7-BP删除的影响HvGA20ox2大麦农艺重要特征的基因（Hordeum Vulgare.l .)

背景

同减至身高-1 (rht.-1)基因与小麦半矮化(sd-1）基因在米饭中，sdw1 /电装参与Ga新陈代谢的遗址，被指定为大麦的“绿色革命”基因。最近候选基因的分子表征HvGA20ox2为了sdw1 /电装基因座允许估计该基因功能多态性对大麦农艺学重要性状的变化的影响。

结果

我们调查了7-BP删除在外显子1中的效果HvGA20ox2基因(sdw1.d.对中高大麦Morex和半矮大麦Barke杂交衍生的DHLs群体产量相关性状和麦芽品质性状的变异进行了研究。在纬度为15°的两个不同环境中，测定了植株高度、开花时间、千粒重、籽粒蛋白质含量和淀粉的分离情况。7-bp缺失HvGA20ox2在单独分离DHLs群体中，基因使株高降低约13 cm，花期推迟3 ~ 5天。在另一方面，sdw1.d.突变不影响粒度特征（蛋白质和淀粉含量）或千粒重的显着影响。

结论

有益效果sdw1.d.等位基因可以在大麦中与耐植物抗性和延长的营养生长期相关联，允许积累额外的生物量，该生物量在某些环境中支持更高的产量。但是，没有直接影响sdw1.d.检测到千粒体重或谷物体重或大麦品质特征的突变。

20世纪“绿色革命”的巨大成功，是由于在农业上引进了以茎短而粗、抗倒伏为特点的新谷物品种。这些品种使我们有可能改变农业技术，增加矿物肥料的用量，从而极大地提高了谷类作物的产量。对于小麦和水稻来说，“绿色革命”基因参与了赤霉酸(GA)代谢，影响株高(矮化)、抗倒伏，从而影响收获指数(如[1])。在六倍体小麦中，矮化主要是通过引入reduce height-1 (rht.-1）编码Della蛋白的基因，其行为抑制Ga-encooctive生长[2］．在米饭中，由于半侏儒，在整个亚洲的20世纪60年代获得的记录收益率sd-1突变体在编码区内缺失280bp的删除Os20ox2基因导致非官能20-氧化酶Ga生物合成酶[3.］．因此，与GA(半矮化)代谢有关的基因sd-1水稻的基因和rht.在降低株高方面发挥了关键作用，这导致两种主要谷物作物的产量显著增加。然而，在大麦中，半矮化基因对现代品种农艺成功的影响仍然不确定。

两个矮化的基因,sdw1 /电装和uzu1.a在GA和Brassinteroid激素的代谢中分别涉及，被指定为大麦中的“绿色革命”基因[4］．其中，SDW1.大麦基因是半矮秆的同源基因sd-1大米基因;相应的候选基因HvGA20ox2最近报道了编码胃肠杆菌素20-氧化酶[5，6］．四个突变等位基因SDW1.基因在大麦中闻名。其中一个sdw1.c.（最初是名字日本电装的突变体中发现简历．Abed Denso在丹麦报道。其他三个SDW1.利用诱变剂人工获得等位基因:1)sdw1.a.突变体(最初命名SDW1.）在挪威六划大麦的X射线诱导简历．巨人。2)sdw1.d.使用X射线治疗品种valticky和1965年释放的突变体简历。钻石。今天的栽培品种sdw1.d.来自Diamant的突变通常被描述为“sdw1 /电装»。3）sdw1.e.命名为“Risø no”。9265’是从Bomi品种的M2代中分离出来的，经过中子处理[7］．

在分子表征方面取得了显著的成功SDW1.大麦等位基因[5，6，7，8］．首先,HvGA20ox2比较了中青稞品种AC Metcalfe和具有半矮秆基因的半矮秆品种Baudin (sdw1.d.）;在AC Metcalfe/ Baudin DH子代与株高共分离的内含子2中发现了A/G替换[5］．接下来，EXON 1中的7-BP删除导致编码帧偏移HvGA20ox2基因的功能多态性sdw1.d.来自Diamant的等位基因[8］．完全删除HvGA20ox2在半矮小突变体Riso NO中鉴定基因。9265携带sdw1.e.等位基因，起源于品种Bomi [7］．通过比较，鉴定出5种不同的序列变异HvGA20ox2基因序列sdw1.c.突变体（吸管Denso）与高大麦品种：它们包括1-BP缺失和在5'未翻译区域中的4-BP插入，以及编码序列中的两个同义突变HvGA20ox2基因(8］．虽然植物高度变化与7-BP删除有显着相关HvGA20ox2基因(sdw1.d.等位基因）在双重父母映射人口和大麦品种的自然群体中，没有暴露的序列变化sdw1.c.突变体可以解释矮化表型[8］．

所有SDW1.大麦突变体的特征是更短更强的茎，支持穗和防止倒伏。然而，在HvGA20ox2基因影响GA的生物合成，控制不同植物组织中的许多过程，因此，它们的抗血细胞效应也导致许多不需要的农艺性状，例如减少晶粒尺寸[4］．有益和有害的影响SDW1.基因已被报道为大麦(在[9])。最近在分子表征方面的成功SDW1.等位基因促进了进一步的研究，重点是更好地了解他们对大麦品种农艺表现的热爱效果。

在本文中，我们估计了外显子1中的7-BP缺失的效果HvGA20ox2基因（本sdw1 /电装等位基因）关于衍生自高麦克利MEREX的交叉和半矮人的双倍单倍体线（DHLS）的经济上重要性状的变异sdw1.d.突变体cv。巴克。巴克继承了sdw1 /电装通过cv从Triumph获得等位基因。亚历克西斯(https://triticeaetoolbox.org/barley/），而Triumph是CV的后代。钻石。我们估计了这种表型效果sdw1 /电装通过QTL映射方法在两个非常多样化的环境中等位基因。评估了种子中植物高度，标题，千粒重，粒蛋白质和淀粉含量的变化。

植物材料与现场评价

由Morex和Barke杂交得来的双单倍体系(DHLs)种子被Nils Stein (Gatersleben, Germany)提供给田间评价。DHLs种群在文中进一步缩写为Morex/Barke DHLs种群。

Morex / Barke DHLS群体的田间试验是在VIL的两个实验站进行的：IN PUBCING（59°53'39“N，St. Petersburg地区，俄罗斯北部）和Krasnodar（45°02'55”N，South俄罗斯）。该场实验包括两个复制曲线，每个块包括每一流的单倍体线和每个父母的两排的50个植物。行间隔大约20厘米。

抽穗期(HD)是指从播种到第一芒可见的天数。在完全成熟时测量株高(PH):每个DH株系记录10个株高至穗顶(不含芒)。Morex/Barke dhl的PH记录于2015年获得(普希金)。

千粒重(TGW)根据标准协议在调节湿度下测量[10.:从每个DH系的谷粒样品中挑出两个砝码，每砝码500粒。样品在实验室天平上称重，准确度为0.01 g。计算两份样本500粒种子的称重结果之和。

采用Infratec 1241谷物分析仪(Foss, USA)分析干种子籽粒蛋白质含量(GPC)和淀粉含量。用瑞典Kjeltec Auto 1030分析仪(Kjeltec Auto 1030 Analyzer)采用凯氏定氮法测定GPC的标定曲线。建立了用埃弗斯极化法测定淀粉的校正曲线。

QTL定位与统计分析

对于Morex / Barke分离人口，可以提供全面的遗传图，其中包含1068个SNP标记93 DHLS [11.，利用已发表的基因分型数据进行QTL分析。使用Windows QTL制图软件2.5版进行QTL制图[12.]使用CIM算法（复合间隔映射）。LOD的最小阈值，95％显着（p= 0.05)，根据1000个排列的结果计算。为了可视化LOD扫描，使用了一个Perl脚本(可根据请求使用)。

CAPS检测HvGA20ox2基因外显子1缺失7bp

用设计的引物进行PCR：前进5'-CTCCCTCCTCCCCCGATTAC和反向5'-CCGGACACCTGGAAGAACCC。反应混合物含有1×Taq缓冲液（2.5mm Mg2 +）;200μmdntp;2,5 U标签DNA聚合酶（Sileks，Moscow）;每个引物的0.4μm;〜30 ng模板DNA，5％DMSO和无菌蒸馏水，最终体积为25μL。PCR循环条件由95℃的初始变性步骤组成，3分钟，其次是30℃的30℃，63℃，72℃，72℃，45秒，最终延伸周期为72°C 5分钟。在TBE缓冲液中在1,3％琼脂糖凝胶上检测到PCR产物，然后用分离物II PCR和凝胶试剂盒（Bioline）纯化，并使用正向和反向引物在两端（欧洲欧莫斯科）测序。DNA序列与Unipro Ugene软件对齐[13.］．Genbank序列加入包括：'Barke'KX611232，'Triumph'KX611233，'MoreX'KX611234，'Franklin'KX789375。

揭示外显子1中的7个BP删除HvGA20ox2PCR产物3 μl，酶切1 UHinf我(Sibenzyme, Novosibirsk)，总反应体积15 μl，含1х SEbuffer O (pH 7.6)， 37℃下反应2 h，然后在1.5%琼脂糖凝胶中电泳分离。

HVGA20Ox2基因在MINES / BARKE DHLS群中重新排序和测定

为了证明巴克是sdw1.d.突变体我们重新测序外显子1HvGA20ox2大麦品种的基因。设计引物，我们对齐morex_contig_40861（http://weblast.ipk-gatersleben.de/barley/viroblast.php.）包含已发表的片段HvGA20ox2序列和MLOC_56462.1的编码序列HvGA20ox2基因(图。1A)．488bp的PCR片段成功扩增并测序Barke，胜利和富兰克林大麦品种，这些品种来自携带半矮人的大麦'Diamant家族'SDW1./日本电装对Morex(高大麦)也是如此。在Barke、Triumph和Franklin的第1外显子中证实了7bp的缺失导致阅读框的移位HvGA20ox2．完整和改变的预测蛋白质仅具有34个氨基酸序列，其次是完全不同的多肽（图。1B.)．

映射到HvGA20ox2我们开发了基因特异性CAPS标记。CAPS标记暴露了DH系是否有7-bp缺失(Barke等位基因)或携带完整的外显子1 (Morex等位基因)(图。2)．接下来，使用基因特异性盖标记来评估来自MoreX和Barke的十字架的94dHL。结果，HvGA20ox2基因在3小时染色体的长臂上映射在MoreX / Barke DHLS群体中，在132.7cm的位置，与SNP 1_0754共隔离（附加文件1)．

Morex/Barke DHLs群体株高分离

以验证sdw1.d.突变与在Morex/Barke DHLs群体中观察到的株高分离有关，920株株高(90个DHLs和2个亲本各10株)2)，考虑到外显子1的7-bp缺失HvGA20ox2基因。得到的双峰分布如图2所示。3．两个明显的峰反映了两个等位基因类的株高值之间的显著差异(p< 0.0000001)。对于DH线与巴克sdw1.d.等位基因平均株高为50 ~ 87 cm，平均70 cm;具有Morex等位基因的DH株系株高为60 ~ 107，平均83 cm。此前有报道称SDW1.和日本电装等位基因高度减少10至20厘米[5，14.，15.］．

株高变异也受到QTL定位的影响。因此，QTL极显著峰(LOD = 10.6，p< 0.05)在Morex/Barke DHLs群体中的3H位点，与HvGA20ox2基因特异性CAPS标记，可解释31%的观察到的表型变异(图。3 b)．

在morex / barke dhls人口中的标题日期分离

在五个环境中评估了Morex / Barke DHLS人口：三年（2011-2013）在普希金和两年（2012年，2013年）在Krasnodar。两个地理位置将彼此分开15°纬度;2012年幼苗日期的日期长度为17小时30分钟和24分钟。根据年份的短日条件（Krasnodar）在短日情况（Krasnodar）中的DH线路的平均日期为12-20天（普希金），根据年份（附加文件）3.)．开花时间的显著差异几乎不是由等位基因引起的PPD.基因，因为Morex和Barke都有一个隐性等位基因Ppd-H1据报道基因，表明对漫长的一天的反应减少了[16.］．

2个影响Morex/Barke DH群体抽穗期的显著qtl定位在2H和3H染色体上(图2)。4)在两个不同的地理位置。这两个qtl的抽穗期延长均与Barke等位基因相关。其中1个qtl均定位于3H长臂132.7 cM位置。QTL定位与HvGA20ox2Morex/Barke基因图谱上的cap标记。最大方差占比(R²）在两个地理位置中，QTL解释的QTL在28％上变化至41％。DHLS，继承sdw1 /电装来自巴克的等位基因，比DHLS携带的DHL在3-5天后发起HvGA20ox2从Morex等位基因。

5种环境中与3H QTL最接近的SNP标记为SNP 1_0754;该SNP与OWB大麦遗传图谱中BOPA SNP标记11_0977共分离[11.］．反过来，SNP 11_0977在SBCC145 x Beastrix DH人口中以3H（139厘米）检测到的标题和植物高度的主要QTL峰值相同的位置，并提出是最接近的标记sdw1 /电装矮化病基因(17.］．

在Pushkin_2011、Pushkin_2013和Krasnodar_2011三种环境下，估算了Morex/Barke DHLs种群的TGW变化。该性状的QTL显著峰一致定位在2H染色体(77.6 cM)上(图2)。5），用SNP 3_0896共同分离，称为Popa SNP标记VRS1.控制花序类型的基因座[18.］．在的等位基因状态VRS1.基因座可区分野生型二棱大麦和六棱大麦。功能缺失突变HVHOX1基因VRS1.位点导致侧小穗发育抑制的停止，从而导致隐性六棱表型[19.］．在Morex/Barke杂交中，两排亲本Barke具有优势Vrs1.b3等位基因，而六划议的父母morex有隐性vrs1.a1等位基因(18.］．多态性的VRS1.在Morex和Barke杂交的dhl中观察到高达48%的TGW变异(附加文件)4)．与六划线DHLS相比，双划平的DHL后代显示出更高的TGW值。但是，没有影响sdw1 /电装检测性状变异的位点。

籽粒蛋白质浓度(GPC)是决定大麦籽粒价值和麦芽品质的主要因素。而非常低(< 90克公斤⁻¹)籽粒蛋白质浓度降低了啤酒大麦的价值，籽粒蛋白质浓度高(> 145 g kg⁻¹)与麦芽提取物含量低和成品啤酒中寒冷雾霾的可能性增加有关[20.］．由于谷物蛋白质浓度因环境条件和遗传背景而受到影响，因此建议作为QTL分析和潜在标记辅助选择的理想主题。淀粉含量影响大麦的浸渍过程中的水吸收，被认为是麦芽行业的重要性状[21.］．检查是否sdw1.d.等位基因影响GPC和淀粉含量分别在五个和三种环境中在MINESX / BARKE DHLS群中评估了两个特征。与TGW分析结果相同，在外显子1中的7-BP删除HvGA20ox2基因没有影响谷物中蛋白质和淀粉的积累，同时对其产生重大影响VRS1.GPC在Mutex / Barke DHLS群体中的轨迹被发现在五个环境中的三个中被发现（附加文件4)．

在本研究中，我们调查了效果sdw1 /电装等位基因对源自中高大麦多六十六十六十岁的DHL群体群体含量相关和麦芽质量特征的变异。后者属于容纳的大麦品种的“Diamant系列”sdw1 /电装来自X射线突变体CV的等位基因。钻石。的sdw1 /电装据报道，欧洲的150多个新成功的麦芽大麦品种22.而且在世界各地的麦芽育种项目中也得到了广泛的认可。问题是，是否只有矮小的身材sdw1 /电装突变体及其抗倒伏性是半矮化大麦取得显著农艺成就的原因，也可能是其多效性的原因sdw1 /电装屈服相关性状的等位基因发挥了决定性的作用。对于小麦来说，它以前报道了直接影响rht.突变降低了植物高度，但也存在一个重要的脂肪效应，导致增加的耳朵分配和每个穗的谷物数量增加，导致产量增强（在[4])。另一方面，农艺成功sd-1水稻中的突变体可能与茎生长和穗发育的发育时间密切相关[3.］．

的sdw1 /电装几十年前在大麦3H染色体上定位了一个位点[23.]从那时起，许多QTL映射研究报告了联系sdw1 /电装遗址到农艺学重要特征（审核[9])。但是，候选人HvGA20ox2基因sdw1 /电装位点和分配给半矮化等位基因的功能多态性是最近才被定义的[5，8］．的sdw1 /电装的外显子1缺失7bp，极有可能是导致该等位基因缺失的原因HvGA20ox2基因(8］．删除导致的阅读框架的转移HvGA20ox2基因并可能显着影响相应蛋白质的结构。HvGA20ox2编码Ga 20-氧化酶，该酶参与嗜昔虫蛋白生物合成的最终步骤。突变的突变HvGA20ox2导致内源气体浓度降低，影响茎伸长和开花时间，因为GA在营养和生殖发育之间起着特别重要的发育转换作用[24.］．与这些报道相对应，我们检测到的第1外显子7-bp缺失与HvGA20ox2在Morex/Barke DHLs群体中，株高和抽穗期的分离与遗传sdw1 /电装来自Barke的等位基因株高平均短13 cm，开花时间晚3 ~ 5天HvGA20ox2从Morex等位基因。这也证实了之前的观察SDW1.大麦突变体显示出10-20厘米的植物高度和3天前线延迟[15.，25.］．此外，Maurer等人[26.最近强调了重要作用sdw1 /电装整个植物生命周期中的基因:野生基因的渐渗SDW1.等位基因进入巴克遗传背景（野生大麦）（大麦芽ssp。spontaneum）植物高度增加至多12.3厘米，减少了达到射击，开花和成熟度所需的时间分别为5.7,4.3和4.0天。

而其主要特点是sdw1 /电装诸如降低秆细极长度，增加的封装抗性和延迟开花的表型，其对大麦的产量组分或麦芽质量性状的影响仍然可疑。QTLS用于标题日期，增长习惯，产量，发展得分，饱满和千富石的重量与之共同sdw1 /电装在染色体的长臂上3h（例如[[6，25.])。积极和消极的影响sdw1 /电装报道了大麦产量构成部分的基因[9，22.］．例如，dhl来自大麦品种Magnum和品种Goldmarker的杂交(携带sdw1 /电装基因)显示较低的单株粒重和50粒重[27.］．在所有情况下，由半矮秆“皇家”亲本和8个大麦株系组成的半矮秆株系的产量都没有显著提高[15.］．报告的主要问题sdw1 /电装大麦品种是千粒重量下降：更换sdw1 /电装Barke等位基因来自野生大麦漫射的人增加了4.5克的TGW [26.］．在另一方面，sdw1 /电装基因座对中高AC Metcalfe和半矮Baudin杂交衍生的DHLs群体的产量有很大的积极影响，解释了49%的变异[6］．

小麦和大麦的最终产量取决于粒数和粒重(详见[4])。影响粒数的产量因素包括:结出可育穗的分蘖数、营养生长和生殖生长的扩展、花序结构、秆的耐受性、穗的形成、伸长和分枝以及小穗的形成。在Morex/Barke分离群体中，粒重(TGW)和籽粒品质(GPC)的变化主要受根系的影响VRS1.基因座，区分二排和六排DHLs后代。无影响sdw1 /电装对产量构成和籽粒品质性状的基因座进行检测。

ortholog的HvGA20ox2水稻基因组基因，sd1被认为是经典的绿色革命基因。类似于大麦，在相应水稻基因的编码部分中的大缺失OS20OX-2被发现为水稻半矮种品种。其中一些（即IR8）为亚洲的许多国家带来了绿色革命[22.]仍表现出最佳的农艺性能[28.］．然而，在大麦中，没有显着的阳性脂肪效应sdw1 /电装在本研究中未检测到TWG或GPC等产量和质量组分的基因，也没有在以前的大部分报告中。然而，假设可以假设半侏儒主义对大麦农艺性能的间接积极作用。Semi-Dwarf Barleys比高植物更耐植物;住宿不仅减少了大麦产量和谷物质量，而且还影响了麦芽质量，因为来自收缩植物的谷物通常重量轻，麦芽提取物的谷物较轻[29.］．与其祖先CV相比。valticky，这sdw1.d.突变体cv。据报道，Diamant增加了12％的谷物产量[30.］．“黛曼”牌啤酒被认为是欧洲酿造大麦的最佳基因来源。

正面或负面的影响sdw1 /电装大麦产量构成部分的基因也可能取决于不同的环境。而且sdw1 /电装春季大师在西欧可能是非常有利的，长长的季节允许积累额外的生物量，以支持更高的产量。然而，在炎热和干燥的区域中，标题日期的延迟引发了谷物填充的风险，这些风险将与可能损害产量性能的干旱和高夏季气温发生日本电装-携带春季大麦品种。因此，迟到的标题与日本电装被报告为西班牙的大麦繁殖的另一个问题[17.］．

在我们的研究中，7-bp缺失HvGA20ox2基因的功能多态性是近年来被提出的sdw1 /电装中青稞和半矮秆杂交衍生的DHLs分离群体中株高降低和开花时间推迟与DHLs基因座的基因多态性显著相关sdw1.d.（sdw1 /电装）品种Barke，独立在环境提示。在另一方面，sdw1.d.突变对该DHLs群体千粒重和品质性状的变异均无影响。由此可见，半矮化的有利作用sdw1.d.大麦中的等位基因似乎与籽粒产量潜力没有直接关系，但与抗倒伏有关。此外，在某些生态环境中，营养生长的延长可以积累额外的生物量来支持更高的产量。

我们非常感谢Andreas Graner和Nils Stein教授，用于提供Morex / Barke Dhls人群的种子材料。

资金

这项工作得到了欧亚经济共同体“创新生物技术”的州际有针对性计划（授予第No.2014-14-М.04-0008）。ML由科学项目不支持。37.1521.2014 / K的俄罗斯联邦科学与教育部。出版成本由圣彼得堡州立大学资助。

可用性数据和材料

支持数据作为附加文件包括在内。

关于这个补充剂

本文已作为一部分发布BMC植物生物学第17卷补充1,2017：来自Plantgen 2017的选定文章。补充剂的全部内容可在线获得//www.cinefiend.com/articles/supplements/volume-17-supplement-1．

隶属关系

1. 圣彼得堡州大学，Universitetskaya em.7 / 9，圣彼得堡，199034，俄罗斯

   Serafima Teplyakova和Elena Potokina

2. 瓦维洛夫植物遗传资源研究所(VIR)， Bolshaya Morskaya, 42- 44,190000，圣彼得堡，俄罗斯

   Serafima Teplyakova, Marina Lebedeva, Nadezhda Ivanova, Valentina Horeva, Nina Voytsutskaya, Olga Kovaleva和Elena Potokina

3. 圣彼得堡州森林技术大学，俄罗斯圣彼得堡（St. Petersburg），5,94021

   Marina Lebedeva和Elena Potokina

贡献

ST进行了QTL分析，ML使测序工作并设计了盖子标记，Ni OK NV表型表型和野外评估，VH评估生化性状（蛋白质和淀粉）。EP构思了这项研究并写了稿件。所有作者阅读并认可的终稿。

通讯作者

对应到艾琳娜波提纳．

伦理批准和同意参与

本研究不包含任何需要伦理同意或批准的研究。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

出版商的注意事项

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。

开放访问本文根据创意公约署署署的条款分发了4.0国际许可证（http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)，它允许在任何媒体上无限制地使用、分发和复制，前提是你给予原作者和来源适当的荣誉，提供一个到知识共享许可协议的链接，并指出是否作出了更改。创作共用及公共领域专用豁免书(http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/）除非另有说明，否则适用于本文中提供的数据。

再版和权限