用RNA-seq分析方法鉴定了不同等位基因状态的大麦近等基因系的代谢途径和基因GydF4y2Ba黑色雷姆玛和果皮GydF4y2Ba（GydF4y2BaBLP.GydF4y2Ba)基因GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

一些植物物种具有'黑色素样'黑色种子色素沉着。然而，由于其复杂的结构和承受几乎所有溶剂的能力，因此尚未完全探索这种“黑色素样”黑色颜料的化学和遗传性质。然而，参与特质地区的遗传网络的鉴定是了解涉及“黑色素”黑色种子色素沉着表达的代谢过程的关键。目前的研究的目的是鉴定通过等位基因状态不同的大麦近代的近代的近似同学线（NIL）的差异表达基因（DEG）GydF4y2BaBLP（黑色LEMMA和PERICARPGydF4y2Ba）位点。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

对6个文库(每个文库3个重复)进行RNA-seq分析。共有957个基因组片段在BLP和BW之间表达水平发生了显著变化，其中632个片段表达水平升高，325个片段表达水平降低。在已鉴定的deg中，有191个基因参与了已知的通路。这些代谢途径包括:“软木脂单体生物合成”、“二萜植物抗毒素前体生物合成”、“角质生物合成”、“角质层蜡生物合成”和“苯丙素生物合成，初始反应”。通过对所选基因进行实时荧光定量PCR分析，确定差异表达。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

代谢途径和基因可能与黑色引理和果皮颜色相关联GydF4y2BaBLP.GydF4y2Ba- 揭示了对氧化应激和病原体的抗性。我们建议lemmas和pericarps的黑色色素沉着与酚类化合物的水平增加及其氧化有关。功能的效果GydF4y2BaBLP.GydF4y2Ba在合成的阿魏酸和其它酚类化合物的合成可以解释增加抗氧化能力和黑粒谷物的生物和非生物胁迫耐受性。影响穗的抗旱性和抗病能力也可能与角质层蜡的生物合成有关。此外，在lemmas和pericarps中上调合成植物脂蛋素，suberin和普通应激蛋白（USP）GydF4y2BaBLP.GydF4y2Ba载体可能有助于其抗病性增加。进一步描述对其与生理特性的关系和研究其与生理特性的关系可能对于未来在大麦预育种中的应用可能是有用的。GydF4y2Ba

籽粒颜色是用于描述和分类大麦(GydF4y2BaHordeum Vulgare.GydF4y2BalGydF4y2Ba2 nGydF4y2Ba=GydF4y2Ba2×GydF4y2Ba= 14，HH）种质。在成熟大麦可有白色，黄色，紫色，蓝色或黑色的色素沉着。在白色颗粒，颜料不存在，而两种不同类别的化合物的确定其它类型的颜色。黄色，紫色和蓝色的是由黄酮类化合物的一个亚组多样引起的，在不同的晶粒组织中[合成GydF4y2Ba1GydF4y2Ba那GydF4y2Ba2GydF4y2Ba］．与黄酮类化引起的色素沉着不同，黑色着色的研究与生化和分子遗传观点来看非常粗糙。GydF4y2Ba

黑色着色是由“黑色素样”颜料引起的，这些颜料是高分子量不规则聚合物的基团，在酚类化合物的氧化过程中产生[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba］．由于其复杂的结构和耐几乎所有的溶剂，它们的化学性质和代谢途径，导致这些黑色颜料都尚未确定[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

在大麦，在生长后的后期阶段，在生长的后期粒度的粒子中，“黑色素样”颜料在粒度的粒度中积聚，略微成熟[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba那GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba］．这种性状是由单基因遗传控制的GydF4y2BaBLP1GydF4y2Ba(黑色外稃和果皮1)位点，已被定位到染色体1HL [GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba］．三位主导等位基因GydF4y2BaBLP1GydF4y2Ba颗粒色素沉着的赋位点强度有报道:GydF4y2BaBLP1.B.GydF4y2Ba（GydF4y2BaBG.ydF4y2Ba），GydF4y2BaBlp1.mbGydF4y2Ba（GydF4y2BaBG.ydF4y2Ba^MB.GydF4y2Ba）， 和GydF4y2BaBLP1.G.GydF4y2Ba（GydF4y2BaBG.ydF4y2Ba^GGydF4y2Ba)分别确定极黑、中黑、浅黑或灰色[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

亚洲西南部发现黑谷物的大麦实地，并疏口在西藏和中国[GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba］．In Syria, the black-grained locally adopted landrace ‘Arabi Aswad’ was grown on approximately 75% of the barley growing area, particularly in the driest part of the country, unlike the white-seeded ‘Arabi Abiad’ landrace which was grown in more favourable conditions [11.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba］．与白播种品种相比，黑色种子大麦类型被认为是更耐旱性，在生长的早期阶段更加活跃，更加耐寒，更耐高采烈，更高，更高，更快 - 成熟[GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

除了在非生物胁迫条件下的更好的活力外，黑色粒粒大麦表现出对真菌感染的更高抗性。FHB筛查表明，在黑色粒度的牧草中，20％是抗性的，而非彩色的进程只发现5％的基因型是抗性的[GydF4y2Ba14.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba］．黑粒的大麦重组近交系（RILS）展现了低镰刀菌长枯萎发病率和霉菌毒素脱氧苯酚的较低积聚，而不是黄色rils，至少在某些疾病压力水平下[GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba］．上升到阻力GydF4y2Ba镰刀GydF4y2Ba疾病也有报道燕麦基因型具有浅色的人[比较深色花颖GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

一些关于黑色大麦粒植物化学成分的研究表明，真正的“类黑色素”黑色色素可能与花青素和其他相关的辅助色素同时存在，这些色素对总酚含量有贡献[GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

在黑色和白颗粒大麦近代近代素（NIL）中黄酮类生物合成途径基因的比较分析和黄酮类生物合成途径基因的转录证明，在黑色零中，没有关键的类黄酮生物合成基因均未升高，而在存在优势GydF4y2BaBLP1GydF4y2Ba等位基因，酚类化合物的总量在黑色颗粒线中比白色颗粒线中增加[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba］．这些数据表明，没有颜色（花青蛋白，花青素，磷酰酚）和uncolour过黄酮参与的“黑色素样”的色素生物合成，而是涉及其他类别的酚类化合物。GydF4y2Ba

在目前的研究中，为了揭示参与“类黑色素”黑色色素形成的遗传网络(以及代谢途径)，RNA-seq测定了黑色颗粒与白色颗粒NILs中的差异表达基因(DEGs)。GydF4y2Ba

六个汇总图书馆总共生产2300万短读数作为原始序列数据。过滤后，在进一步分析之前，从图书馆中删除了249万（15％）读取。将图书馆对齐到的GydF4y2Bah . vulgareGydF4y2Ba参考基因组导致平均为每个库映射40％的读取。图书馆预处理和映射的指标如表所示GydF4y2Ba1GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

在所有基因组片段，22976被确定为具有非零的表达水平。片段，它们的位置，注释和各自RPKM值在其他文件中列出的GydF4y2Ba1GydF4y2Ba（附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba，表'基因'）。这些片段包括在基因组组装注释中列出的基因以及袖扣管道被检测到的基因组片段，并且进一步称为“转录物”。转录物的RPKM值用于库群集（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.BLP(2)和BLP(3)文库在基因表达方面高度相似，BW(2)和BW(3)文库也是如此。BLP(1)与其他两个属于BLP线的库有些不同。BW(1)库与另外两个属于Bowman线的库进一步分离(图1)。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.然而，在地图上可以区分出两个簇，每个簇都包含两个生物系之一的所有库。GydF4y2Ba

Edger检测到648个基因，具有较低和1155个基因，线BLP中表达水平更高（附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2BaCufflinks分别检测到567和938个基因在line BLP中表达水平较低和较高(附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba，表'袖扣'）。在通过两种工具相互鉴定的基因列表中，检测到325个基因，并检测到BLP中表达水平增加的632个基因（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba；额外的文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba，桌子'Upreg Degs袖扣和edger'，'Downreg Degs Cufflinks＆Edger'）。因此，总共检测到具有差异表达的957个转录物，其包含在任何一种生物线中表达的所有转录物中的4.1％。GydF4y2Ba

PlantCyc数据库（BarleyCyc师）注释包括196个差异表达基因，通过袖扣和磨边机鉴定，为参与已知BarleyCyc途径（附加文件GydF4y2Ba2GydF4y2Ba）.具有最高PPS分数的五种途径是“嘧啶脱氧核糖核苷酸的过度GydF4y2Ba德诺维GydF4y2Ba生物合成'，'UTP和CTP去磷酸化II'，'类黄酮生物合成（赤肠）'，'黄酮酚生物合成'和'UTP和CTP去磷酸化I'。具有高次数的途径包括“Suberin单体生物合成”，'Cutin Biosynthesis'，'苯丙烷生物合成，初始反应'，'Scopolin和exculin生物合成'和'丁香酚和异黄烯醇生物合成'。在潜在的含有与尼尔的不同表型有关的途径中，是“切割蜡生物合成”和“二萜植物脂蛋素前体生物合成”。GydF4y2Ba

利用Blastp，在Affymetrix大麦基因组阵列序列中发现了508个上调转录本和270个下调转录本的同源性。基因本体富集分析表明，GO项‘脂肪酸生物合成过程’显著(FDR = 7,5·10)GydF4y2Ba^-4GydF4y2Ba)在BLP中表达较高的转录本中富集(附加文件GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba），而细胞组分GO术语“核状物”（FDR = 0,03）和“叶绿体塔克水解”（FDR = 0,029）和分子功能GO条款“转运仪活动”（FDR = 3,4·10）GydF4y2Ba^-3GydF4y2Ba）和“转录因子活动”（FDR = 5,5·10GydF4y2Ba^-3GydF4y2Ba)在line BLP表达较低的转录本中显著超标(附加文件GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba-GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

QPCR差异表达验证GydF4y2Ba

QRT-PCR用于评估BLP和Bowman Nils的种子中八个基因的转录，结果总结在图1中。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba．通过检测BLP中6个高表达基因和Bowman系中2个高表达基因来验证RNA-seq结果。GydF4y2Ba

在来自RNA-SEQ数据的基因中，BLP中的表达水平增加是编码苯丙氨酸氨 - 裂解酶（PAL），MLOC_76018编码咖啡酸O-甲基转移酶的MLOC_55029编码脂氧基酶B，MLOC_51393编码异黄酮还原酶，MLOC_3802编码普通应激蛋白的MLOC_3802MLOC_80301编码多酚氧化酶。我们还从RNA-SEQ数据进行了实验验证了两种基因，显示鲍曼线中的表达增加：MLOC_54913编码Lys-63特异性脱氢酶和编码屏幕3的MLOC_16300GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba(FC)值,GydF4y2BaP.GydF4y2Ba与Benjamini-Hochberg程序校正的RNA-SEQ数据和QRT-PCR实验折叠变化和相关GydF4y2BaP.GydF4y2Ba- 验证基因的值如表所示GydF4y2Ba2GydF4y2Ba．得到的实验数据与RNA-seq预测的结果一致。GydF4y2Ba

在存在的情况下起伏的代谢途径的多样性GydF4y2BaBLP.GydF4y2Ba（GydF4y2BaBLP1GydF4y2Ba)表明该基因具有多效性。这一发现在表型和生理水平上与以往的观察结果一致，表明除了赋予黑色外稃和果皮颜色外，显性的存在GydF4y2BaBLP.GydF4y2Ba等位基因可能有助于大麦谷物的总抗氧化水平(附加文件GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba），非生物胁迫耐受[GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba]和抗病性[GydF4y2Ba14.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba］．通过对DEG功能的研究，我们可以确定可能与DEG的表型和生理效应相关的基因和代谢途径GydF4y2BaBLP.GydF4y2Ba轨迹。GydF4y2Ba

黑“黑色素像”植物颜料具有复杂的结构，可以承受不同的化学性质几乎所有的溶剂[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba］．提出了这些颜料是酚类化合物的氧化和聚合的高分子量产物[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba21GydF4y2Ba］．事实上，已经观察到BLP中总酚类化合物比BW增加[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba］．在这里，我们报告了显著增加的水平GydF4y2Ba朋友GydF4y2Ba在BLP行mRNA(表GydF4y2Ba2GydF4y2Ba,无花果。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba）.PAL编码苯丙氨酸氨酶，植物中酚类化合物的底层生物合成的苯丙氨酸氨酶。然而，这些定量变化在酚类代谢物和GydF4y2Ba朋友GydF4y2Ba转录本不能解释显性和隐性基因型之间的质量差异GydF4y2BaBLP.GydF4y2Ba等位基因。调查附加DEGS，我们建议，黑色素可以与多酚氧化酶（PPO）的BLP的高表达水平（表相关联GydF4y2Ba2GydF4y2Ba,无花果。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba）.多酚氧化酶催化酚类物质氧化成醌。醌类化合物聚合的产物使一些蔬菜和水果接触空气后颜色变深[GydF4y2Ba22GydF4y2Ba］．在人类中，类似的酶酪氨酸酶，参与黑色素的合成[GydF4y2Ba23GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

在小麦中，黑色尖刺的基​​因型携带显性等位基因GydF4y2BaBG.GydF4y2Ba（GydF4y2BaRG-糖化血红蛋白GydF4y2Ba）在染色体1a上，然而在短臂上[GydF4y2Ba24GydF4y2Ba那GydF4y2Ba25GydF4y2Ba),所以大麦GydF4y2BaBLP.GydF4y2Ba和小麦GydF4y2BaBG.GydF4y2Ba不太可能是同系物。小麦中黑色颖片颜色的起源仍然不清楚，尽管有人认为它与联苯有关，这是一类类黄酮化合物[GydF4y2Ba26GydF4y2Ba］．然而，在大麦中，我们没有观察到鉴定的DEG之间的嗜酚生物合成结构基因。GydF4y2Ba

黑谷物抗氧化能力的提高也可能与酚醛含量的增加有关，因为许多酚醛化合物都是抗氧化剂[GydF4y2Ba27GydF4y2Ba］．在DEG中是与酚醛代谢有关的基因，这对于增加BLP线中颗粒的抗氧化能力的机制特别感兴趣。该基因，BLP中的mRNA水平增加，编码咖啡酸O-甲基转移酶（表GydF4y2Ba2GydF4y2Ba,无花果。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba)，将咖啡酸转化为阿魏酸[GydF4y2Ba28GydF4y2Ba］．阿鲁酸是一种普遍存在的植物成分，由苯丙氨酸和酪氨酸代谢而产生。阿魏酸的积累主要在种子和叶子(包括免费的形式以及共价链接到木质素或其他生物聚合物),以其终止自由基链式反应的能力,因此是一个重要的抗氧化功能,保持细胞的生理完整性在不利的条件下(GydF4y2Ba29GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

黑色粒子对氧化应激的较高电阻可以部分解释早期的发现，即黑色播种类型是更耐旱，在生长和更耐冷比白播种类型的早期阶段更有力[GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba］．更高的耐旱性也可能与表皮蜡的生物合成有关，正如我们的研究所揭示的，这是在存在的代谢途径之一GydF4y2BaBLP.GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

抗氧化能力有助于提高生物的抗应激能力。GydF4y2Ba

黑色颗粒颜色与更高的耐抗性有关GydF4y2Ba镰刀GydF4y2Ba在大麦GydF4y2Ba14.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba]和oat [GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba］．Fusarium Head枯萎是一种潮湿的病情，在开花和核心开发的早期阶段受到潮湿的病症。由于蓄热和加速干燥，谷物谷物可能具有优势。除了黑色色素沉着的这种可能效果外，显性的耐高率升高GydF4y2BaBLP.GydF4y2Ba等位基因载体到GydF4y2BaFusarium Graminearum.GydF4y2Ba也可以用酚醛化合物的密集生产来解释。Gunnaiah等人应用代谢-蛋白质组学综合方法破解小麦QTL (GydF4y2BaFHB1.GydF4y2Ba)有助于抵抗GydF4y2BaF. Graminearum.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba］．GydF4y2BaFHB1.GydF4y2Ba是不相关的GydF4y2BaBLP.GydF4y2Ba或黑色颗粒色素沉着。然而，它提供了阻力GydF4y2BaF. Graminearum.GydF4y2Ba通过诱导苯丙素途径，导致具有抗性的小麦NILs轴的次生细胞壁增厚GydF4y2BaFHB1.GydF4y2Ba等位基因。最后，增加的转录活性GydF4y2Ba朋友GydF4y2Ba基因可以影响Suberin和Phytoalexins的生物合成。Suberin，一种在高等植物中发现的防水蜡质物质，可以通过预防来利用潮湿条件下的黑粒谷物GydF4y2BaF. Graminearum.GydF4y2Ba而植物抗毒素(一种以抗菌特性著称的植物分子)可以作为真菌的毒素。除了GydF4y2Ba朋友GydF4y2Ba基因，我们鉴定了另一个对酚类植物抗毒素合成重要的DEG，编码异黄酮还原酶(Isoflavone reductase, IFR)(表GydF4y2Ba2GydF4y2Ba,无花果。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba）.此外，还鉴定了萜类植物抗毒素合成所必需的DEGs(补充文件)GydF4y2Ba2GydF4y2Ba；'二萜植物脂肪素前体生物合成'）。GydF4y2Ba

提高抵抗力GydF4y2BaF. Graminearum.GydF4y2Ba在GydF4y2BaBLP.GydF4y2Ba载体也可以用表皮蜡的形成来解释。在我们的研究中，表皮蜡的生物合成被揭示为一种代谢途径诱导的存在GydF4y2BaBLP.GydF4y2Ba．抗性的另一种抵抗机制可以与编码普遍应激蛋白（USP）的基因的表达增加，这通常在环境应激下表达并刺激进一步的应力耐受性[GydF4y2Ba31GydF4y2Ba］．BLP线在最佳条件下具有增加的USP水平，因此即使在没有初步刺激的情况下，也可能会增加对环境压力的耐受性。GydF4y2Ba

代谢途径和基因可能与黑色引理和果皮颜色以及具有亲生效应相关的GydF4y2BaBLP.GydF4y2Ba位点(即抗氧化应激和病原菌)被揭示。我们认为，外稃和果皮的黑色色素可能与酚类化合物含量的增加及其氧化有关。的影响GydF4y2BaBLP.GydF4y2Ba阿魏酸和其他酚类化合物的合成可能是黑粒谷物抗氧化能力和生物和非生物胁迫耐受性增强的原因之一。影响穗的抗旱性和抗病能力也可能与角质层蜡的生物合成有关。此外，在lemmas和pericarps中上调合成植物脂蛋素，suberin和普通应激蛋白（USP）GydF4y2BaBLP.GydF4y2Ba带菌者也可能增加了他们的抗病能力。进一步描述对其与生理特性的关系和研究其与生理特性的关系可能对于未来在大麦预育种中的应用可能是有用的。GydF4y2Ba

植物材料，RNA提取，基因分型和TAC测量GydF4y2Ba

两个GydF4y2Bah . vulgareGydF4y2Ba品种鲍曼(GydF4y2Ba32GydF4y2Ba] near-isogenic lines (NILs) were used in the study: ‘Black lemma and pericarp 1.b’, BLP (NGB20470) with black lemma and pericarp, and ‘Bowman From Fargo’, BW (NGB22812) with green lemma and uncoloured pericarp. These lines were kindly provided by the Nordic Gene Bank (NGB,www.nordgen.org.GydF4y2Ba）.植物在ICG温室核心设施（NovoSibirsk，俄罗斯）在20-25°C的每天12小时下长不到12小时。植物是基因分型并用于RNA-SEQ分析。用来自叶片材料（在叶片开发阶段，BBCH码12期间）的微卫星标记的基因分型提取DNA，使用Plaschke等人描述的程序。[GydF4y2Ba33GydF4y2Ba］．大麦1H微卫星位点的扩增，引物[GydF4y2Ba34GydF4y2Ba那GydF4y2Ba35GydF4y2Ba]是在根据Roder等人进行的PCR中使用。[GydF4y2Ba36GydF4y2Ba］．扩增产物通过5%琼脂糖(ACTGene, Inc.， Piscataway, NJ, USA)凝胶分离后可见。BLP NIL染色体1H供体片段的方案在附加文件中提出GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

使用RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Germany)从BLP和Bowman系的外稃和果皮组织(早期生面成熟度，BBCH代码83)中提取总RNA。将从几种植物中提取的RNA进行聚合，以排除生物材料的偏差可能带来的错误。每个基因型准备3个生物重复。GydF4y2Ba

提取了TAC测量获得的孵化1克的全麦粉10毫升的1%盐酸1 h在37°C(方法1)或10毫升的1%盐酸在40%乙醇为30分钟37°C(方法2)。三个复制每一行进行分析的方法)。根据制造商的说明，使用抗氧化活性分析仪“Blizar”(Interlab Ltd.，俄罗斯)进行测量。结果显示在附加文件中GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

RNA制备和测序GydF4y2Ba

将RNA合并成六个图书馆（每条线的三次重复）。将ERCC Spike-in混合物添加到每个文库中以作为内部控制。将文库与聚-T尾珠孵育，用于聚类富集。通过与核酸酶孵育来破碎图书馆RNA。使用离子粗略平台进行测序。GydF4y2Ba

读取预处理和映射GydF4y2Ba

prinseq [GydF4y2Ba37GydF4y2Ba]工具v 0.20.4用来评估序列质量和筛选库。长度小于50个核苷酸和平均Phred质量小于20个的序列被排除在进一步分析之外。被过滤的库被映射到GydF4y2Bah . vulgareGydF4y2Bagenome assembly version 32,608 v 1.33来自Ensembl Plants数据库(GydF4y2Bahttp://plants.ensembl.orgGydF4y2Ba）.映射用TopHat2工具v 2.1.0执行的处理GydF4y2Ba38GydF4y2Ba]使用Bowtie2 V 2.2.6软件构建基因组指数[GydF4y2Ba39GydF4y2Ba］．TopHat2参数“允许不匹配”、“读编辑距离”和“读间隙长度”设置为4。GydF4y2Ba

将文库映射到参考基因组后，使用Cufflinks v 2.2.1管道对结果进行比对[GydF4y2Ba40GydF4y2Ba］．映射到每个基因组片段的读数的数量，无论是在基因组组件中表达或注释（参考此处为“转录物”）和相应的rpkm（每百万映射读数读取每千碱基读数）[GydF4y2Ba41GydF4y2Ba值用于检测两种大麦株系间基因的差异表达。此外，利用cummeRbund [GydF4y2Ba42GydF4y2Ba袖扣管道识别的全部转录本列表用作一个子集。GydF4y2Ba

基因表达分析GydF4y2Ba

差异表达式搜索使用Cufflinks管道cuffdiff实用程序和EdgeR v 3.8.6 [GydF4y2Ba43GydF4y2Bar v 3.1.3包装。似然比测试用边缘进行。从分析中丢弃了属于任何生物系中的任何一种生物线的三种文库中的总RPKM值的转录物。在两条线之间差异表达，在两条线之间差异表达，具有两倍的表达水平（| logfc | 1）和FDR <0.05的表达水平（| logfc |> 1）和FDR <0.05的转录物。分别分别对BLP中表达较高和较低水平的转录物。GydF4y2Ba

抄本功能注释GydF4y2Ba

来自BLAST suite v 2.6.0的BLAST实用程序[GydF4y2Ba44GydF4y2Ba用于将差异表达的转录物的测序对齐，以从Agrigo数据库下载的大麦染色仪基因组阵列的序列[GydF4y2Ba45GydF4y2Ba］．对每个转录本进行了同源性最高的大麦Affymetrix基因组序列的鉴定。利用AgriGO数据库奇异富集分析工具对BLP表达水平升高和降低的转录本对应的Affymetrix序列进行处理。GydF4y2Ba

使用植物代谢网络（PMN）数据库，Barleycyc Distration分析具有差异表达的注释基因（GydF4y2Bahttp://plantcyc.org/databases/barleycyc/5.0.GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

QRT-PCR.GydF4y2Ba

对于QPCR，用DNA酶（无QIAGENRNASE DNA酶组）处理分离的RNA。然后，基于Revertaid TM套件（Thermo Fisher Scientific Inc.，Waltham，Ma，USA）和A（DT），使用0.7μg的RNA制备单链cDNA。通过逆转录制备单链cDNAGydF4y2Ba_15.GydF4y2Ba底漆。GydF4y2Ba

引物使用IDT PrimerQuest软件（设计GydF4y2Bahttp://eu.idtdna.com/primerquest/home/GydF4y2Ba）八个舞台（表GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

这GydF4y2Ba哥伦比亚大学GydF4y2Ba（泛素）基因序列用作参考[GydF4y2Ba46GydF4y2Ba］．随后的QRT-PCR基于Syntol Sybr Green I套件（Syntol，Moscow，俄罗斯）。进行三种技术重复的每种反应。GydF4y2Ba

BLP：GydF4y2Ba

黑色雷姆玛和果皮GydF4y2Ba

BW:GydF4y2Ba

鲍曼GydF4y2Ba

度:GydF4y2Ba

不同表达基因GydF4y2Ba

FHB：GydF4y2Ba

镰刀菌素头枯萎GydF4y2Ba

去：GydF4y2Ba

基因本体论GydF4y2Ba

IFR：GydF4y2Ba

异黄酮还原酶GydF4y2Ba

朋友:GydF4y2Ba

苯丙氨酸氨 - 裂解酶GydF4y2Ba

PPO:GydF4y2Ba

多酚氧化酶GydF4y2Ba

PPS：GydF4y2Ba

途径扰动成绩GydF4y2Ba

QRT-PCR：GydF4y2Ba

定量RT-PCRGydF4y2Ba

RPKM:GydF4y2Ba

每千碱基每百万次读取GydF4y2Ba

RT:GydF4y2Ba

逆转录GydF4y2Ba

TAC：GydF4y2Ba

总的抗氧化剂含量GydF4y2Ba

我们感谢Galina Generalova女士，Tatiana Kukoeva夫人和Olga Zakharova夫人（ICG，Novosibirsk，俄罗斯），用于技术援助，以及埃琳娜Gordeeva和Rimma Yudina的帮助，有关TAC的帮助。GydF4y2Ba

资金GydF4y2Ba

出版成本由俄罗斯科学基金会资助（№16-14-00086）。ICG项目的ICG项目0324-2016-0001支持米格植物生长核心设施的大麦植物。GydF4y2Ba

数据和材料的可用性GydF4y2Ba

原始的RNA-SEQ数据可在NCBI获得Bioproject Prjna399215。GydF4y2Ba

关于这个补充GydF4y2Ba

本文已作为GydF4y2BaBMC植物生物学GydF4y2Ba2017年第17卷增编1:PlantGen 2017节选文章。该补充的全部内容可在网上找到GydF4y2Ba//www.cinefiend.com/articles/supplements/volume-17-supplement-1GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

作者笔记GydF4y2Ba

隶属关系GydF4y2Ba

1. 细胞学研究所和遗传学SB RAS，Novosibirsk，俄罗斯GydF4y2Ba

   Anastasiya Y.Glagoleva，Nikolay A. Shmakov，Olesya Y. Shoeva，Gennady V.Vasiliev，Natalia V. Shatskaya，Dmitry A. Afonnikov＆Elena K. KhlestkinaGydF4y2Ba

2. Novosibirsk州立大学，俄罗斯新西伯利亚GydF4y2Ba

   Anastasiya Y. Glagoleva, Nikolay A. Shmakov, Dmitry A. Afonnikov和Elena K. KhlestkinaGydF4y2Ba

3. 莱布尼兹植物遗传学研究所遗传学研究所和作物植物研究（IPK），CURRENSSTR。3，D-06466，Gatersleben，Stadt Seeland，德国GydF4y2Ba

   andreasbörner.GydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

AYG参加文库的RNA，制备和测序的提取，进行的qRT-PCR的和统计分析，参加了起草手稿。NAS的测序数据的计算机分析进行，参加起草的手稿。OYS促成了数据的解释和参与起草的手稿。GVV备库，进行库的测序上IonTorrent平台，参与研究的协调和解释数据。NVS参与准备和图书馆的测序。AB提供的植物材料，促进了研究和解释数据的概念。DAA参与研究的协调和解释数据。EKK设想的研究，促成了其构思，设计和协调，对数据的解读和批判性地修改稿件。所有作者阅读并认可的终稿。GydF4y2Ba

通讯作者GydF4y2Ba

对应于GydF4y2BaAnastasiya Y. Glagoleva.GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

伦理批准和同意参与GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

同意出版物GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

利益争夺GydF4y2Ba

提交人声明他们没有竞争利益。GydF4y2Ba

出版商的注意事项GydF4y2Ba

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