根据样本标记序列，将结果读取到每个样本的单个fasta文件中。获得的Reads长度约为100 nt，最小长度为36 nt。Reads与参考基因组(“中国长”自交系9930，版本2 [30.])。每个样本的转录物丰度根据测序片段的数量进行评估，通过基因编码序列的长度归一化，每百万测序reads(每千碱基转录物片段，FPKM)。我们从总数据集中提取了三个进化枝V的每个样本的FPKM值枣疯病基因，使用Excel。对于具有多个生物重复的样本，采用方差分析检验分析FPKM值的差异，如果方差是均匀的，则采用Bonferroni事后检验，如果方差不是均匀的，则采用Dunnet T3事后检验。方差齐性采用Levene检验。所有统计分析采用SPSS v23软件(IBM)进行。

利用EMBL-EBI基因表达图谱分析拟南芥RNA-seq数据[54］．拟南芥组织中的基线表达值由[36]对进化支V进行了过滤枣疯病基因AtMLO2(AT1G11310),AtMLO6(AT1G61560)和AtMLO12[AT2G39200]并下载为表格文件。

计算机筛选枣疯病115行的序列变体

从115个黄瓜基因型中鉴定出的snp和索引列表[37]从葫芦基因组数据库下载[38］．根据基因位置，用Excel对snp和indel进行筛选CsaMLO1(Chr1: 8,159,427.8,165,253，负链)或CsaMLO11(Chr6: 14,120,024.14,125,039，正链)。根据序列变异的基因组位置，手工标注序列变异是位于内含子还是外显子，当它们位于外显子时，使用CLC Main Workbench v. 7.6.4对编码序列的影响进行评分。

CS-PMR1和Santou重测序

黄瓜基因型CS-PMR1和桑头种子从日本国立农业与食品研究机构遗传资源中心订购。两种基因型的幼叶都被收获，并立即在液氮中冷冻。从叶子中分离出DNA，如[55］．总DNA发送至文库制备和全基因组测序，使用Illumina Hiseq PE150技术，每碱基对平均覆盖25个reads，插入物大小为350 bp，由Novogene Company Limited，香港，中华人民共和国。所得到的reads与黄瓜参考基因组(“中国长”自交系9930，版本2 [30.])使用Bowtie，版本2.2.6 [56］．筛选读取的基因组位置CsaMLO1和CsaMLO11和SNP/indel调用使用SAMtools软件包，版本0.1.18 [57］．

检查的内含子6中读取覆盖率低的区域CsaMLO1,用5 ' -CCTGCCTTGATGTGGATCGT-3 '(正向)和5 ' -AGTGCCTTCTTCTGACCGTT-3 '(反向)引物从CS-PMR1基因型DNA中扩增出该区域。检查的内含子12中低读取覆盖率的区域CsaMLO11,用5 ' - AGCACACAGAGGATTTGGTCA-3 '(正向)和5 ' - tgaacgagaaccctgatgca -3 '(反向)引物从CS-PMR1基因型DNA中扩增出该区域。在这两个PCR反应中，使用DreamTaq DNA聚合酶(ThermoFisher Scientific, usa)的50 μl反应以2 μl DNA为模板。循环条件为:95℃下初始变性1 min, 95℃下变性30 s, 60℃下退火30 s, 72℃下退火1 min，循环40次。在72°C下孵育7分钟，反应结束。PCR产物通过GelRed染色和琼脂糖凝胶电泳可见。测序反应一式三次，使用用于扩增的相同引物(GATC Biotech，德国)。使用CLC Main Workbench v. 7.6.4对得到的序列进行比对。从比对中提取扩增区域的一致序列。然后将此共识序列与基因组参考序列进行比对CsaMLO1和CsaMLO11,分别。

验证观察到的序列是否在内含子6变异CsaMLO1的内含子12CsaMLO11如果基因型CS-PMR1对剪接有影响，则从cDNA中扩增出相应的区域。采用RNeasy试剂盒(Qiagen, Germany)从黄瓜基因型CS-PMR1和Santou的幼叶中分离RNA。用DNase I, Amp. Grade (Invitrogen life technologies, usa)处理RNA样品，去除可能的DNA污染。采用美国Bio-Rad实验室的iScript cDNA合成试剂盒，用2 μg的RNA样品合成cDNA。一个CsaMLO1利用引物从cDNA中扩增出编码序列片段CsaMLO1 -正向(如上)和5 ' -ATGGCAGCCATAGATACGCC(反向)。一个CsaMLO11利用引物5 ' -GTGGTGGTCAGTATCAGCCC-3 '(正向)和5 ' -CGTCGAACCCATCTGTGTGA-3 '(反向)从cDNA中扩增出编码序列片段。PCR反应使用DreamTaq DNA聚合酶(ThermoFisher Scientific, usa)进行，循环条件如上所述。PCR产物通过GelRed染色和琼脂糖凝胶电泳可见。测序反应一式三次，使用用于扩增的相同引物(GATC Biotech，德国)。使用CLC Main Workbench v. 7.6.4对得到的序列进行比对。从比对中提取扩增区域的一致序列。然后将这些一致序列与cDNA参考序列比对CsaMLO1和CsaMLO11,分别。

我们非常感谢荷兰TKI起始材料基金会，为这项工作提供了大部分资金。

同时，我们要感谢荷兰technology Top Institute Green Genetics (TTI-GG项目INTCFD040RP)，以及Hazera Seeds B.V.、Bayer Vegetable Seeds B.V.、Takii Europe B.V.和Rijk Zwaan B.V.为RNA-seq数据提供资金。

数据和材料的可用性

所有相关数据都在本文及其支持信息文件中。

作者的贡献

JAB, HJS和YB设计了实验。JAB、MA和GB进行了实验。JAB起草了手稿。MA、RGFV、HJS、YB对稿件进行了批判性修改。所有作者都阅读并认可了稿件。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

发表同意书

不适用。

伦理批准并同意参与

不适用

出版商的注意

b施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构的管辖权要求保持中立。

从属关系

1. 荷兰瓦赫宁根大学植物育种与研究中心，荷兰瓦赫宁根，16708 PB

   Jeroen A. Berg, Michela Appiano, Gerard Bijsterbosch, Richard G. F. Visser, Henk J. Schouten和白玉玲

相应的作者

对应到玉玲白。

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