蔓越莓豆种皮原花青素积累及转录响应(gydF4y2Ba菜豆gydF4y2BaL.对采后变黑的敏感性不同gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

食用干豆(gydF4y2Ba菜豆gydF4y2BaL.)在采后储存期间变暗的产品等级较低，比未变暗的产品销路更差。易感基因型的种皮变黑取决于原花青素的可用性及其随后氧化成活性醌。成熟的蔓越莓豆缺乏这种采后变黑特性，往往缺乏原花青素，尽管这种代谢现象的潜在分子和生化决定因素尚不清楚。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

在易变黑的蔓越莓豆重组自交系(RIL)中，种皮原花青素水平随着植株成熟而增加，而在不变黑的RIL植株中，这些代谢物不存在。RNA测序(RNA-seq)分析用于监测作为豆类发育功能的种皮转录组的变化，其中转录水平以每千碱基外显子每百万片段的片段来测量。在变黑和未变黑的蔓越莓豆ril中，共有1336个基因差异表达。在变黑的RIL种皮中，原花青素生物合成途径的结构和调控基因上调。主成分分析确定了两个功能未知的基因和三个原花青素生物合成基因的转录水平变化，gydF4y2Ba黄酮3-羟化酶gydF4y2Ba，gydF4y2Ba二氢黄酮醇4-还原酶gydF4y2Ba和gydF4y2Ba花青素还原酶gydF4y2Ba（gydF4y2BaPvANR1gydF4y2Ba)与变黑敏感蔓越莓豆RIL种皮原花青素积累高度相关。HPLC-DAD分析显示重组蛋白的体外活性gydF4y2Ba光伏gydF4y2BaANR1依赖于nadph，含有花青素的实验产生表儿茶素和儿茶素;高水平的花青素底物抑制了这两种产物的形成。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

原花青素氧化是收获后双子叶种子种皮变黑的先决条件。在模式植物物种中，原花青素的积累依赖于生物合成基因的上调。在本研究中，蔓越莓豆种皮中原花青素的产生与叶绿素含量的增加密切相关gydF4y2BaPvANR1gydF4y2Ba种子成熟过程中的转录本。在NADPH存在下，gydF4y2Ba光伏gydF4y2BaANR1将生理上相关的底物花青素转化为表儿茶素和儿茶素。gydF4y2Ba

食用干豆或普通豆(gydF4y2Ba菜豆gydF4y2Ba豆科植物是一种高度种植的豆科植物，是发展中国家膳食蛋白质、纤维和维生素的主要来源。2014年，全球生产了2510万吨可食用干豆，其中印度、缅甸、巴西、美国和墨西哥的种植面积最大[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]。有证据表明有两个驯化中心gydF4y2Bap .寻常的gydF4y2Ba特别是墨西哥(中美洲)的小籽豆和南美洲安第斯山脉的大籽豆[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]。虽然安第斯栽培品种(如蔓越莓豆)在基因上与中美洲栽培品种(如pinto)不同[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]，两者都容易受到收获后相关种皮变黑的影响[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

在收获时，蔓越莓豆的特点是在奶油色的种皮上有红色的斑驳。采后处理后，浅底色会变成米色/棕色[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]。同样，斑豆的米色背景也容易在收获后变暗[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。通常情况下，种皮变黑是由光、湿度、大气氧促进的gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba，以及储存期间的高温，以及种子的高水分含量[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]。在斑豆中，与采后相关的种皮变黑是由一个显性基因的存在所控制的gydF4y2BaJgydF4y2Ba等位基因，而纯合隐性(gydF4y2BajjgydF4y2Ba)植物不会变黑[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]。控制与收获后相关的种子变黑是一个重要的经济问题，因为它是导致干豆市场质量下降和整体档次降低的因素之一[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。此外，深色的种皮往往与难以烹饪的特征有关[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。迄今为止，蔓越莓豆在采后储存期间变黑的生化和分子因素仍不清楚。gydF4y2Ba

在豆科植物种子中，原花青素积聚在种皮的内皮中[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]。它们被氧化为活性醌，促进了与蛋白质的相互作用，最终在该细胞层内形成棕色沉积物，包括在易受种皮变黑影响的斑豆品种中[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]。因此，豆科植物(如干豆、豌豆和大豆)的种皮变黑与原花青素的可用性有关，类似的现象也发生在芸苔科植物中，包括模式植物gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。原花青素(也称为缩合单宁)是黄烷-3-醇(例如儿茶素和表儿茶素)的低聚物或聚合物，源自类黄酮生物合成途径[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.原花青素代谢有很好的描述gydF4y2BaMedicago truncatulagydF4y2Ba，gydF4y2Ba葡萄gydF4y2Ba和拟南芥。而且，可获得的一些拟南芥种子或苍白gydF4y2Ba透明的外种皮gydF4y2Ba（gydF4y2BaTTgydF4y2Ba)突变体有助于阐明与该途径功能相关的结构和调控步骤[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]。在拟南芥中，原花青素生物合成基因转录本受到协调调控，并随着种子发育而积累，在胚胎发生中后期达到最高水平[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]。相比之下，该途径的基因表达量在豌豆种子发育早期和原花青素在种皮积累之前达到最高[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

原花青素是在早期生物合成基因编码的酶的催化下由苯丙氨酸代谢产生的;具体地说:gydF4y2Ba苯丙氨酸AMMONIA-LYASEgydF4y2Ba，gydF4y2Ba肉桂酸4-HYDROXYLASEgydF4y2Ba，gydF4y2Ba4-香豆醇:辅酶a连接酶，查尔酮合成酶gydF4y2Ba，gydF4y2Ba查耳酮异构酶gydF4y2Ba，gydF4y2Ba黄烷酮3-HYDROXYLASEgydF4y2Ba（gydF4y2BaF3HgydF4y2Ba),gydF4y2Ba类黄酮3 ' -羟化酶gydF4y2Ba（gydF4y2BaF3'HgydF4y2Ba）.值得一提的是，前三种酶提供了所有苯丙素的前体，包括黄酮醇、花青素和原花青素等类黄酮(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.原花青素的形成依赖于晚期生物合成基因的表达，gydF4y2BaDIHYDROFLAVONOL 4-REDUCTASEgydF4y2Ba（gydF4y2BaDFRgydF4y2Ba)，gydF4y2BaLEUCOANTHOCYANIDIN还原酶gydF4y2Ba（gydF4y2Ba守护神gydF4y2Ba)，gydF4y2Ba花青素合成酶gydF4y2Ba（gydF4y2Ba答gydF4y2Ba),gydF4y2Ba花青素还原酶gydF4y2Ba（gydF4y2BaANRgydF4y2Ba)(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.黄酮向黄烷-3-醇的转化始于dfr介导的二氢黄酮醇立体特异性还原为白花青素，随后由LAR还原。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba;［gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba])。白花青素通过ANS转化为花青素[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。此后，花青素可以在ANR存在下还原为黄烷-3-醇，如表儿茶素[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]。在拟南芥和gydF4y2Bam . truncatulagydF4y2Ba例如，原花青素积累和种皮变暗也依赖于多药和毒性挤压(MATE)转运体的存在，这些转运体参与了表儿茶素3 ' -的atp依赖性转运gydF4y2BaOgydF4y2Ba-β-葡萄糖苷穿过液泡张力质体[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]。这些晚期原花青素生物合成基因在种子、叶、花和果实中受到髓母细胞增生原癌基因(MYB)-碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)-WD40重复转录因子复合物的正向调控;此外，myb的区分依据是其活性是激活还是抑制原花青素生物合成基因的转录[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba]。据推测，游离黄烷-3-醇被迄今未知的酶浓缩成原花青素低聚物/聚合物，随后被氧化[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

一种gydF4y2Bap .寻常的gydF4y2Ba最近对安第斯长白种G19833进行了测序，rna测序(RNA-seq)数据为其注释提供了便利[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]。RNA-seq克服了传统转录组方法(如微阵列)所遇到的局限性，因为它能够检测低丰度的转录物[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]。此外，这个新发布的基因组的可用性使得在发育中的干豆植物以及受到真菌病原体挑战的干豆植物中鉴定组织特异性转录物丰度模式成为可能[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]。最近，我们小组的研究确定，原花青素B二聚体和c型三聚体，以及它们的前体，儿茶素和表儿茶素，高浓度存在于完全成熟的蔓越莓豆的种皮中，已知易在收获后变黑。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]。相比之下，这些代谢物的水平在未变黑的种子中非常低。总之，这些代谢物谱表明，原花青素途径在变黑的蔓越莓豆种子的种皮中起作用，而在非变黑的种子中则不存在。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.本研究采用RNA-seq分析方法，对变暗和非变暗的蔓越莓豆重组自交系(RILs)在三个发育阶段的种皮转录物富集谱进行了监测，以验证采后变暗易感蔓越莓豆种皮中原花青素积累与原花青素代谢基因表达增加相关的假说。gydF4y2Ba

蔓越莓豆rls种皮形态和原花青素表型gydF4y2Ba

ril是由采收后易变黑的蔓越莓豆“Etna”和不变黑的蔓越莓样豆“Wit-rood boontje”杂交产生的，在这里被称为变黑和不变黑的ril。定性分析证实，在温室条件下储存22天后，从变暗RIL的成熟荚果中收集的豆类发生了种皮背景变暗(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.在同一时期，从未变黑的RIL植株中取样的成熟豆的种皮颜色背景没有变化。同样，这些视觉表型在4°C保存48个月的种子中也很明显(图2)。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba）.这些老化的种子与4-二甲氨基菊醛(DMACA)孵育，DMACA与植物组织中的原花青素末端单位和/或其单体前体相互作用[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]。之后，深色RIL的种子染色明显，表明存在原花青素及其相关代谢物(图2)。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba）.未变黑RIL的老化种子未见明显染色。gydF4y2Ba

先前，我们确定在变黑RIL的成熟豆种皮中存在高水平的原花青素及其前体，但在非变黑RIL种皮中则不存在[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。上述研究没有分析未成熟豆种皮中的原花青素含量。本研究测量了两种蔓越莓豆RILs种皮中总可提取原花青素的水平，并将其作为种子发育的函数。这一评估是基于一个简单的分光光度测定，在将种皮提取物与酸化的DMACA孵育后，产生在640 nm处具有最大吸光度的发色团[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]。通过与已知范围的原花青素A2二聚体标准进行比较，定量了蔓越莓豆种皮中可提取的总原花青素水平[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]。没有选择黄烷-3-醇标准进行比较，因为有低估原花青素浓度的先例[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]。在变暗的蔓越莓豆RIL中，中期种子种皮中这些代谢物的水平大约是早期种皮的2倍(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.这些代谢物的水平此后保持不变。相比之下，无论种子发育阶段如何，未变黑的蔓越莓豆RIL种皮中总可提取原花青素水平均可忽略不计。gydF4y2Ba

种皮转录组分析gydF4y2Ba

RNA-seq分析用于评估蔓越莓豆种皮转录组的变化是否与原花青素水平相关，作为种子发育的功能。为了获得最大的读取深度，所有cDNA文库都是在rRNA耗尽后制备的，因为众所周知，这种高度丰富的RNA会强烈干扰许多RNA-seq平台[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba，gydF4y2Ba46gydF4y2Ba]。利用Illumina HiSeq 2500平台对18个种皮cDNA文库进行了配对末端读取，这些文库代表了蔓越莓豆在种子发育早期、中期和成熟阶段的三个温室重复。在所有三个发育阶段的两个RILs文库中，101 bp长度的原始序列reads的平均数量在5060万到5700万之间(表1)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.质量修剪程序为所有18个种皮库产生了889.8 M的reads。Bowtie2和TopHat将大约95%的这些读取映射到gydF4y2Bap .寻常的gydF4y2BaG19833参考基因组(1.0版)[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]。分析显示，1.5%的总图谱读取与参考基因组中的多个位置对齐。袖扣用于估计每个生物复制中歧义读取的丰度，包括剪接变体[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba]，这种方法在所有生物复制中平均产生了41,746个转录本。蛋白编码位点的原始估计gydF4y2Bap .寻常的gydF4y2Ba是27,197 [gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]，而31638个基因被投射到gydF4y2Ba菜豆gydF4y2Ba基因表达图谱[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba]。所有种皮文库的基因计数在Cuffnorm中归一化，平均产生27,751个基因。转录水平(表示为每千碱基外显子每百万片段的片段数，FPKM)提供了所有18种皮文库，包括那些注释到的基因gydF4y2Bap .寻常的gydF4y2Ba基因组(见附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

差异基因表达分析gydF4y2Ba

染黑种皮与非染黑种皮之间共有1336个基因差异表达，相对表达比≥1.4,AgydF4y2BaPgydF4y2Ba值≤0.01且一个或多个cDNA文库的原始读取计数为非零。此外，发育阶段特异性cDNA文库的比较显示，在种皮发育的早期、中期和成熟阶段，ril之间的基因表达存在差异(表2)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.每个发育阶段的差异表达基因被分为两组:在RIL种皮变暗中上调的基因和在RIL种皮非变暗中上调的基因(见附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.其中，最大数量的差异表达基因明显出现在成熟发育阶段，其中64%的差异表达基因在变暗的RIL种皮中上调，其余差异表达基因在未变暗的RIL中上调(表1)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.值得一提的是，在RIL种皮变暗过程中，57个基因被上调，与发育阶段无关(见附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.相比之下，在分析的所有三个阶段，26个基因在非变黑RIL种皮中上调(见附加文件)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.此外，在这两个ril中，有证据表明基因在分析的三个阶段中的两个阶段上调(见附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.例如，与未变暗RIL相比，在变暗RIL的早期和中期，有99个基因在种皮中上调，但在成熟期未受影响。我们确定29个基因在变暗和非变暗RIL中以特定阶段的方式差异表达(例如，分别在变暗和非变暗RIL的早期和中期上调;参见附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba）.其余和大部分差异表达基因仅在一个发育阶段上调。gydF4y2Ba

采用模型聚类技术，将不同表达的种皮基因聚为14组;每簇基因的数量从49到168不等(附加文件)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba）.对于所有聚集的基因，在将原始读取计数归一化到FPKM后，可以看到它们在种子成熟阶段的表达模式(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba;参见附加文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba）.簇5、6和9的基因在早期转录丰度最高，而簇2、3、8和14的转录丰度在中间阶段最高。此外，簇2基因在变暗RIL中表达更高，而在非变暗RIL中转录水平显著降低。聚类14中不同基因的表达谱明显相似。1、4、7和13类基因在成熟阶段转录水平最高。基因本体(GO)富集分析显示，197个差异表达基因属于1、2、9和14簇，与生物过程相关，包括与氨基酸、胺类、脂类、有机酸、氧化还原过程和小分子相关的代谢过程(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba）.此外，氧化石墨烯富集分析鉴定出287个基因属于1、2、4、7和9簇，这些基因被归类为15个独立的氧化石墨烯分子功能项，包括催化活性、水解酶活性和金属离子结合。没有显著的氧化石墨烯术语与属于簇5、6、8和11-13的基因相关。gydF4y2Ba

氧化石墨烯富集分析确定了属于簇2的几个基因为生物合成基因(见附加文件)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba）.经进一步检查，确定这些基因中有许多被注释为黄酮类/原花青素生物合成基因gydF4y2Bap .寻常的gydF4y2Ba基因组。此外，这些基因在氨基酸水平上与其他植物(如拟南芥)中已知的结构和调控原花青素途径基因相似，因此被分类。gydF4y2Bam . truncatulagydF4y2Ba，gydF4y2Ba大豆gydF4y2Ba和gydF4y2Ba葡萄属gydF4y2Ba物种。因此，我们确定了它们各自种皮转录物水平的变化作为种子发育的函数(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）.晚期原花青素生物合成基因，gydF4y2BaPvF3H1gydF4y2Ba，gydF4y2BaPvDFR1gydF4y2Ba，gydF4y2BaPvLARgydF4y2Ba，gydF4y2BaPvANSgydF4y2Ba和gydF4y2BaPvANR1gydF4y2Ba在暗色蔓越莓豆RIL种子成熟的各个阶段均有表达。在中间阶段蚕豆种皮制备的cDNA文库中，转录本水平最高。此后，这三个基因在成熟阶段转录物丰度明显下降。相反，无论发育阶段如何，非变黑RIL种皮的转录物水平都非常低。第二个DFR基因，gydF4y2BaPvDFR2gydF4y2Ba在早、中期种皮中转录本水平无显著差异。此外,gydF4y2BaPvDFR2gydF4y2Ba在变黑的豆子中转录物水平比在变黑的豆子中明显低15%到32%gydF4y2BaPvDFR1gydF4y2Ba．类似的转录谱模式在晚期生物合成基因中很明显gydF4y2BaPvANSgydF4y2Ba．对于早期生物合成基因(例如，gydF4y2Ba苯丙氨酸解氨酶gydF4y2Ba)，暗化RIL的转录物丰度水平相对低于上述基因，尽管大部分表达在中间阶段达到峰值。许多基因被注释为原花青素途径转运体(例如，gydF4y2BaPvMATE1gydF4y2Ba)和转录因子(如gydF4y2BaPvMYB6gydF4y2Ba和gydF4y2BaPvMYB11gydF4y2Ba）.总的来说，它们各自的转录水平在中间阶段达到峰值，比变暗RIL中晚期生物合成结构基因的转录水平低两个数量级，尽管比非变暗RIL高1.4至410倍。注释为gydF4y2BabHLHgydF4y2Ba和gydF4y2BaWD40重复gydF4y2Ba转录因子也在RIL变暗中上调，尽管没有gydF4y2BabHLHgydF4y2Ba候选对象属于集群2(参见附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和gydF4y2Ba5gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

对所有差异表达的计算机翻译进行比较gydF4y2BaPvMYBgydF4y2Ba揭示了其他植物中已知myb的氨基酸序列gydF4y2Ba光伏gydF4y2BaMYB6和gydF4y2Ba光伏gydF4y2BaMYB11在系统发育上与其他已知正调节原花青素生物合成基因表达的植物物种的myb相似(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba）.此外,gydF4y2Ba光伏gydF4y2BaMYB6和gydF4y2Ba光伏gydF4y2BaMYB11从含有r2r3 - myb的分支中分离出来，r2r3 - myb在各种植物中负调控原花青素/花青素的生物合成。没有差异表达gydF4y2Ba光伏gydF4y2BaMYBs与已知激活黄酮/黄酮醇生物合成的MYBs聚集，或与参与花青素生物合成和种子粘液生成的MYBs聚集。对于本研究中鉴定的所有差异表达基因，进行了转录因子结合位点(TFBS)富集分析，以确定转录起始位点上游(- 500至- 1 bp)的序列是否含有类似于拟南芥和芥中已知的MYB和bHLH结合位点gydF4y2Ba芸苔属植物显著gydF4y2Ba原花青素生物合成基因[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba48gydF4y2Ba，gydF4y2Ba49gydF4y2Ba]。TFBS富集分析显示，在变暗RIL和非变暗RIL中上调的基因中，转录起始位点上游区域含有MYB和bHLH结合位点的基因百分比是相当的(表1)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.相比之下，TFBS分析显示，相对于变黑蔓越莓豆中上调的完整基因列表，转录因子结合位点在簇2基因上游区域的比例更高。gydF4y2Ba

为了评估上述哪一个原花青素途径基因与变黑RIL种皮中原花青素积累最相关，我们对所有1336个差异表达基因的转录物丰度谱进行了主成分分析(PCA)。为此，将所有18个RNA-seq文库的归一化基因表达数据(以FPKM表示)转换为18个不相关的变量，这里称为主成分(PCs)。pc1至pc4占总方差的95.2%(图2)。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba）.为了确定这些pc中的哪一个在变黑的蔓越莓豆RIL的种皮中积累了原花青素，进行了相关分析。总原花青素水平与pc1、pc2和pc3之间存在正相关系数(图2)。gydF4y2Ba8 bgydF4y2Ba)，其中影响最大的是PC3。得分图显示，PC2解释了总方差的22.86%，在所有三个发育阶段中产生了明显的转录谱分离。此外，PC3解释了总方差的13%，并且将变暗RIL的转录谱与非变暗RIL的转录谱分开(图2)。gydF4y2Ba8 cgydF4y2Ba）.为了确定哪些基因转录水平与变暗和非变暗ril之间原花青素水平的差异相关，对所有差异表达的基因进行了相关加载图分析(图2)。gydF4y2Ba8 dgydF4y2Ba）.在这里，5个基因对这两种PCs都表现出高正系数，并且与原花青素积累有关。这包括两个功能未知的基因的转录谱，gydF4y2BaPhvul.006G097300gydF4y2Ba和gydF4y2BaPhvul.003G174200gydF4y2Ba．在计算机翻译中发现，它们分别编码66个和73个氨基酸的小蛋白。在黑暗的RIL中，转录本gydF4y2BaPhvul.003G174200gydF4y2Ba基因在豆类发育成熟期的表达量最大，是早期和中期表达量的2.3倍(见附加文件图S1)gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）.相比之下,gydF4y2BaPhvul。gydF4y2Ba006G097300转录本水平在变暗RIL的成熟阶段相对于未成熟发育阶段有所降低。在这两种情况下，这些未知基因在非变黑RIL的种皮中表达最少。聚类分析可以识别具有相似表达模式的基因组;此外，该信息可用于根据未知基因与已知功能基因的关联推断未知基因的生物学功能[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba]。gydF4y2BaPhvul.006G097300gydF4y2Ba属于簇2基因，其中许多被注释为类黄酮/原花青素结构和调控基因(见附加文件)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba）.在NCBI的非冗余蛋白数据库中进行BLAST搜索，确定了gydF4y2BaPhvul.006G097300gydF4y2Ba与假设功能的小蛋白相似，包括小豆富含亮氨酸的重复延伸蛋白样蛋白。gydF4y2BaPhvul.003G174200gydF4y2Ba属于第7簇，由许多参与DNA结合的基因组成。有趣的是，一项氧化石墨烯富集分析显示，编码结合蛋白的基因(GO:0005488)代表了最大的差异表达种皮基因群(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）.除了这些未知基因外，原花青素积累与原花青素生物合成基因相应转录本的增加密切相关gydF4y2BaPvF3H1gydF4y2Ba，gydF4y2BaPvDFR1gydF4y2Ba,gydF4y2BaPvANR1gydF4y2Ba．gydF4y2BaPvANR1gydF4y2Ba转录本水平与黑化RIL蔓越莓豆中原花青素水平的相关性较强gydF4y2BaPvF3H1gydF4y2Ba和gydF4y2BaPvDFR1gydF4y2Ba转录水平(图2)gydF4y2Ba8gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

重组蔓越莓豆ANR的生化特性研究gydF4y2Ba

作为这项研究的一部分，我们的目的是研究gydF4y2Ba光伏gydF4y2BaANR1，因为这种推测的原花青素生物合成基因的转录调控与这些代谢物在变黑蔓越莓豆RIL种皮中的积累之间存在很强的关联。重组gydF4y2Ba光伏gydF4y2BaANR1从gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba．变性凝胶电泳和免疫印迹显示，从固定化金属亲和层析(IMAC)步骤收集的洗脱液含有单个六组氨酸(His)gydF4y2Ba_6gydF4y2Ba)标记的43.7 kDa多肽(图2)。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba）.免疫印迹分析表明，随后的肠激酶孵育去除了HisgydF4y2Ba_6gydF4y2Ba-标签，得到一个37.4 kDa的多肽，与该蛋白的预测分子质量相匹配。对于所有重组蛋白制剂，约26±2.4%的HisgydF4y2Ba_6gydF4y2Ba标签免费gydF4y2Ba光伏gydF4y2Ba在肠激酶裂解步骤后，ANR1被回收。采用这种纯化策略，6 L细菌培养平均产生6.75±1.05 mg重组蛋白gydF4y2Ba光伏gydF4y2BaANR1。gydF4y2Ba

系统发育比较显示gydF4y2Ba光伏gydF4y2BaANR1氨基酸序列与其他豆科植物anr密切相关，包括豌豆和大豆代表，它们在种皮中表达，并利用花青素作为底物(见附加文件中的图S2)gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）.在体外gydF4y2Ba光伏gydF4y2BaANR1的活性在花青素存在的情况下进行了评估，花青素主要存在于变黑的蔓越莓豆RIL的种皮中[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]和氢化物供体NADPH。当gydF4y2Ba光伏gydF4y2BaANR1与固定浓度的NADPH和花青素在pH 7.0下孵育，HPLC-DAD分析显示在保留时间3.9和4.7 min时形成两个峰，分别与儿茶素和表儿茶素的真实标准共迁移(图2)。gydF4y2Ba9 cgydF4y2Ba）.没有证据表明这些产物自发形成的分析在缺乏gydF4y2Ba光伏gydF4y2BaANR1。采用HPLC-DAD法建立了花青素和NADPH的动力学性质(表2)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba）.为gydF4y2Ba光伏gydF4y2BaANR1，花青素浓度与表儿茶素和儿茶素形成速率的关系不符合Michaelis-Menten关系。非线性回归模型确定gydF4y2BaKgydF4y2Ba_0.5gydF4y2Ba和明显gydF4y2BaVgydF4y2Ba_{马克斯gydF4y2Ba}对于花青素衍生的表儿茶素和儿茶素的形成高度相似。有趣的是，当花青素浓度大于gydF4y2BaKgydF4y2Ba_0.5gydF4y2Ba;观察到的gydF4y2BaKgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba对于表儿茶素和儿茶素的形成是4.8倍和4.2倍gydF4y2BaKgydF4y2Ba_0.5gydF4y2Ba对于这些产品。同样，表儿茶素和儿茶素的形成与NADPH浓度呈s型关系gydF4y2Ba光伏gydF4y2BaANR1测定在固定浓度为100 μM的花青素下进行。最高特异性常数(gydF4y2BaKgydF4y2Ba_猫gydF4y2Ba/ KgydF4y2Ba_0.5gydF4y2Ba)显示花青素衍生表儿茶素的形成。gydF4y2Ba

种子发芽gydF4y2Ba

为了评估种皮原花青素和变黑对种子萌发的影响，我们分析了老化种子中出现胚根的百分比与渗吸时间的关系。平均而言，未变暗的种子在2 d后发芽26%，而在此期间，变暗RIL的豆子没有发芽(图2)。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba）.此后，两种ril的发芽率都明显增加，尽管在第3天和第4天，未变暗种子的发芽率分别比变暗种子高25%和20%。9 d后，两种对照种子的发芽率均在92%以上，差异无统计学意义。gydF4y2Ba

原花青素在蔓越莓豆种皮发育过程中积累，易受采后变黑影响gydF4y2Ba

植物组织及其衍生食品是原花青素的唯一来源，包括烘焙巧克力、肉桂、葡萄籽、高粱、蔓越莓和干豆[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba]。此外，这些代谢物对人类有许多益处，包括抗氧化和心脏保护作用[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]。不幸的是，这些多酚类化合物的存在与双子叶植物种皮变黑有关[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。种皮变黑往往发生在易感豆类，如蚕豆和某些可食用干豆品种，包括斑豆和蔓越莓豆[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba52gydF4y2Ba]。这在收获后易变黑亲本“Etna”与非变黑亲本“Wit-rood boontje”杂交的蔓越莓豆变黑RIL的种子中也很明显，但在非变黑RIL中则不存在(图2)。gydF4y2Ba2 a, bgydF4y2Ba）.在这里，我们报告了深色蔓越莓豆是dmaca染色的，并且在种子发育的所有阶段含有比非深色蔓越莓豆多得多的总可提取原花青素水平(图2)。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba和gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.对于成熟期种皮，这些趋势与总可提取原花青素代谢物水平的HPLC-MS分析一致[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。值得一提的是，目前的研究报告称，与我们早期的研究相比，成熟的暗色RIL豆的种皮原花青素含量提高了约100%。之前的定量研究是基于儿茶素当量;该化合物的分子质量为图2所示原花青素A2标准品的50%。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba．此外，原花青素A2在体外DMACA实验中产生的显色反应小于儿茶素[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]。染黑蔓越莓豆种皮的中间和成熟阶段原花青素含量较高。这并非没有先例，因为原花青素在拟南芥和豌豆种子发育的早期阶段往往基本上不存在或很少，但此后增加[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

在变黑的蔓越莓豆种子中原花青素的积累与原花青素代谢基因的协同上调有关gydF4y2Ba

RNA-seq方法显示，变暗的蔓越莓豆种皮与非变暗的基因型种皮中有1336个基因的差异表达。我们的发现与转录组分析一致gydF4y2Ba芸苔属植物junceagydF4y2Ba种皮基因，据报道有1304个基因在棕色种子系(含原花青素)和黄色种子系(缺乏原花青素)之间差异表达[gydF4y2Ba53gydF4y2Ba]。此外，大多数的差异表达基因在gydF4y2Bab . junceagydF4y2Ba种皮与原花青素途径无关，这与本研究中发现的大多数差异表达种皮基因一致(见附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba和gydF4y2Ba5gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

编码的MYB-bHLH-WD40重复复合体gydF4y2BaTT2gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaTT8gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaTTG1gydF4y2Ba驱动后期原花青素生物合成基因(如ANR基因)的表达gydF4y2Ba也有gydF4y2Ba)培育拟南芥种子[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]。在我们的研究中，对所有簇2基因(主要是类黄酮/原花青素代谢基因)的TFBS分析显示，假定的MYB和bHLH结合位点的富集与已知的拟南芥相匹配(表1)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba) [gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba48gydF4y2Ba，gydF4y2Ba49gydF4y2Ba]。事实上，转录水平为gydF4y2BaPvMYB6gydF4y2Ba，gydF4y2BaPvMYB9gydF4y2Ba和gydF4y2BaPvMYB11gydF4y2Ba在变暗的蔓越莓豆中协同增强，而在非变暗的基因型中可以忽略不计(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）.此外，它们的表达模式与原花青素结构基因的表达模式相关(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba和gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）.有趣的是,gydF4y2BaPvMYB6gydF4y2Ba和gydF4y2BaPvMYB11gydF4y2Ba属于两个独立的系统发育分支，含有MYBs，已知可激活原花青素生物合成基因的表达(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba）.综上所述，后期原花青素生物合成基因的转录激活对蔓越莓豆种皮中原花青素的含量至关重要。gydF4y2Ba

在我们的研究中，三个原花青素生物合成基因的转录谱，gydF4y2BaPvF3H1gydF4y2Ba，gydF4y2BaPvDFR1gydF4y2Ba和gydF4y2BaPvANR1gydF4y2Ba与原花青素积累高度相关(图2)。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba）.同样，ANR基因的表达也局限于种皮中的原花青素积累细胞gydF4y2Ba显著gydF4y2Ba和拟南芥[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba49gydF4y2Ba]。此外,gydF4y2BaANRgydF4y2Ba表达与豌豆和大豆种皮中原花青素的积累密切相关[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。gydF4y2BaPvANR1gydF4y2Ba在未变黑的蔓越莓豆RIL种皮中，转录物水平可以忽略不计。这一发现与gydF4y2BaANRgydF4y2Ba在红褐色的大豆种子中，与呈现无缺陷品种的棕色种皮相反gydF4y2BaANRgydF4y2Ba基因(gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]。有趣的是,gydF4y2Bap .寻常的gydF4y2Ba基因组包含了第二个gydF4y2BaANRgydF4y2Ba，在这里注解为gydF4y2BaPvANR2gydF4y2Ba它在系统发育上类似于一种无处不在的表达gydF4y2BaANR2gydF4y2Ba从gydF4y2Ba大豆gydF4y2Ba［gydF4y2Ba18gydF4y2Ba[参见附加文件中的图S2]gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）.gydF4y2BaPvANR2gydF4y2Ba转录水平显著低于gydF4y2BaPvANR1gydF4y2Ba，并且在本研究研究的RNA-seq分析中没有差异表达。值得一提的是，PCA分析并没有识别gydF4y2BaPvLARgydF4y2Ba作为深染蔓越莓豆原花青素积累相关基因之一。这很可能是由于该基因在非变暗RIL的早期和中期阶段表达，尽管表达水平低于变暗RIL(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）.同样的,gydF4y2Ba守护神gydF4y2Ba表现为发展gydF4y2Bam . truncatulagydF4y2Ba种子，但不像gydF4y2BaDFRgydF4y2Ba，gydF4y2Ba答gydF4y2Ba和gydF4y2BaANRgydF4y2Ba，其转录谱与原花青素积累关系不大[gydF4y2Ba54gydF4y2Ba]。相反，LAR和ANR分别促进豌豆种子和豌豆种子中儿茶素和表儿茶素的产生gydF4y2BaTheobroma可可gydF4y2Ba［gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]。因此，LAR参与蔓越莓豆种皮原花青素生物合成的可能性仍然存在。gydF4y2Ba

重组gydF4y2Ba光伏gydF4y2BaANR1产生儿茶素和表儿茶素gydF4y2Ba

成熟蔓越莓豆的种皮含有高水平的儿茶素和表儿茶素，以及它们的原花青素二聚体和三聚体[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。在这里，我们纯化了一个重组体gydF4y2Ba光伏gydF4y2BaANR1在gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba）.重组物的分子质量gydF4y2Ba光伏gydF4y2BaANR1 (37.4 kDa)与gydF4y2Ba通用汽车gydF4y2BaANR1 [gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]。体外生化分析显示，在氢化物供体NADPH存在的情况下，花青素被转化为与真正的儿茶素和表儿茶素标准共色谱的产物(图2)。gydF4y2Ba9 cgydF4y2Ba）.对这种酶的动力学分析表明，这些产物的形成具有相似的催化效率(表1)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba）.为gydF4y2Ba光伏gydF4y2BaANR1，明显的gydF4y2BaVgydF4y2Ba_{马克斯gydF4y2Ba}由花青素生成表儿茶素的比例，在其他反辐射反应所检测到的范围内[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba55gydF4y2Ba]。类似地，来自拟南芥的重组ANRs，gydF4y2Ba陆地棉gydF4y2Ba，gydF4y2Bam . truncatulagydF4y2Ba，gydF4y2Ba葡萄属bellulagydF4y2Ba和gydF4y2Ba茶树gydF4y2Ba在体外形成两种黄烷-3-醇产物[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba55gydF4y2Ba，gydF4y2Ba56gydF4y2Ba，gydF4y2Ba57gydF4y2Ba，gydF4y2Ba58gydF4y2Ba]。此外，agydF4y2Ba诉酿酒用葡萄gydF4y2BaANR促进花青素在C2和C4位置的立体特异性还原，形成(+)-表儿茶素和(−)-儿茶素[gydF4y2Ba59gydF4y2Ba]。目前尚不清楚是否存在类似的机制gydF4y2Ba光伏gydF4y2BaANR1，因为我们的研究中没有使用手性色谱。结合转录组分析，对重组蛋白进行体外生化分析gydF4y2Ba光伏gydF4y2BaANR1表明它是蔓越莓豆中原花青素前体产生的主要酶，尽管LAR活性也可能有助于蔓越莓豆种子中儿茶素的形成。浓度高于表观浓度gydF4y2BaKgydF4y2Ba_0.5gydF4y2Ba花青色素,gydF4y2Ba光伏gydF4y2BaANR1活性被该底物抑制。这并非没有先例，因为具体活动明显减少gydF4y2Ba通用汽车gydF4y2BaANR1在花青素浓度超过100 μM时gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]。此外，还描述了重组体的非双曲动力学关系gydF4y2Ba诉bellulagydF4y2BaANR酶[gydF4y2Ba58gydF4y2Ba]。就生物学意义而言，这可能代表了该酶的前馈抑制机制，作为限制原花青素过度积累的一种手段，并为蔓越莓豆种皮中同时形成花青素提供了充足的底物。gydF4y2Ba

未变黑的蔓越莓豆种子种皮发芽延迟gydF4y2Ba

在变暗的蔓越莓种子中，萌发延迟了1天，并且在吸吸的前4天内，萌发率始终低于未变暗的RIL(图2)。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba）.这很可能是由于这两种基因型种皮中原花青素含量的巨大差异。这与一份报告一致，该报告表明拟南芥和芥蓝的发芽受到抑制gydF4y2Ba显著gydF4y2Ba施用外源原花青素后的种子[gydF4y2Ba60gydF4y2Ba]。在拟南芥中，原花青素含量高的种皮促进了种子的强休眠，因为这些种皮对水的渗透性较低，促进了种子的休眠gydF4y2Ba新创gydF4y2Ba生长抑制剂脱落酸的形成[gydF4y2Ba60gydF4y2Ba，gydF4y2Ba61gydF4y2Ba]。未变黑的蔓越莓豆种子的加速萌发能力与其种皮中原花青素含量的缺乏有关，但其对激素相关过程的影响尚不清楚。一个推测的赤霉素酸调节蛋白基因，gydF4y2BaPhvul.001G006300,gydF4y2Ba与蔓越莓豆中原花青素积累负相关(图2)。gydF4y2Ba8 dgydF4y2Ba）.有趣的是，该基因在非变暗的RIL中上调gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.赤霉素酸是一种植物激素，在植物中具有多种生物学作用，包括激活胚胎种子组织中的淀粉分解酶，使其从休眠状态中释放出来[gydF4y2Ba62gydF4y2Ba]。此外，种皮生长与生物活性赤霉素酸的积累有关，特别是在豌豆种子成熟过程中这些组织中的13-羟基赤霉素酸[gydF4y2Ba63gydF4y2Ba]。gydF4y2BaPhvul.001G006300gydF4y2Ba是属于集群4的67个基因之一，集群4包括激素相关基因，这些基因在未变黑的RIL种皮中比变黑的RIL种皮中表达更高(见附加文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba）.需要对这些激素相关基因编码的蛋白质进行生化和功能表征研究，以更好地了解它们各自与非变黑蔓越莓豆种皮发育的相关性。由于未变黑的蔓越莓豆缺乏原花青素，因此仍有可能是激素对休眠期的调节与变黑的蔓越莓豆不同。gydF4y2Ba

双子叶植物种皮变黑取决于原花青素氧化成活性醌[j]。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]。有趣的是，这种现象在种皮原花青素现成可用的基因型中很明显，包括本研究中研究的收获后易变黑的蔓越莓豆RIL种质。此外，模式植物生物拟南芥和gydF4y2Bam . truncatulagydF4y2Ba已经确定种皮中的原花青素水平与一个功能齐全的生物合成途径有关[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]。RNA-seq分析显示，近5%的种皮基因在变黑和非变黑的蔓越莓豆RIL之间存在差异表达，这与不同颜色的种皮转录组分析一致gydF4y2Bab . junceagydF4y2Ba种子(gydF4y2Ba53gydF4y2Ba]。所有原花青素生物合成基因(包括gydF4y2BaPvLARgydF4y2Ba和gydF4y2BaPvANR1gydF4y2Ba)在变暗RIL中协同上调，它们的种子发育特征与gydF4y2BaPvMYBgydF4y2Ba这些现象在未变黑的蔓越莓豆中基本不存在。值得注意的是，变黑易感RIL种皮中原花青素的积累与三个原花青素生物合成基因的表达上调高度相关。gydF4y2BaPvF3H1gydF4y2Ba，gydF4y2BaPvDFR1gydF4y2Ba,gydF4y2BaPvANR1gydF4y2Ba．就像大多数迄今为止所描述的anr一样[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba55gydF4y2Ba，gydF4y2Ba56gydF4y2Ba，gydF4y2Ba57gydF4y2Ba，gydF4y2Ba58gydF4y2Ba，gydF4y2Ba59gydF4y2Ba]，gydF4y2Ba光伏gydF4y2BaANR1的活性依赖于nadph，并催化花青素生成表儿茶素和儿茶素。这三种酚类化合物在变黑的蔓越莓豆的种皮中很明显，但在非变黑的种子中不存在[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]。有趣的是,gydF4y2Ba光伏gydF4y2Ba高浓度花青素抑制ANR1活性。综上所述，本研究结果表明:(1)蔓越莓豆种皮中原花青素的积累与原花青素途径的转录调控有关;(2)gydF4y2Ba光伏gydF4y2BaANR1是原花青素形成的主要酶;(iii)底物抑制该活性可能代表限制原花青素积累的体内控制机制。本文给出的转录组学和生化信息对未来的育种策略具有至关重要的意义gydF4y2Bap .寻常的gydF4y2Ba种子。gydF4y2Ba

化学品和植物材料gydF4y2Ba

除非另有说明，化学品是从Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Canada)购买的。变黑和非变黑的蔓越莓豆RILs是由圭尔夫大学(加拿大安大略省圭尔夫)的豆类育种计划从亲本系“Etna”之间的杂交中创造出来的，“Etna”很容易在收获后变黑[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]和“Wit-rood boontje”，这是一种类似蔓越莓的豆类亲本系，来自位于科罗拉多州柯林斯堡的美国农业部国家遗传资源保护中心(GRIN登记号码:PI 439540)，不经历采收后相关的变黑[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]，此处称为非暗化。‘Etna’亲本系是从Seminis Vegetable Seeds获得的。公司(Woodland, California, USA)简而言之，父母之间的杂交是在圭尔夫大学的一个生长室内进行的。FgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba和FgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba种子被允许自生，FgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba筛选种子对紫外线C光的反应[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba来识别变暗和非变暗的线条。将这些系自交多代，产生变暗和不变暗的重组自交系。gydF4y2Ba

2012年9月11日，来自上述杂交的135颗非暗化RIL种子和135颗暗化RIL种子(FgydF4y2Ba_5gydF4y2Ba种子)播种在1.5 L的花盆中(每盆一颗种子)，其中含有阳光混合#2 / LB2土壤(SunGro Horticulture, St. Catharines, Ontario, Canada)，其中含有1.25 g L的水溶性肥料(N:P:K, 20:8:20) (Plant Products, Ancaster, Ontario, Canada)gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}．在圭尔夫大学(University of Guelph)的三个独立温室中，采用完全随机设计，分别在昼夜温度为26°C和16°C的恒定条件下，培养45株变暗和45株未变暗的RIL蔓越莓豆。在06:00 - 22:00 h，当入射阳光小于200瓦m时，补充高压钠灯照明gydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}．每天用上述混合肥料灌溉植株30分钟，直到收获豆荚的最后一天(2012年11月28日)。在每个温室中，RIL植株的种子荚分别在发育早期、中期和成熟期收获，荚长分别为9-15 cm、15-20 cm和20-28 cm。对于每个温室重复，在每个发育阶段收集45株植物的ril特异性种子荚。然后，将种子从豆荚中取出，人工剥去种皮，并在液态氮中冷冻gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba．将冷冻的种皮材料在液氮下用研钵和杵粉碎gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba保存在- 80°C，直到需要进行原花青素和转录本分析。在这两种试验中，将收获的剩余成熟种子储存在密封的塑料袋中，温度为4°C，最长可达48个月。gydF4y2Ba

DMACA染色gydF4y2Ba

为了可视化原花青素在整个种子中的积累，使用先前描述的方法对两个ril的老化种子进行DMACA染色，并进行以下修改[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba]。简单地说，将之前储存在4℃的种子转移到环境温度下，在水中浸泡24 h。之后，将吸收的种子浸入含有0.8% (gydF4y2BawgydF4y2Ba/gydF4y2BavgydF4y2Ba)盐酸及0.5% (gydF4y2BawgydF4y2Ba/gydF4y2BavgydF4y2Ba) DMACA浸泡60分钟，然后用70% (gydF4y2BavgydF4y2Ba/v)乙醇60min。gydF4y2Ba

原花青素的提取与定量gydF4y2Ba

每个生物重复，用10体积丙酮提取冷冻蔓越莓豆种皮粉(1.5 g): MilliQ-processed water (13:7，gydF4y2BavgydF4y2Ba/v)如前所述[gydF4y2Ba64gydF4y2Ba]，通过将声波分离器设置为最大振幅的80%，对悬液进行10次脉冲，持续30秒(Thermo Fisher Scientific, Mississauga, Ontario, Canada)。连续脉冲之间有30秒的停顿。之后，组织提取液在轨道振动器(Adams™Nutator;Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, New Jersey, USA)，在24°C下发酵2小时，在2500 x下制粒gydF4y2BaggydF4y2Ba在24°C下放置10分钟。取等量上清液(70 μL)转入微孔板孔，与DMACA比色试剂结合至280 μL。在640 nm处检测原花青素水平，如前所述[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba，gydF4y2Ba64gydF4y2Ba]，使用SpectraMax Plus 384微孔板检测仪(Molecular Devices, Sunnyvale, California, USA)，并与正品原花青素A2标准品(Extrasynthese, Genay, France)的已知含量(0.34 - 2.02 μg)进行比较。对于每个生物重复，原花青素测定分三次进行。采用SAS 9.3 (SAS Institute Inc.， Cary, North Carolina, USA)的单因素方差分析，在α = 0.05水平上分析总原花青素数据。gydF4y2Ba

RNA制备与测序gydF4y2Ba

从蔓越莓豆RIL种皮中分离出高质量的总RNA，采用了一种排除多酚类化合物的改进程序[gydF4y2Ba65gydF4y2Ba]。简单地说，用3 mL 100 mM Tris-HCl (pH 7.5)(含2% (gydF4y2BawgydF4y2Ba/gydF4y2BavgydF4y2Ba)十六烷基三甲基溴化铵洗涤剂，2% (gydF4y2BawgydF4y2Ba/gydF4y2BavgydF4y2Ba聚乙烯吡咯烷酮(平均分子量40000克摩尔gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})， 25 mM乙二胺四乙酸，2m NaCl, 2% (gydF4y2BavgydF4y2Ba/v) β-巯基乙醇和0.5 g LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}在65°C下孵育10分钟。在孵育期间，样品周期性翻转。细胞残留物在10000倍离心下成球gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C下放置30分钟，将水相与等体积的氯仿混合并重新离心，如前所述。水相与2 M LiCl混合，总RNA样品在4℃下沉淀18 h。随后，RNA样品在20000倍离心下成球gydF4y2BaggydF4y2Ba在4℃下静置15分钟，用70% (gydF4y2BavgydF4y2Ba/ v)乙醇。使用NanoDrop 1000紫外/可见分光光度计(NanoDrop Technologies, Wilmington, Delaware, USA)定量RNA，并使用标准分子生物学技术分析其质量和完整性[gydF4y2Ba66gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

对于每个温室/发育阶段复制，使用Illumina Ribo-Zero磁性试剂盒(Mandel Scientific Company Inc.， Guelph, Ontario, Canada)去除RNA，并根据制造商的说明，在Agilent 2100生物分析仪上使用Agilent RNA 6000 Pico试剂盒(Agilent Technologies, Mississauga, Ontario, Canada)验证rRNA污染物的存在。cDNA文库的制备和下一代测序在病童医院应用基因组学中心(Toronto, Ontario, Canada)进行。简单地说，每个样品用Illumina TrueSeq RNA样品制备试剂盒v2制备400ng mRNA。随后在Illumina HiSeq 2500平台上对cDNA文库进行测序，得到101bp的成对末端reads。gydF4y2Ba

种皮转录组组装与分析gydF4y2Ba

使用FASTQ Quality Trimmer修剪成对的序列读段，以去除适配器[gydF4y2Ba67gydF4y2Ba]到至少原始序列长度的80%，使用最低Phred评分为32来消除低质量的reads。对于每个种皮cDNA文库，Illumina序列reads (FASTQ格式)被映射到种子的基因组序列gydF4y2Bap .寻常的gydF4y2BaG19833参考基因组(组装版本1.0;［gydF4y2Ba68gydF4y2Ba，gydF4y2Ba69gydF4y2Ba])与Bowtie2使用默认参数，包括在70对齐的最大不匹配的质量总和。对TopHat的外显子-外显子连接进行数据分析，如前所述[gydF4y2Ba70gydF4y2Ba]。在Cufflinks中生成转录组组装，并使用Cuffcompare进行注释。差异表达基因用Cuffdiff鉴定，转录丰度用FPKM报告，使用cummeRbund在R [gydF4y2Ba71gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

通过聚类分析确定种皮转录组中具有相似表达模式的基因。为此，使用samtools从Binary Alignment/Map (BAM)文件中获得所有差异表达基因的原始读取计数[gydF4y2Ba72gydF4y2Bav0.1.17和HTSeq v0.6.1p2 [gydF4y2Ba73gydF4y2Ba]。使用HTSCluster v2.0包进行基因聚类[gydF4y2Ba74gydF4y2Ba] in R [gydF4y2Ba71gydF4y2Ba]，集群个数范围为1 ~ 50。使用模型选择标准对包含14个聚类的模型进行后验选择。gydF4y2Ba75gydF4y2Ba]。然后，使用AgriGO v1.0上的单一富集分析工具对基因簇模型进行氧化石墨烯富集分析[gydF4y2Ba76gydF4y2Ba]，经Fisher统计检验和Yekutieli多重检验调整，显著性水平为5%。gydF4y2Ba

对所有差异表达基因进行TFBS富集分析。为此，我们下载了gydF4y2Ba菜豆gydF4y2BaPhytozome基因组组装(Pvulgaris_218_v1.0.fa)及其注释(pvulgaris_218_v1 .0.基因.gff3) [gydF4y2Ba68gydF4y2Ba，gydF4y2Ba69gydF4y2Ba]。所有支架从基因组组装中移除，染色体序列保留。为了研究转录因子结合位点的基因群，从。gff3文件中分离出基因的起始位置。在大豆基因组中没有注释序列的差异表达基因被排除在分析之外。对于每个基因组，我们从每个转录起始位点上游500bp处提取序列，排除Ns(和Ns上游的核苷酸)，并在序列及其反向补体中搜索一个或多个基序结合位点。分析搜索以下位点:C[AGCT]GTT[AG]和CACGTG，其中[AGCT]表示任意单个核苷酸，并量化每组差异表达基因中至少有一个结合位点的基因数量。所有的分析都是用自定义perl脚本执行的。gydF4y2Ba

PCA在R [gydF4y2Ba71gydF4y2Ba]以确定RNA-seq转录谱与蔓越莓豆种皮中原花青素积累模式之间是否存在关联。为了生成PCA得分，使用正交线性变换将18个种皮重复对应的差异表达基因(表达为FPKM)的转录水平转换为不相关变量。然后，考虑占累积方差95%的分量进行相关分析。对所选PCs与种皮总可提取原花青素水平进行相关性分析，对与种皮总可提取原花青素水平高度相关的PCs进行评分。最后，通过加载图分析确定每种pc中贡献最高的转录本。gydF4y2Ba

重组蛋白的克隆、表达及纯化gydF4y2Ba光伏gydF4y2BaANR1gydF4y2Ba

从上述深色RIL植株收获的发育中的蔓越莓豆种皮中提取高质量的总RNA，并使用标准分子生物学方法评估其质量和完整性[gydF4y2Ba66gydF4y2Ba]。DNase I处理后，使用SuperScript®第一链合成系统(Invitrogen Life Technologies, Burlington, Ontario, Canada)从2.5 μg总RNA中制备第一链cDNA文库。采用正向(5′C ATG GCC ACT GTC AAG AAA ATT GGA AAG 3′)和反向(3′GCA TAA CAA TTT CCA AAT TCA GTT CTT GAG 5′)寡核苷酸引物扩增gydF4y2BaPvANR1gydF4y2Ba用标准技术从cDNA中提取开放阅读框[gydF4y2Ba66gydF4y2Ba]。使用Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity酶(Invitrogen Life Technologies)在以下条件下进行PCR:初始变性步骤为94°C 1 min，然后是94°C 30 s, 55°C 30 s, 68°C 1 min的25个循环，最后延长步骤为68°C 10 min。随后，扩增的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。使用GeneJET凝胶提取试剂盒(Thermo Fisher Scientific)对1014 bp的PCR产物进行凝胶纯化，并连接到pGEM-T亚克隆载体(Promega Corporation, Madison, Wisconsin, USA)。pGEM-T -gydF4y2BaPvANR1gydF4y2Ba构念被消化gydF4y2Ba以区域gydF4y2Ba我和gydF4y2Ba不gydF4y2BaI，并连接到pET-30b载体的相应酶切位点，生成n端HisgydF4y2Ba_6gydF4y2Ba标记gydF4y2Ba光伏gydF4y2Ba带有可切割肠激酶连接体的ANR1。pET-30b -gydF4y2BaPvANR1gydF4y2Ba结构经测序确认，转化为gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaBL21能态细胞(由圭尔夫大学植物农学系Barry J. Shelp博士提供;最初来自EMD Millipore，怡陶碧谷，加拿大安大略省)。此后,gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BapET-30b -gydF4y2BaPvANR1gydF4y2Ba转化体在添加卡那霉素(50 μg mL)的Luria-Bertani培养基上培养gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})在37°C下连续摇动(180转/分)，直到AgydF4y2Ba_600gydF4y2Ba达到中对数生长阶段。用400 μM异丙基β- d -硫代半乳糖苷诱导培养物(6 L)，在20℃下以180 rpm振荡3 h。3500倍离心使细胞成球gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C下快速冷冻10分钟gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba保存在- 80℃(最多5天)，直到需要进行蛋白质纯化。gydF4y2Ba

所有蛋白质提取步骤均在4°C下进行。冷冻后的细菌细胞重悬于200 mL蛋白提取缓冲液中，缓冲液中含有20 mM磷酸钠(pH 7.5)、500 mM NaCl、10 mM咪唑、10 mM β-巯基乙醇、10% (gydF4y2BavgydF4y2Ba/v)甘油，1毫米苯甲磺酰氟和1 X Sigma蛋白酶抑制剂混合物。用声波分离器(Thermo Fisher Scientific)对重悬细胞超声10分钟(30秒脉冲，最大振幅的30%，间隔30秒)。细胞裂解液在19000倍离心gydF4y2BaggydF4y2Ba上清通过0.45 μm聚偏二氟乙烯膜过滤器(Millex-HV;EMD微孔)。澄清后的上清液以1ml min的速度施用gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}1ml HisTrap™HP色谱柱(GE Healthcare Life Sciences;Mississauga, Ontario, Canada)用缓冲液A (20 mM磷酸钠pH 7.5, 500 mM NaCl和10 mM咪唑)预平衡，并连接到ÄKTA FPLC系统。用20柱体积的缓冲液a洗涤，将未结合蛋白从柱上去除gydF4y2Ba_6gydF4y2Ba-gydF4y2Ba光伏gydF4y2BaANR1在缓冲液a中以10-500 mM咪唑线性梯度洗脱(8ml，分数= 2ml)。含有大a的分数gydF4y2Ba_280gydF4y2Ba收集并通过PD-10 Sephadex™G-25凝胶过滤柱(GE Healthcare Life Sciences)，用肠激酶反应缓冲液(20 mM Tris-HCl, pH 8.0;50 mM NaCl;和2mm的CaClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba）.肠激酶的裂解gydF4y2Ba_6gydF4y2Ba-标签从重组gydF4y2Ba光伏gydF4y2Ba用肠激酶轻链(2 μ mL)制备ANR1gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})，按照制造商的协议(New England BioLabs, Whitby, Ontario, Canada)。对方案的修改包括培养HisgydF4y2Ba_6gydF4y2Ba标记gydF4y2Ba光伏gydF4y2BaANR1与4 ng肠激酶在25°C下作用30分钟。裂解后的蛋白在PD-10柱上纯化，缓冲液B (20mm磷酸钠，pH 7.5;和500 mM NaCl)，然后用缓冲液b预平衡的His- select镍亲和柱gydF4y2Ba_6gydF4y2Ba标签免费gydF4y2Ba光伏gydF4y2Ba按照制造商的说明(EMD Millipore)， ANR1制剂在Amicon Ultra-15离心过滤装置中浓缩，截止值为10 kDa。gydF4y2Ba

用Bradford法测定蛋白质浓度[gydF4y2Ba77gydF4y2Ba]通过Bio-Rad蛋白检测试剂盒(Bio-Rad实验室，密西沙加，安大略省，加拿大)，并与已知量的正宗牛γ-球蛋白标准进行比较。最后一个gydF4y2Ba光伏gydF4y2Ba调整ANR1浓度为1 mg mLgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}缓冲液B中含有20%甘油(gydF4y2BavgydF4y2Ba/v)，分成200 μL的等分，在- 80°C快速冷冻保存，然后用于酶分析。的重组gydF4y2Ba光伏gydF4y2Ba采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对制备的ANR1进行纯度和完整性评价。gydF4y2BawgydF4y2Ba/gydF4y2BavgydF4y2Ba)丙烯酰胺凝胶，根据先前公布的协议[gydF4y2Ba78gydF4y2Ba]。他的移除gydF4y2Ba_6gydF4y2Ba标签从gydF4y2Ba光伏gydF4y2Ba免疫印迹法检测ANR1。为此，使用标准程序将sds - page -凝胶转移到0.45 μm聚偏二氟乙烯膜(EMD Millipore)上[gydF4y2Ba79gydF4y2Ba]，用抗his检测免疫印迹gydF4y2Ba_6gydF4y2Ba-tag一抗(1:2000稀释;Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, USA)，然后是与碱性磷酸酶偶联的二抗(1:30 000稀释;Sigma-Aldrich)。使用显色碱性磷酸酶底物试剂盒(Bio-Rad Laboratories)根据制造商的说明检测免疫反应条带。gydF4y2Ba

重组蛋白体外检测gydF4y2Ba光伏gydF4y2BaANR1活动gydF4y2Ba

重组gydF4y2Ba光伏gydF4y2Ba在体外30℃条件下测定终体积为400 μL的ANR1活性。gydF4y2Ba光伏gydF4y2BaANR1活性与重组酶添加量(10 ~ 90 μg范围内)和时间(2 ~ 10 min)成正比。除另有说明外，检测包括50 mM 4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸(pH 7.0)， 800 μM NADPH, 100 μM氰胺氯(Extrasynthese)， 50 μg重组gydF4y2Ba光伏gydF4y2BaANR1和5% (gydF4y2BavgydF4y2Ba/ v)甲醇。氯化氰的新鲜制备率为96% (gydF4y2BavgydF4y2Ba/v)含0.4 mM甲烷磺酸盐缓冲液(pH 2.0)的甲醇，将其加入测定混合物中并在30°C下孵育10分钟，引发反应。加入乙酸乙酯(500 μL)终止实验，旋流30 s, 18800 x离心将反应产物分离到有机相gydF4y2BaggydF4y2Ba1分钟。去除有机相后，按照上述方法用乙酸乙酯重新提取水相。从连续提取的有机层在室温氩气流下汇集和干燥。作为对照，在没有重组的情况下进行测定gydF4y2Ba光伏gydF4y2BaANR1。gydF4y2Ba

干燥后的反应残留物在100 μL甲醇中重悬浮，用0.45 μm聚四氟乙烯注射器过滤器(Mandel Scientific Company Inc.)过滤，5 μL注射液在Kinetex五氟苯基柱(100 × 4.6 mm, 2.6 μm Phenomenex, Torrence, California, USA)上分离，偶联Agilent 1200 HPLC-DAD系统。反应产物用B (CH)溶剂梯度洗脱gydF4y2Ba_3.gydF4y2BaCN: CgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba高频gydF4y2Ba_3.gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba99.9:0.1gydF4y2BavgydF4y2Ba/v)在溶剂A (H)中gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO: CHgydF4y2Ba_3.gydF4y2BaCN: CgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba高频gydF4y2Ba_3.gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba90:9.9:0.1,gydF4y2BavgydF4y2Ba/v/v) 0-25%， 0-10 min;25-81.8%， 10-20 min;81.8-100%，流速0.8 mL min, 20-25 mingydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}．在含有花青素的实验中，在280 nm处检测到儿茶素(保留时间= 3.9 min)和表儿茶素(保留时间= 4.7 min)对应的峰。在这两种情况下，将保留时间和紫外光谱与已知量的正品(+)-儿茶素和(−)-表儿茶素标准品(均来自Extrasynthese)进行比较。使用SigmaPlot(12.3版)酶动力学模块中的非线性回归模型估计动力学参数。gydF4y2Ba

种子萌发分析gydF4y2Ba

种子萌发试验基本上按前面所述进行[gydF4y2Ba60gydF4y2Ba]。两种蔓越莓豆ril的陈年种子(先前在4°C下储存48个月)用70% (gydF4y2BavgydF4y2Ba/v)乙醇浸泡2分钟，然后用无菌水连续冲洗三次(每次1分钟)。种子在无菌柜中干燥15分钟。每个RIL将104粒种子播种在13个含有琼脂培养基的培养皿上，然后在环境控制的培养室中，在25°C的黑暗条件下孵育9天。每天对种子进行分析，寻找胚根出现的证据，这是发芽的第一个物理标志。这个实验做了三个重复。采用SAS v 9.4(过程混合法)进行单因素方差分析，在α = 0.05水平上采用最小显著差异法进行均值比较。gydF4y2Ba

ANR:gydF4y2Ba

花青素还原酶gydF4y2Ba

答:gydF4y2Ba

花青素合成酶gydF4y2Ba

bHLH:gydF4y2Ba

基本helix-loop-helixgydF4y2Ba

DFR:gydF4y2Ba

Dihydroflavonol 4-reductasegydF4y2Ba

DMACA:gydF4y2Ba

4-DimethylaminocinnamadehydegydF4y2Ba

F3H:gydF4y2Ba

黄烷酮3-hydroxylasegydF4y2Ba

F3'H:gydF4y2Ba

类黄酮3 ' -羟化酶gydF4y2Ba

FPKM:gydF4y2Ba

每千个碱基的片段每一百万个片段映射的外显子gydF4y2Ba

走:gydF4y2Ba

基因本体论gydF4y2Ba

他的gydF4y2Ba_6gydF4y2Ba：gydF4y2Ba

HexahistidinegydF4y2Ba

IMAC:gydF4y2Ba

固定化金属亲和色谱法gydF4y2Ba

政治:gydF4y2Ba

Leucoanthocyanidin还原酶gydF4y2Ba

配偶:gydF4y2Ba

多药和有毒挤压gydF4y2Ba

MYB:gydF4y2Ba

成髓细胞瘤原癌基因gydF4y2Ba

主成分分析:gydF4y2Ba

主成分分析gydF4y2Ba

瑞来斯:gydF4y2Ba

重组自交系gydF4y2Ba

RNA-seq:gydF4y2Ba

RNA序列gydF4y2Ba

TFBS:gydF4y2Ba

转录因子结合位点gydF4y2Ba

TT:gydF4y2Ba

透明的外种皮gydF4y2Ba

我们要感谢Tom Smith和Lori Wright(圭尔夫大学植物农学系)在本研究中实现的重组自交系的产生。我们感谢Run Dutton和Prasanth Nair(圭尔夫大学植物农学系)在蔓越莓豆温室栽培方面提供的技术援助。此外，我们感谢应用基因组学中心(Hospital for Sick Children, Toronto, Ontario, Canada)的Sergio Pereira为蔓越莓豆种皮转录组的cDNA文库制备和下一代测序工作。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

这项工作得到了加拿大自然科学与工程研究委员会对GB的资助(发现资助371897-2009)，安大略省研究与创新部对KPP, WLC和GGB的资助(ORF-RE 04-043)，安大略省豆类生产者营销委员会，安大略省有色豆种植者，亨萨尔地区合作社和加拿大脉动的资助。JAFC承认收到安大略省农业，食品和农村事务部的高素质人才奖学金。gydF4y2Ba

数据和材料的可用性gydF4y2Ba

本研究中使用的ANR和MYB氨基酸序列的系统发育数据已存入TreeBASE数据库，网址为http://purl.org/phylo/treebase/phylows/study/TB2:S20776。gydF4y2Ba

变暗和未变暗蔓越莓豆种皮RNA-seq实验数据(gydF4y2Bap .寻常的gydF4y2Ba) rls保存在NCBI序列读取档案[gydF4y2Ba80gydF4y2Ba[生物计划PRJNA380220]。gydF4y2Ba

支持本文结论的所有其他数据集都包含在本文(及其附加文件)中。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

GGB构思了这项研究;GGB和KPP监督项目;JACF进行了实验和大部分数据分析;SM和WLC进行转录组组装;AS在SS的监督下进行聚类分析;SS监督统计分析，包括原花青素水平PCA和转录数据;LL进行TFBS富集分析;JACF, KPP和GGB撰写和/或编辑手稿;并且，所有的作者都编辑并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者宣称他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

发表同意书gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

不适用gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

施普林格·自然对已出版的地图和机构关系中的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 圭尔夫大学植物农学系，加拿大圭尔夫斯通路东50号，n1g2w1gydF4y2Ba

   josise A. Freixas Coutin, Lewis Lukens, K. Peter paul和Gale G. BozzogydF4y2Ba

2. 圭尔夫大学数学与统计系，加拿大圭尔夫Stone road 50, ON, n1g2w1gydF4y2Ba

   Anjali Silva和Sanjeena SubedigydF4y2Ba

3. 温莎大学生物科学系，温莎日落大道401号，安大略省，N9B 3P4，加拿大gydF4y2Ba

   赛斯·芒赫兰和威廉·l·克罗斯比gydF4y2Ba

4. 现地址:美国纽约州宾厄姆顿市Vestal Parkway E. 4440号，宾厄姆顿大学(纽约州立大学)数学科学系，邮编13902gydF4y2Ba

   Sanjeena SubedigydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba盖尔·g·博佐gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba)，它允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是您要适当地注明原作者和来源，提供到知识共享许可协议的链接，并注明是否进行了修改。创作共用公共领域免责声明(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本文中提供的数据，除非另有说明。gydF4y2Ba

转载及权限gydF4y2Ba