化学杂交剂SQ-1诱导水稻雄性不育gydF4y2Ba普通小麦gydF4y2Ba花药蛋白质组的比较分析gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

杂种优势被广泛用于提高许多作物的产量。然而，由于小麦是一种自花授粉的作物，杂交育种在这种生物中并不那么成功。尽管化学杂交剂诱导小麦雄性不育是杂交育种的一个重要方面，但化学杂交剂诱导小麦雄性不育的机制尚不清楚。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

我们利用小麦进行了蛋白质组学分析gydF4y2Ba普通小麦gydF4y2Ba鉴定与化学杂交剂CHA SQ-1诱导的生理雄性不育（PHYMS）相关的蛋白质。2D-PAGE共发现103种差异表达蛋白质，随后通过MALDI-TOF/TOF MS/MS鉴定。总体而言，这些蛋白质具有明显的功能倾向，涉及碳水化合物代谢、氧化应激和抗性、蛋白质代谢、光合作用以及细胞骨架和细胞结构。结合表型、组织切片和生物信息学分析，鉴定出的差异表达蛋白质揭示了一个复杂的网络，在PHYMS和花粉发育的调控背后。因此，我们构建了小麦雄性不育的蛋白质网络，绘制了103个差异表达蛋白质与其注释的生物途径之间的关系。为了进一步验证我们提出的蛋白质网络，我们确定了相关的生理值并进行了实时PCR检测。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

基于蛋白质组学的方法使我们能够识别PHYMS花药的某些倾向。碳水化合物代谢异常和氧化应激，以及绒毡层的过早降解可能是CHA SQ-1处理植物碳水化合物饥饿和雄性不育的原因。在这里，我们为CHA sq -1诱导男性不育的机制提供了重要的见解。我们的研究结果对小麦杂交育种的应用具有实际意义。gydF4y2Ba

在杂交作物育种中，杂交不同的自交系通常会产生比各自亲本产量更高的F1杂种。这种杂种优于亲本的现象被称为杂种优势[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．由于细胞质雄性不育(CMS)和三系杂交系统，玉米、水稻、高粱和其他物种的杂交作物育种取得了巨大成功[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．然而，在小麦等自花传粉作物中生产足够数量的杂交种子更具挑战性。虽然已经在小麦中培育出了几种类型的CMS系(如t型、k型和v型)，但三系体系有其自身的局限性。例如，由于缺乏生育力恢复来源和生育力恢复因素的复杂性，这些品系更难使用[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．为了解决这一问题，化学杂交剂(CHA)已被应用于小麦雄性不育的诱导。这种方法不仅可以生产任何亲本组合的杂交种，而且不需要保持系或预育种，更便于促进杂种优势[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]然而，关于CHA诱导不育背后的蛋白质和分子机制的信息非常有限。gydF4y2Ba

在小麦中，雄性生殖过程发生在花药内。这里，二倍体产孢细胞经过减数分裂形成单倍体小孢子，最终发育成花粉粒[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．在雄性不育的情况下，如果这个复杂的、按时间顺序排列的过程被打乱，花粉的产生就会流产[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]以前对小麦雄性不育的研究主要集中在基因表达、酶活性和激素代谢的变化上[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

近年来，蛋白质组学方法在花药发育和花粉生产研究中得到了越来越广泛的应用。例如，在水稻、拟南芥、玉米、枸杞、番茄和胡椒中检测到许多在花药中特异表达的蛋白质[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．此外，在被子植物花粉中已鉴定出大量参与能量转换、信号转导、耐受性、细胞骨架、转录和蛋白质代谢的蛋白质[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．此外，已经发现热休克蛋白和β-膨胀与低温胁迫诱导的水稻雄性不育有关[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．对雄性不育番茄7B-1突变体花药的蛋白质组学分析表明，蛋白酶体和5B蛋白在绒毡层退化过程中发挥作用，但在花粉发育的四分体阶段下调[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．此外，还发现了一种新的雄性不育突变体gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba与FLP1有关，FLP1是一种可能在孢粉素、蜡和三乙醇胺成分的合成中发挥作用的蛋白质[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．同样，在枸杞中，许多蛋白质的差异表达，包括ATP合酶亚基(能量转换)，假定的胼胝质合酶催化亚基(花药发育)，以及各种蛋白酶和蛋白酶抑制剂，试图解释YX-1雄性不育突变体的发生[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。在一项关于cybrid pummelo的研究中，基于iTRAQ的定量蛋白质组学方法表明，发现与雄性不育相关的差异表达蛋白（DEPs）主要参与碳水化合物和能量代谢，以及通过泛素-蛋白酶体途径降解蛋白质[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．在油菜中，对cha诱导的雄性不育进行2-DE分析，发现部分dep与绒毡层发育有关。这些蛋白被发现下调，可能破坏绒毡层和小孢子的正常发育。这样，这些结构就无法存活，最终花粉败育导致雄性不育[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．此外，在前人对sq -1诱导的雄性不育小麦多泛素化蛋白的研究中，我们发现雄性不育与不育植株的多泛素化降解密切相关[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

小麦是一种重要的谷物作物，在全球范围内种植，以重要的主要谷物的形式提供了近20%的世界日常粮食[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]…因此，有必要了解这种生物的雄性不育性，以提高杂交种子的产量，从而提高总产量。作物的杂交种子生产有三个基本系统：细胞质雄性不育（CMS）、核雄性不育（GMS）和CHAs[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．由于CHAs不需要恢复育性，因此是诱导小麦雄性不育的有利系统。然而，小麦基因组的大尺寸和多倍体复杂性是基因组分析的相当大的障碍。因此，对CHA sq -1诱导的小麦雄性不育进行蛋白质组学分析是比较合适的方法。gydF4y2Ba

杂交小麦被认为是近期增产小麦的首选品种。它也是农业高科技和现代种子产业的国际竞争的主要焦点[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．本研究采用蛋白质组学方法，对不同发育阶段的可育和cha诱导的雄性不育花药中的DEPs进行了比较分析。随后，我们研究了这些DEPs可能的生物学功能，并讨论了它们对花药发育和雄性不育的潜在影响。gydF4y2Ba

植物材料和花药收集gydF4y2Ba

在本研究中，小麦品种(cv。西农1376)在西北农林科技大学杨凌试验田(34°16′N, 108°4′E)种植，次年4月，小麦达到fekes尺度8.5生育阶段(见[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba])，将小麦植株分为两组，每组50行，其中一组植株用CHA SQ-1（5 kg ha）处理gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})，命名为PHYMS-1376，其他水喷对照命名为MF-1376。10 d后，利用光镜观察小麦花药的形态和细胞结构，确定花药的发育阶段。收集MF-1376花药和PHYMS花药，液氮冷冻，−80℃保存，待进一步分析。gydF4y2Ba

组织学分析和表型特征gydF4y2Ba

单个小穗、花和花药的亮场照片的细节已在前面描述[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．利用碳品红对不同发育阶段的小麦花药核进行了染色，并用尼康ECLIPSE E600光学显微镜对核进行了观察和拍照。对新鲜花粉粒和冻干花药进行扫描电子显微镜(SEM)观察。gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．MF-1376和PHYMS植株三核期的花药均采自开花前的小穗。用1%碘化钾溶液(1% KI-I)对花粉进行染色gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

石蜡切片的制备gydF4y2Ba

在发育的不同阶段收集花药，固定在FAA（50%乙醇、10%福尔马林和5%乙酸）中，并使用分级乙醇系列脱水[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]进行组织学分析，然后用二甲苯渗透组织并将其嵌入Paraplast Plus中。最后，将材料切割成12μm厚的切片，用0.5%甲苯胺蓝（Sigma）染色，并使用尼康ECLIPSE E600显微镜拍照。gydF4y2Ba

蛋白质样品制备及定量gydF4y2Ba

花药蛋白提取方法为三氯乙酸(TCA)-丙酮法，采用Sheoran和Sawhney所述方法，稍作修饰[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]。操作步骤的详细信息已在前面描述[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]使用Bio-Rad蛋白质分析试剂（Bio-Rad，美国）对最终提取物的蛋白质浓度进行定量，并最终储存在−对于2-DE，温度为80℃。gydF4y2Ba

凝胶电泳与数据分析gydF4y2Ba

我们根据建立的程序执行2-DE。我们将每种蛋白样品装入4-7个非线性pH梯度的17 cm固定化干条(Bio-Rad, CA, USA)中200 μg，用350 μL蛋白溶液在20℃下被动复水14 h。在Protean IEF细胞(Bio-Rad, CA, USA)上进行第一维凝胶电泳，温度为20℃，每条极限电流为50毫安。我们采用以下电压梯度:250 V 1 h, 500 V 1 h, 1000 V 1 h, 4000 V 1 h, 8000 V，直到达到80000 VH。最后，在最后12小时内施加恒压(500 V)。然后在含有0.375 M Tris-HCl (pH 8.8)、6 M尿素、20% (pH 8.8)的溶液中轻轻摇动，使聚焦条带平衡两次(每个15分钟)。gydF4y2BavgydF4y2Ba/v)甘油，2% (gydF4y2BawgydF4y2Ba/gydF4y2BavgydF4y2Ba)SDS。除此之外，在第一次平衡中添加2%的DTT，在第二次平衡中添加2.5%的碘乙酰胺。对于第二维度，使用PROTEAN II多细胞（美国加利福尼亚州Bio-Rad）在12%SDS-PAGE凝胶上分离蛋白质。SDS-PAGE以10mA/凝胶运行1h，然后以20mA/凝胶运行，直到溴酚蓝染料达到碱。gydF4y2Ba

通过银染色观察蛋白质斑点，并使用Powerlook 2100XL成像密度计（美国德克萨斯州达拉斯UMAX技术公司）以300 dpi扫描。使用软件PDQuest 7.4（美国加利福尼亚州Bio-Rad）进行图像分析根据制造商的说明。进行定量图像分析，以确定那些在丰度（体积百分比）上具有可重复性和显著差异的蛋白质斑点 > 1.5倍；gydF4y2BapgydF4y2Ba-值<0.05）。gydF4y2Ba

凝胶消解和MALDI-TOF/TOF质谱分析gydF4y2Ba

从凝胶中手动切割选定的蛋白质点，并使用测序级胰蛋白酶进行消化。凝胶斑点依次被去除并用30mM K脱水gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba铁(CN)gydF4y2Ba_6gydF4y2Ba100毫米NagydF4y2Ba_2gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba．然后用10mm DTT在25mm NH中还原蛋白gydF4y2Ba_4gydF4y2BaHCOgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba在56°C下持续1小时，并在室温下在黑暗中使用55 mM碘乙酰胺在25 mM NH中烷基化45 mingydF4y2Ba_4gydF4y2BaHCOgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba.最后，用25 mM NH彻底清洗凝胶片gydF4y2Ba_4gydF4y2BaHCOgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba在50%乙腈中，用100%乙腈脱水，并在SpeedVac (Savant，英国)浓缩器中完全干燥。蛋白在5 μL 2.5-10 ng/μL测序级胰蛋白酶溶液(Promega)中37℃下消化过夜。所得胰蛋白酶消化液经CgydF4y2Ba_18gydF4y2BaZipTips (Millipore Corporation, Bedford MA)根据制造商的说明。胰蛋白酶肽被溶解并分析，如[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

生物信息学分析gydF4y2Ba

使用对数转换数据和Multiple Experiment Viewer 4.9软件对DEP点进行聚类分析。所有鉴定的蛋白均通过拟南芥信息资源(TAIR)进行blast处理gydF4y2Ba双足短足gydF4y2Ba(一种新的禾本科模式植物)蛋白质数据库，并用于构建蛋白质相互作用(PPI)网络。生物通路网络由Cytoscape插件BiNGO和CLUEGO生成。gydF4y2Ba

酶活性测定gydF4y2Ba

我们测量了Torres等人所描述的β- 1,3 -葡聚糖酶活性[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba，液泡转化酶活性如Tomlinson等所描述[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．根据Cheng等人的方法[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]，通过测定OgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba^−gydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba通过测定超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)的活性，测定抗氧化酶活性。gydF4y2Ba

实时荧光定量PCR分析gydF4y2Ba

从不同发育阶段的PHYMS和MF-1376花药中提取总RNA。利用primer premier 5.0软件设计实时荧光定量PCR (qRT-PCR)分析引物。特定的引物gydF4y2BaIvr5gydF4y2Ba（登录号AF069309）分别为：5'-TTCACTGTGCTCCG-3'和5'-TCCGCGGATACACCCTC-3'.18S（登录号AY049040）用于RNA标准化。qRT PCR在BIORAD CFX96实时系统上进行。25µL反应和循环参数如前所述[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．在最后一轮扩增中，通过熔化曲线分析(60 ~ 95°C，每5 s增加0.5°C)检测PCR反应特异性。上述各实验独立重复三次。数据采用2gydF4y2Ba^{——∆∆CtgydF4y2Ba}方法，由Livak和Schmittgen [gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

MF-1376与PHYMS小麦的表型差异gydF4y2Ba

我们比较了MF-1376和PHYMS花药在所有三个发育阶段的表型(图。gydF4y2Ba1得了gydF4y2Ba)虽然我们发现MF-1376和PHYMS花药在四分体和单核阶段没有显著差异，但MF-1376花药，而不是PHYMS花药在三核阶段出现花药开裂（图。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)通常，用carbol-fuchsin苯胺蓝染色花药是观察四分体阶段胼胝质壁行为的一种方便方法。这种荧光方法产生生动多彩的照片，细胞质呈红色，染色体呈胭脂红，胼胝质呈深绿色。我们发现，MF-1376花药在e四分体期染色颜色鲜艳，显示出较厚的沉积，PHYMS花药的胼胝质颜色暗淡，显示出异常沉积（图。gydF4y2Ba1 d和egydF4y2Ba)．在单核期，我们没有发现MF-1376和PHYMS花药的小孢子有任何明显的差异。gydF4y2Ba1f和ggydF4y2Ba)．花粉粒用KI-I染色gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba表明MF-1376的花粉粒具有明显的淀粉积累(图。gydF4y2Ba1 hgydF4y2Ba)，而PHYMS几乎完全没有淀粉(图。gydF4y2Ba1我gydF4y2Ba)．利用扫描电镜进一步分析了三核期花药的超微结构特征。我们发现MF-1376的花药外部有一个完整的角质层(图。gydF4y2Ba1 j和lgydF4y2Ba)相反，PHYMS花药的外表面相当杂乱无章（图。gydF4y2Ba1 k和mgydF4y2Ba)．此外，MF-1376花粉的外壁形态光滑，呈颗粒状，呈近圆形。gydF4y2Ba1 ngydF4y2Ba)而PHYMS花粉粒则严重畸形（图。gydF4y2Ba1阿gydF4y2Ba).这些观察结果与KI-I一致gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba染色，表明PHYMS植物的花药壁和花粉粒都有发育缺陷。PHYMS小麦的相对雄性不育率高达99.68%，人工授粉结实率为96.35%，无雌蕊损伤。gydF4y2Ba

花药发育的显微特征gydF4y2Ba

为了更准确地确定PHYMS花药发育缺陷的时间，我们在显微镜水平上检查了花药。MF-1376和PHYMS植物的花药壁由四层组成，分别从表面到内部、表皮、药室内壁、中间层和绒毡层（图。gydF4y2Ba2 a和dgydF4y2Ba)．这四个体细胞层围绕着小腔体，这些腔体的中心是植物的小孢子。在四分体阶段，我们发现MF-1376和PHYMS的花药在四个体细胞层上没有显著差异。然而，在这个阶段可以看到小孢子的显著差异，MF-1376小孢子的外围有一层额外的层，这是在PHYMS小孢子周围所没有的。单核期，MF-1376植株的花药壁(包括绒毡层和中间层)呈现正常退化(图2)。gydF4y2Ba2bgydF4y2Ba)，而PHYMS花药的绒毡层几乎完全降解(图。gydF4y2Ba2egydF4y2Ba)．在单核期，MF-1376小孢子的淀粉积累量比PHYMS小孢子多(图2)。gydF4y2Ba2b和egydF4y2Ba)此外，与MF-1376三核期花药中发现的成熟花粉粒不同（图。gydF4y2Ba2cgydF4y2Ba)，PHYMS花药室中的花粉几乎塌陷，几乎没有淀粉积累（图。gydF4y2Ba2fgydF4y2Ba)在三核期，MF-1376植物的花药壁层进一步退化，事实上，只有表皮层保持完整（图。gydF4y2Ba2cgydF4y2Ba)这表明在这一阶段，亲脂性物质（角质和蜡）扩散到花药细胞壁的表面。相比之下，PHYMS花药壁的各层似乎降解较少。例如，我们观察到清晰的药室内壁，厚的表皮和明确的细胞结构（图。gydF4y2Ba2fgydF4y2Ba)．这说明在这一阶段，内膜和外表皮细胞壁的亲脂性物质沉积或转移量减少。gydF4y2Ba

花药蛋白质组的2D-PAGE分析gydF4y2Ba

分别从MF-1376和PHYMS小麦品种中提取花药蛋白(3个生物重复)，并通过2d PAGE独立分离。在MF-1376和PHYMS组中，我们在银染凝胶上重复检测了800多个蛋白点。其中，在所有凝胶上发现了466个。通过筛选>表达增加或减少1.5倍的蛋白，我们共鉴定出191个差异点(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05;单向方差分析)。gydF4y2Ba

由于2-DE技术的敏感性和重现性，以1.5倍的表达差异为阈值，并进行3个重复，以减少潜在的假阳性数量。附加文件中显示了6张用IPG 4-7条分离的代表性2D凝胶图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba：图S1，用于质谱分析的斑点已标明并编号。我们使用布尔分析和维恩图来说明DEP的数量及其在花药发育的不同阶段之间的重叠（图。gydF4y2Ba3 a和bgydF4y2Ba)共有96种不同的蛋白质显示出至少1.5倍的(gydF4y2BapgydF4y2Ba < 与MF-1376花药相比，PHYMS花药的丰度增加了0.05）。这包括分别在四分体、单核和三核阶段的19个、21个和69个蛋白质，其中2个（点1和点9）在所有三个阶段都更丰富，其中9个在三个阶段中的两个阶段（四核期和单核期的点2和点3；四核期和三核期的点4、5和10；单核期和三核期的点6、7、8和11）。剩下的85种蛋白质仅在一个阶段上调：四核期12种蛋白质，单核期13种蛋白质，三核期60种蛋白质（图。gydF4y2Ba3agydF4y2Ba)．在95个下调蛋白中，只有1个蛋白(spot 13)在所有三个阶段下调，4个蛋白在任意两个阶段下调(spot 12在四分体和单核阶段;无四分体和三核阶段常见的蛋白质;第14、15和16点在单核和三核阶段)。其余90个蛋白仅在一个阶段下调:12个蛋白在四分体阶段下调，21个蛋白在单核阶段下调，57个蛋白在三核阶段下调。gydF4y2Ba3bgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

蛋白质识别gydF4y2Ba

为了鉴定上调和下调的蛋白质，我们对切除的斑点进行了MALDI-TOF/TOF MS和MALDI-TOF/TOF MS/MS分析。从中，我们通过搜索NCBInr和UniProt数据库成功鉴定了103个蛋白质斑点（附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:表S1)。一些切除点的2D-PAGE凝胶放大区域显示相应的3D视图(附加文件)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba:图S2)。根据其假定的生理功能，将鉴定的蛋白质分为13大类:碳代谢(17%)、线粒体电子转运/ATP合成(5%)、其他次级代谢产物代谢(5%)、细胞骨架和细胞结构(11%)、氧化应激/抗性(17%)、光合作用(7%)、蛋白质代谢(12%)、脂质代谢(2%)、细胞信号传导(6%)、转录(4%)、氨基酸代谢(2%)、其他功能(4%)和未知蛋白(8%)(图。gydF4y2Ba3cgydF4y2Ba)．为了进一步可视化蛋白质表达模式，我们根据dep的百分比(%)体积值构建了分层聚类的热图。通过K-means聚类，我们使用来自每个花药阶段的MF-1376蛋白值作为基准值，创建了三个阶段每个dep的动态表达谱。当比较MF-1376的四分体、单核和三核阶段(基准值)时，我们发现了10种不同的dep表达模式。这些模式分别包含10 DEPs、27 DEPs、4 DEPs、18 DEPs、15 DEPs、4 DEPs、13 DEPs、3 DEPs、5 DEPs和4 DEPs(附加文件)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba:图S3)。gydF4y2Ba

小麦雄性不育关键DEPs的生物信息学PPI网络分析gydF4y2Ba

为了探索所有确定的DEP之间的关系，我们创建了一个PPI网络，将103个DEP与TAIR和gydF4y2Ba双足短足gydF4y2Ba蛋白质数据库(附加文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba：表S2a和表S2B）。基于gydF4y2Ba双足短足gydF4y2Ba同源物揭示了四个重要的功能类别，主要涉及糖代谢、应激反应、光合作用和泛素-蛋白酶体途径（图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．这四个功能类别并没有完全分离，而是形成了一个相互联系的网络，调节花药不育。糖代谢和应激反应(防御/解毒)组成员较多，相互作用集中在葡萄糖-6-磷酸异构酶样(BRADI4G32530.1)/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(BRADI3G14040.1)和热休克蛋白(BRADI3G39630.1;分别BRADI4G04220.1)。在光合作用和泛素蛋白酶体途径基团中，RuBisCO大亚基结合蛋白亚基α (BRADI5G02890.1)和26S蛋白酶调节亚基8同源物A-like (BRADI1G36830.1)/ 26S蛋白酶调节亚基6B同源物(BRADI3G10720.1)分别是最重要的节点。除了上述功能类别，我们还从基于tair的PPI网络中识别出另外两个功能类别:与细胞骨架相关的和与雄性不育/花药壁相关的(附加文件)gydF4y2Ba6gydF4y2Ba：图S4）。两个PPI网络中的特定蛋白质名称显示在附加文件中gydF4y2Ba5gydF4y2Ba:表S2a和b。gydF4y2Ba

为了进一步识别与CHA SQ-1诱导的男性不育相关的细胞成分、分子功能和生物学途径的统计上超标或不足的类别，我们将生物网络基因本体工具(BiNGO)应用到DEPs(附加文件)中gydF4y2Ba7gydF4y2Ba:图S5及附加文件gydF4y2Ba8gydF4y2Ba:表S3)。结果显示，最富集的细胞成分是质膜(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 1.17E-4)，细胞质(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 3.12E-12)，细胞壁(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 3.56平台以及)。在这里，细胞质一词包括质体(gydF4y2BaPgydF4y2Ba = 5.07E–7），胞浆(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 1.3E-15)和液泡(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 2.41 e-5)。同时，DEPs中富集的GO“分子功能”项包括催化活性(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 6.71E-12)和绑定(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 1.07 e-6)。BiNGO的生物过程分析表明DEPs在代谢过程中更加富集(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 1.28E-9)、细胞过程(P = 6.71E-12)、对非生物过程(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 5.44E-7)，以及对压力的响应(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 3.14 e-6)。更具体地说，在代谢过程范畴内，前体代谢物和能量的产生(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 3.47E-10)、碳水化合物代谢(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 5.98E-9)和分解代谢过程(gydF4y2BaPgydF4y2Ba = 1.11E–5）的比例明显过高。gydF4y2Ba

为了创建和可视化基于分子功能、生物过程、细胞成分、植物结构和KEGG通路的术语/通路功能分组网络，我们使用Cytoscape插件ClueGO生成了一个KEGG- go地图[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba］．合成网络有87项连接到466年边缘kappa评分,并证实,大多数表达下调DEPs参与糖代谢,氧化还原反应,响应无机物质(金属离子和镉离子),组织叶绿体、液泡,细胞壁,蛋白酶体,对脱落酸(ABA)、脂质和酒精代谢的响应(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba和额外的文件gydF4y2Ba9gydF4y2Ba：数据集S1）这些结果表明，雄性不育植物不仅遭受ROS胁迫和发育胁迫，而且其能量供应途径也存在重大问题。有趣的是，这些网络簇可以揭示DEP的不同作用。无论是直接还是间接，这些DEP都参与了广泛的生物学过程在小麦雄性不育过程中起作用的l途径。gydF4y2Ba

酶活性和所选蛋白的基因表达gydF4y2Ba

我们鉴定了推测的谷胱甘肽s -转移酶GSTF1、SOD和推测的In2.1蛋白为参与氧化-氧化还原应激的DEPs。这三种蛋白质在抗氧化环境下被激活，以清除ROS。为了证实这些蛋白表达的变化，并将这种变化与酶活性联系起来，我们测定了ROS水平和抗氧化活性。我们发现OgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba在四核期、单核期和三核期，PHYMS花药的产量显著高于MF-1376。是多余的啊gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba催化生成HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba，我们发现PHYMS花药也具有更大的HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba所有三个阶段中的含量。已知ROS清除依赖于抗氧化酶，但是，在单核和三核阶段，PHYMS花药中SOD、CAT和POD的活性显著低于MF-1376花药。此外，在过量ROS条件下，多不饱和脂质通常降解形成MDA。我们发现PHYMS花药中的MDA水平显著高于MF-1376花药（图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)总之，这些结果表明PHYMS花药含有异常的ROS水平，这可能影响绒毡层细胞、光合作用和碳代谢以及细胞壁的生物合成和降解[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba］．我们测定了15和16点对应的内-β- 1,3 -葡聚糖酶和液泡转化酶1。结果表明，从四分体阶段到三核阶段，PHYMS花药中β- 1,3 -葡聚糖酶活性显著低于MF-1376花药gydF4y2Ba10gydF4y2Ba:图S6a)。在四分体期，MF-1376和PHYMS花药的液泡内转化酶活性无显著差异，但在单核和三核期，MF-1376花药的液泡内转化酶活性显著高于PHYMS花药gydF4y2Ba10gydF4y2Ba:图S6b)。相应的，表达水平gydF4y2BaIvr5gydF4y2Ba两种花药在单核期和三核期表现出显著的差异，特别是在三核期，其中gydF4y2BaIvr5gydF4y2BaMF-1376花药的mRNA含量是PHYMS花药的近2.85倍gydF4y2Ba10gydF4y2Ba:图S6c)。这与二维PAGE和酶活性结果有很好的相关性。gydF4y2Ba

尽管雄性不育在小麦杂种优势方面具有巨大潜力，但据我们所知，尚未有研究在蛋白质组学水平上描述CHA诱导的小麦花药蛋白质表达的变化。因此，我们在四分体、单核和三核细胞中对MF-1376和PHYMS花药进行了全面的蛋白质组学分析为了更好地理解CHA诱导小麦雄性不育的机制，我们鉴定了103个DEP，主要在碳水化合物代谢和氧化氧化还原应激中发挥作用。氧化还原应激蛋白在氧化应激条件下被激活，以清除exc对于活性氧，我们决定分析活性氧水平和抗氧化活性。此外，一些其他DEP（如β-1，3-葡聚糖酶和液泡转化酶）的潜在作用和mRNA表达水平如下所述。gydF4y2Ba

已知假定的In2.1蛋白、假定的谷胱甘肽S-转移酶GSTF1和SOD都参与清除活性氧[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba］．推测的In2.1蛋白，已被鉴定为GSTF的同源物，仅在PHYMS花药中表达(附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba:图S2，在2.1)。在作物和杂草中，GSTF和或In2.1通过催化亲电除草剂与谷胱甘肽的结合来解毒。GSTF和In2.1蛋白除了在除草剂解毒、胁迫信号传导和凋亡调节等方面的功能外，还具有谷胱甘肽过氧化物酶的功能，在各种胁迫下作为ROS清除剂发挥作用[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba］．在本研究中，对作物喷施外源药剂(即CHA)可能对花药的生长发育产生毒性作用。这可以解释为什么在PHYMS花药中，氧化-氧化还原胁迫蛋白的表达比在MF-1376花药中更高。ROS是有氧代谢的副产品，当细胞内维持高水平的ROS时，机体就会遭受氧化应激。这导致蛋白质和核酸的损害，脂质过氧化，甚至细胞坏死[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba］．事实上，我们发现了一个明显更高的OgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba生产，HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba结果表明，在PHYMS花药中，活性氧(ROS)含量和MDA含量均显著增加。同时，PHYMS花药也表现出较低的ROS清除酶SOD、POD、CAT活性(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．通过2d PAGE凝胶分析，在单核期和三核期，PHYMS花药中SOD的表达均较低。这些结果表明，活性氧的积累，以及氧化-氧化还原应激蛋白和活性氧清除酶的低表达，可能导致绒毡层退化和花粉凋亡。此外，ROS水平异常升高引起的慢性氧化应激可能是PHYMS植物小孢子败育的原因。gydF4y2Ba

碳水化合物代谢是生物系统的基本代谢途径。它的主要生理功能是提供正常生长所必需的碳和能量来源(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．鉴定的蛋白质中有六种与碳水化合物代谢有关。细胞色素c氧化酶(COX)是线粒体电子传递链的最后一种酶，在PHYMS花药的所有三个发育阶段均显著上调(附文件)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba图S2, CCOS)。已知COX受同工酶表达、变构效应如ATP/ADP比例和可逆磷酸化调控[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba］．我们发现COX在PHYMS花药的各个阶段都上调，这表明它也在雄性不育中发挥作用。在CHA胁迫条件下，COX可能通过呼吸链促进能量生成。gydF4y2Ba

替代氧化酶(AOX)是许多生物体线粒体膜内替代电子传递链的组成部分，具有抑制ROS产生、应激反应和程序性细胞死亡信号的能力[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba］．在我们的研究中，我们发现在四分体和三核期，AOX在MF-1376花药中的表达高于在PHYMS花药中的表达。我们的组织切片显示，在四分体时期，两种植物的小孢子有显著差异。例如，只有MF-1376小孢子的外围有一层包裹层围绕着孢子。这些结果表明，四分体期小孢子的异常可能与MF-1376与PHYMS花药中AOX的表达差异有关。gydF4y2Ba

UDP形成α-1,4-葡聚糖-蛋白合酶与细胞壁多糖（如半纤维素和木糖）的形成有关[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]。形成UDP的α-1,4-葡聚糖-蛋白合酶在PHYMS花药中的高表达与三核花药的横截面结果一致，其中，除了清晰的细胞结构外，我们还观察到明显的药室内壁和较厚的表皮。gydF4y2Ba

β-1,3-葡聚糖酶在小孢子释放前表达，参与小孢子四分体周围胼胝质的降解。通过这种方式，β-1,3-葡聚糖酶有助于以花粉粒的形式释放小孢子[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba]在矮牵牛属植物中，胼胝质活动的时间对小孢子的正常发育至关重要，任何时间上的错误都会导致雄性不育[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45gydF4y2Ba］．在我们的研究中，我们鉴定出在单核和三核发育阶段PHYMS花药中均下调的位点15为endo-β-1,3-葡聚糖酶。这一发现与在每个阶段发现的较低的β-1,3-葡聚糖酶活性一致。相比之下，虽然在四分体阶段该蛋白的表达没有显著差异，但在此阶段其活性在PHYMS花药中仍然显著降低(附加文件gydF4y2Ba10gydF4y2Ba：图S6a）。这些结果与另一项研究一致，该研究表明，在CMS系统中gydF4y2Ba芸苔属植物显著gydF4y2Ba正常花药中β-1,3-葡聚糖酶的活性也较高[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．因此，β-1,3-葡聚糖酶可能在小麦雄性不育过程中起重要作用。gydF4y2Ba

液泡转化酶在高等植物的糖代谢中起着不可或缺的作用。液泡转化酶活性的下降与蔗糖的积累、其他糖谱的改变以及淀粉在花药内的空间重新分布有关[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba］．在这里，我们发现液泡转化酶活性和gydF4y2BaIvr5gydF4y2Ba与MF-1376花药相比，PHYMS花药中的表达水平显著降低。这在单核，尤其是在发育的三核阶段是正确的，并且得到了2-D PAGE结果的支持（附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba:图S2、VI和附加文件gydF4y2Ba10gydF4y2Ba这些结果表明，液泡转化酶的异常蔗糖代谢可能与PHYMS花药的流产行为有关。在三核期，不育花粉在PHYMS花药中没有淀粉积累，这也支持了这一观点。我们的发现也支持了一个越来越流行的观点，即在植物的质外体中蔗糖分裂是为正常发育的花药提供碳水化合物的重要途径。其他研究表明，液泡转化酶与小麦干旱胁迫下的花粉败育有关[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba］．另一个可能导致PHYMS花药雄性不育的因素是碳水化合物的可用性降低。在我们的二维PAGE实验中，一些PHYMS点相对于相应的MF-1376点强度较低，被鉴定为参与光合作用的蛋白。例如，spot 14，我们鉴定为叶绿体RuBisCO大亚单位结合蛋白亚单位alpha(附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba图S2, RLSPSA)在单核期和三核期均有较低浓度的PHYMS花药。RuBisCO大亚基结合蛋白亚基是一个65 kDa的伴侣蛋白亚基，在高等植物叶绿体中RuBisCO的组装中形成更大的复合物(可能有6个亚基和6个亚基)的一部分[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．RuBisCO本身是光合作用过程中的关键酶。RuBisCO大亚基结合蛋白亚基α的下调明确表明PHYMS花药中的碳固定受到干扰，光合速率降低。由于PHYMS花药中缺乏这些光合蛋白，因此光合速率的降低以及碳水化合物的有限可用性可能导致花粉败育。有趣的是，RuBisCO大亚基结合蛋白亚基被证明与辣椒雄性不育的发生直接相关[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

ABC转运蛋白家族是一个庞大的蛋白家族，包括完全转运蛋白和半转运蛋白，具有多种与植物激素、脂类、金属离子、次生代谢产物和外源物质运输相关的功能。因此，它是极其重要的植物膜转运蛋白家族[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba］．我们在PHYMS花药中发现ABC转运体C家族成员5在四分体和单核阶段上调，提示ABC转运体在CHA诱导的雄性不育过程中发挥作用。在这个实验中，我们发现了一个转录抑制因子(spot 11)和一个可逆糖基化多肽(spot 12)，很可能转录调控和蛋白质修饰也参与了cha诱导的雄性不育。此外，泛素蛋白酶体途径(UPP)在高等植物有性生殖过程中发挥着重要作用。在这方面，我们的PPI结果与之前的发现相结合[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba表明泛素蛋白酶体途径与小麦雄性不育密切相关(Figs。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba和gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

基于我们的蛋白质组学、生物信息学和分子生物学结果,我们建议工厂CHA直接或间接的影响,从而导致光合速率下降,谷胱甘肽消除heterotoxin需要能量消耗,减少淀粉含量由于不活跃的碳固定,液泡转化酶活性下降。这反过来可能会导致糖代谢途径的阻断，从而导致严重的糖缺乏，而糖是小孢子和花粉粒正常发育所需要的化合物。此外，绒毡层细胞提前凋亡导致ROS大量积累，蛋白酶体途径活跃并降解凋亡蛋白。绒毡层向小孢子的运输途径受阻。综上所述，这些机制可能导致花药或花粉缺乏碳水化合物，最终导致雄性不育。当然，本研究中观察到的dep需要进一步表征，以确定它们是否直接影响不育。我们希望未来利用CRISPR-CAS9特异性下调这些dep的实验能够帮助阐明哪些蛋白质是sq -1介导的雄性不育。gydF4y2Ba

在此，我们应用蛋白质组学方法鉴定了与CHA诱导小麦花药雄性不育有关的关键蛋白质。我们的结果表明，雄性不育花药中的异常花粉发育与四分体、单核和/或三核阶段的DEPs有关。这些蛋白质包括氧化还原应激蛋白（例如，假定的谷胱甘肽S-转移酶GSTF1）、碳代谢和细胞壁相关蛋白质（例如，细胞色素c氧化酶和液泡转化酶）、参与光合作用的蛋白质（例如，RuBisCO大亚基结合蛋白亚基α）重要的是，我们发现ROS的大量积累，以及抗氧化酶和ROS清除蛋白的异常活性，导致PHYMS植物中的慢性氧化应激和小孢子败育。我们还强调绒毡层对正常功能的重要性胼胝质（β-1，3-葡聚糖酶）和花粉发育糖代谢（液泡转化酶）的转化结合表型和组织切片分析，我们在2D–PAGE中鉴定的蛋白质表明，调节PHYMS植物花粉发育的机制是一个复杂的网络。总之，我们为理解CHA诱导雄性不育的机制提供了重要线索，并为实际应用提供了见解小麦杂交育种研究进展。gydF4y2Ba

二:gydF4y2Ba

双向电泳gydF4y2Ba

AOX:gydF4y2Ba

替代氧化酶gydF4y2Ba

计算机辅助设计:gydF4y2Ba

肉桂醇脱氢酶gydF4y2Ba

猫:gydF4y2Ba

过氧化氢酶gydF4y2Ba

查：gydF4y2Ba

化学杂交剂gydF4y2Ba

CMS:gydF4y2Ba

细胞质雄性不育gydF4y2Ba

考克斯:gydF4y2Ba

细胞色素c氧化酶gydF4y2Ba

DEPs:gydF4y2Ba

差异表达蛋白gydF4y2Ba

总经理:gydF4y2Ba

基因的雄性不育gydF4y2Ba

基伊gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba：gydF4y2Ba

Iodine-potassium碘化解决方案gydF4y2Ba

MDA：gydF4y2Ba

丙二醛gydF4y2Ba

豆荚：gydF4y2Ba

过氧化物酶gydF4y2Ba

PPI：gydF4y2Ba

蛋白质相互作用gydF4y2Ba

ROS:gydF4y2Ba

活性氧gydF4y2Ba

SDS-PAGE：gydF4y2Ba

十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳;gydF4y2Ba

扫描电镜:gydF4y2Ba

扫描电子显微镜gydF4y2Ba

草地：gydF4y2Ba

超氧化物歧化酶gydF4y2Ba

我们感谢资金来源。这项工作得到了中国国家支持项目(2015号bad27b01),中国国家自然科学基金(No.31371697),陕西省科技创新和规划项目(No.2014KTZB02-01-02)科技计划项目的部门河南省(No.172102110165),河南省高校重点科研项目(No.15A210015);周口师范学院博士科研启动基金项目(No.ZKNU2014111);周口师范学院校本课题(No.ZKNUB115103)。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

国家自然科学基金项目(No.31371697);陕西省科技创新与规划项目(No. 2014ktzb02 - 01-02);河南省科技厅计划项目(No.172102110165);河南省高校重点科研项目(No.15A210015);周口师范学院博士科研启动基金项目(No.ZKNU2014111);周口师范学院校本课题(No.ZKNUB115103)。gydF4y2Ba

数据和材料的可用性gydF4y2Ba

支持本文结论的数据集包含在本文及其附加文件中。已鉴定蛋白质的数据在另一个文件中。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 西北农林科技大学国家杨凌农业生物技术与育种中心/国家小麦改良中心杨凌分中心/小麦育种工程研究中心教育部/陕西省作物杂种优势重点实验室，陕西杨凌712100gydF4y2Ba

   刘洪战，张盖生，宋玉龙，牛娜，王俊伟，马守才gydF4y2Ba

2. 周口师范学院生命科学与农学学院，河南周口gydF4y2Ba

   刘洪战，王俊生，李晶晶，乔林，李丽丽gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

HZL和GSZ共同构思和设计了实验。HZL进行了实验。HZL分析了数据。手稿由HZL撰写。JSW, LLL, YLS, LQ, JJL, NN, JWW和SCM贡献了试剂，材料和分析工具。所有作者均已阅读并批准本稿件。gydF4y2Ba

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