质体系统基因组学研究发现，温带木本竹分子进化速率与开花周期呈负相关

背景

在整个生命树中，分子进化的异质率是普遍的，这对系统发育推断提出了挑战。温带木本竹子(竹科，竹科，Arundinarieae)以其极慢的分子进化速度而闻名，据说是由它们神秘的单果繁殖引起的。然而，替代率与开花周期之间的相关性还没有得到正式的检验。

结果

在这里，我们介绍了15个新测序的温带木本竹质体基因组，包括有史以来第一个测序的马达加斯加代表基因组。建立了代表12个直系的46个质体基因组的数据矩阵，用于系统发育和分子进化分析。我们使用不同的序列(如编码和非编码)结合不同的数据划分方案进行了系统发育分析，揭示了几个谱系之间涉及节点间的冲突关系。不同谱系间分枝长度差异较大，拓扑不一致可能是由于长枝吸引(LBA)所致。利用最大似然和贝叶斯方法的时钟模型拟合，我们进一步证明了这些主要谱系之间广泛的速率变化。在部落进化过程中，速率加速主要发生在物种多样性有限的孤立谱系中，共发生了11次速率偏移。通过线性回归分析，我们发现Arundinarieae的分子进化速率与开花周期之间存在负相关关系，但考虑系统发育结构时，这种相关性可能不显著。

结论

以温带木本竹子为例，我们发现了进一步的证据，表明速率异质性在植物中普遍存在，这表明这将对竹子的系统发育重建提出挑战。开花周期较长的竹子往往比开花周期较短的竹子进化得更慢，这与假定的世代时间效应一致。

不同谱系之间分子进化速率的异质性，即某些谱系与其近亲相比经历显著不同的速率，在整个生命树中普遍存在。这一现象已被充分记录。1，2]在不同的植物群中，如vittariaceae蕨类植物[3.]，石龙目[4]，和共花单子叶[5，6］．在推断和确定进化事件的年代时，谱系特异性比率异质性可能会成为问题[7，8，9]，通过违反序列进化的模型假设而导致偏差。高进化速率序列中的同构特征可能导致它们聚类，而不考虑它们真正的系统发育关系，这一问题被称为长分支吸引(LBA) [7，10，11］．

大多数针对分子进化速率异质性的研究都试图确定分子进化速率与相关生物体的生活史特征之间的相关性[12，13］．许多性状之间的关系，如身体大小，代谢率，生长形式或世代时间已被提出[1，2，12，14]，但到目前为止，对于哪种性状最能解释这种变化，特别是对植物而言，还没有达成共识[15］．在植物中，生活史性状可以显著共变，而某一性状的变异(例如一年生习惯与一年生习惯)通常反映了世代时间的差异[1］．有人认为，具有较长世代时间的生物进化较慢，因为它们的基因组复制频率较低，导致单位时间内累积的DNA复制错误较少，这种现象被称为世代时间效应[12，16］．

这种分子进化速度较慢的谱系的典型例子是木本竹子(竹科，竹亚科)[17］．它们在一般快速进化的草科中是不寻常的[5，6]，其不同之处在于它们的木质习性和极罕见的开花间隔，大多数品种的开花间隔长达10至60年[18，19]，而且直到最近，许多竹子的开花事件仍未被记录下来[19，20.］．多数木本竹为单性繁殖无性系，且营养期较长，呈现大量开花的现象[18］．人们提出了许多假说来解释木本竹中这种半生期大量开花的进化，如捕食者饱和[18]及竹火循环[21］．然而，两者都没有足够的证据支持。木本竹子的开花仍然是植物进化中的一个谜。

木本竹子分子进化速度缓慢的现象已经被记载很久了[17]，尤见于温带的木质竹子(竹科)[22，23，24]，这一事实可能与它们的长开花周期(即世代时间)有关。此外，在最近的质体系统发育学分析中，这些竹子内部的显著替代率变化出人意料地得到了证实[25]，尽管整体增长缓慢。分子进化速率与木本竹子开花周期之间存在负相关的假设，尽管看起来很直观，但还没有根据经验数据进行严格的检验。一个明显的解释是缺乏可靠的记录它们的开花周期，因为开花时间仍然是不可预测的，间隔时间往往比研究人员的职业生涯甚至寿命都长[18，26］．这也可能是由于整体质体基因组替代率通常太少，无法使用通常为这些竹子测序的一组常见分子标记来可靠地估计。

Arundinarieae是具有重要经济和生态价值的竹子，由约533种组成，形态多样性广泛[19，20.，27］．它们主要分布在东亚至斯里兰卡、印度南端、马达加斯加、非洲大陆和北美东部的山地森林中，表现出高度不对称的分布，95%以上的物种水平多样性局限于东亚[19，20.，27］．Arundinarieae的分类学很复杂，在属和种的定义上有许多未解决的争议[23，24，27］．由于分子进化速度缓慢，缺乏信息丰富的分子标记，这也对Arundinarieae的系统学提出了重大挑战。早期基于多个质体位点的系统发育研究将该部落分为12个谱系(其中7个只包含一个物种)，但这些谱系之间的关系仍未得到解决[23，24，28，29］．这些关系在很大程度上是通过质体系统基因组学建立的[25]，尽管只有一个来自非洲的物种的两个世系的位置和亲缘关系仍然是谜。可从三个谱系获得的部分质体基因组(注释为I和II来自非洲，X来自东亚，[25)可能是这种缺乏决心的部分原因。在我们准备本文的过程中，另一项利用质体系统基因组学对Arundinarieae进行的研究发表了9个新测序的几乎完整的基因组，包括两个有争议的非洲大陆类群[30.］．然而，争议仍然存在，需要进一步的工作。在本研究之前，在完整的质体基因组数据集中采样了覆盖整个现存分布的Arundinarieae的代表性物种[25，30.]，只有一个显著的例外:马达加斯加特有的Arundinarieae辐射。这些分离的马达加斯加竹子是Arundinarieae中研究最少的，在本研究之前，只有两个具有两个质体DNA位点的物种被纳入分子分析[23，31]从六个已知类群中[32］．

为了了解Arundinarieae中分子进化和开花周期的对比速率，有必要显著增加该类群可用的质体数量，特别是通过包括对系统发育位置或分子进化速率知之甚少的马达加斯加谱系[31］．在设计这项研究时，我们计划结合已发表的27个温带木本竹子的完整质体基因组[25，33]，旨在解析Arundinarieae树中的关键节点。我们测序了15个新的完整质体基因组，建立了质体基因组数据集，用于评估该部落分子速率异质性的程度，并测试分子进化速率与温带木本竹子开花周期之间的任何关联。

arundinaraceae的质体基因组及其排列

利用Illumina对总基因组DNA进行测序，并结合de novo和reference-guide assembly，我们成功地将15个新的温带木本竹子质体基因组组装成一个没有间隙的圆形图谱。其中，有三个谱系的质体基因组在之前的研究中是不完整的[25]被重新测序，来自5个个体的质体代表了马达加斯加原生的4个Arundinarieae物种(表1)首次测序。该部落的12个已确定的血统现在都在我们的数据集中以完整的质体基因组序列表示(表1)，也代表了部落分布范围的全部范围(图。1)．

15个新质体的总基因组大小相似，从139,130到140,047 bp。奇怪的是，两个最小的(Oldeania ibityensis)和最大(o . humbertii)质体组已从马达加斯加获得新测序(附加文件1)．在这些新生成的质体基因组中未检测到蛋白编码改变或基因顺序重排或大反转等显著的基因组结构变化。选择四种热带木本竹(竹族)作为系统发育推断的外群(附加文件)1)，因为这些人与我们的兴趣团体最接近[33］．对于内组，共取样了Arundinarieae 12个谱系中的40个物种的42个种质(附加文件)1)．从三个最大的谱系(IV、V和VI)中包括多个物种，以涵盖它们的系统发育多样性[23，24］．我们分析了整个质体基因组，除了一个倒置重复(IR)区域外，对齐的基质长度为124,679 bp。整个Arundinarieae序列差异较小，为3.03%。

基于全质体基因组的Arundinarieae系统发育框架

尽管序列差异较小，但完整质体基因组使我们能够建立一个信息丰富的系统发育数据集。我们以未分割和分割的方式进行了最大似然(ML)和贝叶斯分析。在未分区分析中，ML和贝叶斯方法产生了相同的树拓扑，除了谱系V中的一个节点(图5)。1和附加文件2)，但在ML分析中支持度较差(71% ML自举值)，在贝叶斯分析中几乎可以忽略不计(0.34贝叶斯后验概率)。PartitionFinder选择的最佳分区方案[34]将比对分为五个分区，ML和贝叶斯分析都获得了几乎相同的结果(附加文件3.)．

总的来说，Arundinarieae主要世系之间的系统发育关系与[25，30.]，但具有更好的支持，特别是对谱系I、II和x的节点。在我们的树中，主要谱系中的10个节点中有7个被ML自举值≥85%和贝叶斯1.0后验概率强支持。1)．所有五种抽样的马达加斯加竹子都形成了一个单系群，作为属的姐妹得到了充分的支持Oldeania来自中非东部(图;1)．血统I和血统X之间的姐妹关系，与[的姐妹关系形成对比25，30.]，得到弱到中等的统计支持(58% ML自举值和0.86贝叶斯后验概率)。此外，世系IV、VI和VIII之间的ML自举支持值(52%和60%)仍然较低[25，30.］．这两个样本Thamnocalamus从以前的不同研究中[25，33]没有聚集在一起(图;1)，最可能是由身份的t . spathiflorus_LC1319加入。这个样本聚集在Bergbambos组，而t . spathiflorus_MPF10056的加入Thamnocalamus两组均具有100%引导支持的基于ML分析的更多Bergbambos而且Thamnocalamus样本来自[23，24](附加文件4)．推断的树具有一系列连接长终端分支的短节点间(图2)。1)，各主要谱系间分枝长度差异显著，表明分子进化速度不同。

冲突的关系和对比的分支长度

考虑到率异质性(如LBA)的潜在影响，我们分析了未分割方案和分割方案中质体基因组的编码和非编码序列。它们的分子进化速度不同，这有助于识别和克服系统发育分析中潜在的系统错误。Arundinarieae主要谱系之间的系统发育关系在没有划分或基于tRNA、rRNA、蛋白质编码区域的三个密码子或PartitionFinder划定的非编码区域进行划分的分析中基本一致(图2)。1及附加文件5，6，7而且8)．然而，除了上述适度支持的关系外，世系II和世系IX之间的姐妹群体关系是可变的(图2)。1)。在系统发育树中，共有3个区域存在冲突，且富集于短节间和长分支，如图所示。2．

在编码数据集分析中，谱系X被恢复为由六个主要谱系组成的单系组的姐妹，而在所有其他分析中，谱系I不是姐妹(图2)。2)．在对编码数据集的分析中，获得了沿袭X位置的最高ML自举支持值(未分区的为80%，分区的为79%;无花果。2)．另一方面，对编码数据集的分析将谱系IX视为谱系III + XII的姐妹，具有中等支持，而不是谱系II(图2)。2)．对于谱系IV, VI和VIII之间的关系，与所有其他分析相比，在编码数据集分析中再次获得了替代拓扑。世系IV、VI和VIII之间恢复的关系都没有得到强有力的支持(图2)。2)．与编码数据集相比，从非编码数据集推断的系统发育关系与从整个质体基因组分析得出的系统发育关系完全一致，支持值通常更高(附加文件)7而且8)．

Arundinarieae的速率异质性

由ML和贝叶斯分析估计的亲缘关系(图。1及附加文件2而且3.)显示了Arundinarieae主要谱系的高度异质性分支长度。在由谱系II、III、IX和XII组成的分支中，有一个明显的向较长的分支发展的趋势，而在Arundinarieae的谱系V中发现了最短的分支(图5)。1)．在谱系VI中也观察到大量的分支长度变化(图。1)．除了简单的目视检查分支长度外，我们还使用了模型拟合测试[3.]由PAML提供[35]正式研究整个Arundinarieae的分子进化速率变化。

假设各谱系间速率相同的全球时钟模型被明显拒绝，而无时钟模型最受青睐(表2)2)，尽管受到赤池信息标准(AICc)的严厉处罚。局部时钟模型比全局时钟模型更适合数据，但不如无时钟模型。对于局部时钟模型，允许拥有自己时钟的血统越多，AICc评估的模型拟合性越好(表2)2)．每个本地时钟模型的AICc得分比下一个拥有更少血统的模型提高了12分以上(表2)，而四个或以上的点可视为非常符合[36］．其中，值得注意的改进是模型中125.698个AICc点，该模型允许II、III、IX和XII世系的分组有自己的时钟，正如预期的那样，这些世系的分支非常长(图。1)．此外，部落内进化最快和进化最慢的谱系之间分子进化速率的最大差异约为3倍(XII和V)(表12)2)．

基于随机本地时钟(RLC)模型的BEAST分析[37，38]显示了与似然分析相似的一致的速率变化，重建了Arundinarieae系统发生树的每个分支的分子进化速率(图。3.和附加文件9)．整个树的速率移位数的中位数为11,95%最高后验密度(HPD)区间为9-13。谱系II、III、IX和XII的分支被重建为分子进化速率增加，而谱系V的分支进化速率下降，两者之间的差异接近3倍(图2)。3.)．速率减速也发生在谱系VI(图。3.)．除了RLC模型，我们还在BEAST分析中应用了对数正态不相关放松时钟(LURC)模型，并获得了非常相似的结果，尽管重构的速率变化模式不太均匀(附加文件)10)．在这个模型下，谱系V的速率下降似乎主要归因于谱系底部的一个缓慢分支，而谱系II、III、IX和XII的速率相当一致地升高(附加文件)10)．

替代率与开花周期呈负相关

如上所示，现在很清楚的是，尽管总体上分子进化的速率较低，但在Arundinarieae的主要世系中发生了广泛的速率变异。因此，确定这种比率变化的潜在相关因素是有趣的。对竹子来说，一个潜在的原因是它们以开花事件间隔时间的差异而闻名，这代表了世代时间的合理测量。我们首先从文献中收集了40个Arundinarieae物种的开花事件数据。其中14种有可靠的开花周期记录，尽管大多数有至少一种有记录的开花事件的数据1)．据我们所知，这14个记录几乎代表了迄今为止所有记录完好的Arundinarieae开花周期。开花周期短则1年，长则100年以上，大多数花期间隔在20至60年之间1)．我们还在修剪后的未分割ML树中绘制了记录的开花周期，以演示该特征在部落中的进化(图2)。4)．绘图重建了开花周期的平均值(图中绿色部分表示)。4)为树的根部，由此衍生出非常短或非常长的开花周期。我们注意到Gaoligongshania megalothyrsa开花周期长值较大，系统发生树分支较长。

我们计算了这14个有记录的开花周期的物种的系统发生树的根到尖的分支长度，反映了它们的分子进化速度[13]，并进行线性回归分析，以评估开花周期与开花速率之间的关系。利用从整个质体基因组序列数据集推断的ML树上计算的根到尖端距离(图2)。1)，简单线性回归结果显示，分子进化速率与开花周期呈显著负相关(r=−0.5824,P= 0.0288;无花果。5)．然而，点表示g . megalothyrsa是一个异常值(图中填充的圆。5)，明显偏离回归线。因此，我们使用对异常值不敏感的Siegel重复中值方法进行线性回归[39]，导致更显著的p-value为0.00136的相关性(图;5)．此外，我们还进行了系统发育独立对比(PIC) [39在检测相关性时解释系统发育关系的分析。PIC分析显示，分子进化速率随开花周期的变化呈相同的下降趋势，但不显著(r=−0.1688,P= 0.5815)。

由于它们在草类中的特殊生物学(例如，木质习性和很少开花)，温带木质竹子长期以来以其极低的分子进化速率而闻名[17，22，23，24］．已提出在该组别内可能出现的比率异质性[25］．然而，由于低遗传分化，以及用于系统发育重建和替代率估计的大规模序列数据的可用性有限，对这一假设的系统研究一直受到限制[22，23，24］．测量分子进化速率通常需要在系统发育重建后计算分支长度[13］．通过生成许多以前未采样的类群的完整质体基因组序列数据，我们重新评估了Arundinarieae与所有12个采样谱系的系统发育关系，为这些孤立谱系在其中的系统发育位置提供了进一步的解决方案。我们还发现了温带木本竹子中广泛的速率变化的有力证据，并验证了替代率与开花周期相关的假设。

arundinaraceae的替代率异质性及其相关性

了解物种间的分子进化速率差异是一个挑战[3.，13］．目测系统发育树分支长度之间的差异只能给出关于速率变异的经验印象，应使用严格的统计分析来检验变异的真实性。我们在我们的数据集上进行了基于可能性的模型检验，这种方法在最近的研究中被证明是调查率异质性的有效手段[3.，6]，以及一个贝叶斯框架来估计可以直接比较的相对替代率。通过这两种方法，我们证明了Arundinarieae中广泛的速率变化(图2)。3.、表2)．尽管不同植物类群的率异质性已被表征，但大多数研究都是在高分类水平上进行的，通常高于科水平[例如，3,4,6]。我们在这里提出了一个植物中较低分类水平的速率异质性的例子，在大约1100万至1200万年前的部落中[31］．

3.、表2)．速率减慢主要发生在部落中物种多样性最高的谱系V [23，24］．2)，在Arundinarieae中，比例差异最大。在贝叶斯分析中，这些谱系之间的比率变异性几乎相同(2.79-2.91倍)。3.及附加文件9而且10)．尽管在低分类水平上，这种最大的比率差异与在高分类水平上观察到的差异(约3.53倍)有一些相似之处，如共花单子叶[6]和caryophylales(~3.1倍)[4］．与谱系V相比，其他孤立谱系的替代率也很高，但没有上述谱系那么显著。除了主要谱系之间的比率异质性外，在谱系VI内也观察到异质性(图1)。3.及附加文件9而且10)．在RLC模型下的贝叶斯分析中，一共恢复了11次Arundinarieae进化过程中的速率偏移。

木本竹子分子进化速度缓慢一直被认为是由于它们很少开花[17］．获得开花周期的数据是研究的主要挑战:由于开花事件的罕见性和不规则性，其历史记录很差[18，26］．现有的历史记录通常是残缺不全的，核实起来很有挑战性，尤其是温带的木本竹子[26］．本研究收集了14个可靠的开花周期记录(表1)和线性回归分析发现，Arundinarieae植物的分子进化速率与开花周期呈显著负相关(图2)。5)，尽管在PIC分析中考虑到这些竹子的共同进化史时，相关性并不显著。PIC分析的非显著性可能是由于该测试的样本量较小。因此，快速进化的温带木本竹子的开花周期往往比缓慢进化的木本竹子的开花周期短g . megalothyrsa作为一个值得注意的例外(图。5)．树的花期图谱表明，树的花期长g . megalothyrsa可能是最近的收购(图;4)．不出所料，更重要p相关性的-值是使用西格尔重复中值线性回归方法获得的，该方法是在存在异常值和有限测量值时检测相关性的更强大的检验方法[39]，与简单线性回归方法相比(图;5)．虽然并不是所有40个样本Arundinarieae物种都有开花周期，但这14个开花周期在Arundinarieae的主要谱系中或多或少分布均匀(图2)。1而且4)．由于来自同一谱系的物种具有相对一致的分子进化速率和相似的开花周期间隔(图2)。3.而且4)，我们假设这种负相关可能与更多物种的开花周期数据的增加有关。木本竹子的开花模式及其触发因素仍然是生物学的一个谜。18，21，26］．本文首次建立了分子进化速率与分子进化速率的负相关关系，为今后对木本竹材的进一步研究提供了一个正式的实验依据。

世代时间(以开花周期之间的时间来评估)效应可以直接解释Arundinarieae中分子进化速率与开花周期之间的相关性[1，12，16］．一般认为，由于世代时间较短，每时间单位的有性繁殖频率增加，累积的突变就会更多。尽管植物生殖组织是由持续有丝分裂的顶端分生组织发育而来，但以往的研究表明，体细胞突变不能抵消种系突变对分子进化速度的影响[1］．此外，生成时间还可以用来解释分子进化速度与其他性状之间的关系，如植物的高度[40］．然而，我们不能排除其他生物过程也参与这种相关性的可能性，特别是对于这些具有高分子进化率的孤立世系，它们的物种通常是特有的和分布狭窄的。与这些竹子过去长距离扩散事件相关的种群规模和瓶颈效应等因素[31]应该被考虑在内，以解释孤立世系的高发病率，特别是来自马达加斯加的世系。不幸的是，质体蛋白编码基因的同义和非同义替换可以为理解这些因素的潜在作用提供更多的见解[41，42]的数量太低，无法在这里进行可靠的估计。分子进化速率与开花周期之间的负相关关系，以及温带木本竹的分子进化速率变化的其他潜在相关关系，值得进一步研究，并结合其他生活史性状数据[15]，以及核和线粒体基因组数据。

Arundinarieae的系统发育和进化意义

速率异质性会影响系统发育推论的准确性[7，8，9]，导致不相关的类群以高分子进化速率聚集在一起，这种现象被称为LBA [10，11］．分子进化模型的不规范和高度异质率的结合可以放大这种效应[9］．在Arundinarieae的系统发育树中，涉及几个孤立谱系(例如谱系IX和X)的关系很难解决(图2)。1而且2) [25，30.］．它们的节间短，末端分支长，容易受到LBA的影响。为了解决潜在的系统错误，我们使用进化中保守的编码序列以及分区模型进行了系统发育分析。这些方法都有能力处理LBA工件[11，43］．

在缓慢进化的质体编码序列分析中不支持谱系I和谱系X之间的姐妹关系。这两个谱系都在快速进化，分支长度都很长(图2)。1)，而整个质体基因组分析所揭示的这种姐妹关系很可能是LBA的结果。如果是这种情况，在分析快速进化的质体非编码序列时，LBA的作用将被放大[11这就是我们所发现的。2)．对于世系II和世系IX之间的姐妹关系，我们得到了与上面相似的结果(图2)。2)．涉及谱系IV、VI和VIII的系统发育关系(Arundinarieae树中剩余的不确定区域)仍然难以捉摸(图2)。2)．总之，我们认为使用编码序列重建的系统发育关系比使用非编码或完整质体基因组序列重建的系统发育关系更可靠，至少对于谱系IX和谱系x的系统发育位置而言是如此。因此，我们建议尽管植物系统基因组学中的分子进化率较低，但即使在较低的分类水平上，质体编码序列也应独立于完整质体基因组进行分析。

除了分子进化速度慢、辐射快、网状进化外[23，24，25，44]，本文所记录的高异质性是导致Arundinarieae系统发育分辨率低的另一个主要因素，这在以往的研究中被忽视了。尽管存在这些挑战，我们的系统基因组学研究，以其前所未有的全质体基因组的分类单元采样，没有缺失的数据，仍然恢复了一个很好的支持Arundinarieae的系统发育。总的来说，该部落主要世系之间的系统发育关系与早期的研究大致相符[25，30.，31]，但得到了更好的支持，并为Arundinarieae的进化提供了新的见解。谱系VII的系统发育新位置(在[30.])并不代表真正的冲突，很可能是由物种错误识别问题引起的(补充文件4)．其中一个重要的结果是完全解决了马达加斯加温带木本竹在Arundinarieae中的系统发育位置，作为姊妹Oldeania阿尔来自中非东部。这一结果并不意外，因为它们在地理上有密切的相似性，在形态上也有相似之处[45，46］．然而，这个单系群并不是姐妹Bergbambos这两种世系(I和II)分别有来自东亚的独立世系作为其近亲。此外，这些孤立的世系大多数具有较高的分子进化率。研究这些孤立世系的多样化和进化，以及“来自东亚”的假设，将是很有趣的。31]因为这些竹子的扩散能力普遍较低。

我们对整个质体基因组的分析进一步阐明了Arundinarieae主要谱系之间的系统发育关系[25，30.]，尤其是这些孤立的世系的位置。此外，我们的研究为Arundinarieae中替代率的极端异质性提供了强有力的证据，并评估了这些竹子的分子进化率与开花周期之间的相关性。据我们所知，这是检验这种相关性的第一个例子。开花周期较长的竹子往往进化较慢，我们假设世代时间效应可能是这种相关性的驱动因素。我们的研究结果对竹科的系统学研究具有重要意义，有助于我们对这些竹的进化有更全面的认识。

分类单元采样和数据收集

在这里采样的46个竹子中，31个竹子的完整质体基因组是之前测序并从GenBank数据库下载的，其余15个基因组是为本研究新测序的(附加文件)1)．我们使用叶片材料进行基因组测序，样本是在实地收集的，包括来自马达加斯加本土分布的5个样本。在马达加斯加采集的研究许可由马达加斯加国家公园和Générale des Forêts方向颁发，由密苏里植物园提供便利，并得到Tsimbazaza植物园和马达加斯加植物园保护中心的支持，其余样本不需要特定的采集许可。新定序竹子的凭证信息列在S1表中。我们通过查阅相关文献，收集了40个样本Arundinarieae种的开花周期信息。当一个物种有多个公开的来源时，所有的信息都被记录下来。不出所料，并不是每个样本物种都有开花周期的数据，最终只有14个物种的数据得到了一致的收集1)．开花周期的平均值是在给定物种有不同记录的情况下取的(2.5年Kuruna debilis)，所有14条记录都被映射到修剪后的ML树上(图。1)使用phytools包中的contMap()函数[47]以了解这种特征在Arundinarieae中的进化。

质体基因组测序、组装与注释

采用改良的CTAB方法从新鲜或二氧化硅干燥的叶片材料中提取总DNA [48］．在NanoDrop分光光度计(Thermo Scientific, Carlsbad, CA, USA)和凝胶电泳定量后，总dna被运往深圳华大基因进行文库制备和Illumina测序。从插入大小为500bp的库中生成成对的末端读(90,125或150bp)，每个样本过滤后，除去的干净数据总计为500mb至2gbo·阿尔．在另一个项目中，该物种的基因组调查测序产生了大约30 Gb的序列数据，我们仅提取了1.5 Gb的子集数据用于后续质体基因组组装。

结合使用从头和参考导向组装构建质体基因组，遵循[25］．简单地说，从头组装是在SOAPdenovo v1.05中构造的[49]，在不同样本的k-mer值为63 ~ 101的情况下。保留输出的大于1000bp的支架/contigs，并用BLAST将其定位到小鼠的质体基因组植被类型(基因库HQ337796)。然后，在参考基因组的指导下，绘制的支架/contigs之间的连接。如果装配中的间隙存在，则通过BLAST搜索所有装配的scaffold /contigs对应的参考序列或使用BWA v0.5.9 [50]和SAMtools v0.1.19 [51］．Arundinarieae的质体基因组在进化上是保守的(例如，基因含量和顺序)[25，30.，52]，促进了基因组组装，我们获得了所有完整的基因组。随后，使用DOGMA对组装好的基因组进行注释[53］．我们手动检查了外显子和内含子的边界，以及开始和停止密码子的位置，并在必要时进行了微小的调整。所有新测序的质体基因组均存入GenBank数据库，登录号为MF066243-MF066257(附加文件)1)．

序列比对和数据集构造

46个竹子的完整质体基因组序列在默认设置下与MAFFT v7.215进行比对[54］．然后在MEGA v6.0中手动检查对齐的序列[55]，去除了有限的模糊区域和识别的小反演。此外，我们还调整了编码框架内蛋白质编码序列的排列。为了评估分子进化速率异质性对系统发育估计的影响，我们还分析了来自整个比对的两个数据子集:组合编码(蛋白质编码基因、tRNAs和rrna)和非编码序列。假设编码序列在进化过程中更为保守，而非编码序列的进化速度更快。有6个蛋白质编码基因，由于某些物种的突变导致过早终止密码子，其排列最终不是严格的3倍，为了分析3个密码子划分的编码数据(见下文)，我们从这6个基因中删除了这些共计69 bp的排列序列。编码数据集和非编码数据集的最终对齐分别为62,831 bp和61,779 bp。

系统发育分析

我们使用ML和贝叶斯方法以未分区和分区的方式分析了上面构造的三个数据矩阵。PartitionFinder v1.1.1 [34]，利用“rcluster”算法和贝叶斯信息准则(BIC)为全对齐和非编码数据集寻找最优分区方案。对于整个比对，程序从262个预先定义的分区开始运行，对应于组合的tRNAs, rrna, 80个非编码区域(< 200 bp的与附近的区域组合)，60个蛋白质编码基因中的每个密码子位置(< 200 bp的分别与来自同一功能组的基因组合，视为一个基因)[25］．对于非编码数据集，使用上述80个非编码区域的先验定义分区。另一方面，我们将编码数据集划分为5个分区，对应于连接蛋白编码基因的组合tRNAs、rrna和3个密码子位置，而不是使用PartitionFinder。

使用RAxML v8.0.20实现ML推断[56]，参考软件手册中的GTR + Γ。使用10个重复ML搜索器对得分最高的ML树进行了分析，并使用标准自举选项估计了1000个自举重复。使用MrBayes v3.2.6进行贝叶斯推理[57]在jModelTest v 2.1.6选择的最佳序列演化模型下[58]用于未分区分析中的每个数据集(附加文件11)．在分区分析中，PartitionFinder为每个确定的最佳分区确定的模型用于整个质体基因组和非编码数据集，而对于编码数据集，模型也由jModelTest为上述定义的五个分区中的每一个选择(附加文件12)．两个独立的马尔科夫链蒙特卡洛(MCMC)链运行，每个链有三条加热链和一条冷链，从随机树开始。MCMC运行了2或4百万代(整个质体基因组的分区分析)，每100代对树和模型参数进行采样。在收敛检验后，丢弃前25%的树作为老化树，使用剩余的树构建50%多数规则共识树。

这两个人T．spathiflorus来自不同的研究[25，33]在我们的系统发育树中没有形成一个单系群t . spathiflorus_LC1319为姊妹Bergbambos(无花果。1)．这结果亦载于[30.]和可能的错误识别被提出作为一个潜在的原因。为了进一步澄清这一问题，所有Thamnocalamus和相关的Bergbambos以往研究的样本[23，24]，其中首次确定了Arundinarieae的主要谱系，并将其添加到我们的分类单元样本中进行系统发育分析。基于7个质体位点，采用RAxML进行ML推断(atpI-atpH，psaA-ORF170，rpl32-trnL，rps16-trnQ，trnC-rpoB，trnD-trnT,trnT-trnL)。

质体谱系特异性率异质性分析

为了明确评估Arundinarieae谱系中分子进化速率的变化，我们采用了一种模型比较方法，使用PAML v4.8包的基本程序[35］．我们首先研究了全球分子钟模型，假设所有的竹子都以相同的分子进化速率进化。随后，测试了不同的局部分子钟模型，允许与主要Arundinarieae谱系对应的系统发育树的预定义区域的速率变化。对于局部时钟模型，根据观察到的树中主要谱系分支长度的变化，选择了四种不同的制度(图2)。1)，以作比较。我们所有的分析都使用了GTR + Γ模型和在整个质体基因组的未分割分析中获得的固定拓扑(图2)。1)．每个分析都独立重复10次，以避免次优峰值，这里报告了运行的最高可能性。

为了进一步详细研究分子进化速率的变化，使用BEAST v1.8.0对我们的整个质体基因组数据集采用贝叶斯方法[37，38］．数据集分析使用了BEAST软件中实现的两个放松时钟模型，即RLC和LURC模型[59),分别。在这两种情况下，我们都使用了未分区的GTR + Γ + I模型和一个Yule树先验。根据以往的研究，四个分类单元集被强制采用单系[23，24，25]和系统发育结果分别为Arundinarieae的全部分类单元，以及IV、V和VI三个谱系的全部分类单元。先验值保持默认值。由于我们在这里对绝对散度时间估计不感兴趣，因此没有使用化石校准，平均时钟速率固定在1.0。在Tracer v.1.6中评估了收敛性，参数的有效样本量(ESS)大于200。对于LURC模型，分析进行了3次独立的2亿代，每2000代采样一次。这些测试收敛速度相对较快，其中只有一个参数的ESS值在200以下为196。对于RLC模型，运行7次，每2000代采样2亿代，但有3次单独运行未能收敛而被放弃。单独运行中的前4000万和8000万代分别被丢弃为LURC和RLC模型的老化代，剩余的树使用TreeAnnotator v1.8.0进行汇总。

分子进化速率与开花周期的相关性检验

为了检验分子进化速率与开花周期之间的关系，我们计算了14种有记录的开花周期的竹子的系统发育树的根到尖的分支长度。由于从它们共同的祖先分裂出来后，树上的每根竹子尖端都有相同的进化时间，因此从根到尖的树枝长度的任何差异都可以反映出分子进化速度的差异[13］．使用R包ape[中的drop.tip()函数对树进行修剪，只保留这14个提示。60]和父根到尖端的距离是使用R包adephylo[中的distRoot()函数计算的。61］．

我们首先使用R[中的lm()函数隐含了一个简单的线性回归方法。62基于整个质体基因组的未分割ML树计算的对数转换开花周期和父代距离。由于我们的数据集与我们正在分析的完整树相比只有有限的测量量和明显的离群值(点)g . megalothyrsa，详见结果)，我们还使用Siegel的重复中位数方法进行了线性回归[40]使用mblm R包中的mblm()函数[63］．这种更复杂的方法是Theil-Sen单中值估计器的变体[64，65]，它被证明在简单线性回归中估计真实斜率的鲁棒性和对异常值不敏感。最后，我们还使用了PIC分析[66]，在R包ape中实现[60来克服潜在的非独立性问题，因为密切相关的物种由于共同的进化史而趋于相似。

AICc:

赤池信息标准

ESS:

有效样本量

HPD:

最高后验密度

LBA:

朗布兰奇的吸引力

LURC:

对数正态不相关放松时钟

密度:

马尔科夫链蒙特卡洛

ML:

最大似然

图片:

系统发育独立的对比

RLC:

随机本地时钟

作者非常感谢张廷在马达加斯加野外工作中的帮助，以及密苏里植物园KMCC和斯图尔特·凯博组织这次野外工作。作者感谢付承新、张玉晓、张丽娜、周梦远和郭英在获取竹子样本方面的帮助;杨俊波，叶夏英，郭岑，中科院昆明植物研究所野生物种种质资源库分子生物学实验中心提供实验室支持。

资金

国家自然科学基金项目(No. 314300,011和31300,184)、国家基础研究计划项目(No. 2014CB954100)和中国科学院青年创新促进会(No. 2015321)资助。资助机构在研究的设计中没有任何作用;数据的收集、分析和解释;或者在写手稿的时候。

数据和材料的可用性

GenBank登录号列在附加文件中1．在本研究过程中产生或分析的所有数据都包含在本文及其补充信息文件中。

从属关系

1. 中国科学院昆明植物研究所野生物种种质资源库植物种质与基因组学中心，云南昆明650201

   马鹏飞，郭振华，李德柱

2. 比较植物和真菌生物学，皇家植物园，邱园，里士满，萨里，TW9 3AB，英国

   Maria S. Vorontsova

3. 马达加斯加基尤保护中心，马达加斯加塔那那利佛101伊凡德里安博迪沃安霍131B, IIJ地段

   Olinirina Prisca Nanjarisoa

4. Herbier, Département florore, Tsimbazaza植物园和动物学公园，BP 4096，塔那那利佛101，马达加斯加

   杰奎琳Razanatsoa

5. Institut de Systématique， Évolution, Biodiversité (ISYEB) UMR 7205国家科学研究中心- Muséum国家自然历史中心- École高级研究中心Études - Université皮埃尔和玛丽居里夫人，索邦大学Universités, CP39, 57 rue Cuvier, 75231, Paris Cedex 05, France

   托马斯Haevermans

贡献

PFM和DZL设计了研究。PFM、MSV、NOP、JR、TH、DZL进行现场采集。PFM和TH进行分析。PFM、MSV、ZHG、TH、DZL对数据进行了分析，并对结果进行了讨论。PFM撰写了论文，所有作者阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到托马斯Haevermans或De-Zhu李．

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。

开放获取本文根据创作共用属性4.0国际许可协议(http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)，允许在任何媒介上不受限制地使用、分发和复制，前提是您对原作者和来源给予适当的赞扬，提供到创作共用许可证的链接，并注明是否进行了更改。创作共用公共领域奉献弃权书(http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/)除另有说明外，适用于本条所提供的资料。

转载及权限