转录组分析揭示了具有接近相同AABB基因组的天然和再合成的六倍体小麦不同粒级的潜在机制GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

常见的小麦是衍生自同质化液体（AABB）之间的间隙交叉的典型的Allohexaploid物种（AABBDD）GydF4y2Ba山羊草属tauschiiGydF4y2Ba（DD）。观察到晶粒尺寸和形状的宽变化GydF4y2Ba山羊草属tauschiiGydF4y2Ba在人工合成的六倍体小麦中可以保留，但其机制尚不清楚。本研究利用天然和再合成的AB基因组接近相同、D基因组不同(TAA10和XX329)的六倍体小麦进行分析。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

TAA10和XX329在发育早期存在显著的粒度和重量差异，这主要是由于XX329的果皮和胚乳细胞的生长速度高于TAA10。通过比较转录组分析发现，TAA10和XX329授粉后6 d籽粒间的69,711个ungenes中有8891个(12.75%)表达差异，其中XX329中有5314个基因表达上调，3577个基因表达下调。MapMan功能注释和富集分析显示，差异表达基因在细胞壁、碳水化合物和激素代谢等类别中显著富集。值得注意的是，再合成的六倍体小麦6-DAP籽粒葡萄糖和果糖含量明显高于天然六倍体小麦，这与再合成的六倍体小麦蔗糖合酶基因相对于天然六倍体小麦的上调是一致的。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

这些数据表明，D基因组的遗传变异诱导自然和再合成的allohexaploid小麦籽粒中基因表达的激烈变化，这可能有助于观察到的晶粒尺寸和重量的差异。GydF4y2Ba

小麦是当今世界生产、消费和贸易的主要粮食作物。为了满足不断增长的人口需求，我们需要具有更高产量潜力的小麦品种[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba］.小麦的籽粒产量主要是由每米粒数决定的GydF4y2Ba^2GydF4y2Ba和粒重。现代育种大大提高了小麦的产量，每米产量增加了GydF4y2Ba^2GydF4y2Ba由于矮化基因的利用(GydF4y2BaRhtGydF4y2Ba）在20世纪60年代和1970年代[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba］.1800个品种的千粒重(TGW)由20世纪40年代的平均31.5 g增加到21世纪初的44.64 g，每10年平均增加2.19 g，表明TGW是提高小麦产量潜力的重要指标[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba］.在过去的二十年中，成功地应用定量遗传方法已经促进了所有21个小麦染色体上的QTL的许多QTL [GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba］.最近，通过使用基于同源性的方法分离出与小麦粒度和重量相关的几个基因，例如GydF4y2Batacwi.GydF4y2Ba那GydF4y2BaTaGW2GydF4y2Ba那GydF4y2BaTatgw6.GydF4y2Ba那GydF4y2Batags1a.GydF4y2Ba那GydF4y2BaTaGASR7-A1GydF4y2Ba和GydF4y2Batacyp78a3.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba14.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba，增强了我们对小麦粒度和重量测定的知识。GydF4y2Ba

粒的发展是在小麦的生命周期的一个重要和复杂的过程，并直接影响粒重，其可被分成五个主要阶段：施肥，“多核的”胚乳，细胞化和早期灌浆，最大灌浆和干燥[GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba］.在基因表达水平上，生长研究表明，转录本/蛋白质丰度的巨大变化与小麦籽粒发育的不同阶段有关。例如，利用一种新型高通量mRNA原位杂交技术揭示了小麦颖果发育过程中独特的空间基因表达模式[GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba］.通过细胞类型特异性表达分析，发现了不同的共表达簇，反映了小麦胚乳发育的时空进程[GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba］.尽管这些研究提供了一些对籽粒生长和发育重要的候选基因，但参与决定籽粒重量和大小的分子机制仍然知之甚少。GydF4y2Ba

常见的小麦是一种天然的Allohexaploid，具有贡献的B和D基因组GydF4y2Ba小麦属植物urartuGydF4y2Ba，亲密的相对GydF4y2Ba山羊草属speltoidesGydF4y2Ba和GydF4y2Ba山羊草属tauschiiGydF4y2Ba（GydF4y2Basyn Ae。squarrosa, Tritcum tauschiiGydF4y2Ba),分别GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba］.然而，只有少数GydF4y2Ba山羊草属tauschiiGydF4y2Ba其种内谱系促进了普通小麦的进化，这导致了在六倍体面包小麦中代表的有限的d -基因组变异[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba］.因此，为了增加面包小麦的d -基因组多样性，GydF4y2Ba山羊草属tauschiiGydF4y2Ba已经习惯了经济上的重要性基因渗入各种性状导入小麦[GydF4y2Ba21.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba23.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba］.具体而言，在晶粒尺寸和形状差异很大之间观察到GydF4y2BaAe。Tauschii.GydF4y2Baaccessions保留在合成的allohexaploid小麦线中[GydF4y2Ba25.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba26.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba27.GydF4y2Ba］.此外，已经进行了几项研究，以识别普通小麦二倍体D供体的谷物重量的有益QTL [GydF4y2Ba28.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba29.GydF4y2Ba］.例如一个主要的QTLGydF4y2BaQGw.caas-3DGydF4y2Ba控制更高粒重鉴定上人工合成小麦的染色体3D AM3 [GydF4y2Ba29.GydF4y2Ba］.1964年，从四倍体面包小麦(TAA10)中提取了含有AABB成分的异源四倍体小麦(ETW)。然后，通过ETW与小麦杂交，获得了一个重合成的六倍体小麦(XX329)GydF4y2BaAe。tauschii无性系种群。窒息GydF4y2Ba(TQ18)。有趣的是，再合成的六倍体小麦(XX329)的粒级和重量远高于TAA10 [GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba］.由于XX329的AABB基因组应该与供体TAA10非常相似，所以观察到的这两种基因型在粒度和重量上的差异可能主要是由于D基因组的差异造成的，但其分子基础尚不清楚。GydF4y2Ba

小麦颖果是一个复杂的组织，其中母质和胚乳组织遵循不同但协调的发育程序[GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba］.期间晶粒生长的初始阶段，母体组织（晶粒的果皮）经受一个显着的膨胀，因为它们是晶粒的此时的主要成分。从而，晶粒尺寸和重量测定通过果皮生长驱动[GydF4y2Ba31GydF4y2Ba］.为了分析天然和再合成的六倍体小麦(TAA10和XX329)粒级和粒重变化的分子基础，研究了这两个基因型的动态粒级和粒重，并选择6 DAP的粒级进行比较转录组分析。结果表明，TAA10与XX329的果皮膨大程度不同是导致其粒度变化的主要原因。值得注意的是，参与碳水化合物和细胞壁代谢的差异表达基因的富集可能在TAA10和XX329在粒级和重量方面的差异中发挥重要作用。GydF4y2Ba

植物材料GydF4y2Ba

天然小麦异源六倍体TAA10和异源六倍体再合成小麦XX329在三个生物学重复生长（5行/复制）在上庄，北京（E116°，N40°）在2015年谷物的秋良好地分散于该分别为1.5 m行长和0.3米外与在每行20粒一播种率。GydF4y2Ba

谷物重量和体积测量GydF4y2Ba

在授粉后的2,4,6,8,10,15,20,25,30和35天内收集TaA10和XX329的显影晶粒（DAP），三个生物重复。在每次发育阶段的每次复制中，将五个尖峰进行取样，并且每个尖峰的八个中央小穗的谷物用于测量谷物鲜重，干重和体积。在105℃下干燥15分钟和65℃的烘箱后，记录晶粒的干重。使用“水位移”原理测定谷粒体积，在将晶粒放入测量管后，测量为95％醇的体积变化。GydF4y2Ba

细胞学观察和测量GydF4y2Ba

在细胞学观察方面，取TAA10和XX329在2、4、6、8、10和15 DAP的颗粒，共3个生物学重复。每个复制包含一个穗的八个中心小穗中的粒。来自不同样品的谷物被固定在50% (GydF4y2BaV.GydF4y2Ba/ v）乙醇，5％（v / v）乙酸和3.7％（GydF4y2BaW.GydF4y2Ba/GydF4y2BaV.GydF4y2Ba)， 4°C, 12 h后脱水，石蜡包埋。用徕卡超切旋转切片机切割颗粒中部3 μm的横切面，并用周期性席夫酸(PAS)染色。照片由Pannoramic MIDI (3DHISTECH, Ltd.，匈牙利)拍摄。GydF4y2Ba

用于每个发育阶段（2,4,6,8,10和15个DAP的三个晶粒的横截面测量细胞区域。在每个横截面上，通过从表皮向内选择三个区域的三个区域来测量Pericarp的细胞面积，并且使用胚乳的三个随机选定的区域测量胚乳的细胞面积。在每个测量的区域中，用Caseviewer 2.0（3dhistech，Ltdary）测量20至40个细胞。GydF4y2Ba

糖度分析GydF4y2Ba

取TAA10和XX329的3个生物重复的6 DAP谷粒，立即在液氮中冷冻，在−80℃下保存。每个重复3个穗，每个穗中央8个小穗上的粒体取样。在每个样品中使用10粒糖进行分析，这些糖被称量并准备测量。提取谷物样品中的可溶性糖并溶于水，使用R-Biopharm(德国达姆施塔特)的试剂盒，根据手册(GydF4y2Bahttps://food.r-biopharm.com/wp-content/uploads/sites/2/2014/04/Roche_IFU_Sucrose-Glucose-fructose_EN_10716260035_2014-01.pdfGydF4y2Ba）.使用Student’s对TAA10与XX329的糖含量差异进行统计分析GydF4y2BaT.GydF4y2Ba以及。GydF4y2Ba

RNA提取和转录组测序GydF4y2Ba

总RNA从晶粒在6使用TRIzol试剂（Invitrogen）3次生物学重复DAP TAA10和XX329的提取，根据手册。RNA浓度使用NanoDrop 2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific公司，Inc.，美国）测定和RNA完整性使用Agilent 2100生物分析仪（安捷伦科技公司，USA）进行评估。非绞合配对末端测序文库与400碱基对的平均插入片段大小与TruSeq RNA样品制备试剂盒V2（Illumina公司，USA）中制备和基于制造商的说明书，使用HiSeq 2000（Illumina公司，USA）测序。从Illumina测序获得的原始数据进行处理，并使用Illumina管道（过滤GydF4y2Bahttp://www.illumina.comGydF4y2Ba)来生成FastQ文件。低质量读取使用以下参数进行过滤:去除包含适配器序列、超过3%的模糊碱基(记为N)和50%的低质量碱基(Phred质量评分Q < 30)的读取。最后，从每个库生成大约6 Gb高质量的125-bp对端读取。用于这项研究的RNA-Seq reads保存在美国国家生物技术信息中心短读档案(GydF4y2Bahttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/GydF4y2Ba）在加入号码SRP117710下。GydF4y2Ba

RNA测序的对准读取和表达分析GydF4y2Ba

每个库的高质量配对终端RNA-SEQ读数与小麦参考基因组（TGACV1版本）对齐（GydF4y2Bahttp://plants.ensembl.org/Triticum_aestivum/GydF4y2Ba）[GydF4y2Ba32GydF4y2Ba]使用与Hisat2参数“--phred33 --max-intronlen 7000 -k 10 -t -p 4 --no-UNAL - 忽略quals --rdg 3,1 --rfg 3,1- --score分钟L，0，-0.19” ，和比对以不超过一个错配被保留[GydF4y2Ba33GydF4y2Ba］.然后，通过自定义筛选乘法映射读取GydF4y2BaPerl.GydF4y2Ba由HTSeq-count统计的小麦内参基因的唯一图谱[GydF4y2Ba34GydF4y2Ba］.的唯一映射读取计数在以下FPKM使用（每千碱基的片段映射每百万次读取）其通过修边器包中的R软件来执行计算和差异表达分析[GydF4y2Ba35GydF4y2Ba］.小麦参考基因具有超过2倍的变化和虚假发现率（FDR，Benjamini和Hochberg的方法） - 调整GydF4y2BaP.GydF4y2Ba-Value小于0.05被认为是差异表达的基因。GydF4y2Ba

MapMan分析GydF4y2Ba

使用Mapman Mercator工具注释小麦转录物（GydF4y2Bahttp://mapman.gabipd.orgGydF4y2Ba/ web /客户/墨卡托)。差异表达基因的功能分类分析采用MapMan 3.6.0版本进行[GydF4y2Ba36GydF4y2Ba］.显着超越的MAPMAN功能类别由Fisher的确切测试确定（GydF4y2BaP.GydF4y2Ba- 与整个基因组背景相比，value <0.05）和富集折叠≥1.5。GydF4y2Ba

定量逆转录PCR（QRT-PCR）分析GydF4y2Ba

根据制造商的说明，使用HiScript Q RT SuperMix进行qPCR (Vazyme Biotech, Ltd, China)，从每个样品中提取总RNA (2 μg)生成互补DNA (cDNA)模板。采用SYBR Green PCR Master Mix (Vazyme Biotech, Ltd, China)在CFX96 Real-Time PCR检测系统(Bio-Rad Laboratories, Inc, USA)上进行QRT-PCR。PCR条件为:95℃3 min, 95℃15 s, 60℃15 s, 72℃30 s，共40个循环。用于qRT-PCR分析的特异性引物对如表S6所示。每个样品独立进行3个重复的PCR分析，采用相对定量法进行基因表达定量(2GydF4y2Ba^{-ΔΔctGydF4y2Ba}方法）GydF4y2BaβGydF4y2Ba-肌动蛋白作为内源性控制[GydF4y2Ba37GydF4y2Ba］.GydF4y2Ba

天然和再合成六倍体小麦籽粒发育动态比较GydF4y2Ba

为了探究天然和再合成六倍体小麦(TAA10和XX329)籽粒大小和重量变化的内在机制，我们在2、4、6、8、10、15、20和35 DAP测定了这两个基因型的粒积。各基因型籽粒体积在发育初期迅速增加，在10 DAP左右达到最大值，这与前人研究一致[GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba］.当比较这两种基因型，XX329的晶粒体积为从4 DAP比TAA10的显著更高并且在10 DAP获取的最大差。在此之后，XX329的优势一直保持到所有谷物成熟（图GydF4y2Ba1 bGydF4y2Ba）.接下来，我们测量了TAA10和XX329在不同发育阶段的鲜粒和干粒重。TAA10和XX329的鲜粒重从2个DAP开始连续增加，在25个DAP左右达到最大，之后一直下降到籽粒成熟(图2)。GydF4y2Ba1 cGydF4y2Ba）.与鲜粒重不同的是，各基因型的干粒重持续增加，直到籽粒在35 DAP左右成熟。GydF4y2Ba1 dGydF4y2Ba）.值得注意的是，XX329在晶粒发育的每个阶段显示出比TAA10显着更高的新鲜和干燥的粒度，并且当XX329和TAA10之间的干粮重量之间的差异在成熟的所有晶粒时达到约35个Dap的最大值（图。GydF4y2Ba1C-dGydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

母体晶粒组织的发展是由调节的细胞膨胀和胚乳生长的协调介导的[GydF4y2Ba38GydF4y2Ba］.因此，我们决定通过细胞学观察测定和比较TAA10和XX329在籽粒发育早期(2、4、6、8、10和15 DAP)的果皮和胚乳的细胞大小。果皮细胞面积在2 ~ 15 DAP时增加了2倍，且2 ~ 8 DAP果皮细胞生长速度快于8 ~ 15 DAP。在籽粒发育早期，XX329的果皮细胞比TAA10的生长速度快，细胞面积大(图3)。GydF4y2Ba2 i pGydF4y2Ba;无花果。GydF4y2Ba3GydF4y2Ba）.胚乳细胞的生长与果皮细胞的生长同步。各基因型胚乳细胞大小从6个DAP增加到15个DAP，增加3 ~ 4倍。在8 ~ 15 DAP, XX329的胚乳细胞面积明显大于TAA10。GydF4y2Ba2Q-V.GydF4y2Ba;无花果。GydF4y2Ba3 bGydF4y2Ba）.值得注意的是，我们发现胚乳的细胞化已经完成，淀粉颗粒最初在胚乳细胞中大量形成。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba）.综上所述，选取6 DAP的谷粒进行进一步的转录组比较分析。GydF4y2Ba

天然和再合成的六倍体小麦6-DAP粒的转录组比较GydF4y2Ba

为了分析天然小麦和重合成小麦粒级差异的潜在分子基础，我们对TAA10和XX329的6-DAP粒级进行了RNA测序，共3个生物重复。去除低质量测序reads后，共生成约1.622亿个125 bp的配对端reads，平均每个文库过滤了2700万个reads。约65.4% ~ 74.5%的优质reads被特异定位到小麦参考基因组序列。TAA10和XX329在四倍体小麦A、B、D基因组上的特异定位reads的比例为21.5 ~ 23.7%，表明TAA10和XX329在三个亚基因组中分布均匀(图2)。GydF4y2Ba4GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

为了鉴定天然allohexpaploid TaA10的6-dap晶粒之间的差异表达基因，并使用每种库的唯一映射读取进行表达分析。不同生物复制的相关系数范围为0.972至0.986（附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:图S1)。两种基因型中TGACv1内参基因共表达69,711个(FPKM≥0.5,Reads Counts≥10)，TAA10和XX329的内参基因数量分别为69162和69195。在69,711个基因中，TAA10与XX329 (fold change≥2 and false discovery rate (FDR) adjusted)差异表达基因8891个(12.75%)GydF4y2BaP.GydF4y2Ba< 0.05)(附加文件GydF4y2Ba2GydF4y2Ba：表S1）。与TAA10相比，XX329（5314）中上调基因的数量远高于下调基因（3577）（图。GydF4y2Ba4 bGydF4y2Ba）.为验证RNA-Seq结果，随机选取9个差异表达基因进行qRT-PCR。如图所示。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba，通过QRT-PCR确定的基因表达的折叠变化与RNA-SEQ测定的归一化表达水平（FPKM）的变化一致。这些基因的详细信息显示在附加文件中GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba:表S6。GydF4y2Ba

根据小麦基因组注释（版本TGACv1，GydF4y2Bahttp://plants.ensembl.org/Triticum_aestivum/GydF4y2Ba)、8526个(95.89%)差异表达基因被分配到染色体上，A、B和D基因组上的差异表达基因分别为2287个、2090个和4149个(图3)。GydF4y2Ba4 bGydF4y2Ba）.值得注意的是，在D基因组的每种染色体上相对于TaA10的XX329中的下调基因的数量高于A和B基因组的每种染色体上的TaA10。另外，我们发现富含染色体1dL的下调基因，而上调基因在染色体1AL上持续持续（图。GydF4y2Ba4 c - dGydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

差异表达基因的功能注释和分类GydF4y2Ba

进行了分析MapMan分析差异表达的基因的功能注释和分类。总共TAA10和XX329之间的8891 7039差异表达的基因可以被分配给MapMan类，其中的2022是“未分配”，以功能性类别。基因的数目被分配给功能类别“RNA”最高（842），其次是“蛋白质”（815），“杂项”。（811）和“信令”（397）（表GydF4y2Ba1GydF4y2Ba;附加文件GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba:表S2)。此外，对差异表达基因的功能富集分析显示，6个主要功能类别显著超标，包括“misc”。“细胞壁”、“次级代谢”、“主要CHO(碳水化合物)代谢”、“激素代谢”和“糖异生/乙醛酸循环”GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.此外，我们还进一步研究了每个过度代表的类别中丰富的功能子类别。结果表明，“杂项”中丰富的次级功能类的数量较多。“细胞壁”、“次级代谢”、“主要CHO(碳水化合物)代谢”、“激素代谢”和“糖异生/乙醛酸循环”分别为10、4、4、2、2和1(附加文件)GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba:表S3)。虽然这些差异表达基因的确切作用尚不清楚，但基因的改变可能是导致TAA10和XX329之间所观察到的粒度变化的原因。GydF4y2Ba

碳水化合物代谢是指碳水化合物形成、分解和相互转化的各种生化过程。在小麦发育过程中，蔗糖代谢为细胞壁和淀粉的生物合成提供物质和能量来源。我们的MapMan分析显示，参与蔗糖降解的差异表达基因显著富集，包括蔗糖合酶(SUS)和转化酶基因。10个差异表达的蔗糖合酶基因中有8个在XX329中相对于TAA10表达上调。在编码细胞壁(13个)、液泡(15个)和中性(1个)转化酶的29个差异表达基因中，XX329相对于TAA10的上调基因数分别为7、7和0GydF4y2Ba2GydF4y2Ba;无花果。GydF4y2Ba6GydF4y2Ba）.与TAA10相比，XX329积累的蔗糖、d -葡萄糖和d -果糖含量显著增加(图2)。GydF4y2Ba6汉英GydF4y2Ba）.此外，我们的MAPMAN分析显示，在淀粉生物合成途径中富含21种差异表达基因，其编码了四个关键酶，即淀粉分支酶（SBE），ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（AGP酶），淀粉合酶和淀粉脱枝酶（DBE）。与TAA10相比，编码包括异戊酰酶1（1）和异戊聚糖酶2（1）的差异表达基因，包括异戊聚糖酶1（1）和异戊聚糖酶2（1）显着上调。10个差异表达GydF4y2Basbe.GydF4y2Ba基因,9GydF4y2BaSBE2GydF4y2Ba基因上调，而另一个GydF4y2BaSBE1GydF4y2Ba基因相对于TaA10在XX329中抑制基因。三个差异表达的三个GydF4y2Ba党卫军GydF4y2Ba与TAA10相比，XX329基因表达上调(表)GydF4y2Ba2GydF4y2Ba;无花果。GydF4y2Ba6 bGydF4y2Ba）.为了进一步验证RNA-SEQ结果的准确性，对参与碳水化合物代谢的5种随机选择的不同表达基因进行QRT-PCR，其中4个基因的表达变化与RNA-SEQ结果一致（附加文件GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba:图S2)。GydF4y2Ba

早期发展期间的谷物生长涉及细胞膨胀的细胞膨胀需要大量的细胞壁生物合成。有趣的是，我们发现201型差异表达的基因富集在主要功能类别“细胞壁”中，其中4个功能性亚类别表现出显着的超重，包括“纤维素合成”，“降解”，“改性”和“细胞壁蛋白”（附加文件GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba:表S3)。在纤维素合成亚类中，有26个差异表达基因显著超标，主要包括GydF4y2Ba纤维素酶GydF4y2Ba和GydF4y2Ba眼镜蛇GydF4y2Ba其中，XX329中编码纤维素合成酶和COBRA的基因相对于TAA10的上调基因分别为5和6个。此外，我们还鉴定了57个与细胞壁降解相关的差异表达基因，包括22个上调基因和35个下调基因，如纤维素酶和果胶酶基因。值得注意的是，在与细胞壁修饰相关的expansin(26)和Xyloglucan transglucosylase/hydrolase (XTH)(31)的差异表达基因中，XX329相对于TAA10的上调基因分别为16和18个。此外，在功能亚类“细胞壁蛋白”中富集的24个差异表达基因中，编码阿拉伯半乳糖蛋白(AGP)的5个基因在XX329中均较TAA10上调，而编码亮氨酸富重复序列(Leucine-rich repeat, LRR)家族蛋白的15个基因中只有7个基因上调(Additional file)GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba:表S4)。GydF4y2Ba

通过MapMan分析，我们发现226个差异表达基因在“激素代谢”的主要功能类别中富集，包括生长素、脱落酸、乙烯和赤霉素代谢(Additional file)GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba:表S3) . .在10个与生长素代谢相关的差异表达基因中，XX329中有8个调控生长素内环境稳定的iaa -亮氨酸抵抗(ILR)蛋白基因的表达水平高于TAA10。此外，7个参与脱落酸信号转导的基因，如GydF4y2BaABI3GydF4y2Ba和GydF4y2BaFUS3GydF4y2Ba，与TAA10相比，XX329也显著上调。值得注意的是，我们发现了大量与乙烯代谢相关的差异表达基因(108个)，它们参与了乙烯的生物合成、降解和信号转导。此外，9个参与赤霉素生物合成的GA20ox基因表达发生显著改变，其中XX329相对于TAA10有6个表达上调，3个表达下调(Additional file)GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba：表S5）。GydF4y2Ba

四倍体小麦D基因组的遗传变异引起基因表达的剧烈变化GydF4y2Ba

山羊草属tauschiiGydF4y2Ba的d -基因组祖先GydF4y2Ba小麦GydF4y2Ba，包括具有潜在经济重要性的各种性状的广泛变异，包括产量、生物和非生物抗逆性、品质和营养[GydF4y2Ba21.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba23.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba39GydF4y2Ba那GydF4y2Ba40GydF4y2Ba］.到目前为止，大多数研究都致力于了解遗传和形态多样性GydF4y2BaAe。Tauschii.GydF4y2Ba种质及其在六倍体遗传背景下的功能，但其对基因表达的影响尚不清楚[GydF4y2Ba41GydF4y2Ba那GydF4y2Ba42GydF4y2Ba那GydF4y2Ba43GydF4y2Ba］.具有几乎相同A和B基因组的天然和再合成的六倍体小麦可以为研究不同D基因组在异源多倍体小麦形成和进化过程中对基因表达的影响提供一个很好的例子[GydF4y2Ba44GydF4y2Ba］.最近，据报道，D基因组的祖细胞的遗传变异（GydF4y2BaAe。Tauschii.GydF4y2Ba)不会导致重新合成的六倍体小麦叶片的基因表达发生显著变化，通过直接比较天然和重新合成的六倍体小麦观察到类似的特征[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba］.在本研究中，我们发现AB基因组接近相同的天然和再合成的六倍体小麦6-DAP粒间有8891个基因的差异表达，远远高于以往研究中叶片的差异表达[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba]，这表明d基因组的遗传变异诱导的基因表达的急剧改变异源六倍体中的小麦谷粒。有趣的是，对相对于天然异源六倍体小麦（2041）再合成的d基因组下调的基因的数目上超过了A和B基因组（675和713）高得多，这可能是由于对d基因组的修饰期间和异源多倍体之后发生的基因组冲击[GydF4y2Ba45GydF4y2Ba］.它应该要注意的是的上调基因上以相对于异源六倍体天然小麦（2989）再合成的AB基因组的数目是大于的下调的基因（1388）显著更高，这表明的d基因组GydF4y2Ba山羊草属tauschiiGydF4y2Ba主要有助于通过重新合成的allohexaploid小麦的基因组相互作用对AB基因组的基因表达的积极作用。GydF4y2Ba

累积的数据显示，通过在Allopolyploid小麦中的其他其他基因的激活来补偿一种同源基因的抑制[GydF4y2Ba44GydF4y2Ba那GydF4y2Ba46GydF4y2Ba那GydF4y2Ba47GydF4y2Ba］.例如，在面包小麦中叶基因表达的最近研究鉴定了许多基因组优势的区域（来自一个基因组的同源种子的转录物比其他基因组更丰富），并且基因组抑制的许多区域（来自一个基因组的同源性的转录物较小比其他人丰富）[GydF4y2Ba47GydF4y2Ba］.有趣的是，我们发现在染色体1DL基因组区域相对于异源六倍体自然人工合成小麦富含下调基因。相反，在异源六倍体再合成小麦上调的基因被过表达染色体1AL的相应的同源区域。总之，这些数据提供了在异源六倍体人工合成小麦特定的基因组区域，这可能在部分同源基因组分歧中发挥重要作用，并有助于基因组不对称优势/基因表达的抑制了进一步的证据。但是，此功能没有在染色体1BL，这是需要进一步研究观察。GydF4y2Ba

在再合成的六倍体小麦中，蔗糖代谢的改变是形成大粒的关键GydF4y2Ba

谷物发展高度依赖于蔗糖的代谢利用，这可以为细胞壁多糖和淀粉的合成提供碳[GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba48GydF4y2Ba］.在本研究中，我们发现26个蔗糖降解相关基因在合成的六倍体小麦6-DAP粒中的表达量显著高于天然六倍体小麦。蔗糖合酶被广泛认为是植物中碳从蔗糖进入细胞代谢的主要途径，它催化蔗糖生成udp -葡萄糖和果糖[GydF4y2Ba49GydF4y2Ba］.在小麦中，遗传研究显示出蔗糖合酶1和2倍的基因（GydF4y2BaTaSus1和TaSus2GydF4y2Ba）与TGW相关[GydF4y2Ba50GydF4y2Ba］.有趣的是，编码蔗糖合酶8 10（80％）基因在相对于异源六倍体自然小麦再合成的上调。在另一方面，蔗糖也是在调节多种细胞类型的基因表达和正常晶粒发展[信号分子GydF4y2Ba51GydF4y2Ba那GydF4y2Ba52GydF4y2Ba］.一般来说，蔗糖有利于细胞的分化和成熟，而己糖则有利于细胞的分裂和扩张[GydF4y2Ba53GydF4y2Ba那GydF4y2Ba54GydF4y2Ba］.结果表明，6 DAP时，再合成的小麦籽粒葡萄糖和果糖含量均高于天然小麦。综上所述，与天然六倍体小麦相比，重合成六倍体小麦蔗糖合酶基因的上调能够加速细胞的生长过程，这在粒级和重量的差异中发挥了重要作用。GydF4y2Ba

细胞扩增的速率促成了变化粒度重新合成和天然小麦异源六倍体之间GydF4y2Ba

颗粒形态发生依赖于细胞分裂和膨胀的调节[GydF4y2Ba55GydF4y2Ba］.2个DAP在果皮内几乎完成细胞增殖。后来，子粒器官在母体果皮内迅速生长和扩张。因此，胚乳的生长必须与母体果皮的发育协调，共同影响籽粒的发育[GydF4y2Ba38GydF4y2Ba］.在本研究中，我们发现天然和再合成的六倍体小麦的粒体体积在10 DAP左右达到最大值，而再合成的六倍体小麦的粒体尺寸显著大于天然的六倍体小麦。根据颗粒大小的差异，在籽粒发育早期，再合成的四倍体小麦的果皮和胚乳的细胞面积和生长速率均高于天然四倍体小麦。因此，观察到的天然和再合成的六倍体小麦的粒度变化可以追溯到子代组织生长速度的不同。GydF4y2Ba

细胞生长需要细胞壁通过壁松动过程不可逆地拉伸，然后沉积新的壁材料[GydF4y2Ba56GydF4y2Ba］.本研究的一个重要观察是，天然小麦和再合成小麦的差异表达基因在细胞壁代谢中显著富集，这与天然和再合成的六倍体小麦在早期粒膨化关键期(6 DAP)的粒级差异有很好的相关性。例如，膨胀蛋白是唯一通过破坏纤维素微纤维和交联聚糖之间的氢键并允许膨胀驱动细胞壁扩张而直接诱导细胞壁扩张的蛋白质[GydF4y2Ba57GydF4y2Ba那GydF4y2Ba58GydF4y2Ba］.在小麦中，扩展蛋白被直接显示出诱导细胞壁延伸，并且扩展蛋白的基因的表达在与粒度相关联GydF4y2Ba59GydF4y2Ba］.有趣的是，26个差异表达的膨化蛋白基因中有16个(61.5%)相对于天然的六倍体小麦在重新合成中表达上调GydF4y2Ba．GydF4y2Ba这一的基因GydF4y2Ba眼镜蛇GydF4y2Ba家族参与各种类型的细胞扩张和细胞壁生物合成[GydF4y2Ba60GydF4y2Ba］.在8个差异表达的cobra样基因中，有6个(75%)在合成过程中相对于天然小麦上调表达。在植物细胞扩张过程中，纤维素-木葡聚糖网络被认为是控制细胞扩张程度的主要承重网络[GydF4y2Ba61GydF4y2Ba］.GydF4y2BaXTHGydF4y2Ba基因是重要的壁松动的基因，其功能在壁重塑是切割木葡聚糖掺入木葡聚糖和纤维素[之间的新分子和催化联动GydF4y2Ba62GydF4y2Ba那GydF4y2Ba63GydF4y2Ba］.我们发现，在相对于天然allohexaploid小麦的重组中，编码Xth蛋白的31个（58.1％）基因中的18个（58.1％）基因。但是，与表达式模式不同GydF4y2BaXTHGydF4y2Ba在相对于异源六倍体自然小麦再合成的基因，大部分的差异表达的纤维素合酶基因（7/12，58.3％）为下调。综上所述，我们建议这些差异表达的基因可能有助于重新合成和天然小麦异源六倍体之间的粒径的偏差和重量。GydF4y2Ba

差异表达基因与先前已知的QTL和控制小麦粒度和重量的候选基因的比较GydF4y2Ba

最近，我们使用F分别识别出与染色体2DS，2DL和7DS的晶粒尺寸和形状相关的三个QTL区域，使用F.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba和FGydF4y2Ba_{2：3GydF4y2Ba}源自天然Allohexpaploid麦田Ta10和重新合成的allohexaploid小麦XX329 [GydF4y2Ba64GydF4y2Ba］.本研究对TAA10和XX329在6-DAP粒上的转录组进行了比较分析，为发现表型变异的候选基因提供了有用的信息[GydF4y2Ba65GydF4y2Ba］.比较分析显示，位于染色体2DS，2DL和7DS上的QTL区域内的差异表达基因的数量分别为43,78和48（附加文件GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba:表S7)。值得注意的是,一个差异GydF4y2BaSBE2GydF4y2Ba基因（GydF4y2BaTRIAE_CS42_2DL_TGACv1_158200_AA0512220GydF4y2Ba)的QTL定位在2DL染色体上。此外，还有一项上调GydF4y2BaGATLGydF4y2Ba（GydF4y2Ba半乳糖糖基转移酶样式GydF4y2Ba)基因(GydF4y2BaTRIAE_CS42_7DS_TGACv1_ 622210 _aa2035360GydF4y2Ba）在相对染色体7DL的QTL区域内再合成的天然小麦异源六倍体参与细胞壁生物合成[GydF4y2Ba66GydF4y2Ba］.综上所述，这些基因可能是已检测到的控制颗粒大小和形状的QTL的候选基因，因此有必要对QTL与本研究鉴定的差异表达基因的关系进行详细的研究。GydF4y2Ba

迄今为止，通过基于同源的方法成功地分离了控制晶粒尺寸和重量的一些小麦基因，包括GydF4y2BaTaCwi-A1GydF4y2Ba那GydF4y2BaTaGW2GydF4y2Ba那GydF4y2BaTatgw6.GydF4y2Ba那GydF4y2Batags1a.GydF4y2Ba那GydF4y2BaTaGASR7-A1GydF4y2Ba那GydF4y2Batacyp78a3.GydF4y2Ba那GydF4y2Batacwi.GydF4y2Ba那GydF4y2BaTaCKX6-D1GydF4y2Ba和GydF4y2BaTasaP1-A1GydF4y2Ba[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba14.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba67GydF4y2Ba那GydF4y2Ba68GydF4y2Ba那GydF4y2Ba69GydF4y2Ba］.然而，这些基因在天然六倍体TAA10和再合成的六倍体小麦XX329的6-DAP粒间均无差异表达(Additional file)GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba:表S7)。此外，尽管在1AL染色体上有大量的上调基因(362个)相对于天然的六倍体小麦被重新合成，但据我们所知，在1AL染色体富集差异表达基因的基因组区域，尚没有已知的控制粒级和重量的QTL与之匹配，值得进一步研究。GydF4y2Ba

在天然和再合成的Allohexaploid小麦（TaA10和XX329）之间观察到显影早期阶段的晶粒尺寸和重量的显着差异，其主要归因于与TAA10相比XX329中Pericarp和胚乳细胞的较高生长速率。对比转录组分析表明，差异表达的基因在细胞壁，碳水化合物和激素代谢的功能类别中显着富集，这可能在TaA10和XX329之间的观察到差异方面在晶粒尺寸和重量之间发挥重要作用。值得注意的是，与相对于天然allohexaploid小麦重组的蔗糖合成酶基因的上调一致，再混合的allohexaploid小麦的颗粒在6 dap的谷物中显示出更高的葡萄糖和果糖，而不是天然的allohexpaploid小麦，表明蔗糖代谢的改变在重新合成的allohexaploid小麦中形成大颗粒是必不可少的。GydF4y2Ba

AGPase：GydF4y2Ba

ADP-葡萄糖焦磷酸化酶GydF4y2Ba

DAP：GydF4y2Ba

几天后授粉GydF4y2Ba

DBE:GydF4y2Ba

淀粉脱支酶GydF4y2Ba

FDR：GydF4y2Ba

错误发现率GydF4y2Ba

FPKM：GydF4y2Ba

每千千岁的碎片百万读GydF4y2Ba

劳工关系:GydF4y2Ba

IAA-leucine-resistantGydF4y2Ba

聚合酶链反应:GydF4y2Ba

聚合酶链反应GydF4y2Ba

存在:GydF4y2Ba

定量逆转录PCRGydF4y2Ba

SBE：GydF4y2Ba

淀粉分支酶GydF4y2Ba

SS:GydF4y2Ba

淀粉合成酶GydF4y2Ba

苏：GydF4y2Ba

蔗糖合酶GydF4y2Ba

TGW：GydF4y2Ba

千粒重GydF4y2Ba

XTH:GydF4y2Ba

Xyloglucan transglucosylase /水解酶GydF4y2Ba

我们感谢宝柳（东北师范大学，长春130024，中国）提供了Taa10和XX329的种子。GydF4y2Ba

资金GydF4y2Ba

基金资助:国家重点研发计划(No. 2016YFD0100801);国家自然科学基金重大项目(No. 31290212);基金资助:国家自然科学基金资助项目(No. 91435204)和国家自然科学基金资助项目(No. 31601305)。GydF4y2Ba

可用性数据和材料GydF4y2Ba

稿件中可以使用所有相关数据。用于这项研究的RNA-Seq reads保存在美国国家生物技术信息中心短读档案(GydF4y2Bahttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/GydF4y2Ba）在加入号码SRP117710下。GydF4y2Ba

作者指出GydF4y2Ba

从属关系GydF4y2Ba

1. 农业科学农业科学杂志与利用率的国家重点实验室，中国农业大学作物遗传改善重点实验室，北京100193GydF4y2Ba

   雷燕，惠文徐，张小平张，飞良，明明鑫，慧鲁鹏，迎阴瑶，齐鑫阳光和中福倪GydF4y2Ba

2. 陕西杨凌农学院农艺学院作物应力生物学作物应力生物学研究室，陕西省陕西，712100GydF4y2Ba

   Zhenshan刘GydF4y2Ba

3. 河北农作物遗传育种实验室河北农林科学院谷物粮油作物研究所，石家庄050035GydF4y2Ba

   Aiju赵GydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

ZN和QS构思了这个项目;LY、HX、XZ、AZ、FL进行了实验;ZL、MX、HP、YY分析数据;作者是LY和ZN。所有作者都已阅读并批准了最终稿。GydF4y2Ba

相应的作者GydF4y2Ba

对应到GydF4y2Ba中富倪GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

伦理批准和同意参与GydF4y2Ba

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