黄瓜多组织中替代剪接的比较

背景

替代剪接（AS）是重要的转录后过程。已经提出，大多数事件受组织特异性调节。然而，在不同组织中的全球动态探索不佳。

结果

为了分析多种组织中的全局变化，我们将作为事件的事件确定，并基于来自黄瓜的10个组织的基因组RNA-SEQ读数，在每个组织内构建了作为事件的综合目录。首先，我们发现58％的多外显子基因接受如此。与随机基因相比，我们进一步获得了565个基因，与事件相比明显多。在与肌动蛋白长度的调节有关的生物过程中发现这些基因显着富集。其次，发现了十种组织中的事件谱显着不同。具有相同发展起源的组织更可能与外形相对相似。此外，7370个基因显示出组织特异性作为事件，并且在与细胞组分组织的正调节有关的生物过程中高度富集。作为基因的根本特异性与对DNA损伤刺激的细胞反应有关。第三，十种组织中具有不同内含子保留（IR）模式的基因显示出保留内含子的GC百分比和主要成绩单的外显子数和FPKM的数量显着差异。

结论

我们的研究提供了在多种组织中的综合观点。我们透露了在多种组织中的模式和黄瓜中的组织特异性方面的新颖见解。

替代剪接（AS）是从单个基因产生多个转录物的重要转述过程。它在调制转录组和蛋白质组多样性时发挥着关键的调节作用[1那2那3.那4.］．此外，可以在发育，组织和物种特异性中提供其他调节功能[5.那6.那7.］．具体来说，植物总是暴露在环境胁迫下，并通过差异剪接受到许多植物过程的调控[8.］．随着测序技术的发展，植物中的AS技术正在走向成熟[9.］．

AS最早由Walter Gilbert在1978年提出[10.]在几个基因[已报告11.那12.］．如现在的真核生物高度普遍存在。由于事件分为四种基本类型，具体取决于受影响的区域：内含子保留（IR）事件，外显子跳过（ES）活动，替代捐助网站（AD）活动和替代受体网站（AA）事件[13.］．IR事件是内含子没有拼接出来的，而是与侧翼外显子组合以形成更长的外显子。ES事件指的是整个外显子与其侧翼内含子。广告和AA事件是使用替代3'或5'边界的事件。作为事件中，ES是美达人中最常见的类型[14.]，而IR是在植物中作为最常见的类型[15.］．

通常从基因组 - 范围内的转录组数据估计;因此，必须获得转录组数据以评估。在过去的几十年中，使用了三种主要的基于序列的技术来获得这些数据：表达标签（EST），微阵列和RNA测序（RNA-SEQ）。EST是200-800个核苷酸碱基。它们是随机选择的单通序列读取，因此它们受到采样偏差的影响[16.］．由于事件被确定为40％至60％[17.那18.人类基因和22%拟南芥基因[15.从ESTs推导出来的。微阵列是高通量的，但需要事先了解基因组序列。基于微阵列的AS数据库显示，至少74%的人类多外显子基因发生了AS [19.］．然而，RNA-SEQ已彻底改变了真核转录om的方式[20.获得了，其允许系统性，无偏见的转录组查询。最近，基于RNA-SEQ数据，95％的人类基因[21.61％的拟南芥基因[4.据报道，通过仿真生产多个成绩单。

自RNA-SEQ技术的出现以来，大大增加的估计值，表明其主要依赖于来自生物体的转录物的数量和覆盖[22.]研究人员试图增加成绩单的数量和覆盖，以更好地理解。在人的情况下报告了15种组织和细胞系转录om，发现同种型在组织中差异表达超过50％[23.］．这表明大多数受组织特异性调节的影响[24.］．在植物中，最近也报道了利用不同组织和发育阶段的RNA-seq reads对AS的转录组全范围分析。在大豆中，来自28个发育组织的RNA-seq reads显示，基因结构和基因组特征是影响AS频率的主要因素[25.］．在玉米中，两项研究如不同的组织和压力条件探索。获得来自两种不同基因型的RNA-SEQ读取的玉米两种不同基因型，这证明编码新的转录物的许多基因通常以组织特异性方式表达[26.］．RNA-SEQ在浇水和干旱条件下，玉米的耳朵，流苏和叶子读取，表明与组织类型强烈相关，发育阶段和应力条件27.］．对不同组织和胁迫条件下不同基因型的葡萄进行深度调查，表明与组织类型和基因型相关[28.］．RNA-SEQ从幼苗，番茄中的鲜花和早期生长果实读取，揭示了在早期生长果实中产生更多的接头变体[29.］．这些研究进一步透露，在植物中比以前观察到的更复杂[22.］．

黄瓜(Cucumis sativusvar。缎点)是最重要的经济栽培植物之一。黄瓜的基因组序列于2009年被报道[30.］．测序来自10种组织的RNA-SEQ读数以改善基因组注释[31.］．然而，在黄瓜中，AS的景观和多组织间AS的差异尚未被研究。因此，利用黄瓜10个组织的全基因组RNA-seq reads，我们对AS进行了概述，并在组织水平上分析了AS。我们发现58.17%的多外显子基因发生了AS。结果表明，AS事件在黄瓜的10个组织间存在显著差异。茎和叶组织的AS谱图相似。在10个组织中还发现了7370个组织特异性AS基因。这将为进一步研究AS在植物中的作用提供有价值的资源。

数据源

在这项研究中，我们主要使用三种类型的数据：基因组序列，基因组注释和RNA-SEQ读数。从以下网站下载黄瓜的基因组序列和基因组注释（版本2）：http://cmb.bnu.edu.cn/cucumis_sativus_v20/[30.］．所有这些数据都来自Cucumis sativusvar。缎点9930系。此外，从SRA数据库中收集了十种组织的RNA-SEQ读数（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/）（SRA：SRA046916）[31.］．这些组织包括子房、受精后(开花后7天)的膨大子房、未受精后(开花后7天)的膨大子房、根、茎、叶、雄花、雌花、卷须、卷须基部。这些序列是75 nt对端测序读取。

读取预处理

生的质量读数，使用FastQC（版本0.11.2）[评估32.］．然后，使用Trimmomatic（版本0.35）除去低质量的碱[33.]默认参数。在配对端格式两侧的长度等于或超过25bp的读数进行进一步分析。

使用基于参考基因组的读取映射转录组件

为了获得黄瓜转录物，我们将所有高质量读取所有高质量的读取到参考基因组（参数'-n5 -read-Gap-Length 3 -Read-Edit-Dist 5'）[29.那34.那35.]和袖扣（版本2.2.1）（参数-b -u -g）[36.那37.］．通过FPKM测量转录物的丰度（每百万碱基对测序的转录物序列每千碱基的预期片段数）。滤出具有低于0.1的FPKM的转录物[29.，连接位点由RSeQC (version 2.6.4)提取[38.］．

识别替代拼接事件

为了识别AS事件，使用Cuffcompare将组装好的转录本亚型映射到参考基因组结构注释中。然后，我们获得了一个非冗余的转录库[36.］．通过注释基因编码的同种型被提取并用于下一分析。Astalavista是一个可以尽可能多地提取事件的Web服务器，用于检测事件[39.］．进一步分析了四种基本类型的事件，包括IR，ES，AD和AA。

建造组织的事件概况

为了比较这10个组织的AS事件，我们首先构建了一个向量P = (N₁N₂N_3.N_4.）表示每个组织的事件配置文件，其中n_一世(我∈1，...，4）是第i级的AS在一种组织事件的数量。这四个类作为事件均IR，AA，AD和ES。

构建基因的IR模式

首先，提取10个组织中发生IR事件的所有基因。其次，我们构造了一个向量P_IR. = ({N_一世}），其中n_一世(我∈{1，..，10}）如果发生IR中的IR，则为1，如果没有发生IR，则表示为基因的IR模式。十个组织是卵巢，卵巢膨胀卵巢，卵巢膨胀卵巢不精化，根，茎，叶，雄花，雌花，卷须和卷须的基部。

层次聚类分析

为了将作为组织中的事件概况的相似性进行比较，基于使用分层聚类的距离来聚集十个组织的轮廓[40］．根据十种组织中这四种事件的这四种基本类型的数量，用完全的联系绘制了一种图。为了检测组织之间的相似性，使用相对距离。

既然IR是植物中常见的AS类型，那么与IR模式相似的基因可能具有哪些特征呢?为了回答这个问题，我们采用分层聚类的方法对基因的IR模式进行了聚类。度量距离的指标是一个二进制度量。

基因和基因本体学富集分析的功能诠释

为了注释参考基因，使用带有默认参数的Blast2GO，将注释基因的序列作为对Swiss-Prot数据库的BLASTX搜索的查询[41］．然后，将基因本体（GO）术语分配给注释基因。使用刀具Ontologizer与表达基因的背景进行的富集分析进行了[42］．本杰明尼 - Hochberg方法是对多测试校正进行的。为具有小于0.05的虚假发现速率（FDR）的人选择过于代表的功能GO术语。

随机化过程

为了用随机基因检测AS事件明显多于预期的基因，我们采用了随机方法。对于每个AS基因，我们得到AS事件的数量作为观测值。然后，我们随机从其他AS基因中提取一个基因。这个随机化过程重复了1000次。我们可以得到一个经验的p值每次作为基因。这p值被定义为这些数量的事件的数量大于观察到的值。如果是p值基因小于0.05，因此事件的发生比随机预期的发生更大。

鉴定出显示组织特异性的基因，如十个组织中

由于基因可以含有多个作为事件，其在十个组织中可能不会同时发生。此外，一些事件仅在个体组织中发现。如果基因在十个组织中仅含有一个组织中的作为事件，则它被定义为具有组织特异性的基因。

RT-PCR验证作为事件

Cucumis sativus var。缎点来自中国农业科学院（IVF-CAAS）的蔬菜和鲜花研究所的第9930号线在本实验中使用。该植物在长期的条件下生长（25°C / 15°C的16/8-HY / 15℃），当地政府的权限。在IVF-CAAS的制度外，从30天植物中收获顶部叶子和茎，然后在液氮中闪蒸。通过Trizol Reagent（中国天根）提取全RNA。RT-PCR用于通过快速Qualt RT试剂盒（天根）生产第一cDNA链。DNA被30个PCR循环再现，并通过Page Gel分析。

统计测试

Fisher的单尾试验用于分析富集。Chi-Square试验用于分析十个组织中作为事件谱的差异。Mann-Whitney U-Rest用于比较保留和非保留内含子之间的长度差异。Kruskal-Wallis等级和测试用于分析多个组之间的差异。使用R统计包进行所有统计测试。

转录组的概述

探索AS的事件，我们下载的75-nt的配对末端转录组测序从10组织，包括卵巢，下施肥扩大卵巢，扩大卵巢没有受精读取，根，茎，叶，雄花，雌花，卷须，和卷须的基部。我们应用Trimmomatic过滤出低质量读取[33.］．在读取的质量控制之后，仍然存在199,307,425份高质量读数，占据总读数的90.39％（表1)．

我们使用的程序TopHat2 [34.]将高质量读取到黄瓜基因组，其中92.94％的读数是唯一对齐的（表1)．此外，我们获得了36,910个完整的新型联结和40,884个部分新的联系（附加档案1：图S1A），可以帮助找到新的拼接事件。

通过Cufflinks将映射到基因组的RNA-seq reads组装成转录本[36.］．共有21,387个基因，对应于88.11％（21387/24274）的注释基因，产生了74,543转录物，并在10个组织中的至少一种中表达。这些转录物分布在十个组织中，范围为24,406（卷须的基部）至27,175（膨胀卵巢不受精）（表2)．10个组织中表达的基因数量从17,859(卷须)到18,572(根)不等(见表)2)．此外，检测到3344个新基因，其产生5173份转录物。

作为事件的全球视野

我们应用了astalavista的程序[39.]识别黄瓜中的事件。根据当前的注释，我们仅分析了由注释基因编码的转录物上发生的事件。鉴定了总共40,195例，分布在10,015个内含子基因中，其占10个组织中表达的多外显子基因的58.17％（10,015 / 17,216）。在确定事件中，IR的IR占总事件的37.55％，并且是最丰富的类型，其次是AA（17.83％），AD（9.02％）和ES（5.01％）（图。1)．结果与大豆中的观察结果一致[25.]和番茄[29.］．除了作为事件的四种基本类型之外，还有12,291种复杂的事件（30.58％），含有四种类型的四种事件中的一个以上，这进一步提出了在黄瓜中的复杂性（图。1)．在所有作为事件中，通过比较不同组织（组织事件中）的转录物来鉴定13,154，通过在各个组织（组织内事件内）内鉴定其他27,041。对于基本类型的类型，组织内事件和组织内事件之间的比率相似：IR是最常见的，而es是最低的（附加文件2:图S2)。

基因的功能注释

为了确定黄瓜中基因的功能，我们通过Blast2GO对所有基因进行了功能注释[41］．共有59％（14,390 / 24,274个）基因具有潜在的功能，涉及8660个术语，其分为5352个生物过程，2406个分子功能和902个细胞组分。

基因受到如此

在注释的基因中，10,015个基因包含一个或多个作为事件。为了评估作为基因的潜在功能相关性，我们检查了这些基因的功能关联。我们测试了基因中的富集。作为基因的生物过程主要富集细胞组分组织的调节，蛋白质修饰过程和对DNA损伤刺激的细胞反应。对于分子功能，这些基因主要富含N-乙酰转移酶活性，碘脱氧核酸酶活性，转录因子结合和蛋白质结合（附加文件3.:图S3)。这些结果表明AS基因在植物中的重要性[43］．

10,015作为基因，作为事件的数量广泛变化。将一些基因作为事件进行许多基因，而其他基因仅受到少数几个。为了进一步了解与随机基因相比明显多样化的基因的洞察，随机化方法用于提取这些基因。与随机基因相比，我们获得了565个基因，与事件相比明显多。我们发现这些基因显着富集在与调节肌动蛋白长度的调节相关的生物过程中，例如细胞组分组织的正调节，蛋白质复合组件的调节和生物粘附（图。2)．先前的研究报告称，细胞粘附分子的富浓度增加了昆虫或脊椎动物基因组中可用的细胞 - 细胞识别分子的数量[44］．这些结果表明，细胞粘附分子可能采用类似机制来增加黄瓜细胞 - 细胞识别分子的能力。

作为事件的四种基本类型

对于每种类型的事件，调节机制是不同的。因此，我们探讨了在不同基因中发生的不同类型的功能意义。如前所述，存在10,015个基因，其中IR，AA，AD和ES基因的数量分别为7241,458,2648和1504个。Go浓缩表明，随着基因类型的不同函数涉及不同的功能，几个重叠的术语（附加文件4.：图S4）。作为基因同时接受不同类型的事件。为了更好地理解作为类型的功能，我们只有一种类型的孤立的基因。我们提取了3262,1153,463和202个基因，其只有IR，AA，AD和ES，事件类型。在仅具有IR事件的基因中，显着的生物学过程与细胞壁宏指令代谢有关（图。3.)．在拟南芥中，IR类型的基因调节淀粉代谢作为[45］．这表明，参加由IR调节代谢的基因可能在植物中广泛存在。

十个组织中不同，因为事件概况

为了进一步研究AS事件在10个组织中的分布，我们使用组织内事件进行进一步分析。在这些AS事件中，IR是最丰富的类型(1912-3004)，其次是AA(966-1450)、复合事件(731-1157)、AD(510-695)和ES(323-401)(图3)。4.)．在研究的10个组织中，未受精卵膨大的卵巢AS事件最高，显著高于受精卵膨大的卵巢(Fisher 's one-tailed test，p值 = 1.53e-10). Conversely, the smallest number of AS events was detected in the base part of the tendril and was significantly lower than the tendril (Fisher’s one-tailed test,p值 = 2.48e-4) (Additional file1：图S1B）。这是符合我们的假设，即成绩单的数量越大，事件的数量越高;该结果已在人类中核实[46］．

为了将作为组织中的事件进行比较，每个组织由表示为事件配置文件的载体表示。我们在十种组织中发现了与事件概况有显着不同（Chi-Square测试，p值 ≤ 2.2e-16). To further detect the similarity in the AS event profiles among tissues, we used hierarchical clustering to analyse the relationship among the ten vectors. As Fig.5.表明，茎和叶的AS事件分布相似;受精后的子房、膨大子房和未受精的膨大子房的AS事件分布相似。

显示组织特异性的基因如十个组织中

许多事件以组织特异性方式调节;因此，我们想确定具有组织特异性的基因，如十个组织及其功能中。我们首先使用我们的Perl脚本孤立显示组织特异的基因。完全，我们观察了7,370个基因，显示组织特异的事件，分散在十个组织中。要了解这些基因的生物学意义，用Ontologizer施用富集富集[42］．在这10个组织中具有组织特异性AS事件的基因列表中，我们发现它们高度富集于与细胞成分组织的正调控相关的生物学过程和与结构特异性DNA结合相关的分子功能(Additional file)5.：图S5）。结果表明，这些基因可能参与组织特异性调节。

我们进一步调查了组织特异性事件的基因。在十个组织中，作为事件的组织特异性的基因数量为1067至1763.由于事件的组织特异性的最多基因在不受精体的扩张卵巢中，其次是根（1469），具有显着较少的组织基因-specific AS event than in the expanded ovary not fertilized (Fisher’s one-tailed test,p值= 1.523 e-06)。茎中具有组织特异性AS事件的基因最少，其次是卷须基部(1173)，其中具有组织特异性AS事件的基因显著多于茎(Fisher 's one-tailed test，P.-Value = 1.95E-02）（附加文件1：图S1C）。

这些基因在10个组织中对AS事件具有组织特异性，利用图中显示的氧化石墨烯富集结果研究了它们的功能。6.．例如，在根中，细胞对DNA损伤刺激的反应显著增强。之前的一项研究在拟南芥的根中发现了一个干细胞龛[47］．这些干细胞必须具有有效的DNA损伤反应，以防止突变传播到植物的其他部位[48］．此外，RNA剪接是DNA损伤反应中的新手[49］．基于这些研究，我们推测，在黄瓜根部有一个干细胞小生境和根特异性AS在DNA损伤反应中观察到的事件。

十个组织中具有类似IR模式的基因

IR是植物中占主导地位的AS，短内含子比长内含子更容易被保留[25.］．因此，我们研究了保留内含子的长度与其他内含子相比，发现保留内含子的长度明显短于其他内含子（Mann-Whitney U测试，p值 ≤ 2.2e-16) (Additional file6.：图S6）。这表明黄瓜中短保留内含子的趋势。

对于每个基因进行IR，我们得到的10的组织（参见材料和方法）中的IR模式。根据他们的IR图案，所述基因被聚成12类（图7A)，同一簇基因具有相似的IR模式。在此基础上，我们探索了这12组基因的4个特征:保留内含子长度、保留内含子GC百分比、外显子数量和主要转录本(同一基因在所有组织中FPKM最高的转录本)的表达值。有趣的是，这些组保留的内含子长度相似(Kruskal-Wallis秩和检验，p值 = 0.1765); GC percentages of the retained introns, number of exons and FPKM of major transcripts are significantly different among the groups (Kruskal–Wallis rank sum test,p值 = 0.04874,p值 = 7.318e-05,p值 = 0.03796, respectively) (Fig.7.)．这些结果表明基因的特征可能会影响10种组织中基因的IR模式。

RT-PCR验证AS事件

为了验证RNA-seq预测的AS事件，我们利用新提取的RNA对两个组织(叶和茎)的41个AS事件进行了逆转录- pcr (RT-PCR)实验。首先，我们验证了这些事件在叶片中的准确性，并验证了31个AS事件(76%)7.：图S7）。然后，我们选择了18个以上的事件，如叶子和茎之间的事件不同。在这18个事件中，验证了10（56％）（56％）（附加档案8.：图S8）。由于RT-PCR的敏感性，可以获得更多的事件。鉴于实验的RNA不相同，因为产生分析的RNA-SEQ，一些作为未经验证的事件可能是由于空间和时间基因表达的变化。此外，根据凝胶检测到的结果，我们可以看到主要和替代转录物之间的表达水平的差异，例如CSA5G621964和CSA6G01160（附加文件8.：图S8）。

在本研究中，我们利用RNA-seq数据对黄瓜的转录组进行了系统分析。我们的结果显著增加了转录本的复杂性;在黄瓜V2中未检测到亚型。

AS在植物发育和逆境适应中起关键作用[26.］．以前的研究试图探讨和发展之间的关系以及作为和压力条件之间的关系。在大豆和番茄中，由于不同发展阶段的事件具有不同的分布，并且较年轻的发育阶段具有更高的基因频率[25.那29.］．在Zea Mays.，验证了在不同组织中表达的不同同种型可能会增加或失去功能域，而递力作用因子的不同表达更可能引起组织特异性事件[27.］．在葡萄中，研究了组织、胁迫和基因型与AS的关系，结果表明组织是影响AS的重要因素[28.］．在我们的研究中，我们专注于10个组织中的事件的概况，并与随机基因相比，与事件更多的基因获得了基因。此外，我们基于依据基因的IR模式和基因的IR模式和基因特征的关系确定了组织特异性。

我们的分析是基于RNA-seq数据;因此，转录组数据的数量和多样性将影响我们对AS事件的识别。为了确保每个组织的测序深度足以执行替代剪接分析，我们通过RSeQC提取了一个重新取样的reads子集[38.]，发现随着重样百分比的增加，检测到的剪接节点数量接近于固定值(附加文件9.:图S9)。这表明每个组织的读取深度足以进行AS分析。

根据10个组织的RNA-seq数据，共提取了40195个AS事件，涉及近60%的多外显子基因。通过对4种基本AS事件类型的比较，我们发现IR是AS事件的主要类型，ES仅占一小部分。这一结果与其他植物相似[50］．此外，该基因显示出更多的事件似乎与肌动蛋白丝有关。以前的研究表明，肌动蛋白长丝是偏振植物细胞生长的主要因素[51建议植物生长需要更多的拼接变异。

在我们的研究中，作为事件曲线是十个组织中显著不同。我们进一步分析二花，三个卵巢，茎和叶是表现出对AS事件比较相似的外形。从相同的生殖细胞的茎和叶的起源也许可以解释的相似性。单独的卷须也意味着AS的组织中的复杂性。此外，由于IR是植物的主要类型，我们认为，基因的功能可能会影响组织中的IR模式。

RNA-SEQ技术的进步为学习提供了很大的学习机会。例如，拟南芥基因的百分比从1.2％增加到61％4.那52］．在黄瓜中，AS事件是通过在基因组 - 范围内的EST数据进行研究的，并确定了430个事件[53］．在这项研究中，我们观察到40,195，因为事件比以前高100倍。测序技术提供更多数据和更长的成绩单，这提供了更好的学习机会[29.］．

总之，利用RNA-seq reads，我们从黄瓜的10个组织中鉴定了许多AS事件。这将是进一步研究AS的宝贵资源。此外，我们发现10个组织表现出显著不同的AS事件和组织特异性事件。这些结果将促进我们对不同组织中AS的认识，阐明AS事件在不同组织中的发生模式。本研究结果为进一步研究黄瓜转录本的功能奠定了基础。

AA：

替代受体位点

广告：

替代捐助部位

作为：

替代拼接

ES:

外显子跳跃

ests：

表达了标签

FPKM：

每百万碱基对测序每百万碱基对每千碱基的预期片段数

红外：

内含子保留

RNA-seq:

RNA测序

RT-PCR：

逆转录PCR

我们感谢编辑和两个匿名审查员进行稿件的洞察力反馈。

资金

国家自然科学基金资助项目(no . 31571361, no . 31421063)。这些资助机构在本研究的设计、收集、分析、数据解释或手稿写作中没有发挥作用。

可用性数据和材料

所有支持数据被包括在另外的文件的形式的附加文件1那2那3.那4.那5.那6.那7.那8.和9.．

隶属关系

1. 教育部重点实验室北京师范大学生物多样性与生态工程学院，生命科学学院，19号新街口大街，北京，100875，中国

   孙颖，宋洪涛，林奎，庞二力

2. 北京师范大学生命科学学院，北京市基因资源与分子开发重点实验室，北京市新街口外大街19号，100875

   孙颖，宋洪涛，林奎，庞二力

3. 中国农业科学院蔬菜和鲜花部园艺作物生物学和遗传改善重点实验室，北京100081

   侯涵，张中华

4. 中国农业科学院烟草研究所（CAAS），青岛，266101

   韩侯

5. 信息生产系统，早稻田大学，北九州市，808-0135，日本的研究生院

   景禄胡

贡献

ELP和Ys构思和设计了分析。ys进行了分析。HTS有助于数据阐述。ELP，YS和KL写了稿件。HH和Zhz对事件进行了验证。JLH为这项工作提供了基本建议。所有作者均阅读并批准最终手稿。

相应的作者

对应于erli pang．

伦理批准和同意参与

不适用

同意出版物

不适用

利益争夺

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

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