联合生物胁迫引发了相似的转录组反应，但对咀嚼食草动物的抗性却截然不同gydF4y2Ba芸苔属植物黑质gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

在自然界中，植物经常暴露于同时激活不同的、通常是拮抗的防御信号通路的生物胁迫。植物如何整合这些信息，以及它们是否优先考虑一种压力而不是另一种压力，目前尚不清楚。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

我们研究了野生一年生十字花科植物的转录组特征，gydF4y2Ba芸苔属植物黑质gydF4y2Ba，以应对虫卵和毛虫gydF4y2Ba地区brassicaegydF4y2Ba蝴蝶,gydF4y2BaBrevicoryne brassicaegydF4y2Ba蚜虫和细菌植物病原体gydF4y2Ba黄定gydF4y2Bapv。gydF4y2BaraphanigydF4y2Ba（gydF4y2BaXcrgydF4y2Ba)．预处理用蛋精、蚜虫或gydF4y2BaXcrgydF4y2Ba对受到毛毛虫挑战的植物的后续转录组谱有微弱的影响，这表明第二种胁迫主导了转录反应。尽管如此,gydF4y2Bap . brassicaegydF4y2Ba卵浸提液对幼虫生产性能影响较大gydF4y2BaXcrgydF4y2Ba预处理和初始应力施加的位置决定了初始应力的大小。尽管鸡蛋提取物gydF4y2BaXcrgydF4y2Ba前处理抑制了昆虫诱导的防御基因表达，提示水杨酸(SA)/茉莉酸(JA)通路交叉，这与幼虫性能没有严格的相关性。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

这些结果强调，需要更好地整合植物在不同生物组织层面的反应，并考虑局部效应，以预测多重胁迫对植物抗性的影响。gydF4y2Ba

生物和非生物胁迫对自然界的植物施加了强大的压力。高温、干旱或高光强等胁迫综合起来会对作物性能和产量产生深远影响[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．植物已经发展出特定的机制来精确检测环境变化，并对复杂的胁迫条件做出反应，以最大限度地减少损害，并为生长和繁殖保存足够的资源。多年来，研究主要集中在几种模式植物对单一胁迫的反应上，包括拟南芥[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．然而，人们越来越认识到需要在分子水平和生物组织的更高水平上考虑多重应力的影响[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．这种方法是至关重要的，因为我们需要知道植物是如何在共存胁迫的背景下适应新的环境因素的。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

昆虫的食草性是自然条件下的主要生物胁迫。因此，植物已经进化出复杂的构成性和诱导性防御来抵抗或减少昆虫攻击的影响。gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．一些研究表明，受到非生物胁迫或营养限制的植物对昆虫的表现和行为有不同的影响[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．除昆虫外，植物病原体是植物生长和生存的主要威胁，也会影响以病原体感染植物为食的植食动物的定殖和性能[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．由于生物营养性植物病原体和坏死性植物病原体表现出不同的感染途径，它们会诱导不同的植物反应[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．它们对植物的作用可能以不同的方式影响昆虫攻击者的植物化学环境。此外，病原体对植物抗虫能力的影响将取决于植食动物的生物学特性，例如，它是韧皮部供给者还是咀嚼幼虫[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．例如，坏死性病原体gydF4y2Ba葡萄孢菌gydF4y2Ba抑制蚜虫的发育、繁殖力和成活率gydF4y2Ba蚜虫fabaegydF4y2Ba在gydF4y2Ba蚕豆根尖,gydF4y2Ba而生物营养真菌gydF4y2BaUromyces viciae-fabaegydF4y2Ba增强蚜虫的性能[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．最有趣的是，结合的效果gydF4y2Bab .灰质gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba美国viciae-fabaegydF4y2Ba蚜虫表现受到的胁迫似乎随感染顺序而波动[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．相比之下,gydF4y2Bab .灰质gydF4y2Ba预处理对其进一步性能无显著影响gydF4y2Ba地区rapaegydF4y2Ba拟南芥中的毛虫[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．番茄种植面临挑战gydF4y2Ba两gydF4y2Ba减少gydF4y2BaSpodoptera exiguagydF4y2Ba番茄花叶病毒可提高毛虫的生长性能，但减少蚜虫的定植[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．gydF4y2BaManduca sextagydF4y2Ba幼虫以gydF4y2Ba烟草attenuata则gydF4y2Ba用细菌群体感应处理的植物gydF4y2BaNgydF4y2Ba-酰基高丝氨酸内酯含量显著高于未处理植株。这种效应被归因于植物对食草动物防御的抑制[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．下子,gydF4y2Ba地区brassicaegydF4y2Ba抑制生长gydF4y2Bap .两gydF4y2Ba拟南芥中的菌株[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．此外,gydF4y2Bap . brassicaegydF4y2Ba幼虫表现较差gydF4y2Bap .两gydF4y2Ba-感染的拟南芥植物，这表明昆虫卵为了后代的利益而抑制植物防御[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．总之，生物预处理对草食动物性能的结果很难预测，主要取决于感染的严重程度和持续时间，病原体和草食动物的攻击策略，以及被攻击的植物种类。gydF4y2Ba

诱导防御是由植物激素控制的。从活组织中获取营养的生物营养性病原体主要激活水杨酸(SA)途径，而从死亡宿主组织中获取营养的坏死营养性病原体和咀嚼食草动物则主要激活茉莉酸(JA)和乙烯(ET)途径[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．这些通路调节防御基因的表达，为攻击者提供特定的抵抗。SA和JA通路之间的拮抗作用已得到很好的证实[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．它被认为是调节针对不同攻击者的防御分配的优先级[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]但也是植物病原体和昆虫食草动物防御操纵的目标[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba］．刺激SA途径减弱了植物对通用性食草动物的反应，即食草动物以不同植物科的植物为食，但对专家没有影响gydF4y2Bap . brassicaegydF4y2Ba，主要以芸苔科植物为食[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba］．在分子水平上，用SA或提高SA水平的病原体处理降低了抗草食动物的表达gydF4y2BaVSP2gydF4y2Ba拟南芥[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba］．因此，通路串扰可能是植物对复合胁迫反应的一个重要组成部分。gydF4y2Ba

为了更好地了解植物对多种胁迫的反应，已经进行了转录组分析。例如，一项研究分析了受单(a)或双(a)生物胁迫组合挑战的十个生态型拟南芥的转录组差异。作者得出的结论是，在应对联合胁迫时，基因调控的大多数变化是不能用单一处理的表达谱来预测的[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba］．干旱或洪水预处理显著改变了转录组特征gydF4y2Ba茄属植物dulcamaragydF4y2Ba感染了gydF4y2Ba美国exiguagydF4y2Ba［gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．同时攻击食液和咀嚼的食草动物gydF4y2Ban attenuata则gydF4y2Ba触发了一种不同于单一攻击者的转录反应[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba］．对33种不同组合胁迫的概述显示，每种处理似乎都产生了独特的反应，反映了植物特别适应不断变化和复杂环境的能力[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．在代谢组学和蛋白质组学水平上，联合应激的影响也得到了同样的结论，在多次应激后，几种独特的代谢物和蛋白质会积累，而在单一应激后则不会[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba］．然而，受到线虫和干旱双重挑战的拟南芥主要对干旱作出反应[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

因此，植物对多种胁迫的反应是相互关联的，并导致复杂和不可预测的结果。进一步研究植物对复合胁迫条件的反应对于了解这些相互作用的影响至关重要。这需要在多个水平上分析，转录和激素反应，防御化合物积累和生态后果，使用不同的植物物种。在本研究中，我们利用生态相关系统研究了复合生物胁迫对植物转录组变化、植物激素和代谢产物变化以及昆虫生产性能的影响。我们选择了野生的一年生十字花科植物，gydF4y2Ba芸苔属植物黑质gydF4y2Ba，以一种天然的鳞翅目害虫——大白菜白的毛虫为食gydF4y2Bap . brassicaegydF4y2Ba单独或与第二重音组合。复合应力由预处理与gydF4y2Bap . brassicaegydF4y2Ba鸡蛋提取物，卷心菜蚜虫gydF4y2BaBrevicoryne brassicaegydF4y2Ba，或坏死性细菌植物病原体gydF4y2Ba黄定gydF4y2Bapv。gydF4y2BaraphanigydF4y2Ba（gydF4y2BaXcrgydF4y2Ba)，其次是毛虫食草。这里使用的所有应力都是自然发生的gydF4y2Bab .黑质gydF4y2Ba在外地[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba］．植物对咀嚼幼虫的防御主要由JA途径调控，而虫卵和蚜虫主要激活SA途径[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45gydF4y2Ba，gydF4y2Ba46gydF4y2Ba]和防御gydF4y2BaXcrgydF4y2Ba由SA, JA和ET介导[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba］．鉴于这些信号通路已知的相互拮抗作用，我们预期主要应激对应激反应的显著影响gydF4y2Bap . brassicaegydF4y2Ba幼虫。的相互作用gydF4y2Bab .黑质gydF4y2Ba-攻击者之间的相互作用在生态层面上得到了充分的研究，在多个攻击者发生的现场条件下[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba，gydF4y2Ba48gydF4y2Ba，gydF4y2Ba49gydF4y2Ba］．然而，很少有人知道的机械方面的反应gydF4y2Bab .黑质gydF4y2Ba与复合胁迫相比，植物倾向于单一胁迫。这就是本研究的主题。gydF4y2Ba

复合胁迫对草食性转录反应的影响gydF4y2Ba

我们使用了全基因组拟南芥CATMA微阵列[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba，gydF4y2Ba51gydF4y2Ba来评估基因表达的变化gydF4y2Bab .黑质gydF4y2Ba．先前的研究表明，拟南芥微阵列可以成功地用于研究植物的转录反应gydF4y2Ba芸苔属植物oleraceagydF4y2Ba或gydF4y2Bab .黑质gydF4y2Ba［gydF4y2Ba52gydF4y2Ba，gydF4y2Ba53gydF4y2Ba］．饲养1天后由gydF4y2Bap . brassicaegydF4y2Ba幼虫在gydF4y2Bab .黑质gydF4y2Ba， 218个基因显著上调(loggydF4y2Ba_2gydF4y2Ba> 0.585,gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)， 49个基因显著下调(log2 >−0.585，gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S1)。基因本体(GO)检索显示，表达上调的基因在损伤反应(GO:0009611)、应激反应(GO:0006950)、茉莉酸刺激反应(GO:0009753)、生物刺激反应(GO:0009607)、几丁质反应(GO:0010200)、防御反应(GO:0006952)、茉莉酸生物合成(GO:0009695)、氧脂素生物合成(GO:0031408)、次生代谢过程(GO:0019748)等词语上高度富集。下调基因在光合作用(GO:0015979)、细胞代谢过程(GO:0044237)、氮代谢(GO:0034631, GO:0044271)、叶绿体(GO:0005907, GO:0044434)等方面富集(附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:表S2)。这一转录特征证实了之前关于其他植物物种对毛虫食草性反应的研究结果，这些研究已经确定了茉莉酸通路在诱导抗虫防御基因方面的关键作用，并观察到光合作用相关基因的下调[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba，gydF4y2Ba54gydF4y2Ba，gydF4y2Ba55gydF4y2Ba，gydF4y2Ba56gydF4y2Ba，gydF4y2Ba57gydF4y2Ba，gydF4y2Ba58gydF4y2Ba，gydF4y2Ba59gydF4y2Ba］．因为我们用的是拟南芥微阵列，有些是远亲gydF4y2Bab .黑质gydF4y2Ba防御基因可能在杂交过程中被遗漏了。一份更详尽的昆虫反应基因列表将等待RNA测序的转录组分析gydF4y2Bab .黑质gydF4y2Ba参考基因组可用。gydF4y2Ba

然后，研究生物预处理如何影响gydF4y2Bap . brassicaegydF4y2Ba-诱导的转录组变化，我们提出了挑战gydF4y2Bab .黑质gydF4y2Ba植物与gydF4y2Bap . brassicaegydF4y2Ba鸡蛋提取物，细菌病原体gydF4y2BaXcrgydF4y2Ba,或gydF4y2Bab . brassicaegydF4y2Ba在添加蚜虫之前gydF4y2Bap . brassicaegydF4y2Ba24 h。作为对照实验gydF4y2Bab .黑质gydF4y2Ba植物对每一个单一的压力。引人注目的是，所有实验的基于表达的聚类分析表明，来自三种联合应激处理的转录组与gydF4y2Bap . brassicaegydF4y2Ba幼虫处理，而卵提取物、细菌病原体或蚜虫单一处理的转录组明显分离(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．事实上，在单纯草食后上调和下调的218个基因中，卵浸液预处理后仍有206个(94%)、43个(88%)基因被同样上调，病原预处理后155个(72%)、38个(78%)基因被同样上调，蚜虫预处理后201个(92%)、46个(94%)基因被同样上调，说明生物预处理对草食后的转录应答影响较弱(图2)。gydF4y2Ba1 b, cgydF4y2Ba)．对50个上调和下调基因进行单次处理后的分析表明，在单次胁迫和蛋膏联合胁迫下，有48个基因表达差异不显著，分别为42个。同样，36个上调基因和46个下调基因在草食胁迫和复合胁迫蚜虫中表达无差异(附加文件)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba:图S1、S2)。然而，在病原体预处理的情况下，前50个基因中有22个诱导明显降低，包括已知的ja调控基因，如gydF4y2BaLOX3gydF4y2Ba，gydF4y2BaCORI3gydF4y2Ba,gydF4y2BaOPR3gydF4y2Ba，这表明细菌感染抑制了对食草性的防御(附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba:图S1)。gydF4y2Ba

压力的组合可能会激活在单一压力下通常不受调控的基因。为了确定组合胁迫的特定特征，我们寻找了仅在三种双重胁迫处理(卵提取物/毛毛虫、病原体/毛毛虫/或蚜虫/毛毛虫)中显著诱导或抑制的基因。符合上述标准的上调基因分别为7、23、52个，下调基因分别为16、15、13个。值得注意的是，这些组合胁迫特异性基因的比较表明，只有一个基因通常在卵提取物/毛虫和病原体/毛虫中受到调控，而其他基因则受到每种胁迫组合的特异性调控(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．对联合应激反应基因的GO搜索没有显示任何特定或保守的生物过程的富集(附加文件)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba:图S3, S4)。这些结果表明，组合胁迫没有典型的转录特征，但每种组合激活了相对少量的额外基因。gydF4y2Ba

复合胁迫对幼虫生长性能和植物防御化合物的影响gydF4y2Ba

的性能gydF4y2Bap . brassicaegydF4y2Ba用鸡蛋提取物或病原体处理过的植物和未处理过的植物，毛虫的体重也得到了测量。当毛虫自由取食经卵提取物或病原体处理过的整片叶子时，它们的增重与对照植物(线性混合模型(LMM))相比显著降低。gydF4y2BaPgydF4y2Ba_{(鸡蛋提取)gydF4y2Ba}= 2 * 10gydF4y2Ba^{−16gydF4y2Ba}和病原体,gydF4y2BaPgydF4y2Ba_{(病原体)gydF4y2Ba}= 2 * 10gydF4y2Ba^{−8gydF4y2Ba})(图。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)．为了测试昆虫在预处理植物上表现的改变是否与防御信号和代谢物的变化相关，我们量化了SA、JA和硫代葡萄糖苷(GS)的浓度。GS是芸苔类植物中有效的防御化合物，可有效对抗多种昆虫，因食草性而累积[gydF4y2Ba60gydF4y2Ba，gydF4y2Ba61gydF4y2Ba，gydF4y2Ba62gydF4y2Ba，gydF4y2Ba63gydF4y2Ba，gydF4y2Ba64gydF4y2Ba］．全叶分析结果表明，虫卵浸提液处理叶片或幼虫饲喂后的病原菌处理叶片与幼虫单独饲喂叶片JA和总GS浓度差异不显著(双向方差分析，gydF4y2BaPgydF4y2Ba_{[JA，鸡蛋提取物]gydF4y2Ba}= 0.62,gydF4y2BaPgydF4y2Ba_{(是的,病原体)gydF4y2Ba}= 0.17,gydF4y2BaPgydF4y2Ba_{[GS，鸡蛋提取物]gydF4y2Ba}= 0.46,gydF4y2BaPgydF4y2Ba_{(GS,病原体)gydF4y2Ba}= 0.41)(附加文件gydF4y2Ba7gydF4y2Ba:图S5)。对于SA，是否有毛毛虫喂食不会改变卵提取物或病原体处理反应的显著积累(双向方差分析，gydF4y2BaPgydF4y2Ba_{[SA，鸡蛋提取物]gydF4y2Ba}= 0.20,gydF4y2BaPgydF4y2Ba_{(SA)、病原)gydF4y2Ba}= 0.49)(附加文件gydF4y2Ba7gydF4y2Ba:图S5)。gydF4y2Ba

由于未处理和预处理植物之间幼虫性能的差异很难用转录组数据、防御激素信号的变化或GS的整体积累来解释gydF4y2Bab .黑质gydF4y2Ba叶片，我们决定研究预处理对幼虫取食部位的影响。其基本原理是，叶片内部局部诱导的变化可能解释了所观察到的影响。值得注意的是，最近一项关于玉米的研究报告显示，与老叶相比，幼叶中防御代谢产物(即1,4-苯并恶嗪-3-酮)的浓度具有统计学意义，且这与昆虫性能呈负相关[gydF4y2Ba65gydF4y2Ba］．我们修改了实验设计，通过在夹笼中局部或远端限制幼虫，相对于预处理部位。卵浸液预处理后毛毛虫增重显著降低，但仅当毛毛虫被迫在预处理部位(LMM，gydF4y2BaPgydF4y2Ba_{(本地)gydF4y2Ba}= 0.029;gydF4y2BaPgydF4y2Ba_{(远端)gydF4y2Ba}= 0.37)。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)．效果与全叶反应相似(图2)。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)．相比之下，毛虫在病原体预处理的叶片上的表现明显好于对照叶片(LMM，gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 9 * 10gydF4y2Ba^{−7gydF4y2Ba})，但当它们被迫从预处理部位远端喂食时，它们的体重没有变化(LMM，gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.22)，这表明，例如，细菌效应物对防御的局部抑制(图。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)．这一结果与全叶实验的结果不同，在全叶实验中，毛虫在病原体预处理过的叶片上的性能降低了(图2)。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)．由此可见，病原体预处理和毛虫取食部位的定位明显影响了病原体对昆虫性能的影响。gydF4y2Ba

为了进一步将昆虫的表现和处理部位与防御化合物和信号激素的积累联系起来，我们定量了从未处理植物和预处理植物叶片组织中收集的SA、JA和GS浓度。在同样暴露于毛毛虫喂食的植物中，从毛毛虫受到约束的区域收集叶子组织，因此在预处理的位置或在远离预处理应用的位置(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．在鸡蛋提取物的实验中，JA只在食草性反应中积累。鸡蛋提取物预处理本身不会引起JA积累，也不会改变毛虫诱导的JA浓度(ANOVA，gydF4y2BaFgydF4y2Ba= 13日31日gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.0001)(图gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba)．相比之下，病原预处理导致JA浓度增加了10倍，而仅暴露于毛虫取食的叶片组织中的JA浓度与对照植物没有显著差异(ANOVA，gydF4y2BaFgydF4y2Ba= 68.85,gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 5 * 10gydF4y2Ba^{−7gydF4y2Ba})(图。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba)．当毛虫从施用病原体的部位远端取食时，当毛虫在同一部位取食时，JA的诱导相同(5倍)。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba)．鸡蛋提取物和病原菌预处理显著诱导SA，且仅在处理部位。此外，草食性对水杨酸浓度没有影响，毛虫对卵提取物或病原体诱导的水杨酸浓度没有影响(方差分析，gydF4y2BaFgydF4y2Ba_{(鸡蛋提取)gydF4y2Ba}= 18.37,gydF4y2BaPgydF4y2Ba_{(鸡蛋提取)gydF4y2Ba}= 2 * 10gydF4y2Ba^{−5gydF4y2Ba}，gydF4y2BaFgydF4y2Ba_{(病原体)gydF4y2Ba}= 66.18,gydF4y2BaPgydF4y2Ba_{(病原体)gydF4y2Ba}= 5 * 10gydF4y2Ba^{−8gydF4y2Ba})(图。gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba)．因此,gydF4y2Bab .黑质gydF4y2Ba叶片通过积累不同的JA或SA浓度对生物挑战做出局部反应，这取决于生物胁迫。此外，SA对联合应激的反应与激素对单一应激的反应没有区别，而JA则有区别。gydF4y2Ba

与全叶实验一样，总GS浓度在对照组和处理植物之间没有显著变化(方差分析，gydF4y2BaFgydF4y2Ba_{(鸡蛋提取)gydF4y2Ba}= 2.71,gydF4y2BaPgydF4y2Ba_{(鸡蛋提取)gydF4y2Ba}= 0.058,gydF4y2BaFgydF4y2Ba_{(病原体)gydF4y2Ba}= 0.66,gydF4y2BaPgydF4y2Ba_{(病原体)gydF4y2Ba}= 0.68)。gydF4y2Ba4 dgydF4y2Ba)．在鉴定和定量的13种硫代葡萄糖苷中(附加文件gydF4y2Ba8gydF4y2Ba:表S3)，不同处理中苦参苷对总GS含量的贡献为91% ~ 96%。与生物胁迫后GS积累不足相一致gydF4y2Bab .黑质gydF4y2Ba，我们观察到27个GS生物合成基因中的22个基因的表达在单一或联合胁迫下没有显著增强(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba:表S1，图S6)。这与拟南芥草食后GS生物合成各步骤基因的协调诱导形成了鲜明对比[gydF4y2Ba64gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

复合应力对SA/JA串扰的影响gydF4y2Ba

由于暴露于卵提取物、病原体处理和毛虫取食在不同程度上触发了SA和JA的积累，我们决定研究已知的SA/JA拮抗作用在联合胁迫下的响应。我们设计了QPCR引物gydF4y2Bab .黑质gydF4y2Ba相关序列gydF4y2BaVSP2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaMYC2gydF4y2Ba，即JA-和草食调节基因[gydF4y2Ba56gydF4y2Ba]和forgydF4y2BaPR2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaSAG13gydF4y2Ba，这是SA和蛋的调控基因[gydF4y2Ba66gydF4y2Ba］．在单一胁迫处理中，gydF4y2BaBnVSP2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaBnMYC2gydF4y2Ba在受毛虫喂养的组织中表达显著上调，但在蛋提取物或病原体处理的组织中没有(双向方差分析，gydF4y2BaPgydF4y2Ba_{[VSP2，鸡蛋提取物]gydF4y2Ba}= 0.01,gydF4y2BaPgydF4y2Ba_{[VSP2,病原体]gydF4y2Ba}< 0.0001,gydF4y2BaPgydF4y2Ba_{[MYC2，鸡蛋提取物]gydF4y2Ba}= 0.04,gydF4y2BaPgydF4y2Ba_{[MYC2,病原体]gydF4y2Ba}< 0.0001)(图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．与之相反,gydF4y2BaBnPR2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaBnSAG13gydF4y2Ba在鸡蛋提取物或病原体处理的组织中显著上调，但在暴露于毛毛虫喂养的组织中没有(双向方差分析，gydF4y2BaPgydF4y2Ba_{[PR2，鸡蛋提取物]gydF4y2Ba}< 0.0001,gydF4y2BaPgydF4y2Ba_{[PR2,病原体]gydF4y2Ba}< 0.0001,gydF4y2BaPgydF4y2Ba_{[SAG13，鸡蛋提取物]gydF4y2Ba}< 0.0001,gydF4y2BaPgydF4y2Ba_{[SAG13,病原体]gydF4y2Ba}< 0.0001)(图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．有趣的是，对于联合胁迫，我们发现卵提取物和病原体预处理都导致昆虫反应的诱导显著降低gydF4y2BaBnVSP2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaBnMYC2gydF4y2Ba．联合胁迫也减少了卵提取物或病原体反应的诱导gydF4y2BaBnSAG13gydF4y2Ba,而gydF4y2BaBnPR2gydF4y2Ba仅鸡蛋提取物预处理能抑制诱导(图;gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．这些结果表明，在双重胁迫条件下，在鸡蛋提取物或病原体预处理后的草食中，SA和JA的联合积累会对特定的JA和SA反应基因产生负面影响。因此，我们观察到一个一致的和互反的SA/JA串扰gydF4y2Bab .黑质gydF4y2Ba，以卵提取物或病原体处理后，再喂食毛虫。gydF4y2Ba

暴露于两种或两种以上的生物压力可能比单一压力更有害，或者相反，具有衰减作用。因此，植物识别和应对组合和特定胁迫的能力似乎很重要，特别是当病原体和食草动物等胁迫触发不同的植物防御途径时。多胁迫条件下的全基因组响应研究较少，基因表达研究多集中在拟南芥模型上。在这里,gydF4y2Ba黑质,gydF4y2Ba它也是一种十字花科植物，被用来研究植物如何对联合胁迫做出反应。令人惊讶的是，转录组反应gydF4y2Bab .黑质gydF4y2Ba到不同的预处理，然后gydF4y2Bap . brassicaegydF4y2Ba草食性研究表明，第一种胁迫对第二种胁迫的转录反应影响不大。此外，没有基因共同的组合压力可以确定。最近发现，以前接触过的影响gydF4y2Bab .灰质gydF4y2Ba或干旱只略微改变拟南芥的转录反应gydF4y2Bap . rapaegydF4y2Ba喂食，这表明植物优先考虑对第二种压力的反应[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．类似地，拟南芥转录组gydF4y2Bap . brassicaegydF4y2Ba喂养不受预暴露的影响gydF4y2Bap . brassicaegydF4y2Ba鸡蛋，虽然它受到了冷预处理的影响[gydF4y2Ba67gydF4y2Ba］．然而，一项详细的时间过程分析显示，预暴露会改变毛毛虫诱导反应的时间。植物对gydF4y2Bap . rapaegydF4y2Ba如果之前发生了干旱或者gydF4y2Bab .灰质gydF4y2Ba治疗(gydF4y2Ba59gydF4y2Ba]，表明需要考虑作出反应的时机。阿特金森和同事[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba)假设在多重攻击中，植物会优先对最具破坏性的胁迫做出反应(另见[gydF4y2Ba68gydF4y2Ba])。在干旱和/或线虫胁迫的拟南芥中，96%的差异调控基因在联合胁迫和水分胁迫中共享，而只有2%的差异调控基因与线虫取食重叠[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba］．我们假设gydF4y2Bab .黑质gydF4y2Ba优先处理毛毛虫的食物，而不是蚜虫、虫卵或细菌，这样有利于自身的健康gydF4y2Bap . brassicaegydF4y2Ba毛虫以芸苔类植物为食;这些毛虫在二龄及以后的阶段是食花的，因此直接降低了适应性[gydF4y2Ba69gydF4y2Ba］．同样在代谢组水平上，变化gydF4y2Bab .黑质gydF4y2Ba暴露于gydF4y2Bab . brassicaegydF4y2Ba蚜虫和/或gydF4y2Bap . brassicaegydF4y2Ba在同一片叶子上，无论是单独取食还是与蚜虫一起取食，幼虫对幼虫取食的反应都最强[gydF4y2Ba68gydF4y2Ba］．进行互反实验来观察转录组是否gydF4y2Bap . brassicaegydF4y2Ba-预处理的植物被第二种生物胁迫的特征所主导，或者植物优先考虑对食草性的反应而不是其他胁迫。拟南芥侵染病毒的转录组研究gydF4y2Ba葡萄孢菌gydF4y2Ba无论是否有先前的食草性，都表明第一个假设更有可能[gydF4y2Ba59gydF4y2Ba］．另一个可验证的假设是，植物对最严重的压力有反应，与攻击的顺序无关。gydF4y2Ba

我们观察了预处理与生物营养性病原体gydF4y2BaXcrgydF4y2Ba对gydF4y2Bap . brassicaegydF4y2Ba转录组。事实上，约30%的昆虫诱导基因，包括ja调控基因，对联合胁迫的反应明显减少，但与此同时，昆虫的体重增加gydF4y2Bap . brassicaegydF4y2Ba当幼虫全叶取食或限制其远端取食时，幼虫在病原侵染植物上数量减少。自gydF4y2BaXcrgydF4y2Ba单次处理触发SA积累，我们假设SA/JA串扰是导致基因表达减弱的原因。我们有针对性的分析JA标记gydF4y2BaBnVSP2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaBnMYC2gydF4y2Ba证实了这一观察结果，但昆虫性能测定也表明，这些基因的衰减对植物的防御没有负面影响gydF4y2Bap . brassicaegydF4y2Ba．在用鸡蛋提取物预处理过的植物上，毛毛虫的体重增加也减少了。sa反应基因，包括gydF4y2BaPR1gydF4y2Ba，经鸡蛋提取物处理后明显上调，表明SA通路被鸡蛋激活，如拟南芥[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba66gydF4y2Ba］．在全基因组水平上SA/JA交联的明显缺失可能是由于相对较弱的反应gydF4y2Bap . brassicaegydF4y2Ba鸡蛋。的确，我们发现之后SA的积累要高得多gydF4y2BaXcrgydF4y2Ba病原比后gydF4y2Bap . brassicaegydF4y2Ba鸡蛋提取物治疗。此外，全叶分析可能稀释了局部反应，因为我们检测到局部抑制gydF4y2BaBnVSP2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaBnMYC2gydF4y2Ba卵提取物处理后的表达。防御信号通路之间的交叉对话被认为可以强烈地调节联合生物胁迫的结果[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．在这里，我们还表明，病原体和卵提取物预处理抑制了JA-和sa调控基因的诱导，以响应额外的喂养gydF4y2Bap . brassicaegydF4y2Ba这表明SA/JA交声降低了一些被认为在植物防御昆虫中重要的基因的转录。gydF4y2Ba

虽然单gydF4y2BaXcrgydF4y2Ba侵染导致SA和JA的强烈积累，值得注意的是只有SA调控gydF4y2BaBnPR2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaBnSAG13gydF4y2Ba是诱导的而不是ja调控的gydF4y2BaBnVSP2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaBnMYC2gydF4y2Ba．此外，SA/JA串扰效应在gydF4y2BaBnVSP2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaBnMYC2gydF4y2Ba转录水平的反应相结合gydF4y2BaXcrgydF4y2Ba/草食胁迫，表明SA在这一特定环境中强烈影响了JA途径。因此，防御信号的积累并不一定与下游基因的诱导相关，这取决于激素的环境。相反，病原体和鸡蛋提取物诱导sa信号相关基因gydF4y2BaBnPR2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaBnSAG13gydF4y2Ba被毛虫摄食抑制，说明JA/SA互串也在起作用。这种相声对易患的后果gydF4y2BaXcrgydF4y2Ba感染没有进行测试，但这将是未来研究的一个有趣的主题。因此，JA和SA的活化及其相互拮抗作用可能取决于处理的强度或性质。例如，拟南芥的一项研究报告，如果分别用低浓度或高浓度的每种激素处理植物，会对JA-和sa诱导的基因产生协同或拮抗作用[gydF4y2Ba70gydF4y2Ba］．此外，已知植物对食草性的反应是动态的，可能取决于采样时间[gydF4y2Ba59gydF4y2Ba，gydF4y2Ba71gydF4y2Ba］．因此，在未来的实验中，看看我们在单个时间点上对SA/JA串扰的观察是否有力地支撑了组合相互作用的结果，将是很有趣的。总之，尽管出现的情况是最近的应激在转录反应中占主导地位[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba59gydF4y2Ba]，通过扩展生物和非生物压力相互组合的范围，包括时间过程分析，来证实这一假设将是有趣的。gydF4y2Ba

我们发现不同处理之间昆虫的表现不同，这表明复合胁迫后植物的抗性状况很难根据转录组、防御激素谱或防御途径串扰来预测。的确，我们观察了昆虫之后的表现gydF4y2Bap . brassicaegydF4y2Ba蛋精用量减少。在拟南芥中，我们已经证明了这一点gydF4y2Bap . brassicaegydF4y2Ba卵子沉积对专家的表现没有影响gydF4y2Bap . brassicaegydF4y2Ba［gydF4y2Ba35gydF4y2Ba］．拟南芥和gydF4y2Bab .黑质gydF4y2Ba透露,gydF4y2Bap . brassicaegydF4y2Ba在有卵子的情况下表现较差或相同，这取决于卵子捐赠者的物种身份[gydF4y2Ba67gydF4y2Ba，gydF4y2Ba72gydF4y2Ba，gydF4y2Ba73gydF4y2Ba，gydF4y2Ba74gydF4y2Ba］．类似的结果也被发现gydF4y2Bap . brassicaegydF4y2Ba以其他野生芸苔科植物为食。gydF4y2Ba芸苔属植物oleraceagydF4y2Ba，gydF4y2BaMoricandia moricandioidesgydF4y2Ba而且gydF4y2BaSinapsis薄荷gydF4y2Ba暴露于gydF4y2Bap . brassicaegydF4y2Ba鸡蛋(gydF4y2Ba43gydF4y2Ba］．相反，多面手gydF4y2Ba美国littoralisgydF4y2Ba在已处理过的植株上表现较好gydF4y2Bap . brassicaegydF4y2Ba卵子提取液或自然产卵后[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba75gydF4y2Ba但对多面手的鸡蛋没有发现任何影响gydF4y2BaMamestra brassicaegydF4y2Ba在随后的gydF4y2Bam . brassicaegydF4y2Ba幼虫表现[gydF4y2Ba72gydF4y2Ba］．因此，虫卵是否诱导植物防御是环境特异性的。同样，暴露于生物营养性病原体是否会产生影响取决于具体的环境[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba76gydF4y2Ba]也可能取决于病原体的毒力水平[gydF4y2Ba77gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

此外,gydF4y2Bap . brassicaegydF4y2Ba毛毛虫自由进食gydF4y2BaXcrgydF4y2Ba与以未经处理的叶子为食的毛毛虫相比，未经处理的叶子增加的重量更少。因此，在全叶水平上，gydF4y2BaXcrgydF4y2Ba预处理对植物防御反应的影响类似于鸡蛋提取物预处理，尽管其潜在机制可能有所不同。一项关于gydF4y2Ba甜椒gydF4y2Bal报告了增强的性能gydF4y2Ba美国exiguagydF4y2Ba感染的植物上的幼虫gydF4y2Bax定gydF4y2Bapv。gydF4y2Ba实验gydF4y2Ba［gydF4y2Ba76gydF4y2Ba］．相比之下，性能gydF4y2Bap . brassicaegydF4y2Ba拟南芥幼虫减少gydF4y2Ba两gydF4y2Bapv。番茄(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．同样，昆虫在感染植物病原体的植物上的表现似乎是可变的。gydF4y2Ba

令人惊讶的是，与全叶生物测定相比，昆虫性能测定得出了一些相反的结论，使用夹子笼限制毛毛虫在叶片上特定位置的取食。而卵提取物处理对幼虫的影响相似，无论它们是在整个叶子上自由进食，还是在夹笼中局部进食，gydF4y2Bap . brassicaegydF4y2Ba毛毛虫以gydF4y2BaXcrgydF4y2Ba-渗透的叶面积比那些限制在非感染区或未经处理的叶上进食的叶面积大。这一观察结果可以通过我们发现的局部抑制ja依赖的防御基因表达来解释gydF4y2BaXcrgydF4y2Ba预处理，虽然限制饲喂鸡蛋提取物预处理组织没有导致提高昆虫性能。因此，其他因素可能会导致局部效应。gydF4y2BaXcrgydF4y2Ba感染引起SA和JA的局部积累gydF4y2Bap . brassicaegydF4y2Ba蛋精处理仅引起SA积累。食草昆虫倾向于避开有防御的树叶区域[gydF4y2Ba78gydF4y2Ba]，而在夹笼约束条件下，它们无法做到这一点。事实上，当我们有选择的时候，我们注意到了gydF4y2Bap . brassicaegydF4y2Ba幼虫避免卵处理和gydF4y2BaXcrgydF4y2Ba-感染区域(附加文件gydF4y2Ba10gydF4y2Ba:图S7)。这是有趣的关于幼虫的相反表现，当喂食卵处理或gydF4y2BaXcrgydF4y2Ba来华的区域。这一幼虫选择性取食的发现值得进一步研究。gydF4y2Ba

SA和JA信号通路的不同激活可能会影响代谢物的组成。然而，我们没有观察到不同处理间GS积累的差异。在臭氧和臭氧结合后观察到类似的发现gydF4y2Bap . brassicaegydF4y2Ba治疗gydF4y2Bab .黑质gydF4y2Ba，虽然幼虫在臭氧预处理的植物上生长较差[gydF4y2Ba79gydF4y2Ba］．Ponzio等人的研究报告了相反的结果。[gydF4y2Ba68gydF4y2Ba]，其中GS总浓度显著增加gydF4y2Bap . brassicaegydF4y2Ba毛毛虫。此外，在双重胁迫条件下，以毛虫和gydF4y2Bab . brassicaegydF4y2Ba蚜虫的数量取决于蚜虫的密度。在Ponzio等人的研究中，每叶毛虫密度的差异为30个[gydF4y2Ba68gydF4y2Ba]和这里的10，可以解释这种差异。如先前所假设的[gydF4y2Ba80gydF4y2Ba]，其他防御化合物可能发挥至关重要的影响作用gydF4y2Bap . brassicaegydF4y2Ba在芸苔科植物上的表现gydF4y2Ba．gydF4y2Ba最近对黄酮类化合物的鉴定产生了负面影响gydF4y2Bap . brassicaegydF4y2Ba拟南芥中毛毛虫的表现支持了这一结论[gydF4y2Ba81gydF4y2Ba，gydF4y2Ba82gydF4y2Ba］．此外，由于ET是与gydF4y2BaXcrgydF4y2Ba拟南芥[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba的局部性ET信号通路可能参与了的局部性效应gydF4y2BaXcrgydF4y2Ba在gydF4y2Bap . brassicaegydF4y2Ba的性能。此外，处理地点的植物营养质量也可以发挥作用。它可能与虫卵处理后的昆虫表现负相关，但与虫卵处理后的昆虫表现正相关gydF4y2BaXcrgydF4y2Ba处理网站。例如，发现叶片碳水化合物含量受JA控制，并介导植物对适应食草动物的敏感性gydF4y2Ba烟草attenuata则gydF4y2Ba［gydF4y2Ba83gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

转录组分析gydF4y2Bab .黑质gydF4y2Ba尽管预处理明显影响了植物抵抗食草动物攻击的方式，但对联合胁迫处理的反应显示，第二种胁迫主导了转录特征。测量防御信号激素和防御标记基因转录水平以应对不同胁迫的多重攻击并不一定能直接预测植物的防御反应。未来的研究应该包括更多的标记基因，代表沿着分子序列的不同步骤。我们的结果表明，在多重胁迫条件下，植物对每种胁迫组合有高度特异性的反应。对比反应强烈地表明，我们需要更好地整合不同生物组织水平的反应，考虑叶片内的局部和远处植物反应，并在试图将植物性状与昆虫性能联系起来时，测量一系列(防御)代谢产物的积累，以决定营养质量。gydF4y2Ba

生物材料gydF4y2Ba

的种子gydF4y2Ba芸苔属植物黑质gydF4y2Ba取自瓦赫宁根(荷兰)的野生种群[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba］．在白色荧光灯(170 μmol m)照射下，在生长室(光照16 h，日间25℃，夜间22℃，相对湿度60%)土壤中生长gydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}年代gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})．播种后种子在4℃下分层3 d。土壤含有65%的腐殖质，10%的沙子，15%的珍珠岩和10%的淤泥。在下面描述的不同生物测定中，生长条件相同。gydF4y2Ba

黄定gydF4y2Bapv。gydF4y2BaraphanigydF4y2Ba（gydF4y2BaXcrgydF4y2Ba)(以前被分类为gydF4y2Bax定gydF4y2Bapv。gydF4y2BaarmoraciaegydF4y2Ba)从荷兰乌得勒支大学植物-微生物相互作用组获得，最初从美国俄亥俄州立大学植物病理学系获得。通过致病性试验和PCR鉴定病原性。细菌在10 ml King B液体培养基(20 g/ l蛋白胨(Sigma-Aldrich)、1.5 g/ l磷酸氢二钾、1.5 g/ l七水硫酸镁、12 g/ l琼脂，最终pH为7.2)中添加利福平(25 μg/ ml)，在28°C、200 rpm的摇床中培养48 h。gydF4y2BaXcrgydF4y2Ba以7000转/分的速度离心培养2分钟。丢弃上清液，洗净颗粒并在10 mM MgCl中重新悬浮gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba再次以7000 rpm离心2 min。弃上清，用10 mM MgCl稀释颗粒gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba并调整到OD 600为0.07，以获得10的浓度gydF4y2Ba^7gydF4y2Bacfu /毫升。gydF4y2Ba

地区brassicaegydF4y2Ba以抱子芽植物饲养(gydF4y2Ba甘蓝变种gydF4y2Ba) 1米gydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba瑞士洛桑大学温室(25±5°C, 60±5% RH, 16/8小时明暗循环)。人工从植物中取出鸡蛋，用杵在埃本多夫管中碾碎。离心后(15 ' 000gydF4y2BaggydF4y2Ba， 3 min)，上清液(蛋液)保存在−20°C。gydF4y2Ba

Brevicoryne brassicaegydF4y2Ba蚜虫被养大了gydF4y2Bab . oleraceagydF4y2Bavar。gydF4y2BagemmiferagydF4y2Ba在荷兰瓦赫宁根大学(Wageningen University)的温室(22±3℃，65±5% RH, 16/8 h明暗循环)中，所有的蚜虫实验也在那里进行。gydF4y2Bab .黑质gydF4y2Ba植物生长在泥炭土壤(Lentse potgrond no。4、大斋节，荷兰)。gydF4y2Ba

害虫种类gydF4y2Bap . brassicaegydF4y2Ba而且gydF4y2Bab . brassicaegydF4y2Ba,gydF4y2Bab .黑质gydF4y2Ba植物是在荷兰的野外采集的。这符合国家立法，因为荷兰根据《名古屋议定书》允许自由访问其生物多样性。正确识别gydF4y2Bab .黑质gydF4y2Ba得到了E. H. Poelman博士(荷兰瓦赫宁根大学植物科学系)的证实。的种子gydF4y2Bab . oleraceagydF4y2Bavar。gydF4y2BagemmiferagydF4y2Ba从Semences Zollinger (1897 Les evouttes，瑞士)或Syngenta Seeds (2678 LV De Lier，荷兰)获得。gydF4y2Ba

植物治疗gydF4y2Ba

总体实验设计总结在表S4(附加文件gydF4y2Ba11gydF4y2Ba:表S4)。在不同的处理条件下，植株生长5周。对3种植物的3个发育完全的最年轻的叶片分别进行了蛋液和病原菌预处理。蚜虫被应用在一片叶子上，即第一片发育完全的叶子(总共9株)，根据相同研究系统的先前实验中使用的设计[gydF4y2Ba84gydF4y2Ba，gydF4y2Ba85gydF4y2Ba］．为gydF4y2Bap . brassicaegydF4y2Ba卵提液处理:在三片叶片中分别添加12 × 2 μl卵提液，孵育72 h。该处理与之前对拟南芥的处理相当，每片叶片约有10-12个卵批，每批包含20-30个卵[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba66gydF4y2Ba］．以未经处理的植物叶片为对照。gydF4y2Ba

对于细菌病原体的感染gydF4y2Bax定gydF4y2Bapv。gydF4y2Baraphani,gydF4y2Ba三个处理叶片分别进行了3次10的渗透gydF4y2Ba^7gydF4y2Bacfu/ml，用1ml无针注射器孵育72 h。每个浸润区为1.5 cm的圆形gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba．在对照厂，同样数量的10mm MgClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba进行渗透。gydF4y2Ba

用于治疗gydF4y2Bab . brassicaegydF4y2Ba将100只若虫放置在9株植物发育完全的最年轻的叶片上，培养48小时。蚜虫没有受到限制，而是留在了它们被引入的叶片上。gydF4y2Ba

幼虫处理包括在三片接受预处理(联合胁迫)的叶片上或在与洁净植物发育相似的三片叶片上引入10只新生毛虫。在蚜虫处理过的单叶或洁净植株的单叶上引种了30只新生毛虫。饲养24 h。gydF4y2Ba

所有实验每隔几周独立重复5次或以上。gydF4y2Ba

卵提取物或病原体预处理植物的昆虫性能测定gydF4y2Ba

的有没有gydF4y2Bab .黑质gydF4y2Ba在生长室(20±1°C, 65±10%相对湿度，10/14 h明暗循环，100 μmol m)中，将植物置于60 × 60 × 60 cm的塑料帐篷(Bugdorm公司)中gydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}年代gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})．在整片叶子上进行昆虫生物测定时，将10只新生毛虫放在3片预处理过的叶子上，或放在3片干净植物的叶子上，每株总共30只毛虫。饲养7 d后测定毛虫体重。为了研究预处理的局部和远端影响，将5只新生毛虫放在夹子笼子(36.5 × 25.4 × 9.5 mm, BioQuip Products，美国)中，分别放在3片预处理叶片上，每株共15只幼虫，分别位于预处理施用部位的同一部位或远端。用卵提取物或病原体对植物进行如上处理，并培养3天(见图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba实验设计)。4 d后测定毛虫体重。在所有实验中，不同处理之间的昆虫恢复情况相似。gydF4y2Ba

每种处理分别在三种不同的植物上进行。所有实验每隔几周独立重复三次或三次以上。gydF4y2Ba

激素和硫代葡萄糖苷分析gydF4y2Ba

如前所述，将取样用于激素(SA和JA)和GS分析的叶片组织暴露于卵提取物、病原体和/或毛虫喂食中。采集整片叶子(不限制毛毛虫取食的实验)或2.4厘米叶盘(限制毛毛虫取食的实验)，并在液氮中冷冻。如前所述进行提取、UHPLC-QTOFMS测量和数据分析[gydF4y2Ba86gydF4y2Ba，gydF4y2Ba87gydF4y2Ba］．每个处理分析三个独立的生物重复。gydF4y2Ba

转录组分析gydF4y2Ba

处理后，采集整片叶子，在液氮中快速冷冻，并在- 80°C保存。RNA提取、探针标记、拟南芥CATMAv4微阵列杂交和数据分析已在之前发表[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba，gydF4y2Ba56gydF4y2Ba，gydF4y2Ba88gydF4y2Ba］．对于数据分析，我们使用了log的表达式阈值gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba> 0.585和< - 0.585，以及未经调整的gydF4y2BaPgydF4y2Ba-value为0.05。FDR值显示在补充数据中，以便进一步评估。GO富集分析采用AgriGO奇异富集分析，采用超几何试验[gydF4y2Ba89gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

定量聚合酶链反应gydF4y2Ba

根据先前发表的方法测量相对基因表达[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba90gydF4y2Ba］．简单地说，根据商业说明书，使用M-MLV逆转录酶(Invitrogen)和oligo dT引物将500纳克总RNA转录为cDNA。cDNA的合成在三个重复中完成。QPCR分析按照Brilliant III Fast SYBR Green说明书(安捷伦)进行，最终体积为25 μl。gydF4y2Bab .黑质gydF4y2Ba引物(附加文件gydF4y2Ba12gydF4y2Ba:表S5)设计在来自不同物种的基因的多个比对所识别的保守序列上gydF4y2Ba芸苔属植物gydF4y2Ba家庭。序列从gydF4y2Ba芸苔属植物gydF4y2Ba数据库(gydF4y2Bahttp://brassica.nbi.ac.uk/BrassicaDB/gydF4y2Ba)．每个引物的Tm为60°C，在cDNA链的保守部分，扩增子长度在100到250 bp之间。引物效率通过五步稀释回归进行评估。每个扩增子产生一个条带，并通过Sanger测序证实。为了标准化，gydF4y2BaBnSANDgydF4y2Ba基因被用作管家基因。类似于拟南芥gydF4y2Ba沙子gydF4y2Ba基因(gydF4y2Ba91gydF4y2Ba]，在实验中表达稳定。gydF4y2Ba

我们感谢布莱斯·天梭对工厂的维护和约翰·韦伯对微阵列分析的帮助。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

瑞士国家科学基金会(资助31003A_149286和EUROCORES计划EuroVOL资助31VL30_134414给PR)和荷兰科学研究组织(NWO)的地球与生命科学委员会(ALW) (EUROCORES计划EuroVOL资助855.01.171给MD)支持了这项工作。gydF4y2Ba

数据和材料的可用性gydF4y2Ba

微阵列数据已提交至ArrayExpress数据库(gydF4y2Bawww.ebi.ac.uk arrayexpressgydF4y2Ba)，登记编号为E-MTAB-5059。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 洛桑大学植物分子生物学系，瑞士洛桑生物馆1015号gydF4y2Ba

   克里斯特尔·邦纳，史蒂夫·拉苏尔和菲利普·雷蒙德gydF4y2Ba

2. 荷兰瓦赫宁根大学昆虫学实验室，信箱16,6700 AA，瓦赫宁根，荷兰gydF4y2Ba

   Camille Ponzio, Rieta Gols和Marcel DickegydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

CB、CP、RG、MD、PR设计实验。CB、SL和CP进行实验。CB和PR分析了数据。CB, MD, RG和PR撰写了论文。所有作者均已阅读并同意此稿件。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

菲利普·雷蒙德的信件。gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

发表同意书gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者宣称他们之间没有利益冲突。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文根据创作共用属性4.0国际许可协议(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba)，允许在任何媒介上不受限制地使用、分发和复制，前提是您对原作者和来源给予适当的赞扬，提供到创作共用许可证的链接，并注明是否进行了更改。创作共用公共领域奉献弃权书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)除另有说明外，适用于本条所提供的资料。gydF4y2Ba

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