'菠萝'甜橙叶片中的开花基因的表达模式[柑橘sinensis.(l)和柚子(柑橘祖母OSB.艾克）

背景

在柑橘中，从幼龄到成熟期的转变是由树的开花和结出一致的能力所标志的。柑橘的幼年期很长，这严重阻碍了利用遗传策略来提高果实品质、抗病能力和对非生物环境因素的响应。在许多植物物种中，表达花发育信号的基因之一是开花位点t (ft)．

结果

在本研究中，研究了开花基因的表达水平CiFT1, CiFT2和CiFT3采用反转录定量实时PCR技术对佛罗里达州柑橘树进行了1年的检测。采用不同树龄的不同基因型。在成熟的柚子树(柑橘祖母“菠萝”甜橙(柑橘sinensis.（L.）Osbeck）所有三个的表达CiFT在开花结束后，基因在4月份协调并明显更高，无论它们是在温室还是在领域。有趣的是，未成熟的“菠萝”幼苗显示出显着高的水平CiFT3表达在4月和6月，而CiFT1和CiFT26月表达量最高，因此在成熟植株中诱导表达不同步。

结论

在成熟的柑橘树中诱导CiFTs叶片中的表达发生在春天的末端，并且在开花后发生建议它与休眠中断和进一步的花芽发育不相关，但可能涉及射击顶点分化和花芽测定。CiFTs在未成熟幼苗中也有季节性诱导，这表明一定有其他因素抑制开花诱导，它们的表达有其他功能。

许多柑橘物种的特征是具有延长的幼发期，因此许多年不开花或结果，长达十年或更长[1那2］．导致柑橘树开花的过程很可能涉及环境和生理线索。在拟南芥开花线索包括植物激素，如赤霉素(GA)，春化，光，基因表达模式和其他生理反应[3.］．花的发育发生在茎顶分生组织;然而，一些参与其中的环境反应途径在树叶中起作用。拟南芥众所周知，植物在短日照条件下(8或10小时的光照)仍处于营养状态。当转换到长昼(光照16小时)时，参与开花过程的基因会在24小时内在分生组织中表达[4.］．一些研究也证明了低温条件在诱导柑橘开花中的重要性[5.那6.］．这种温度条件已被证明对开花的季节性周期性有影响，但很少有关于这一和其他环境提示对柑橘的开花途径中基因表达的影响的研究。在拟南芥涉及开花途径的许多基因已经过度研究，并且清楚地理解其角色[4.］．多年生树木中开花基因的同源物，如柑橘为进一步探讨柑橘品种间幼龄期差异如此之大的原因以及季节性对基因表达谱的影响程度提供了基础。

具有重要商业价值的柑橘品种在世界上潮湿的亚热带地区如佛罗里达、中国中部、巴西和墨西哥繁荣[2］．这些地区雨水、阳光、风、湿度和温度的平衡有利于柑橘的生长和生产。因此，了解这些特定区域的因子如何影响季节周期性，进而影响开花途径基因的基因表达是很重要的。特别是佛罗里达州，从4月到10月气温最高;尽管夏季气温很少超过40°C。在夏季，低温范围从佛罗里达北部接近21°C到该州最南端的Keys地区接近27°C。夏季全州的平均高温为33到35摄氏度。11月至3月期间，佛罗里达确实会出现中度至严重的冰冻，但该州的气候条件适合某些商业柑橘品种[2］．经济上重要的柑橘品种，如“菠萝”甜橙(柑橘sinensis.(l)和柚子(柑橘祖母奥贝克）已知在佛罗里达州的悠久少女时期和季节性开花，强调这些是两个独立但相关过程。对于这些种类的柑橘，涉及开花发作的分子机制尚未表征。实际上，大多数迄今为止的研究已经在日本的普通话中进行了与佛罗里达州那些完全不同的气候条件6.］．

也许在不同的属中被广泛研究的开花基因是开花轨迹T（英国《金融时报》)．在拟南芥表达式的英国《金融时报》基因和constans 1过表达抑制因子(soc1)认为基因是必需的君士坦斯(有限公司)诱导开花。英国《金融时报》通常在花诱导开始时最大限度地表达[7.］．本构表达的rapidopsis ft.苹果基因[8.]，大豆[9.和白杨树[10]导致早熟开花表型和FT在柑桔(柑橘unshiuMarc。）与花数字相关联[11］．此外,英国《金融时报》同源物已被鉴定为多种属，如水稻[12],杨树[13那14]，柑橘[6.那15，以及许多其他的。在柑橘类,CiFT1Satsuma普通话的同源物[6.]在三叶橙中组成表达，并具有明显的早花表型[15］．基于的病毒载体柑橘叶斑病病毒也被用于构成性表达答:芥和C. Sinensis Ft.并能诱导多种柑橘类幼体开花[16］．

西川等人[6.]在日本进行了实时荧光定量PCR研究，包括CiFT1和两个新的同系物英国《金融时报》在柑橘类(CiFT2和CiFT3）， 虽然CiFT1和CiFT2被认为是同一位点的等位基因[17］．本研究提供了一些洞察力涉及开花活动的几种基因的表达模式，但在现场条件下没有针对柑橘树建立了定期模式。总体而言，一些途径和开花的机制拟南芥已被证明在包括木质多年生植物在内的其他物种中被保守，但必须进行更多的研究来调查特定的分子机制柑橘．

总而言之，柑桔开花需要两个过程:1)植株必须成熟，2)必须暴露在正确的环境线索下。因此，本研究的主要目的是比较FTs基因在成熟柑橘和幼柑橘叶片中表达的季节周期性。由于FT被认为是植物开花诱导的主要决定因素，并且在佛罗里达的条件下观察到了开花的季节性，我们开始研究它在成熟(开花)和幼(不开花)个体之间的表达模式如何不同。此外，既然柑橘至少有两个FTs，是否存在表达水平的差异，可以表明不同的年龄或季节的功能?因此，一项为期1年的体内跟踪研究C一世FT1, CiFT2和CiFT3在不同年龄和基因型的柑橘树中进行了表达。基因表达水平以月为单位进行比较_T.实时荧光定量PCR方法。叶组织被用于这一目的有几个原因。首先,英国《金融时报》已知基因表达发生在叶片中，而FT蛋白易位到分生组织[18］．此外，一些被分析的树木是幼树，不开花。柑橘，像许多其他多年生植物一样，在相同的冲洗茎中有叶和花的分生组织，这些不同的分生组织很难区分，因此分析分生组织，尽管有可能，是有问题的。叶子作为被检查的组织似乎是合适的，因为我们的目的不是比较不同的组织，而是测量基因表达，因为它与年份和年龄有关。因此，我们观察了从全年选择的基因转录本的生产，而不仅仅是在开花。

植物材料

本研究中使用的柑橘基因型是'菠萝甜橙（PSO）（柑橘sinensis.(l)和柚子(柑橘祖母osbeck）（pum）。T.wo adult ‘Pineapple’ sweet orange trees of approximately 15 years of age were located in the USDA A. H. Whitmore Farm (23,402 USDA Rd., Groveland, FL 34736 (28°41′16.1″N 81°53′09.6″W; summer solstice daylight: 13:57 h, winter solstice daylight: 10:15 h; January average high: 22 °C, average low: 9 °C; July average high: 34 °C, average low: 23 °C). The temperatures registered during the experimental period are shown in Additional file1:图S1。其中一棵甜橙树是无籽突变体，另一棵有种子。在佛罗里达大学盖恩斯维尔的温控温室(29°38 ' 20.8″N 82°21 ' 35.6″W;夏至日:14:03 h，冬至日:10:14 h)，温度设置在18 - 35°C之间，不补光。三棵两岁的PSO树也在同一个温室里。因此，本研究共使用了6棵树。每个月从每棵树上采集一次叶子，为期12个月，在同一天从两个地点采集。年度收集期从2012年7月3日开始，至2013年6月28日结束。对于PSO无籽、有籽和柚子成熟乔木，分别从乔木的不同部位采集3个不同的叶片样品作为生物复制。每个复制的代表性样本包括从新生长到老生长的多个叶片。 For the 2-year-old PSO trees, three different plants were used as biological replicates and each sample also consisted of several leaves representative of the whole tree. Collected tissue was stored in aluminum foil in a cooler with dry ice during transport to a − 80 °C freezer in the laboratory.

RNA提取和cDNA合成

根据制造商的说明，使用TriZol试剂(Invitrogen)提取总RNA，然后用DNase处理，并用RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN)清理。使用NanoDrop 2000c分光光度计(Thermo Scientific)测定RNA浓度和纯度。采用基于OD的标准₂₆₀/ OD₂₃₀（≥1.7），OD₂₆₀/ OD₂₈₀(≥1.7)和RNA吸光度曲线判定样品质量合格。cDNA合成反应如下:总共16μL纯化RNA组成的1μg, 2μL 50μM随机decamers (Ambion), 2μL核苷酸(5毫米)和RNase-free水在80°C孵化3分钟在ptc - 100可编程温度控制器(MJ研究Inc .)然后放在冰3分钟。随后,16 μL的样品中加入M-MLV逆转录酶(Ambion) 1 μL(200单位)、10X第一链缓冲液(10X First Strand Buffer) 2 μL和RNase Inhibitor (Ambion) 1 μL(40单位)的混合物，最终体积为20 μL。20 μL反应混合物在热循环器(PTC-100 Programmable thermal Controller, MJ Research Inc.)中进行逆转录，参数如下:42°C处理1小时，然后92°C处理10分钟。cDNA产物在−20°C保存。从50 ng/μL cDNA文库中最终稀释1:10。

基因表达分析

使用SpeponePlus实时PCR系统（Applied Biosystems）用逆转录量实时PCR（RT-QPCR）测量基因表达水平。反应参数设定如下：比较C._T.(ΔΔC_T.)，快速扩增95°C for 20s, 95°C for 1s, 60°C for 20s 40个循环。使用快速96孔反应板(0.1 mL) (MicroAmp, Applied Biosystems)进行反应，每个孔用于对每个样品进行20 μL的基因表达检测。用10 ng的工作cDNA溶液进行基因扩增。每个反应混合物由2 μL cDNA、10 μL TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2X) (Applied Biosystems)、1 μL TaqMan探针和引物分析Mix (20X) (Applied Biosystems)和7 μL RNase-free水组成。20X Assay Mix是每个基因的特定TaqMan MGB探针、正向和反向引物的组合。所有被检测的柑橘开花基因，最终引物浓度分别为900 nM和250 nM。探针用6-羧基荧光素(FAM)标记。内源对照内参基因采用5.8S rRNA，引物最终浓度为250 nM，探针最终浓度为150 nM。5.8S rRNA探针用4,7,2 ' -三氯-7 ' -苯基-6-羧基荧光素(VIC)标记。所有引物和探针序列，和来源列在附加文件2S1:表。引物和探针5.8 s rRNA采用Primer Express软件(Applied Biosystems)进行设计。所用的引物和探针CiFT1, CiFT2和CiFT3摘自西川等人[6.］．每个96孔反应板使用含有所有RT-QPCR反应元素和水代替CDNA的阴性对照。

统计分析

比较C_T.采用2012年7月3日的PSO种子样本(PSOsd M01-1)作为PSO 15岁种子和无籽乔木以及PSO 2岁乔木的参考样本。以2012年7月3日采收的柚子样品(PUM M01-1)为参考样本，确定柚子基因型。将12个不同时间点和每个基因的3个生物重复的实时定量PCR扩增数据用5.8S rRNA C归一化_T.值和阈值是自动设置的，但需要时需要手动调整。相对定量(RQ)值使用StepOne 2.3软件(Applied Biosystems)计算，并导出到Microsoft Office Excel进行进一步分析。使用Dixon’s Q检验在95%置信度下识别离群值[19和来自JMP Genomics 8.2 (SAS Institute Inc.)的分位数范围异常值工具。NC)。RQ数据用于计算平均值和标准误差(N= 3为PUM和2岁的PSO，N= 6岁的PSO 6）。使用JMP基因组学模型进行统计分析，标准的最小二乘法（LS手段）和学生的T检验（P.<0.05）（附加文件3.．表S2）。

为了研究佛罗里达州柑桔幼树和成熟树开花过程中相关基因的表达模式，从不同物种和年龄的代表性样本中提取mRNA，并使用实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)研究。根据基因型、年龄和时间点测定表达水平。选择时间点是为了让它们能代表一年中的12个月。获得3个生物重复的方法是基于相同基因型和年龄的树木的可用性。由于在佛罗里达州的Groveland没有幼树，我们使用了位于佛罗里达州盖恩斯维尔校区的温室幼树。

三个都CiFT在每次点处针对每个样品收集的叶片中检测到该研究的内部对照基因。从树木的不同部分中选择了从新生成长到旧增长的叶子，以便为整个树获得更具代表性的概况。

CiFTs成熟柑橘中的表达

在成熟的pummelo树中，mRNA水平Cift1，Cift2，和CiFT3与所有其他时间点相比，2013年4月30日最高（图。1)．一般来说,CiFT3月和6月之间的水平最高，CiFT2表现出最高的转录水平，其次是CiFT1然后CiFT3．2013年4月，这棵15岁的柚子树在2月底和3月初开花，结果未成熟。同样，成熟的PSO(图。2)的最高水平CiFT2013年4月30日的成绩单，2013年4月至6月和2012年7月之间的总体水平最高。然而,不像柚子,CiFT3展出了最高的转录水平（4月和5月期间，图。2） 相比CiFT1/FT2和所有三个CiFT基因相对表达量较柚低。到这个时候，在佛罗里达的田野里，开花基本上已经结束了[20.树上结着成熟和未成熟的果实(这些果实不是从实验树上收获的)。因此,C一世FT1，CIFT2，和CiFT3成熟植物叶片中的基因表达大多是在开花后的同步和最高的。这个时间令人惊讶，因为在佛罗里达州的领域，花芽诱导，当可能送到顶部芽的信号时，从大约10月到1月底发生，并且被认为是花芽发展所必需的释放凉爽的温度，在2012年11月至2013年11月期间发生的研究区域，2013年3月注册的最低限度的最低温度（附加档案1:图S1)。此外，温室中生长的成熟柚的基因表达谱与田间生长的PSO树相似。值得一提的是，尽管温室内的温度是受控的，但全年温度在18至35°C之间波动，在冬季(11月至3月)保持较冷的状态。很有可能，除了温度之外，其他环境因素，如光照条件，也可以作为调节的线索英国《金融时报》表达式。另一种可能性是叶的表达罚球在柑橘中取决于内部信号。结果表明叶片表达CiFTs与休眠中断和花芽进一步发育(这发生在4月观察到的表达高峰之前很久)无关，但可能与茎尖分化和花芽的测定有关。

表达式C一世FT1，CIFT2和CIFF3在柚子的叶子里。通过实时荧光定量PCR对12个月期间的基因表达进行定量，并使用对比CT分析进行评估。纵轴表示每个样本与7月3日至12日的参考样本进行比较后的基因表达水平的相对定量(RQ)。水平轴显示收集日期。数据为平均值±SE (N= 3）。指出了学生T分析的A和B。具有不同字母的列显着不同

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表达式CiFT1那CiFT2,CiFT3在成年“菠萝”甜橙的叶子中。通过实时荧光定量PCR对15岁树木的基因表达进行了为期12个月的定量分析，并使用对比CT分析进行评估。纵轴表示每个样本与7月3日至12日的参考样本进行比较后的基因表达水平的相对定量(RQ)。水平轴显示收集日期。数据为平均值±SE (N= 6).表示学生的t分析的A级和B级。具有不同字母的列显着不同

全尺寸图像

CiFTs在未成熟柑橘中的表达

季节性在表达上CiFT在幼苗中也观察到基因。在不成熟的算法,CiFT12013年6月28日的成绩单最高（图。3.)．CiFT2表达量在2013年6月28日也最高，表现为最高的转录水平CiFTs．另一方面，CiFT3表达量在2013年4月30日和6月28日最高。总的来说,算法CiFTs未成熟植株的表达量高于成熟植株，且在3月至6月之间有波动。这些植物没有开花，所以这些蛋白质的功能可能与营养生长或其他功能有关。除了在诱导开花和打破开花休眠中发挥作用外，FT似乎还影响营养生长、叶、花、花序结构和刺的发育[15那21那22那23那24］．例如过表达英国《金融时报》在poncirus trifoliata柑橘的近亲，改变了树的结构、休眠要求和叶子的形状[15］．

表达式C一世FT1，CIFT2和CIFF3“菠萝”小甜橙树的叶子。采用实时荧光定量PCR方法对2年树木的基因表达进行了为期12个月的定量分析，并使用比较C_T.分析。纵轴表示每个样本与7月3日至12日的参考样本进行比较后的基因表达水平的相对定量(RQ)。水平轴显示收集日期。数据为平均值±SE (N= 3）。指出了学生T分析的A和B。具有不同字母的列显着不同

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在成熟的柑橘树中，三个叶片表达模式之间没有差异CiFT基因研究。他们的表情是同步的，在4月左右达到顶峰，然后在接下来的几个月消退。无论是在温室还是在田间温度可控的条件下，树木都能观察到这种模式。这也是幼年植物的主要区别CiFT3但不是CiFT1 / FT2在2013年4月30日诱导。

在叶片中产生的FT蛋白被运输到顶端分生组织，在那里，通过与其他蛋白质的相互作用，它触发花分生组织的形成[18］．此外，在包括柑橘在内的多个系统中都观察到异位过表达英国《金融时报》克服幼嫩及诱导提早开花[10那15那16那23那25那26］．有趣的是，我们观察到在PSO未成熟植株叶片中，FT的表达被高度诱导，特别是在6月份，这表明在野生型幼植株中，FT的高表达水平英国《金融时报》与开花无关。假设CiFTmRNA水平与Ft蛋白质水平相关，并且它被运输到分生成，然后FT不足以诱导开花，并且必须先用或伴有取代因子，使得从少年到成熟的过渡。这可能是一种进化的战略，以保证个人已达到适当的规模或累积足够的资源，以提供果实的最佳机动，从而为生殖生存。从这些结果似乎在野生类型个人中观察到的表达水平，CiFT表达是诱导开花的必要条件，但不是充分条件。要开花，必须先从幼体过渡到成熟体。在转基因植物中并非如此，也许是因为异常高的英国《金融时报》是达到了。事实上，已经观察到表达水平和开花时间之间的相关性[15］．

归纳英国《金融时报》柑橘叶片的基因表达与冬季向春季的过渡相一致(附加文件)1，图S1）并且它可以通过温度（寒冷小时的累积或变化为温暖的温度）或增加日长度或两者。

C_T.：

循环阈值

mRNA：

信使核糖核酸

PCR：

聚合酶链反应

PSO：

'菠萝'甜橙

PSOsd:

'菠萝甜橙，种子

泵:

柚子

中移动:

相对量化

核糖体rna:

核糖体核糖核酸

RT-qPCR:

逆转录实时荧光定量PCR

SE：

标准错误

我们感谢Jude Grosser博士和Harry Klee博士的知识、时间和努力来改进这份书面工作。我们也想对摩尔实验室的每一个人表示感谢。我们还要感谢参与这项研究的佛罗里达大学园艺科学系的教师、学生和工作人员。

资金

这项工作的部分资金来自柑橘研究与发展基金会(Citrus Research and Development Foundation, Inc.)给G. a . Moore的拨款，拨款号为5200-146。

数据和材料的可用性

本研究中使用和分析的数据集均可根据要求从通讯作者处获得。

从属关系

1. 园艺科学系，佛罗里达大学粮食和农业科学研究所，2550赫尔路，盖恩斯维尔，FL，32611，USA

   Melanie Pajon, Vicente J. Febres & Gloria A. Moore

2. 佛罗里达大学植物分子与细胞生物学专业，佛罗里达Gainesville 32611, USA

   Gloria A. Moore.

贡献

MP设计并进行了实验，分析了数据并起草了手稿。VJF促进了实时PCR实验的设计和执行，贡献和监督数据分析并修订了稿件。GAM构思并设计了实验并修改了手稿。所有作者阅读并认可的终稿。

相应的作者

对应到韦森特j . Febres．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

利益争夺

作者宣称没有相互竞争的利益。

出版商的注意

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。

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