B盒基因：基因组鉴定，进化及其对梨花花粉生长的贡献（短果梨REHD。）

背景

B盒（BBX）蛋白质在调节植物生长和发育方面具有重要作用。在植物中，BBX基因家族已在几种植物中鉴定，例如米饭，拟南芥和番茄。但是，仍然缺乏对基因组的调查BBX基因在梨。

结果

在本研究中，共25次BBX在梨中鉴定基因（短果梨REHD。）。随后，在这些中对系统发育关系，基因结构，基因重复，转录组数据和QRT-PCR进行了BBX基因成员。转录分析显示十二PbBBX基因（48％）在梨花粉管中特异性地表达。此外，QRT-PCR分析表明这两者都PBBBX4.和PbBBX13对梨果实发育有潜在作用，而PBBBX5.应参与梨花粉管的衰老。

结论

这项研究提供了一个全基因组的调查BBX基因家族在梨中，并突出了它在梨果和花粉管中的作用。结果将有助于改善我们对复杂性的理解BBX未来研究中成员的基因家族和功能特征。

锌手指蛋白是重要的转录因子之一，在植物生长，发展和对环境变化的反应中起重要作用。通过结合锌离子稳定三维的锌指蛋白[1，可以与参与植物细胞生命活动的DNA、RNA和蛋白质相互作用[2］．B盒该基因家族属于锌指蛋白家族。除了保守的B盒结构域外，一些B盒成员还包含其他家族特异性结构域，如CCT（CONSTANS，CO-like和TOC1）结构域。这个B盒基因家族根据其包含的B-BOX结构域或CCT结构域的数量可分为5个亚家族[2］．在第一次识别B盒构件之后非洲爪蟾蜍光滑的［3.]，其同源物(CONSTANS: CO)从植物中克隆Arabidoosis芥，具有在植物开花时间的光周期调节中的功能[4]. 随后的研究进一步表明，植物中的B-BOX转录因子在介导各种生命活动中起着非常关键的作用，如种子萌发[5]，开花[6]，阴影避免反应[7]生物或非生物应激反应[8]和植物激素信号转导[9]. 最近的研究表明，作为油菜素类固醇信号通路的负调节因子，BBX20（atbzs1.)答:芥可以通过识别COP1（组成型光致血栓形成1），透光信号转导的关键因素附着于E2，然后通过26s蛋白瘤进行降解[9]. Gangappa等人（2013年）表示ATBBX25通过与HY5（蛋白质长下胚轴5）形成二聚体并抑制其功能，参与植物光形态发生的负调控[10.］．对苹果的研究发现MdBBX22（MdCOL11）参与UV-B诱导的花青素合成的合成[11.]. 基于这些结果，这意味着B盒基因成员可能与cop1 - hy5介导的光信号转导途径相关，并进一步参与植物光形态发生、调控开花、次生代谢产物合成及多种生命活动的调控。

已经证实一些转录因子家族在梨果实的发育过程中发挥了重要作用，如MYB和热激因子基因家族[12.，13.］．两个myb家族成员，PBMYB25和PBMYB52个基因是梨果实木质素合成调控的候选基因[12.］．虽然有很多关于功能的知识B盒基因家族，例如对生物和非生物胁迫的反应以及参与光信号转导途径，已提出[14.，15.，16.]，对梨花花卉和水果发育的作用较少。完成的梨基因组测序[17.提供了有关梨的综合分析的有用信息BBX基因家庭。在这项研究中，在梨中鉴定了25个非冗余成员BBX家庭。随后，这些细胞发育和表达模式分析BBX进行基因进行。目前的结果对于进一步的功能表征是有用的BBX基因在梨。

鉴定BBX梨中的基因

为了获得梨基因组中的BBX蛋白，将已发表的拟南芥BBX蛋白作为查询，利用DNAtools软件在本地梨基因组数据库中进行搜索。去除多余重复序列后，在梨中共确认了25条推测的BBX蛋白序列。为了一致性，这些BBX基因被依次命名为PBBBX1来PbBBX25．相应的PbBBX蛋白的基因标识符、染色体位置、蛋白结构及特征详见表1．氨基酸序列序列的长度范围为142（PBBBX23）至859（PBBBX7）。梨BBX基因编码蛋白质，具有预测的理论等电点为4.48-9.02，分子量为15.63900（PBBBX23）至93.60447（PBBBX7）KDA（表1）.

梨的蛋白质序列和系统发育分析BBX基因家族

PbBBX蛋白在142 ~ 859个氨基酸之间具有较大的分子长度变异。25个PbBBXs中有7个含有一个保守的CCT结构域和两个B-BOX结构域。4和5个成员分别包含一个B-BOX加一个CCT域，或仅包含一个B-BOX域，其余9个成员包含两个B-BOX域(表1）.发现PBBBX成员的保守结构，用B盒1序列（CDXCXXXXXXAXADEAALCXXCDXXVHXAXRAXRHXH，X表示任何氨基酸）和B盒2（CDICXXXXXXXXXDXXXLCXXCDXXXXXXXXXXXRXX1）（图。1). 此外，CCT结构域在PBBBX中高度保守（图。1）.图2中示出了包括B-BOX1，B-BOX2和CCT域的这些域的徽标。1，以及图中所示的对应位置。2．

进一步了解系统发育关系和分歧的洞察力BBX家庭，文学树，包括BBXS双足短足，奥雅萨苜蓿，答:芥，杨树trichocarpa和梨，是建造的。基于系统发育分析，该树可分为五个曲折，并与前一项研究一致[2，18.］．如图1所示。3.，来自杨树，拟南芥和梨的大多数BBX成员比梨和奥雅萨苜蓿，双足短足．其中，来自Clades I，II，III的成员含有两个B盒域加上CCT域，这意味着这些基因包含CCT结构的基因可能在开花控制中发挥至关重要的作用[4，19.］．而演化支VI和演化支V的成员则缺少cct域，只有1 ~ 2个B-BOX域。以往的研究表明，B-BOX结构域(CX₂残雪₈残雪₇残雪₂残雪₄HX.₈H）在N-末端区域中，预计B盒结构域中的保守半胱氨酸（C）和组氨酸（H）残基对BBX蛋白质 - 蛋白至关重要[2］．有趣的是，发现半胱氨酸（C）和组氨酸（H）残基分别发现在来自C片II，II和IV的BBX成员的C末端区域中的B盒结构域处保存（图。1). 综上所述，这些B-BOX蛋白的结构分析与系统发育关系基本一致。

基因结构和基因复制

以往的研究表明，基因结构的多样性可以导致多基因家族的进化。为了更好地描述和理解结构的多样性PbBBX基因，基因外显子-内含子分析(图。4）.如图1所示。4，外显子的数量从1到17次，有PBBBX7.包含最多的外显子（17）PbBBXs，第12页，共页PbBBXs含有两个外显子，分别为3个外显子。此外，梨BBX基因在与高度相似的外显子结构相同的地形中聚集，例如，八个PbBBX在I和III的片间内（包含两个外显子），以及属于Clade IV的大多数成员（有三个外显子）。同样，CLADE V中的三个基因仅包含一个外显子，除了PbBBX24和PbBBX25．这些结果推断出在演变期间发生的外来损失或吉恩PbBBX基因家族，导致密切相关的功能分歧PbBBXs(无花果。4）.

到data为止，节点的扩展事件信息BBX梨的基因家族尚不清楚。为了进一步揭示PbBBX生成基因，染色体位置和基因重复事件PbBBX研究了基因。染色体地点和分布为25PbBBX在12条梨染色体中发现了基因（共17条染色体）（附加文件1:图S1)。其中，15号染色体和17号染色体的数量均最高PbBBX基因（5）;其次是染色体5含有三种基因;染色体3和10都有两个基因;虽然染色体6,8,9,11,13,14和16只有一个基因。基因家族扩增通常通过串联复制和节段性重复来实现。在目前的研究中，我们没有识别任何串联复制对。然而，通过使用MCScanx软件在梨基因组中发现了13个分段重复基因对（图。5）.随后，这些基因对之间的分歧时间计算，随着6.15〜253.08万年（MYA）的时间而异（额外文件）2:表S1)。

确定复制的选择压力PbBBX基因，计算13对基因的非同义(Ka)/同义(Ks)值。所有的Ka/Ks值PbBBX基因对小于1.0(附加文件2:表S1)，说明它们在进化过程中具有较强的净化选择性，并具有保守的进化模式BBX基因。

梨的表达模式BBX基因

已知在许多高等植物中的花粉萌发和花粉管生长在性繁殖中发挥着至关重要的作用。以前的研究表明，花粉管通过尖端生长迅速延伸，然后在体外接受15小时（P4：停止 - 生长花粉管内的衰老[20.］．在我们的研究中，进一步了解的角色BBX梨花粉生长的家族基因，表达模式PbBBX通过转录组测序数据对基因进行分析。如图所示(附加文件3.：图S2），13 ofPbBBX未发现基因（52％）在普通花粉的不同发育阶段表达，这意味着这些基因可能以根，茎，叶或/和特殊条件表达。相反，12PbBBX48%的基因在梨花粉中以发育依赖模式表达。例如,5PbBBXs（PBBBX6.，7，9，11.，12.）在p1阶段（成熟花粉粒）特异性表达，而2（PBBBX8.和PbBBX10）在p2阶段（水合花粉粒）（附加文件3.：图S2）。大量的PbBBX在花粉生长期间差异表达的基因表明它们是在该过程中发信号传导的重要蛋白质。此外，表达模式PbBBX通过在梨花花管生长期间使用QRT-PCR来验证基因（附加文件4:图S3)。我们发现qRT-PCR结果与转录组测序数据基本一致，除了PBBBX6.和PBBBX7.．产生这种差异的原因可能是花粉管生长过程中表达水平最低。值得注意的是，与其他时期相比PBBBX5.基因在P4（停止 - 生长花粉管）达到峰值，这意味着该基因可能在植物生殖发育中发挥潜在作用，例如花粉管的衰老。

随后，这些表达配置文件PbBBX利用qRT-PCR检测不同组织或器官中的基因。6）.结果表明，除pbbbxs6，8，9，11.， 和19.在测试的组织或器官中显示没有表达，PBBBXS 1，2，3.，4，7，10.，14.，16.，18.，20.，21.，22.，23.，24.和25.主要在叶片中表达，而PbBBXs 13和17.在根中高表达。此外，基因的表达水平PbBBXs 12，17.和25.根，茎或叶子较高，比梨果不同发育阶段的叶子。有趣的是，pbbbxs6，8，9， 和11.在梨花粉的不同发育阶段均有组织特异性表达。此外,我们发现PbBBX19在根、茎、叶和果实中未表达，这些结果建议在其他组织或特殊条件下进一步研究其功能(图1)。6）.

亚细胞定位分析PBBBX4.，PBBBX5.和PbBBX13

转录因子的核定位对其调控功能至关重要。以往的研究报道，BBX蛋白主要位于细胞核，如番茄中的SlBBX5、SlBBX7和SlBBX15 [21.]. 表达水平PBBBX4.，PBBBX5.和PbBBX13观察到他们在梨花花盆或水果的发展中发挥着重要作用。为了进一步了解这三种蛋白质特征，进行了亚细胞定位实验。随后，我们引入了GFP控制和PBBBX4-GFP，PBBBX5-GFP和PBBBX13-GFP融合构建体（图。7A）通过Camv 35s启动子进入N. Tabacum.表皮细胞。如图所示。7B.，来自表达的融合PBBBX4-GFP，PBBBX5-GFP和PBBBX13-GFP的绿色荧光信号特异性分布在核内，如DAPI（DNA染料4,6-二苯胺亚胺-2-苯基吲哚）染色证实。然而，在整个细胞中观察到对照GFP蛋白（图。7B.）.这些结果提示PbBBX4、PbBBX5和PbBBX13为核蛋白，与之前的结果一致[21.］．

虽然BBX基因家族已在几种模型植物中鉴定，例如米[22.]和拟南芥[2[梨在梨中尚不清楚它的功能和进化。在这项研究中，梨综合分析BBX进行基因家族，包括分析系统发生，染色体定位，基因重复，序列特征和表达模式。

共25岁BBX从梨基因组中鉴定了相关基因。的数量BBX与番茄中的垂直（29）相比，梨的基因较少（29）[21.]，拟南芥（32）[2]和大米(30)[22.］．值得注意的是，梨的基因组大小(512mb) [17.]大于水稻（403 MB）[23.拟南芥（125 MB）[24.]但虽然小于番茄基因组大小（960 MB）[25.]. 这些结果表明BBX在不同的植物中，基因家族成员可能与基因组大小没有直接关系。虽然在数量上差异不显著，但是，类型BBX基因在物种间存在差异。番茄中BBX成员2串列b - box + CCT结构域、BOX1 + CCT、2串列b - box和B-BOX1的数量分别为8、5、10和6 [21.］．在拟南芥中，相应的数字为13,4,8和7 [2］．在梨中为7,4,9和6.这些结果表明BBX基因可能在不同物种中具有共同的祖先，并且在分离斑点和单焦点的分歧后独立地扩展。此外，阐明如何阐明BBX基因家族进化，植物的系统植物BBX单子叶（米饭和Broachypodium distachyum.）和Dicots（梨，杨树和拟南芥）构建。在系统发生树内，BBXS分为五个片状：I，II，III，VI和V.我们发现大部分BBX来自Dicot的基因在一起聚集在一起，这意味着这些基因可能是先前研究报告的直观基因[2，18.］．

在植物进化过程中，基因复制在产生新基因方面起着重要作用。植物中的基因复制有两种主要的复制模式，包括节段复制和串联复制[26.]已被证明在许多物种（如家庭）中在基因家族成员的扩展中发挥关键作用WOX，MYB，插件可以和四氯化碳在梨12.，27.，28.，29.]， 这CHS在玉米[30.］．进一步揭示了演变的潜在机制BBX基因家族，在梨中分析了分段和串联复制事件。在目前的研究中，没有一个PbBBX基因位于串联。16.PbBBX鉴定基因以在梨染色体的节段重复区域中排列。这些结果表明，分部重复是梨扩增的主要驱动力BBX基因家庭成员。此外，以前的研究报告说，串联重复经常发生在大型和快速发展的基因家族中，例如NBS-LRR基因家族[31而节段复制通常发生在进化缓慢的基因家族中，例如MYB基因家族[31］．目前的结果表明梨BBX基因家族应被归类为具有缓慢进化特征的基因家族。

收集的转录组数据显示B盒基因家族参与花粉管的生长。十二个梨B盒研究发现，基因家族成员参与了梨花粉管的发育。Gangappa等人之前的报告[32的研究表明，在拟南芥的光形态发生过程中，BBX家族的一些成员可以与蛋白质竞争性互作，进而调节HY5的活性，从而对花粉管发育进行精细调控。同样，在梨花粉管的生长过程中BBX家庭成员可能会规范发展过程。完全，我们的结果表明，该基因家族不仅参与了花卉器官的发展，而且在花粉管的发展中。后者可能由几个基因满足（PBBBX6.，8，9， 和11.）在梨花粉管中特别表达。以前的Gao等人研究。［20.]表明文化持续时间的延长到15 h (P4: stopped-growth花粉管),梨花粉管生长变得缓慢,表现出一些特点的衰老P4 post-cultured体外,这意味着衰老的梨花粉管可能发生在P4的时期。在本研究中PBBBX5.在梨花粉管中显着增加，其表达模式与前一份报告基本一致[20.］．增加表达水平PBBBX5.建议它可能在调节花粉管衰老中发挥作用。

另外，两者的表达模式PBBBX4.和PbBBX13，与果实木质素含量动态一致:果实木质素含量在前期至中期呈上升趋势，成熟期呈下降趋势[27.，33，34］．这些结果表明，这两个基因可能调控梨果实中木质素的合成。根据我们之前的研究报道，结石细胞的含量被认为是影响梨果实品质的重要因素[33，34］．由于石细胞的发展与木质素生物合成之间的密切关系[33，34，这是可能的PBBBX4.和PbBBX13可应用于梨果实的基因工程改良。

在本研究中，系统分析PbBBX基因家族进行，包括保守结构域，基因结构，系统发育关系，染色体位置，基因复制和表达模式分析。这PbBBX基因分为五片曲巾：I（4基因），II（4基因），III（3基因），IV（9基因），V（5基因），由基因结构和保守结构域分析负载。基因复制分析表明，节条重复性已驱动梨的膨胀BBX基因家庭。转录组测序和QRT-PCR分析显示PbBBX基因在不同花粉管和果实发育阶段起着重要作用。进一步的分析表明PBBBX4.和PbBBX13可能会调节梨果木质素的合成，和PBBBX5.可能在花粉管的衰老中发挥作用。

序列检索

识别和注释BBX梨中的基因，拟南芥BBX蛋白序列[2]来自rabidopsis信息资源（tair）数据库（http://www.arabidopsis.org）用作查询以搜索具有BLASTP程序（E-Value <1E-5）的梨基因组数据库。随后，推定BBX通过对InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/）[35),包含了(http://pfam.sanger.ac.uk/）[36]及SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/）[37)数据库。

系统发育分析和序列比对

使用默认设置的ClustalW version 1.83生成25个梨BBX蛋白的多序列比对，并使用MEGA 5.2 bootstrap分析构建邻居连接(NJ)树(1000个重复)[38]. pfam(http://pfam.xfam.org.）[36), InterProscan (http://www.ebi.ac.uk/Interpro/scan.html.）[35]，聪明（http://smart.embl-heidelberg.de.）[37用来识别域名。保守域的序列标识使用在线webblogo生成（http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）[39］．

基因结构，染色体定位和重复分析

外显子和内含子BBX根据pear基因组注释文件鉴定基因。利用基因结构显示服务器生成外显子-内含子图谱(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）[40］．梨的染色体位置图像BBX使用MapInspect软件根据梨染色体上的物理位置使用MapInspect软件绘制染色体或支架上的基因。McScanx软件（http://chibba.pgml.uga.edu/mcscan2/）[41用来识别重复PBPRX．计算器2.0软件[42]用于估计不同基因复制对的非同义词（KA）和同义（KS）替换率。ks值用于估计梨中发生的每个重复事件的大致日期，看到公式：t = ks /2λ×10^{- 6}mya（λ= 6.5×10⁻⁹）[17.，43］．

植物材料

样本取自10棵40岁的健康梨树(Pyrus Bretschneideri CV.．在安徽省砀山县的果园中采用了相同的灌溉和施肥方式。2016年4月上旬采集同一发育时期的梨样品，向中南方向种植。根、茎和叶在开花后15天采集。2016年4月19日(15 DAF)、5月14日(39 DAF)、5月30日(55 DAF)、6月22日(79 DAF)和8月29日(145 DAF)分别采集大小一致的果实40个。梨花粉粒的收集、干燥和离体培养方法均以周教授的方法为基础。等人2016 [44］．

RNA序列表达分析

来自梨花花粉的原始RNA-SEQ读取从NCBI数据库下载（Prjna299117）[44］．梨花粉样品分别为:P1:成熟花粉粒，P2:水化花粉粒，P3:生长花粉管，P4:停止生长花粉管。原始RNA-seq数据的分析按照之前的方法[45]， RPKM (Reads Per Kilobase Per Million mapping Reads)值用于估计基因表达水平。的热图PbBBX利用R软件(http://www.biocumon.org/）.

QRT-PCR分析

根据制造商的说明，使用天根RNAprep纯品（中国北京天根）提取总RNA，然后进行DNaseI（中国北京天根）消化，以消除任何污染的DNA。对于qRT PCR分析，根据制造商的说明，使用逆转录酶M-MLV系统（中国北京天根）从1μg RNA合成第一链cDNA。Beacon Designer 7软件用于设计和检查基因特异性引物（附加文件5：表S2）。梨微管蛋白基因（正向引物：5'-AgaacaActcgtcctac-3';反向糖粉：5'-gaactgctcgctcactctcc-3'）用作参考基因[46］．使用CFX96 Touch™实时PCR检测系统（Bio-Rad，USA）使用Sybr®MencixMExTaq™（Takara，Japan）进行QRT-PCR进行。对于每个样本，我们执行了三种生物重复。2^——ΔΔCT方法用于估计相对表达水平[47］．

亚细胞定位分析

通过插入cDNA来构建35秒：PBBBX5-GFP，35秒：PBBBX4-GFP和PBBBX13-GFP的表达载体PBBBX5.，PBBBX4.和PbBBX13分别进入PCAMBIA1304向量。将这些构建电穿孔后根癌土壤杆菌EHA105，以pCAMBIA1304为阴性对照[48，将转化的细菌细胞侵染到叶组织中尼科尼亚塔哈瓦姆如Sparkes等人(2006)所描述的方法[49］．使用激光共聚焦显微镜（Zeiss LSM700，Germany）观察PBBBX-GFP的瞬时表达，DNA染料4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）用于可视化细胞核。

BBX:

B盒

COP1：

组成富有光骨膜1

DAF：

几天后开花

DAPI:

DNA染料4,6-diamidino-2-phenylindole

唔：

隐马尔可夫模型

HY5：

蛋白质长的胚乳5

K a：

不幸的是

Ks:

同义词

MEME：

MOTER MOTIF ELICITITE

mya：

万年

NJ：

邻居加入

存在:

实时聚合酶链反应

RPKM:

每千票读数读取每百万映射的读数

我们要感谢Muhammad Abdullah对此手稿的仔细阅读和有用的评论。我们感谢审阅者和编辑对此手稿的仔细阅读和有用的评论来扩展我们的审阅者和编辑。

资金

本研究由国家自然科学基金项目(no . 31,640,068)和安徽农业大学2017届研究生创新基金项目(no . 2017yjs-31)资助。资助机构没有参与研究的设计、数据的收集、分析和解释以及手稿的编写。

数据和材料的可用性

从本文中的表达式概要文件的RNA-SEQ数据从NCBI数据库下载（登录号：PRJNA299117）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov//bioproject/PRJNA299117）.从GigaDB数据库(http://gigadb.org/site/index）.梨BBX基因ID列于表中1．

隶属关系

1. 安徽农业大学生命科学学院，合肥，230036

   云鹏曹，丹丹萌，大辉李，春阳娇，清金，易林和永平蔡

2. 安徽农业大学茶叶植物生物利用国家重点实验室，合肥230036

   亚利汉

贡献

YCAO和YCAI设计并进行了实验;YCAO，DM，CJ和YH分析了数据;YH，DM，DL，YL，QJ，YCAO和YCAI贡献试剂/材料/分析工具;Ycao写了这篇论文。所有作者审查并批准了最终提交。

通讯作者

对应于永平蔡．

伦理批准和同意参与

这些实验没有涉及濒危或受保护的物种。这些地点/活动不需要特定的许可证，因为本研究使用的梨来自于砀山的一个园艺园地，该园地是奥辉农业大学的示范果园。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

作者声明他们没有竞争利益

出版商的注意事项

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。

开放访问本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议(http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)，允许在任何媒体中不受限制地使用、分发和复制，前提是您给予原作者和来源适当的信任，提供到知识共享许可证的链接，并说明是否进行了更改。知识共享公共领域奉献豁免(http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/）除非另有说明，否则适用于本文中提供的数据。

重印和许可