抵抗梅痘病毒(PPV)在杏(李属armeniacaL.)与2的下调有关MATHd基因

背景

李子痘引起沙卡病的病毒(PPV)是沙卡病的主要限制因素之一李属全球生产。在杏(李属armeniacaL.主要的PPV抗性位点(PPVres)，包含~ 196 kb，已映射到链接组1的上部。在PPVres，在23个预测转录本中鉴定出68个与PPV抗性偶联的基因组变异。考虑到序列同源性的预测功能，我们将meprin和TRAF-C同源结构域(MATHd)基因集群中的一些成员定位为PPV抗性候选基因。

结果

在这里，我们描述了全球杏对PPV-D感染的转录组反应，确定了6个PPVres位点基因(ParP-1来ParP-6)在抗性/敏感品种中差异表达。其中两个(ParP-3和ParP-4)编码MATHd蛋白的基因在抗性品种中明显下调，qRT-PCR证实了这一点。同时，利用24个品种(10个抗ppv、14个敏感ppv)和2个野生近缘品种(敏感ppv)的全基因组测序数据进行变异调用。ParP-3和ParP-4，命名为Prunus基于“增大化现实”技术meniacaPpvr米ATHd -c含有基因(ParPMC)，是仅有的两个与PPV抗性偶联的等位变异基因。ParPMC1有1个nsSNP，而ParPMC2有15个变体，包括在第二个外显子内产生移码突变的5bp缺失。ParPMC1和ParPMC2相邻且高度同源(87.5%的同源性)，表明它们是源于串联复制的同源物。携带ParPMC2抗性(突变)等位基因在两者中均缺乏表达ParPMC2特别是ParPMC1．

结论

因此，我们假设ParPMC2介导下调其功能的假基因是否存在ParPMC1沉默。总体而言，结果支持强烈ParPMC1和/或ParPMC2作为PPV感染所需的宿主易感基因，其沉默可能赋予PPV抗性性状。这一发现可能有助于通过标记辅助选择进行抗性育种，并为基因编辑方法铺平道路李属．

沙卡病，由李子痘病毒(PPV)，是目前影响人类最重要的病毒性疾病李属物种(17]。PPV是Potyvirus属中的属Potyviridae，是最大的植物病毒科之一，并已列入与科学/经济相关的植物病毒“十大”排名[46]。首次描述侵染李子(李属有1917年左右在保加利亚[3.]，从那时起，PPV传播到大多数温带水果作物种植区[6]。抗ppv的生长李属品种被指出是理想的长期解决方案，特别是在果树无法有效保护免受沙卡病感染的地方病地区[17]。然而，抗性来源很少。种质筛选刚刚发现了一些北美杏(李属armeniacal .)抗PPV品种[36]目前被用作育种计划的供体，以及一些对PPV感染表现出耐受性或过敏反应的李子基因型[21]。

杏对PPV抗性的遗传控制一直是一个有争议的问题。表型方法的差异和不同PPV菌株的使用阻碍了得出确切的结论[31]。然而，目前大多数研究都支持一个主要显性基因位点(PPVres位点)位于杏1连锁群上部，包括遗传作图[15，25，26，34，41，50]和全基因组关联方法[35]。在之前的工作中，我们缩小了PPVres根据桃基因组同工区，位点为~ 196 KB [58]。本研究还指出了含有meprin和TRAF-C同源结构域(MATHd)的基因簇与PPV耐药有关。遗传证据主要支持干扰其中一个基因的5-bp插入突变作为引起耐药性的候选变异。因此,自PPVres杂合子基因型通过突变赋予抗性PPVres等位基因，功能获得或显性负突变被假设[58]。在拟南芥是另一种mathd独有的蛋白质编码基因，RTM3是占主导地位的RTM参与限制PPV长距离运动的基因[10]。此外，非功能性的一个或多个RTM等位基因足以消除抗性表型[10，40]。相反，杏的PPV抗性可能与a有关MATHd编码截断的无功能蛋白的突变等位基因[58]。同样，宿主真核翻译起始因子4E亚型的功能丧失(eIF (iso) 4 e)已被证明赋予PPV抗性答:芥还有李子[14，56]。然而，在这些情况下，抗性是由于“隐性纯合子”，而在杏中，天然PPV抗性存在于杂合子中[58]。

已经探索了基因工程技术来获得PPV抗性李属克服杂交障碍和长世代等育种限制的品种和砧木。许多工作涉及利用PPV外壳蛋白(CP)基因构建病原体衍生抗性(综述由[23])。该策略通过RNA沉默激活PPV CP编码序列，成功地开发了抗PPV的“HoneySweet”C5李子([47];专利号Us pp15154 p2)。宿主源性抗性也通过沉默宿主易感基因(S)得以利用eIF (iso) 4 e获得抗PPV转基因李子[56]。然而，转型和再生在李属基因转移技术仍然存在高度依赖于基因型的限制因素[23]。没有genome-edited李属但这项技术可能会对PPV抗性育种产生重大影响。

在这项工作中，我们结合转录组学和基因组数据来验证Zuriaga等人先前鉴定的候选基因。[58]并表征杏对PPV感染的全球转录组反应。总的来说，结果使我们能够支持PPV抗性依赖于两个下调PPVres轨迹MATHd基因和通过基因沉默提出显性基因的作用，这两个发现都与未来的育种有关李属．

抗病/易感杏品种的转录组谱不同

为了分析杏对PPV感染的反应，将PPV抗性品种Goldrich和Stella以及易感品种Canino嫁接到易感品种GF-305的桃源砧木上，用PPV- d片芽法接种一半植株。采用对端(PE) HiSeq2000 Illumina测序对16份叶片RNA样本进行基因表达分析。获得了超过490 M的101 bp原始序列读数，平均每个样本30.63 M(附加文件)1:表1)。经过高质量的修剪和适配器修剪，共获得70-100 bp的高质量测序碱基(占原始测序碱基的99.75%)。正如Haas等人所建议的。[19]，用Trinity软件进行归一化清洗后的序列组装。经过细化(详见实验程序部分)，共生成91,735个转录本，并将其分组为61,096个基因，共有98,391,234个碱基，连续平均长度为1072.56个碱基。关于其他的李属，研究李子对PPV感染的反应得到了类似的结果[44]，杏仁生殖组织对霜冻胁迫的响应(李属dulcis（机．）D.A.韦伯) [37]，以及果实发育的动态[1]和甜樱桃中的花青素生物合成(李属鸟结核l .) [57]。碧桃参考转录组(peach v.1.0，rosaceae.org)，从不同的组织(即果实、根、叶、胚胎和子叶)中获得，有28,689个转录本[54]。在这个仅基于叶片RNA的杏转录组中，有多达10,894个桃转录本，长度覆盖率超过80%(附加文件)2表2)。利用互反最佳Blast hit (RBH)标准，在桃树中检测到34%的推定同源物(附加文件)3.:数据S1)。

梅痘病毒基因组序列(NCBI参考序列:NC_001445.1)与杏组装的contigs (e值>1e-07)进行了对照，只有一个contigs (c34934_g0_i1)显示与病毒序列相似(附加文件4表S3)。PPV基因组几乎完全组装成这个单一的contig，除了两端的一小部分和45个碱基插入外，全长9741个碱基，同源性超过98%。针对此“PPV组”的读取映射用于检查病毒的存在(附加文件5:表S4)。正如预期的那样，PPV在接种PPV的易感' Canino '的3个重复中显著存在，但在其他重复中几乎不存在。所有接种GF305的砧木指标均可明显观察到PPV症状。

每个样本的转录丰度估计是通过将修剪过的PE读段与组装的转录组对齐来获得的。为了识别趋势或检测数据集中假定的偏差，使用多维缩放(MDS)图检查样本之间的关系(附加文件)6:图S1)。总体而言，不同品种间的转录组谱变异高于不同侵染条件(1:接种;NI:未接种)(附加文件6:图S1a)。ppv接种的' Goldrich '复制' Go_I_rep3 '与其他' Goldrich '样品明显分离，因此为后续分析消除了它，以防止背景噪声。在品种中，' Canino '(附加文件)6:图S1b)和“Stella”(附加文件)6:图S1d)根据感染条件，样品似乎是分开的，但在“Goldrich”(附加文件)中没有6:图S1c)。技术复制对(' Ca_NI_rep2a ' /'Ca_NI_rep2b ';“Go_I_rep1a”/“Go_I_rep1b”;' Go_I_rep2a ' /'Go_I_rep2b ')分别聚在一起，并被视为单个生物重复(' Ca_NI_rep2 '， ' Go_I_rep1 '和'Go_I_rep2 ')，用于后续分析。

I和NI感染条件下的差异表达基因(DEGs)数量因品种而异:“Canino”为793个(PPV易感性纯合子)，“Stella”为194个(PPV抗性纯合子)，“Goldrich”为23个(杂合子)。1）.“Canino”和“Stella”共有102度，而“Canino”只出现688度，“Stella”只出现92度。两个常见的DE细胞壁相关基因在两个品种中表现出相反的行为，c29444_g0在接种过的‘Canino’中表现为下调，而在接种过的‘Stella’中表现为过表达，而在接种过的‘Stella’中则相反c33041_g0(无花果。1 b）.为了深入了解两个品种中deg的生物学作用，使用Blast2GO进行了基因本体(GO)类别富集分析(Fisher精确检验，FDR < 0.05)1）.在“Canino”中，我们发现氧化石墨烯的分子功能显著富集于结合(铁离子、染色质和DNA)和催化活性(氧化还原酶、水解酶、裂解酶、转移酶和转运蛋白)。在生物过程中，氧化石墨烯的富集与非生物刺激反应有关。最后，对于细胞成分，富集的氧化石墨烯与叶绿体(类囊体和基质)、细胞核和核小体有关。在“Stella”中，我们只发现了与非生物和内源性刺激、昼夜节律和积极发育调节相关的生物过程相关的丰富的氧化石墨烯术语。

两个PPVres轨迹MATHd抗杏品种基因下调

主属音PPVres根据桃基因组同区，杏的基因座约为196 KB [58]。19个组装的杏基因为RBH，另外10个与桃内的一些注释基因高度相似PPVres轨迹(附加文件)7表5)。在比较PPV感染条件的品种内，6 (ParP1到ParP-6)在品种间表现出显著的DE(图2)。2、附加文件8表6)。ParP-3和4在' Stella '中高度下调(绝对logFC值在5.19-7.4之间)，而ParP-1,−2，−5和−6上调(绝对logFC值在0.78-1.45之间)。ParP-3，ParP-4和ParP-5是否与3桃同源MATHd基因(ppa022254m，Ppb0221 95 m和ppa008951m，分别为)先前指出的PPV抗性候选基因[58]。qRT-PCR分析进一步证实了RNAseq结果，揭示了相似的基因表达模式(图2)。3.）.例如，没有统计上的显著差异(p在不同侵染条件下，各品种间均检测到< 0.05)。ParP-3和ParP-4与“Canino”相比，在“Stella”中明显被下调，而“Goldrich”则处于两者之间的中间位置(图2)。3 a - b）.ParP-3显示出最高的相对表达差异，未接种的“Canino”与“Stella”相比增加了约300倍(图2)。3、附加文件9表S7)。相反，ParP-5样本之间和样本内均无显著差异(图2)。3 c）.这些基因表达模式与ppv抗性表型之间的相关性通过测试另外两个抗性品种(' Harlayne '和' Orange Red ')得到证实PPVres杂合子)和四个易感品种(' Currot '， ' Ginesta '， ' Katy '和' Mitger ')(图2)。3.;额外的文件9表S7)。ParP-3和ParP-4在所有抗性品种中均明显下调(图2)。3 a - b),ParP-3在‘Stella’(附加文件)中，易感品种的基因表达量在300 ~ 4267倍之间，再次显示出更显著的差异9表S7)。此外,ParP-5在敏感品种和抗性品种之间没有一致的差异(图2)。3 c）.

ParP-3和ParP-4积累与PPV抗性相关的基因组变异

24个杏品种(10个抗ppv品种和14个敏感ppv品种)和2个杏亲缘品种(ppv敏感品种)的全基因组序列(WGS)，以及与“Goldrich”对应的6个BAC克隆的reads。PPVres基因座r -单倍型，与桃基因组(桃v1.0;http://www.rosaceae.org)(附加文件10表8)。变异调用检测snp或小的插入和删除(INDELs)PPVres每个基因型鉴定出2424 ~ 3928个推测snp和425 ~ 711个推测INDELs10表8)。随后，三种过滤器依次应用于从所有7459个检测到的变异中区分与PPV抗性相关的snp /INDELs: i)变异应该与PPV抗性偶联，正如它们在' Goldrich ' r -单倍型BACs中的存在所证实的那样，在' Goldrich '二倍体WGS中是杂合的;ii)在‘Stella’中为纯合子，在其他抗性品种中为杂合子;iii)在所有16个易感品种中均不存在(图2)。4、附加文件11表S9)。共有44个SNP/INDELs满足这三个条件。这些变异中有28个在基因间区被发现，其中14个和11个在基因间区被发现ParP-3和ParP-4，分别为(图2)。4 b）.此外，1个过滤变体存在于ParP-3(nsSNP: Ile109Leu)和15ParP-4(内含子区7个，5个sSNPs, 2个nsSNPs: Glu194Lys和Thr266Ala, 15个5-bp缺失)(图2)。4 b）.有趣的是，后一个5-bp的缺失位于第二个外显子，并产生一个移码突变，产生一个过早停止密码子(图2)。4摄氏度）.这种5 bp的缺失可以通过琼脂糖凝胶电泳和等位基因特异性PCR在易感和抗性品种中一致地筛选出来，为杏育种计划中的标记辅助选择(MAS)提供了有用的工具(图2)。4 c - d）.根据蔷薇科基因组数据库(GDR)的基因命名指引[24]，ParP-3和4分别命名为ParPMC1和ParPMC2（Prunus基于“增大化现实”技术meniacaPpvr轨迹米ATH-domaincontaining (PMC)基因)。

杏的5个基因被鉴定为与桃的同源或高度相似PPVres轨迹MATHd基因根据相互Blast结果(附加文件)7表5)。基于最大似然的这14个基因的系统发育揭示了3个高度支持的亚簇(图2)。5）.ParPMC1，ParPMC2和ParP-5，以及它们假定的桃同源物，ppa022254m，Ppb0221 95 m和ppa008951m,在同一子集群中分组在一起的。ParPMC1和ParPMC2结果表明，在所有杏对中，遗传距离最短(0,148)，序列一致性为87.5%(附加文件)12:表S10)。

杏对PPV感染的反应

杏品种间转录组谱的差异比病毒感染条件间的差异更显著。与PPV感染相关或不相关的不同因素可以解释这一点。例如，“Goldrich”和“Stella”是适应寒冷生长条件的北美杏品种，而西班牙的“Canino”主要生长在温带的地中海盆地[29]。PPV接种程序需要冷处理以打破休眠[38]。因此，不同品种对这种处理的反应可以通过它们的全球基因表达谱来反映。正如预期的那样，在PPV接种和未接种组织之间的转录组谱在易感材料中观察到更深的差异。根据先前的研究，这种表达模式可能是由于细胞经历致病性应激时所遭受的变化。考虑到以往研究的广泛差异，在这项工作中发现了类似的生物过程和分子功能受到影响。在杏，卢比奥等。[45]确定了与不同刺激反应相关的生物过程中涉及的deg。Wang等。[55在桃感染叶片中，参与防御、细胞运输、发育、蛋白质合成和结合功能的基因表达上调。猪对PPV感染反应的研究拟南芥叶片鉴定出属于代谢、转录/剪接/RNA加工蛋白、防御和发育/储存蛋白主要群体的改变基因[4]。细胞成分的富集氧化石墨烯术语与描述PPV对叶绿体中产生物理和生化变化的光合过程的影响的论文一致[11，22，44，49]。总的来说，本工作提供的转录组学数据增强了我们在基因表达水平上对PPV反应的认识，并可能有助于寻找参与PPV抗性的其他基因。

杏抗PPV是由MATHd基因/秒

的PPVres根据国际桃基因组计划(International peach Genome Initiative)的注释，桃的基因座共合区包含29个基因，其中一个基因编码3个备选转录本。本研究的基因表达分析显示，在感染/未感染组织中，没有相应的杏基因是DE，这表明PPV-D的存在不会调节它们的表达。然而，在易感的“Canino”和耐药的“Stella”之间鉴定了6个deg。其中两个，ParPMC1和ParPMC2， DE明显成为表达数据的最佳候选者。此前，利用3个PPV抗性品种和4个PPV敏感品种的基因组数据，在~ 196 kb的23个基因中共鉴定出68个与PPV抗性相关的变异PPVres轨迹(58]。在这项工作中，基于26个杏WGS的更深入的变异召唤分析，使我们能够确认44个变异符合杏PPV抗性的遗传标准[50，53]。ParPMC1和ParPMC2基因分别包含1个和15个这样的变体，而另外14个和11个位于它们假定的启动子区域。值得注意的是，这两个基因都与桃子的成员同源MATHd先前被认为是最有可能的PPV抗性候选基因的基因群[58]。ParPMC1在第一个MATH域中只有一个nsSNP (Ile109Leu)，但是ParPMC2累积15个变异，包括一个5nt缺失，导致过早终止密码子。ParPMC1和ParPMC2高度相似(87.5%同一性)，接近ParP-5，并且这三个都在MATHd基因簇。因此，我们假设它们是由来自单一祖先基因的串联复制而产生的亲缘关系。然而，它们的表达模式是不同的，ParPMC1和ParPMC2在抗PPV品种中表达下调，但ParP-5在PPV抗性和易感品种中表达似乎相似。ParPMC1基本保持不变，而ParPMC2抗性等位基因积累了有害突变，这可能是假原化过程的结果[16]。可以推测，这反过来又影响了的表达ParPMC1和ParPMC2而不是易感等位基因ParP-5序列差异引起的表达。因此，也可以认为ParP-5函数不是多余的ParPMC1和ParPMC2．总之，这些结果支持了这一点ParPMC1和/或ParPMC2杏对PPV的易感性需要基因。在使用PPV- rec的研究中提出了其他有助于PPV抗性的位点[34]和PPV-M菌株[35]，但一致的候选基因仍有待鉴定。此外，Decroocq等人[12，13观察到一些杏的基因型携带ParPMC2抗性等位基因对PPV易感，主要对M株易感。这些报告表明ParPMC2抗性等位基因不足以使PPV抗性成为必要的附加基因。根据这项工作提供的证据，这一点不能被抛弃。然而，所有可用的研究(包括后者)无疑都显示了两者之间的紧密联系ParPMC2抗性等位基因和PPV-D抗性。此外，不匹配可能是由于其他基因，但也可能是由于PPV菌株(不同的基因可能是PPV- m抗性的基础)。

下调的MATHd基因/s表达导致杏抗PPV

下调的ParPMC1和ParPMC2基因表达是PPV抗性和易感杏品种间的差异因子PPVres轨迹。PPV抗性等位基因启动子区域积累的突变可能直接影响其表达，但半基因剂量不能解释抗性和敏感品种之间的差异。尽管如此,ParPMC1和ParPMC2基因沉默也可以阻止基因表达。例如，无义介导的mRNA衰变(NMD)是一种保守的机制，它针对携带过早终止密码子的异常mRNA进行破坏，防止潜在有害的截断蛋白的积累[33]。根据这些作者的说法，一个典型的靶标具有一个终止密码子，位于最后一个外显子-外显子连接处上游50-55 nt以上，或者具有一个很长的3 '未翻译区。有趣的是,ParPMC2在外显子-外显子连接处上游73 nt处的第二个外显子有一个5bp的功能缺失，是NMD的潜在靶标。假基因被认为可能调控它们的蛋白质编码表亲[42]，如无细胞分裂中有性种子形成所需的基因沉默雀稗单纯形与其同源伪基因有关的[48]。此外，在植物中也发现了RNA沉默和NMD通路的重叠。Christie等人，[8]指出，当异常mRNA形成频繁时(即由于无义突变)，存在阈值依赖性的RNA沉默诱导。根据基因表达数据，杏品种只携带一种ParPMC2抗性(突变)等位基因缺乏这两种基因的表达ParPMC2和ParPMC1基因，尤其是ParPMC1．这种情况与显性突变是一致的ParPMC2通过沉默功能同源物(如易感(非突变))赋予PPV抗性ParPMC2等位基因和/或ParPMC1．因此,ParPMC1和ParPMC2可以认为宿主易感性(隐性)基因，沉默可能赋予PPV抗性性状。

连同eIF(iso)4类因子[56]，ParPMC1和ParPMC2据我们所知，在李属是PPV的天然宿主。功能分析目前正在进行中，以阐明的确切作用ParPMC1和ParPMC2PPV抗性基因与此同时，通过基因组编辑技术沉默这些和其他隐性基因，如eIF(iso)4样因子，似乎是利用宿主来源的抗性的一种很有前途的策略李属金字塔持久抵抗PPV。此外，对易感品种“Canino”的其他deg进行更仔细的分析，可能会发现参与病毒感染的其他宿主s基因。

植物材料与PPV接种

采用抗PPV品种Goldrich和Stella以及易感品种Canino进行RNAseq试验。这些品种是IVIA(西班牙瓦伦西亚)种质收藏的一部分。每个基因型都被嫁接到在Moustafa等人描述的受控温室条件下盆栽生长的PPV易感的“GF305”桃幼苗上。38]。一半植株用PPV Dideron菌株3.3 RB在GF305砧木上进行片芽接种[2]。嫁接4周后，在5°C的黑暗环境中进行人工休眠期，为期8周。随后，这些植物再次被转移到温室。8周后，收获沿发芽随机分布的发育完全的幼叶，在提取RNA之前直接在温室液氮中冷冻。通过对易感的“GF-305”叶片的症状进行目视检查，并通过RNAseq分析检测PPV转录本，对病毒的存在进行评分。每种条件(接种/未接种)从' Goldrich '和' Canino '中取样3个重复，从' Stella '中取样2个重复。

此外，2个抗性品种(“Harlayne”和“Orange Red”)和5个易感品种(“Canino”、“Currot”、“Ginesta”、“Katy”和“Mitger”)被用于基因表达分析。所有这些品种也作为IVIA (Valencia, Spain)种质收藏的一部分进行保存。

总RNA的分离和测序

使用RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)从100 mg粉末状叶片中分离总RNA，使用前在试剂盒提取缓冲液中加入1% (w:v)聚乙烯吡罗烷酮(PVP-40)，然后使用RNase-Free DNase Set (Qiagen, Valencia, CA, USA)进行dna酶处理。通过琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop ND-1000分光光度计(Nanodrop Technologies, Wilminton, DE, USA)检测RNA的质量和数量。文库构建和测序由北京基因组研究所(华大基因技术解决方案(香港)有限公司)完成。测序前，华大基因使用Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)和Nanodrop重新检查RNA的质量和数量。使用Illumina HiSeq2000仪器对' Short-insert '文库进行测序，用于101-bp的PE测序。对一些样品进行两次测序以获得所需的干净数据量，并在随后的分析中作为技术重复处理。清洗后的配对端序列数据存储在NCBI短读档案(SRA)中，登录号为SRR5591366 ~ SRR5591375，与BioProject PRJNA387702相关。

从头转录组组装和质量控制

FastQC v.0.10.1http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)软件评估原始和干净读取集的质量。使用FASTX-toolkit (http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit)，最低质量分数为25分，最低长度为40分。适配器序列使用' trim_blast_short '脚本进行裁剪，该脚本可作为seq_crumbs (http://bioinf.comav.upv.es/seq_crumbs/）.使用Trinity v.20140413p1软件，将所有样品的高质量读数组合在一起，以便进行从头组装[18(参见附加文件13:方法S1)。

为了检查程序集的质量，将获得的转录本与GDR桃转录本数据库v.1.0 (ftp://ftp.bioinfo.wsu.edu/species/Prunus_persica/Prunus_persica-genome.v1.0/genes/)进行相似度搜索(e值>1e-07的前25个搜索结果)。结果使我们能够使用Trinity软件中的“analyze_blastPlus_topHit_coverage.pl”脚本来估计恢复的基因的数量和长度。组装好的转录组存储在与BioProject PRJNA387702相关的NCBI转录组Shotgun Assembly Sequence (TSA)数据库中。

从头转录组注释

使用Blast2GO软件进行基因本体(GO)注释[9]和针对NCBI非冗余蛋白(nr)数据库的Blastx结果(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein）.利用GDR桃v1.0数据库中的多肽进行Blastx互易最佳匹配(RBH)分析，获得杏和桃的一组假定的同源物。梅痘病毒将基因组序列(NCBI参考序列:NC_001445.1)与杏组装转录本进行比对(e值>1e-07)鉴定病毒序列。ngs_backbone软件[5]用于所有情况下Blast结果的注释，除了GO术语注释。爆炸分析使用来自Málaga大学超级计算和生物创新中心的毕加索超级计算机(http://www.scbi.uma.es）.其余的分析是使用生物信息处的服务器(http://bioinf.comav.upv.es/)，瓦伦西亚理工大学瓦伦西亚农业多样性研究中心(COMAV)的研究员。

差异表达分析

使用Bowtie将清洗过的RNA-seq reads与组装好的转录组对齐。28]通过Trinity软件[19]。用RSEM进行转录物定量分析[30.]和edgeR包[43]用于调用差异表达基因(DEGs)。被认为是技术重复的样本既可以独立分析，也可以作为单一样本组合分析。采用错误发现率(FDR)≤0.05确定其阈值p在多个测试中使用-value。使用多维尺度(MDS)图观察样本之间的关系，其中每对样本之间的距离可以解释为样本之间的主要对数倍变化，以最佳区分该对样本的基因。默认情况下，领先的倍数变化被定义为这对样本之间最大的500个log2倍变化的均方根。在我们的案例中，MDS图是使用这500个基因获得的，也使用了所有基因，两种方法之间没有显著差异。采用Blast2GO软件对DEGs进行GO富集分析，截断值FDR≤0.05。使用一次性刀具获得了维恩图http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html．热图使用自定义R脚本执行。

存在分析

采用qRT-PCR对4个PPV抗性品种(‘Goldrich’、‘Stella’、‘Harlayne’和‘Orange Red’)和5个PPV敏感品种(‘Canino’、‘Currot’、‘Ginesta’、‘Katy’和‘Mitger’)进行了分析。总RNA (500 ng)用PrimeScript RT试剂试剂盒用Oligo-d(T)引物(Takara Bio, Otsu, Japan)逆转录，总体积为10 μl。用10倍稀释的第一链cDNA 2微升进行PCR反应，终体积为20 μl。qRT-PCR在StepOnePlus实时PCR系统(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)上进行，使用SYBR预混物Ex Taq (Tli RNaseH plus) (Takara Bio)。引物对在附加文件中列出14表S11。循环方案包括在95°C下10分钟，然后在95°C下进行15秒的变性40次循环，在60°C下进行1分钟的退火和延伸。PCR反应的特异性通过扩增后解离曲线上是否存在单峰以及琼脂糖电泳对扩增产物的大小进行估计来评估。采用相对标准曲线法，利用两个内参基因的几何平均值测定归一化基因表达水平;肌动蛋白和沙子-就像(32]。结果平均为1-3个独立的生物重复，每个重复3个技术重复。使用Statgraphics Centurion XVII v. 17.2.00软件(Statpoint Technologies, Warrenton, VA, USA)，通过非参数Kruskal-Wallis检验评估多个样本的比较，置信水平为95%。不同的样本用不同的字母标记。

WGS映射，变量调用和过滤

本研究采用10个PPV抗性品种和14个PPV敏感品种以及2个PPV敏感亲缘品种的WGS(附加文件)10表8)。其中10个WGS和454个测序的BAC克隆属于“Goldrich”PPVres基因座r -单倍型，可从我们之前的工作中获得[39，58]。其他16个WGS则是从SRA资料库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra）.使用Trinity软件中的“run_trimmomatic_qual_trim .pl”脚本处理所有原始读取。在去除低质量区域以及载体和适配器污染物后，将清洗后的reads与桃子基因组v1.0 (ftp://ftp.bioinfo.wsu.edu/species/Prunus_persica/Prunus_persica-genome.v1.0/)使用Bowtie2 v2.2.4软件[27]。使用基因组分析工具包(GATK) v3.5-0-g36282e4软件中的HaplotypeCaller工具进行变异调用以检测snp或小indel [52在排放置信度和呼叫置信度上分别设定了最低质量分数为10分和30分。遵循GATK最佳实务(https://software.broadinstitute.org/gatk/best-practices/)，变异发现分析作为样本队列进行。为了从所有检测到的变异中区分与PPV抗性偶联的变异，使用自制的python脚本顺序使用3个过滤器:(i)变异必须存在于PPV抗性的' Goldrich '单倍型(454 BAC配置序列)中，并且在' Goldrich '二倍体WGS中是杂合的;(ii)变异在‘Stella’中应该是纯合的，而在其他抗PPV品种中应该是杂合的;(iii)变异不能出现在任何PPV易感品种中。利用GDR提供的桃基因组注释作为参考，鉴定与预测转录本相关的多态性。

ParPMC2cDNA扩增和测序

的完整编码DNA序列(CDS)ParPMC2利用引物对cDNA_EcoRI_F/cDNA_BamHI_R(附加文件)扩增易感(S)和抗性(R)等位基因14:表S11)，以‘Goldrich’叶片cDNA为模板。利用SuperScript III第一链合成系统试剂盒(Invitrogen)从500 ng总RNA合成该cDNA。循环方案为95℃下2min;10个循环，在95°C下30秒，在49°C下30秒(每个循环+ 0.5°C)，在60°C下1分钟;25个循环，在95°C下30秒，在57°C下30秒，在72°C下1分钟(每个循环+ 10秒);最后72°反应10 min。pcr的终体积为25 μL，含10 ×缓冲液，1.8 mM MgCl₂每个dNTP 0.2 mM，每个引物400 mM, FastStart Taq DNA Polymerase (Roche) 1 U, cDNA模板2 μL。PCR产物在1% (w/v琼脂糖凝胶。按照生产厂家的说明书将PCR片段克隆到pGEM-T载体(Promega)上。DNA测序在ABI Prism 3130XL基因分析仪上进行，按照BigDye终结者v.3.1循环测序试剂盒(应用生物系统公司，福斯特城，CA)的制造商说明，使用T7和SP6通用引物。使用Staden包v.1.6-r (http://staden.sourceforge.net/）.使用BioEdit version 7.0.9中的ClustalW函数进行成对比对[20.]。完整光碟ParPMC2抗性(R)和易感(S)等位基因分别存放在GenBank登录号MF346726和MF346727下。

ParPMC2等位基因特异性PCR测定

ParPMC2使用两个正向特异引物(ParP-4_F_alleleS或ParP-4_F_alleleR)特异性pcr扩增R-和s -等位基因，在3 '端不同，反向引物ParP-4_R(图2)。4、附加文件14(表S11)。pcr最终体积为20 μL，其中含有1 × DreamTaq缓冲液，每个dNTP为0.2 mM，每个引物为5 μM, DreamTaq DNA聚合酶(Thermo Fisher)为1 U, DNA为100 ng。循环条件为:95℃初始变性5 min;35次循环，95°C 30秒，55°C 45秒，72°C 45秒;最后延长72°C 10分钟。PCR产物在1% (w/v)琼脂糖凝胶中电泳。

系统发育分析

九大唱片MATHd桃的基因聚集在PPVres轨迹(58]从GDR数据库中下载。多序列比对使用桃和杏MATHd使用BioEdit version 7.0.9中的ClustalW函数进行基因分析[20.]。使用Gblocks v.0.91b消除排列中的不良位置和发散区域[7]。采用赤池信息准则建立核苷酸取代比较模型。在500次bootstrap重复的最大似然系统发育分析中，采用了最适合的进化模型Tamura 3参数模型(T92) + G。使用相同的进化模型和所有密码子位置来估计序列之间的进化分歧，但去除每个序列对的模糊位置。得到了两两单位矩阵。对MEGA6进行了进化分析[51]。

爆炸:

基本的局部对齐搜索工具

互补脱氧核糖核酸:

互补脱氧核糖核酸

cd:

编码DNA序列

CP:

外壳蛋白

度:

差异表达基因

罗斯福:

错误发现率

德意志民主共和国:

蔷薇科基因组数据库

走:

基因本体论

我:

接种过的

INDELS:

插入/缺失多态性

MAS:

分子辅助选择

MATHd:

Meprin与TRAF-C同源结构域

MDS:

多维标度图

倪:

徵

NMD:

Nonsense-Mediated衰变

Nr:

NCBI非冗余蛋白序列

ParP:

Prunus基于“增大化现实”技术meniacaPpvr

ParPMC:

李属armeniacaPPVres MATHd-containing

PPV:

梅痘病毒

PPVres:

PPV抗性轨迹

存在:

定量实时聚合酶链反应

接待员:

耐药

RBH:

互惠最佳爆炸命中;

RNAseq:

RNA序列

史:

易受影响

单核苷酸多态性:

单核苷酸多态性

SRA:

短读档案

运输安全管理局:

转录组鸟枪组装序列数据库

WGS:

全基因组序列

我们感谢Málaga大学(西班牙)通过毕加索超级计算机处理数据。我们感谢Gabino Rios博士和Alba Lloret博士对qPCR的建议，Chris Dardick博士、Tetyana Zhebentyayeva博士和Albert Abbot博士提供了一些WGS数据，以及Joaquin博士Cañizares对手稿的有益评论。

资金

本研究得到了西班牙经济、工业和竞争力部(研究项目RTA2013-00026-C03-01)的支持。

数据和材料的可用性

清洗后的配对端序列数据存储在NCBI短读档案(SRA)中，登录号为SRR5591366 ~ SRR5591375, BioProject登录号为PRJNA387702。Sanger序列存入GenBank数据库，登录号为MF346726和MF346727。

作者的贡献

EZ设计并进行实验，分析数据并撰写稿件。CR参与了数据分析并修改了稿件。JMB为RNAseq计算分析做出了贡献，并提供了生物信息学方面的技术专长。MLB提供材料、试剂和分析工具，监督数据分析并修改稿件。所有作者都阅读并批准了最终的手稿

从属关系

1. 西班牙瓦伦西亚农业调查研究所(IVIA)柑橘和植物生产中心，CV-315, Moncada, 46113，西班牙瓦伦西亚

   Elena Zuriaga和Maria Luisa Badenes

2. Biología植物分子细胞研究所(IBMCP)，巴伦西亚理工大学-高等调查委员会Científicas, Fausto Elio工程师，46022，西班牙巴伦西亚

   卡洛斯·罗梅罗

3. 瓦伦西亚理工学院(COMAV)，瓦伦西亚理工大学，Fausto Elio工程师，西班牙瓦伦西亚46022

   何塞·米格尔·布兰卡

相应的作者

对应到埃琳娜Zuriaga．

伦理批准并同意参与

不适用

发表同意书

不适用

相互竞争的利益

作者宣称他们没有相互竞争的利益

出版商的注意

施普林格·自然对已出版的地图和机构关系中的管辖权要求保持中立。

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