中国白梨富含羟脯氨酸糖蛋白超家族的独特进化模式(Pyrus Bretschneideri.）

背景

富含羟脯氨酸糖蛋白(HRGP)超家族，包括三个家族(阿拉伯半乳糖蛋白，agp;伸展蛋白,ext;富脯氨酸蛋白(proline-rich proteins, PRPs)是一类富含脯氨酸的蛋白质，在植物生物学的许多方面发挥着重要作用。

结果

在这项研究中，838HRGPs从中国白梨(Pyrus Bretschneideri.）通过搜索偏置氨基酸组成和保守基序。405.HRGPs全基因组复制(WGD)事件被认为是驱动HRGPs膨胀和由苹果和梨共享最近WGD事件生成最复制HRGPs在梨。这种重复事件掘进的结构性变化HRGPs编码羟脯氨酸（Hyp）富含基序。HRGPs进化率主要影响的羟脯氨酸丰富的图案即使在嵌合HRGPs。在53演进前提方案也有典型的7-脱氧loganetin葡萄糖基转移酶基因，从PRP来non-PRP通过正选择间接地被修改。这些结果表明，率HRGP进化主要体现在嵌合影响富含脯氨酸的图案，甚至HRGPs．表达分歧HRGPs高于其他通常重复的基因。在Pear Pistil，601HRGPs在梨花粉中，285HRGPs表达。qPCR的结果表明：Pbr036330.1和Pbr010506.1梨花雌蕊自交不亲和表现出不同的表达谱。

结论

该研究表明，WGD事件是HRGPs的进化过程中的主要的重复类型和高度可变的脯氨酸基序可能是扩大，进化和表达发散负责HRGPs这种差异可能是植物获得新功能的原因。

羟脯氨酸丰富糖蛋白(HRGPs)是一个超家族，包含三个亚家族:高度糖基化阿拉伯半乳糖蛋白(AGPs)，中度糖基化伸展蛋白(EXTs)和轻度糖基化脯氨酸丰富蛋白(PRPs) [1，2]，它们通常被脯氨酸4-羟化酶翻译后修饰，生成羟脯氨酸(Hyp)残基。HRGPs在植物界广泛表达，从藻类到开花植物，表明它们在植物生命中发挥着基础性作用[3.］．事实上，HRGPs被认为具有广泛的功能，从提供结构完整性和介导细胞-细胞相互作用到促进根、叶和生殖组织的细胞间通讯。由于梨是一种主要的经济作物，因此梨的生育力是一个关键问题，而HRGPs在梨生殖发育中的作用尤为重要。

agp的阿拉伯半乳糖链通常通过羟脯氨酸-半乳糖(hypl - gal)连接到半乳糖。最近的研究表明agp在许多组织中发挥着重要作用，如叶、根和花组织[4］．agp通常位于细胞表面，与营养和生殖生长有关[2，5］．T. Schindler报道，AGPS参与植物开发，例如木质区分[6］．AGP31 (At1g28290)通过与各种细胞壁成分相互作用参与细胞壁的形成[7］．AGP19 (At1g68725)参与细胞分裂和扩张[8］．花柱传递组织中表达的agp也有助于花粉在柱头上的粘附和花粉管沿着传递组织直接生长[9，10.］．AGPNa3蛋白（RT35蛋白）被定位在柱头，特别是在的雌蕊烟草alata(烟草)11.］．在风格中表达的120kDa糖蛋白（120 k）在S特定的花粉中发挥作用n alata然后被带入花粉管[12.］．agp富集，柱状管渗出物百合longittorum已被证明用作粘合剂基质，其增强花粉管生长体外[13.］．

ext包含几个重复的SP_n在他们的超级丰富的主题。大多数ext属于不溶性细胞壁蛋白，在根、花粉/雄蕊或角果中表达[14.］．ext几乎涉及植物生长发育的所有方面，包括花粉识别、受精[15.，防御反应[16.]和细胞分裂、分化和伸长[17.，18.，19.］．重复的SP_nPEX蛋白的图案可以参与物种，家庭或组织特异性识别Solanum lycopersicum.(番茄)20.］．Pex1表达玉米花粉与特定的伴侣相互作用并触发下游反应[21.］．在细胞内，AtLRX1直接参与细胞壁形成的过程拟南芥蒂利亚纳．SP的_n具有可变长度和数量的LRX蛋白质中的图案参与调节细胞壁中的信号传导过程[22.］．

蛋白质富含脯氨酸或Hyps不能被分为EXTS或AGPS，他们被定义为前提方案[23.］．prps大多在胚乳，射击顶点和叶柄中表达，而少数人以root表达[14.或与生殖有关。prp在大豆（SbPRP1，SbPRP2，SbPRP3）在各种细胞中表达并从细胞壁蛋白不同。ENOD2从隔离Pisum sativum.对于细胞形态重要，尤其是在结节实质[24.］．玉米中的HyPRP在授粉前在合子胚胎和子房中高度表达，被认为有助于发育胚胎的稳定性和防御[25.］．

配子体自交不亲和（SI）是一种普遍的机制来防止近亲繁殖和在开花植物促进异型杂交[26.］．属植物的SI蔷薇科，茄科和车前草科由S-RNase测定[27.］．花粉管在细胞外基质(ECM)中的生长引发花粉和雌蕊之间的一系列相互作用。例如，花柱ECM中的AGP成分直接与烟草中的花粉管相互作用[12.］．位于柱头中的AGPNa3蛋白(RT35蛋白)可能在雌蕊中起特殊作用[11.］．组织特异性糖蛋白(tissue-specific glycoprotein, NaTTS)在体外诱导花粉管和刺激花粉管的过程中起着重要作用。在转基因烟草植株中，NaTTS蛋白水平大幅降低，导致花粉管生长速率降低[28.，29.］．据报道，III类雌蕊特异性延伸素样(PELPIII)蛋白结合到亲和和不亲和花粉管中[12.，30.］．120k被带入花粉管，与花粉管液泡相关[29.，31.］．120k、PELPIII和TTS能够结合S-RNase，而SI只需要120k [12.，28.，29.］．然而，大多数HRGPs在梨SI中的作用尚不清楚。

本研究通过对梨生殖组织中HRGPs的系统发育关系、进化模式和表达模式进行研究。相对于HRGPs的生物信息学分析拟南芥和杨树trichocarpa(黑色三角叶杨)[32.，33.]，我们的数据表明，通过羟脯氨酸丰富的图案影响的演化模式和表达分歧和阐明中羟脯氨酸丰富图案的重要性HRGPs进化。最后，表达模式HRGPs以揭示其在SI中的功能作用。

梨中HRGP的鉴定和分类

为了收集所有HRGPs在pear中，利用了基于每个族特征的多种搜索方法。基于偏倚氨基酸组成和保守基序，共838种HRGPs包括522agp，201前提方案和115年ext(附加文件1：表S1）。但是，56HRGPs在筛选过程中被鉴定为重复序列。根据hyperrich motif的特征，将hrgp分为agp、EXTs和prp三大类。

百分比，排序顺序和脯氨酸（P），丙氨酸（A），丝氨酸（S）和苏氨酸（T）的量被认为是标准的，用于识别AGPS，并收集522个序列（表1)．通过详细识别序列性状，AGP系列分为五个亚属：Ag（阿拉伯半乳酰胺）肽，富含赖氨酸的AGPS，FLA（粘性IGP），EXT-AGPS和古典AGP。通过搜索偏置氨基酸（AA）组合物的偏置氨基酸（AA）组合物，含有至少10％的氨基酸（AA）的组合物，蛋白质长度小于或等于90AA，鉴定了126Ag肽序列。通过寻找偏置AA组合物，富含10％过去和赖氨酸的基序的偏置AA组合物来鉴定183毫升富含型的AGP。鉴定了含有超过10％过去的筋膜H1基序的7个FLAS蛋白。通过搜索[SP]来确定54 ext-AGPS_3,4,5.主题至少有10%的过去内容。通过搜索至少有30% PAST且没有交换结构域的偏置aa组合，识别出152个经典agp。比较各亚家族成员的大小，Lys-Rich AGPs > Classical AGPs > AG多肽> EXT-AGPs，其中只有1%的AGPs为FLAs。预测了信号肽(SPs)裂解位点和糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定位点。25%和9%的agp成员分别标注了SPs和GPI锚。每个子家族成员的原型结构显示在附加文件中2:图S1。

通过筛选超过2个SP的梨蛋白数据库，鉴定出115个EXTs基因_3., SP₄和/或SP₅图案。Ext家庭成员根据SP主题中的次级重复的数量分为三个亚属_3.ext, SP₄-EXT和SP.₅-EXT。SP的_3.的56名成员，其中19具有SP的切割位点和3具有GPI锚定位点-EXT亚科组成。SP的₄-EXT亚家族有33个成员，其中16个有SPs裂解位点，2个有GPI锚定位点。SP的₅-EXT亚家族有26个成员，其中16个有SPs裂解位点，没有一个有GPI锚定位点(见表)1)．EXT家族的典型结构显示在附加文件中2:图S1。

201组的PRPs通过筛选[KKPCPP]和[PPVX（K / T）]基序针对梨蛋白质数据库中识别。只有17必备方案成员预计将有SP的，而没有被发现有GPI锚网站（表1)．PRP族的典型结构显示在附加文件中2:图S1。分类结果表明我们的搜索策略是准确的。

HRGP超家族的系统发育分析

考虑到不同家庭HRGP的序列结构大大变化，总外家族成员的系统发育树不能反映偏置AA组合物对系统发育关系的影响。为了调查系统发育关系，使用raxml构建每个家庭的系统发育树。基于每个成员的过去序列的过去和绝对数量的百分比构建AGP系列的系统发育树。每个亚家族的成员没有聚集在一起，表明系统发育关系不受偏氨基酸组合物的影响。然而，具有相似数量过去的AGPs总是聚集在一起，而具有对比的AGPS的过去百分比显示平衡的聚类（图。1)．构建了EXT家族的系统发育树，并结合SP的数量进行分析_n主题（附加文件3.：图。S2）。每个EXT子家族的成员在植物之间均匀地传播，表明系统发育关系不符合SP的类型_n图案。然而，带有相对较多SP的ext_n主题倾向于聚集在一起。

利用氨基酸序列构建PRP家族系统发育树(附加文件)4:图S3)。大多数PPV[X]C基序的prp聚集在一起，主要分布在两个分支。带有PPV[X]K的PRPs以非常分散的方式聚集，这表明带有这种hyper -rich motif的PRPs可能具有更广泛的功能。三个系统发育树的拓扑结构表明，HRGPs的进化模式是复杂的。

HRGP超家族的扩展模式

为了进一步确定系统发育关系和偏置AA组成之间的潜在的不间断的机理，我们确定了膨胀模式HRGPs．研究表明，全基因组复制(whole genome duplication, WGD)、节段复制和单基因复制是主要的基因复制方式[34.］．利用MCSanX鉴定了HRGP超家族的5种复制模式，包括WGD、节段复制、串联复制、分散复制和近端复制。HRGP家族成员的重复类型多样(表1)2)．大多数重复的基因对HRGPs来源于WGD事件，但单拷贝HRGPs和分散重复HRGPs也被检测到，并建议WGD和分散重复主要占扩张HRGPs．WGD后的重复基因保留和进化受到基因特征的严重影响，例如结构复杂性或GC含量[35.］．基因组GC含量在10 kb窗口内计算，并由Circos显示在染色体旁边(图。2A)．富含gc的基因通常表现出更快的进化速度[36.］．事实上，我们发现近一半的HRGPs位于富含气相烃的地区，进化迅速。共线基因对93对HRGPs，而没有发现PRP基因与其他基因共线HRGPs．共线基因对位于梨最近发生的WGD事件的同源染色体区域，如9和17、8和15 [37.］．这一结果表明，梨和苹果共享的近期WGD事件产生了大量HRGPs(无花果。3.)．我们观察到一些基因对其中两个基因拷贝属于不同亚科HRGPs，表示家庭内部结构变化频繁的。通过对嵌合的HRGPs序列比对，我们发现hyper -rich motif比普通保守结构域的变异性更大，可能是基因复制后HRGPs的高变异性的原因。

然后，我们对不同亚家族的两个基因的共线基因对进行序列比对，分析Pbr028717.1 (EXT-AGP)、Pbr013421.1(赖氨酸丰富AGP)、Pbr030772.1 (EXT-AGP)和Pbr013433.1(赖氨酸丰富AGP)等HRGPs的结构变异。结果表明，P₅₂在两个富含赖氨酸的AGP已突变至S₅₆，将Pbr030772.1和Pbr028717.1纳入EXT-AGPs亚家族。另外，K的损失₆₇K₇₄和K.₇₅导致在没有Pbr030772.1和Pbr028717.1（图富含赖氨酸的基序。2B.)．此外，Pbr042269.1（EXT-AGP）是线性的Pbr012012.1（EXT-AGP),Pbr040388.1（富含赖氨酸的AGP)．Pbr042269.1和Pbr012012.1均含有两个额外的SPPP基元。与两种ext - agp相比，P_129.在PBR040338.1中突变成H._129.和一组标有一个黑盒子的氨基酸被删除，包括SPPP基序。这些突变改变Pbr040338.1进入富含典型的赖氨酸富含AGP（图。2B.)．这些序列在HRGPs重复对之间的差异表明，hyper -rich基序变化特别大，影响了AGP的分类。此外，HRGPs和非HRGPs之间的重复比一个HRGP对另一个HRGP的重复要频繁得多，这也证实了hyper -rich motif的高变异频率(图)。2A)．

HRGPs的进化模式

许多HRGP通过畴交换形成的嵌合蛋白[38.］．考虑到大多数保守结构域在净化选择下进化，而HRGP中hyper -rich motif的变异较为频繁，我们探讨了hyper -rich motif是否会影响进化速率。比较嵌合的进化速率HRGPs具有相应结构域的基因通过共线性分析鉴定出特殊的复制模式。

Ka(每个位点的非同义替换)和Ks(每个位点的同义替换)的比值被广泛用于估计编码序列的进化速率。我们选择了一组包含保守结构域的嵌合HRGPs进行进一步分析，如富亮氨酸重复序列(LRR, PF12799.1)、Pkinase_Tyr (PF07714.15)、可能的脂质转移(LTP, PF14368.4)和RNA识别基序(RRM, PF00076.20)。选择的HRGPs被用来比较嵌合的HRGPs和具有相似交换结构域的蛋白质之间的进化速率(图。4)．我们发现嵌合HRGPs与基因之间的进化速率与相应的域是显著不同。具体而言，对于具有LRR和LTP基序嵌合HRGPs，HRGPs的进化率比非高-HRGPs。与PKinase_Tyr和RRM嵌合的HRGPs进化率较低。这表明，在不同的嵌合HRGPs中，hyper -rich基序并不是简单地加速或减慢进化速度。我们还比较了嵌合HRGPs之间的进化速率，t检验没有发现显著差异。这表明，在嵌合HRGPs中，高度富基序可能比保守结构域对进化速率的影响更大。

三个系统发生树，使用氨基酸序列经由RAxML构成。每个分支聚集基因呈现密切的亲缘关系。分析PRP进化树和每个分支的富脯氨酸主题特征，我们发现了PPV，大多数的PRP [X] C图案属于一个特定的基因家族（附加文件4:图S3)。

为了探索嵌合HRGPs的形成，我们分析了含有prp和非prp的7-脱氧loganetin糖基转移酶样基因家族作为代表集。利用PRP Pbr024572.1作为查询序列对梨蛋白组进行blast，发现了266个同源基因，属于7-脱氧loganetin葡萄糖基转移酶样基因家族。53个包含prp和非prp的密切相关基因被保留。我们发现PRPs在所有的系统发育分支中传播，这表明一个古老的基因可能包含了这个基序。

我们使用PAML包中的codeml来估计53个基因的选择压力(图。5)．我们发现，大部分网站都是在负选择（图6)，表明树中的基因是保守进化的;但也有7个氨基酸位点处于阳性选择。在蓝色进化支中，大部分基因被鉴定为prp，而Pbr040614.1突变为非prp。在所有估计位点中，有一个氨基酸位点S_120.在Pbr040614.1突变至K_120.(无花果。6 b)．该位点的突变可能引发Pbr040614.1的功能变化，并导致其hyper -rich基序的结构变化。而PRP的hyper -rich motif PPV[X]C则进行了显著的纯化选择，这表明PPV[X]C的motif是保守的(图2)。5 b, c)．在PRPs中，这部分hyph -rich基序似乎并没有受到正选择压力的直接调控，而其他处于正选择的位点可能导致hyph -rich基序的结构变异。

蓝色分枝的分化时间为0.45 ~ 0.52，在此期间梨7-脱氧loganetin葡萄糖基转移酶样基因发生了爆发性的扩增(图2)。6摄氏度)．分歧时间Pbr040614.1和其他前提方案范围为0.46 ~ 0.49，也处于快速扩张时期。我们还发现，在7-脱氧loganetin葡萄糖基转移酶样基因的扩增模式中，不存在WGD事件，而WGD事件是大多数基因家族扩增的主要力量。这种爆炸性的扩增可能是由大量的单基因重复和近一半已确认的重复引起的前提方案被发现以这种方式复制。

HRGPs从花粉的Ole e9我的家庭通常参加了高度发散的生殖过程中的植物，使得该嵌合HRGP域特别重要的重复。花粉的Ole e9我域HMM文件被用来作为对梨基因组进行Hmmsearch查询。我们发现含有两个的PRPs，二AGPS和一个EXT 42组的序列。42个基因的系统发育树构造和估计上氨基酸残基的选择压力。结果发现，花粉的Ole e口基因家族是正选择和23个氨基酸的部位为下强烈的选择压力（图7 b)．我们还发现Pbr026226.1，Pbr041309.1和PBR016247.1.在进化密切相关，但Pbr041309.1不是一个AGP．序列比对显示Pbr041309.1缺少一个n端PAST序列。我们还发现一个阳性的位点，H_117年,在Pbr041309.1中缺失，而其他两个基因保留了该位点(图。7一个)．我们推测H_117.可能引发PAST片段的损失。这些结果表明，正选择与增益和损失相关HRGPs．

HRGP超家族基因在梨生殖组织中的表达

因为进化速度是嵌合的HRGPs为进一步探讨梨中嵌合基因的表达模式，我们对其表达模式进行了分析。据报道，许多hrg在生殖过程中发挥着重要的作用，特别是在样式[39.］．因此，我们研究了的表达模式HRGPs在梨的花粉和花型中，梨是一种经典的SI植物。为了更好地理解的表达模式HRGPs，我们利用RNA-seq在花粉管不同发育阶段和自交和非自交花柱动态发育过程中的RPKM值(数据未发表)。

多种多样的表达方式HRGPs在不同的组织中发现。我们发现601HRGPs在授粉雌蕊表达，而只有285花粉表达。我们所有的集群表示HRGPs来自两个转录文库（附加文件5中：图S4），并发现HRGPs表示不同的表达模式。在花粉中，HRGP基因的高表达量小于低表达量，而在授粉花柱中，HRGP基因的高表达量小于低表达量5：图。S4）。这表明HRGP基因可能在雌蕊高于花粉发挥更重要的作用。这些结果是根据TTS的先前的数据和120 K [40］．我们还发现，大多数的表达HRGPs在花粉管和雌蕊发育的不同阶段均稳定。我们还对其表达模式进行了分析HRGPs在水果发育过程中，我们发现HRGPs显示了复杂的表达式模式6:图S5)。

‘金蝇’是来自‘雅丽’的自交不良突变体，我们推测突变体的遗传特征可能与花粉有关。以前的报道表明，‘金珠’ב鸭梨’授粉失败，而‘金珠’ב金珠’授粉成功[41］．然而，其他报道认为，“Jinzhui”花粉授粉可以既“Jinzhui”和“鸭梨” [的雌蕊42］．因此，我们分析了两种不同授粉雌蕊的各个阶段的RNA-SEQ，以揭示“YALI”和“晋嘴”之间的潜在突变机制。它可能是由授粉过程中HRGP基因的发散表达模式引起的。

为验证这一可能性，分别在授粉后24 h、48 h和72 h采集‘金珠’和‘雅丽’的花粉进行授粉。在比较HRGP超家族的每千碱基百万分之读数(RPKM)后，两个HRGP基因表现出不同的表达模式。

在‘金珠x金珠’雌蕊授粉后24 h，表达水平Pbr036330.1在《金珠x雅礼》中得到了更多的调控，而Pbr010506.1表达下调。然而，两者的差异表达HRGPs在授粉后48小时后在雌蕊中减少，授粉后72小时没有差异。QRT-PCR结果与授粉雌蕊的转录组数据中的RPKMS趋势一致（附加档案7中：图S6A，B）。考虑到在24小时后授粉，已经发生在梨雌蕊自兼容和不兼容的反应[43这些数据表明，这种差异表达模式可能与授粉自交亲和性反应下游机制的突变有关。

基因对中的复制基因表现出高同源性倾向于显示相似的表达模式，而我们的结果表明在超家族膨胀后HRGP基因对之间发现了相对较低的同源性。更好地阐明特征HRGP表达差异，我们检测了随机的HRGP基因对与总基因对(作为对照)。HRGP基因随机组合成基因对的表达差异表明，HRGP基因之间存在普遍的表达差异HRGPs并从植物基因组复制数据库（PGDD）获取的总基因对指示重复基因之间的通用表达发散。我们发现，随机基因对，重复基因对和复制的基因HRGP呈现对不同的表达特征的发散（图8)．总重复基因对的表达差异可能反映了表达差异的共同率，而随机HRGP基因对的表达差异则表现在无共线关系时。我们的结果表明HRGPs不共线的关系是不是从复制的基因对更多的分歧。然而，HRGP基因对表达分析显示出比两个随机HRGP基因对总表达的基因对较高发散。它提出的是重复事件HRGPs可以增强其表达分歧。

探讨表达分歧的机制HRGPs，我们还分析了来自WGD基因对的HRGP基因的启动子序列。为了HRGPs从WGD表明表达发散的较高水平，我们比较了来自WGD HRGPs基因对启动子序列。我们提取的上游1000bp的HRGPs基因的和预测的转录因子结合位点/顺bp的上游区域存在的元素的1000。结果表明，具有较高的相关性表达基因HRGPs共享对几个转录因子而具有较高表达发散HRGPs基因对没有共同的转录因子（附加文件1：表S2）。据推断，启动子序列的变异HRGPs可以是占从WGD事件HRGPs基因对表达发散的重要因素。

识别HRGPs的更敏感的方法

我们对梨生殖组织中HRGP基因超家族的扩展、进化和表达进行了研究，发现了与其他基因家族的关键差异。我们采用偏置aa组合分析来收集HRGP超家族的序列，而不是通常用于其他基因家族的Blastp和隐马尔可夫模型(HMM)。我们对HRGP超级家庭中的每个家庭都采用了一种家庭特定策略。每个HRGP的hyper -rich motif也被注释(数据未显示)。通过这一过程，鉴定出838个基因，远远多于之前报道的其他策略所鉴定的数量。事实上,在P. Trichocarpa，271HRGPs在拟南芥162人被鉴定[14.，33.］．要将搜索方法与先前报告的搜索相比，我们搜索了HRGPs在拟南芥和blackcotton木多HRGPs是通过我们的方法获得的(附加文件1:表S3)。虽然我们的搜索策略是基于有偏见的肖沃尔特的aa成分搜索模式[14.]，应用我们编写的perl脚本筛选HRGPs，并修改搜索策略，以最大限度地识别梨的HRGPs。在筛选过程中，我们使用BlastP在候选HRGPs中使用了不同百分比的PAST残基，发现至少10%是识别HRGPs的关键。与BIO OHIO相比，我们的搜索方法更适合于HRGPs的识别。

WGD和单基因复制都是重要的HRGPs

WGD事件在几种被子植物基因组中普遍存在[44］．古代WGD事件发生在被子植物的祖先基因组中[45]，以及一些经历多个谱系特异性WGD事件的植物[46，47］．这表明，WGD事件是驱动基因家族扩展的主要力量，WGDs和节段复制中保留了大量重复基因[48］．然而，被子植物中也经常发生单基因复制[49］．以前的研究报告说，梨和苹果在140 mya中经历了两轮WGD事件[50]和30-45 MYA [51]，两个物种在MYA 5.4-21.5之间相互分离[37.］．我们的结果表明，这些WGD事件主要促进了HRGP家族的扩展，并且HRGPS中发现的广泛分散复制也很重要。此外，单基因复制事件也占大的比例。在HRGP家族中检测到的分散重复酯的大量分散重复剂的替代解释可以是衍生自最近WGD事件的重复基因经历了染色体重排，然后进行单基因重复，导致分散基因复制的爆发[52，53］．据报道，串联复制在很大程度上促进了一些大型基因家族的扩展[54];然而，我们的研究结果表明，串联复制在扩展过程中并没有发挥很大的作用HRGPs。

hrp对生殖过程很重要

因为HRGPs在开花植物生殖过程的许多方面都有报道[12.，39.]，我们探讨了花粉发育和不同授粉雌蕊它们的表达模式。以前的研究表明，TTS蛋白，120 K和PELPIII是花柱糖蛋白HRGPs可能在体外结合烟草S-RNA酶，并且还可以与花粉管相互作用[12.］．两个ext,Pbr036330.1和Pbr010506.1在授粉的雌蕊中大量表达。此外，两个HRGPs对SI表现出不同的反应。在花粉,Pbr036330.1在较低的水平表达，而Pbr010506.1没有表达。然而，这两个基因在自交和非自交雌蕊中均表现出较高的RPKM值。与此同时，我们发现Pbr036330.1和Pbr010506.1在授粉后24小时，自花雌蕊中表达量高于非自花雌蕊。然而，这些差异在48 h时减小，72 h时消失7:图S6A, B)。前人研究表明，梨的SI通常发生在授粉后24 h [55］．我们推测这两个HRGPs的反应过程可能与SI有关。值得注意的是，HRGPs的蛋白结构均包含一个SPs和SP基序，未发现其他保守结构域。而TTS、120k和PEPLIII均含有花粉Ole e I结构域，仅含有一个SP_n主题。两个HRGP和Si的关系需要进一步研究。

的Pbr031110.1属EXT亚科，花粉Ole e I结构域序列特别独特。的相对表达水平Pbr031110.1在花粉和风格中低于水果，叶子，卵巢和茎的风格，表明PBR031110.1与大多数HRGPS不同于生殖过程（附加文件）7:图S6C)。其余分析的梨基因的表达量为Pbr031110.1是水果中的最高，其次是卵巢。有趣的是，通过BLASTP搜索对数种Pbr031110.1，包括碧桃，马吕斯有明显，Fragaria Vesca.，李春万，葡萄和拟南芥thalinana，未发现同源系数大于40%的基因(数据未显示)。Pbr031110.1具有保守的花粉Ole结构域和大量重复的SP₅这些图案在其他物种中是不存在的，甚至在密切相关的苹果中也是不存在的。HRGPs与木质素和石细胞的聚合有关，其中在梨果实中木质素含量特别高，这在开花植物中是独一无二的[56］．我们推测PBR031110.1可以解释这种现象。

HRGPs影响植物进化的可变富脯氨酸图案

我们的分析表明，WGD事件促进了表达分化HRGPs．因为复制的基因通常表现出比单拷贝基因更多的发散模式[57]，我们比较的重复表达发散HRGPs与其他常见的复制基因。这种比较表明，表达复制HRGP比普通的复制基因更具多样性。因为复制的基因可能在不同的组织和发育阶段发挥独特的功能[58]，我们推测较高的表达散度HRGPs可能是由于其高度可变丰富的羟脯氨酸的图案。羟脯氨酸基序的结构完整性还可能影响基因的进化速率。该重复基因含有相同的域，并用另外的羟脯氨酸丰富的基序的人表现出不同的进化速率。花粉的Ole的选择压力分析E I和7-deoxyloganetin葡糖基转移酶样基因家族脯氨酸建议丰富图案的那损益是正选择更加频繁。

在中性进化模型中，两个基因的表达差异通常被认为是由随机效应驱动的[59，60］．然而，其表达差异极高HRGPs建议的演变HRGPs在这个模型下没有发生。此外，Hyp-富含基序的高变异性与表达式的类似变异相关HRGPs尤其是在复制HRGPs．在重复后保留的基因可能在基因组中获得新功能，进一步驾驶表达分歧[61，62］．因此，大量的HRGPs高表达分化可能是植物进化的主要力量。

我们的数据阐明了该基因的扩展、进化和表达模式HRGP总科梨。鉴于阳性选择信号强烈，重复的HRGP基因表达差异剧烈，我们认为HRGP可能在植物新功能的进化和适应中发挥重要作用。这些基因在梨的雌蕊中富集，可能为我们研究梨的生殖过程提供了重要的观点。

HRGP序列集合

中国白梨(Pyrus Bretschneideri.）从梨基因组项目下载（http://peargenome.njau.edu.cn./）[37.］．偏置的AA组合物是收集HRGPS的基本标准[14.］．HRGPs的不同亚家族具有不同的富基序。过去的含量和百分比是搜索agp的标准。其他亚家族是根据过去的百分比以及独特图案的存在来确定的。对于FLAs, H1 motif被用于执行Hmmsearch [14.］．对于ext - agp, SP_nMotif作为额外的搜索标准。对于经典agp，要求至少30%的PAST含量。AG肽段的PAST百分比至少为10%，肽段长度小于90 aa。对于富含赖氨酸的AGPs， [X]KK、KKK和K[X]K残基序列作为附加标准[14.］．对于ext，大于2 SP_n（n = 3,4 and 5) sequences were required. For PRPs, the PPV[X][KC] sequence was required. Blastp was used to check sequences with a threshold around 10% PAST. The SP annotations were performed by SignalP4.0 [63[Big-PI预测器的GPI预测[64，65］．

HRGP基因的基因复制分析

复制的共线关系HRGPs已被MCScanX收购[44］．共线基因对由Circos提出[66的基因组位置HRGPs重叠在相应的染色体上，而不固定HRGPs不包括在共线分析。为了估计梨基因组的GC含量，我们分裂每个染色体成每个窗口10,00 kb和由Perl脚本计算出的各10 kb的窗口的GC含量。

选择压力和演化速率的估计

与相应的保守结构域比较嵌合HRGP基因和基因之间的进化速度，KaKs_Calculator2.0 [67]，用NG方法计算成对Ka/Ks值[68］．我们收集到的个LRR（PF12799.5），RNA识别基序（PF00076.20），LTP（PF14368.4），蛋白酪氨酸激酶（PF07714.15）和花粉的蛋白质的Ole e9我喜欢（PF01190.15）通过针对Hmmsearch梨基因组，与相应的HMM文件从PFAM数据库下载（http://pfam.janelia.org/）[69］．采用PAML中的Codeml程序估算选择压力[70］．序列对齐由肌肉进行，并通过JALVIEW显示默认参数[71，72］．prp的hyp- motif由Weblogo绘制(http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）[73］．通过RAxML使用cd和GTRCATI模式构建引导树[74］．在Codeml中，使用站点模型来评估正面选择的站点。选择M0，M7和M8以评估Omega的概率。似然比测试（LRT）= CHI2（2 DL）= CHI（ABS（2 *（LNL7-LNL8））））。KS值用于估计花粉OLE E基因家族的分歧时间。因为7-脱氧糖蛋白葡萄糖基转移酶样基因对的KS值不足以估计整个家庭的发散时间，所以使用7-脱氧糖蛋白葡糖基转移酶样基因的基因嵌段的KS值。用于评估每个家庭的相对发散时间的KS来自PGDD（http://chibba.agtec．uga.edu/duplication/) [75］．Divergence time, T = Ks/2λ, with λ = 9.1*10^{- 9}，这是来自黑色棉布的[76］．

系统发育分析

系统发育树是用RAxML构建的。序列比对采用log-expectation (Muscle)多序列比较，采用默认参数。编码序列构成了用codeml编码的树。其他树是由氨基酸序列构建的。氨基酸构建的树选择PROTGAMMA模型，核苷酸构建的树选择ASC_BINGAMMA模型。树的呈现是由互动生命之树(http://itol.embl.de）[77]和Evolview（http://www.evolgenius.info/evolview）[78］．

表达分析分析

的授粉雌蕊的六个表达谱“Jinzhui X亚利”和“Jinzhui X Jinzhui”被用于表达发散分析。的divergences in the expression of three types of gene pairs were calculated separately: (1) When gene a and gene b were in one gene pair, their expression RPKM in six libraries was set as two matrices, A and B, where A = [a_k]（k = 1〜6）和b = [b_k[k = 1~ 6]。(2)表达保守(EC)由EC (i) = PCC (A, B)计算。(3)' i '基因对的表达差异计算为1-EC (i)。

花粉和授粉雌蕊HRGPs RNA-seq的RPKM值

的RPKM值HRGPs在花粉发育阶段和果实发育阶段的研究79，80］．“Jinzhui”和“砀山酥梨”的花粉从南京农业大学江浦的农家收集。To calculate the RPKM values of HRGPs in pollinated pistils of ‘Jinzhui x Yali’ and ‘Jinzhui x Jinzhui,’ the pistils of ‘Jinzhui’ and ‘Yali’ were all pollinated with ‘Jinzhui’ pollen and were collected in 24 h, 48 h and 72 h post-pollination in Jiangpu farm. All RPKM values were normalized into − 3 to 3 and displayed as heat maps by R. The expression pattern of HRGPs during the dynamic pear fruits development were acquired from NCBI and the RPKM values were normalized into − 4.55 to 4.55 and displayed as heat maps by R.

QRT-PCR分析

用于QRT-PCR分析的总RNA从六种不同阶段的雌蕊授粉（即JY24，JY48，JY72，JJ24，JJ48和JJ72）中提取。根据制造商的说明，使用转肌型一步GDNA除去和cDNA合成Supermix（Transgen Biotech Co. Ltd.）将总RNA调节至相同的第一链cDNA合成。根据制造商的协议使用LightCycler 480 Sybr Green I Master Mix（Roche）进行QRT-PCR分析。我们使用含有12μl的含有12μl的轻循环480 Sybr Green I母线的20μl混合物进行每种反应，5μl无核酸酶的水，每个引物和1μl稀释的cDNA。QRT-PCR在94℃下用5分钟开始，然后在94℃下进行55个循环，在72℃下延长60℃，延长30°C。Pyrus微管蛋白（登录号AB239681）作为内部对照基因和用2计算相对表达水平^——ΔΔCt方法。所有的引物在其他文件中所示1:表S4。RPKMs的Pbr036330.1和Pbr010506.1将其在授粉雌蕊中的相对表达量标准化。

HRGPs中顺式调控元件的鉴定

为了鉴定HRGPs启动子序列中的潜在转录因子，Softberry TSSPlant网站(http://www.softbers.com.用于此分析[/）81］．我们从WGD事件中提取了1000bp上游序列的HRGP，并筛选了TSSplant数据库。

120 K:

120 kDa糖蛋白

答:

丙氨酸

AGP:

Arabinogalactan蛋白

ECM:

细胞外基质

EXT:

拓

唔：

隐马尔可夫模型

HRGP：

富含富含羟脯氨酸的糖蛋白

K a：

每个站点的非同义替换

KS：

每个站点的同义词替换

肌肉：

对数期望多序列比较

病人:

脯氨酸

PCC：

皮尔森相关系数

PELPIII:

III类雌蕊特异性延伸素样

RPKM:

读取每千碱基每百万

如果:

自交不亲和性

师:

苏氨酸

TTS:

传输的修复

WGD：

全基因组复制

我们希望在科学语言编辑方面对Enago表示感谢。我们还要感谢匿名审查员对此稿件的评论。

资金

国家自然科学基金项目(NO.31522048, NO.31471839, NO.31772276);科技部国家科技支撑计划项目(no . 2014BAD16B03-4);中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(no . KYTZ201602, no . KYLH201502-2)。关键词:岩石力学，裂隙发育，裂隙发育，数值模拟

数据和材料的可用性

本研究中生成和/或分析的数据集可从合理请求的相应作者获得。

停止生长的花粉管，Accession: SRX1356346;花粉管，Accession: SRX1356343;水化花粉粒，Accession: SRX1356152;梨成熟花粉粒，专利号:SRX1356151。

GSM825779：梨果发育阶段1.加入：SRX104374;GSM825780：梨果发育阶段2.加入：SRX104375; GSM825781：梨果发育阶段3.加入：SRX104376;GSM825782：梨果发育阶段4.加入：SRX104377; GSM825783：梨果发育阶段5.加入：SRX104378。

隶属关系

1. 南京农业大学梨树工程技术研究中心，作物遗传与种质创新国家重点实验室，江苏南京210095

   焦慧君，刘星，孙曙光，王鹏，乔鑫，李佳明，唐超，吴居友，张少陵，陶树田

贡献

HJ在数据分析、数据准备、手稿起草等方面做出了贡献。XL改进了数据收集和分析的方法。SS和CT用于标本采集和qRT-PCR实验。XQ, JL和PW贡献了分析HRGP进化。JW对数据的分析和澄清做出了贡献。SZ贡献了文献研究，指导了整个研究的完整性。ST构思和设计了整个实验的细节，并对手稿进行了修改。他为我们提供了授粉雌蕊的转录组数据，并与我们讨论了相关数据，并参与了整篇手稿的语言修订。所有作者都已阅读并批准了最终稿。

通讯作者

对应于Shutian道．

伦理批准和同意参与

中国白梨基因组数据库来源于梨工程技术研究中心;而党山酥里、金珠、鸭梨的花粉、金珠和鸭梨的花型均采自南京农业大学江浦农场。在梨工程技术研究中心的许可下，我们将基因组数据库、花粉和花型用于本研究。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

出版商的注意事项

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。

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重印和权限