映射雄性育性恢复基因座为A₄使用基于基于序列的基于序列键合图的珍珠米体中的细胞质 - 基因雄性无菌系统

背景

珍珠小米（狼尾草glaucum(l)r . Br。syn。美洲蒺藜草(l)是炎热干旱地区重要的谷类和饲料作物。通过杂交育种提高珍珠谷子产量具有很大潜力。细胞质雄性不育(CMS)及其相应的核不育恢复/不育维持基因(RF.是珍珠谷子经济杂交制种的重要工具。映射RF.A基因₄珍珠谷子的CMS系统将使两个显性雄性不育恢复等位基因更有效地渗入(RF.）和他们的隐性雄性不育维护同行（RF.）.

结果

基于单核苷酸多态性(SNP)标记生成高密度连锁图谱₂映射人群和基因分型逐序列（GBS）。这种十字架的父母是'ICMA 02777'和'ICMR 08888'，它为A分离₄RF.轨迹。连杆地图由460个SNP标记分布，主要均匀，总长度为462厘米。基于花粉生产（存在/缺失）的雄性肥沃和雄性无菌植物（3：1）的分离率表明了男性生育恢复的单一显着遗传。相应地，在连杆组2上发现了花粉生产的主要定量性状基因座（QTL），交叉验证显示出非常高的QTL发生（97％）。使用自带种子设置为表型特征，确认了主要QTL，但精度较低。然而，这些QTL分别解释了花粉生产和自带种子集的表型差异的14.5％和9.9％，这是低于预期的。为已识别的基因座开发了两种功能性kasp标记。

结论

本研究利用基于gbs的连锁图谱确定了雄性育性恢复的主要QTL，并开发了KASP标记，为单基因块的高通量筛选提供了支持。这是对a进行标记辅助选择的第一步₄珍珠粟的雄性不育恢复与雄性不育维持。

珍珠小米（狼尾草glaucum(l)r . Br。syn。美洲蒺藜草（L.）R. BR），一种高营养的，干旱和盐度耐受性谷类作物，主要由自给农民在西非和南亚，在那里它的产率水平通常有限由于低的半干旱地区生长水的供应，高温和低土壤肥力。珍珠粟是一种天然异交种和杂种优势，从开采大大受益[1];这种作物的混合养殖计划已经在印度建立得很好，并在西非的早期发展阶段。

细胞质雄性不育（CMS）的特征在于未在耻辱通常发生的同时未能产生功能性花粉。当隐性继承的核基因与致密性诱导的细胞质相互作用时，会发生CMS。因此，CMS是潜在的继承和通过防止自授粉来促进大规模的混合种子产生。CMS系统用于珍珠小米和许多其他混合作物，其中谷物或水果是收获的经济上重要组成部分[2,3.]．男性生育能力可以在雄性不育诱导胞质的背景由显性遗传核恢复基因恢复，称为RF.基因。这些基因抵消无菌性诱导基因在细胞质中的影响（表示线粒体和/或叶绿体），并允许生产雄性可育杂种植物的[4]．

在珍珠谷子中，首次报道了CMS系统(A₁)是基于蒂夫特23A₁细胞质[5]．随后，一个₂,一个_3.＆ 一种_β找到了替代系统[6,7];但是，这些系统都证明了比a的稳定性较低₁CMS系统，所以a₁单独使用的系统用于印度的混合珍珠米特育种数十年。为了避免细胞质均匀性，这可能导致疾病和昆虫害虫流行病的脆弱性[8]，替代CMS源到A₁寻求混合珍珠小米中的细胞质多样化的系统。研究了几个来源[6,9,10.,11.,12.,13.]，但只有A_m=一个₄和一个₅CMS系统被认定为商业上可行的[14.,15.]．其他CMS系统不能满足a系的完全雄性不育、杂种的高程度雄性不育恢复以及这些性状在环境中的稳定性等要求。

在西非，目前的活动包括鉴定有前途的杂交父母，确定适当的CMS系统，以及适当的雄性不育性维持/男性生育恢复等位基因进入本地适应的种质。一种₄和一个₅CMS系统似乎比A系统提供更稳定的雄性不育₁在西非更热的生产环境中，这与在印度更高的温度条件下，被认为是雄性不育的植物的花粉脱落率更高是一致的。目前,一个₄和一个₅RF.基因最容易在适应印度状况的种质中获得[16.[西非珍珠米尔种质中两种系统的维护等位基因的频率似乎很高了[17.]．的遗传作图RF.底座的一个₄和一个₅CMS系统将使这些生育恢复等位基因更有效地将这些生育恢复等位基因转移到适合于西非条件的一个或多个潜在的男性异丙疮池中。此外，这种映射可以通过使其更容易跟踪和操纵雄性不育基因，以便将雄性不育基因更容易地进行潜在的杂种种子父母，因为各种种质被整合到繁殖计划中。

在过去的三十年中，开发了许多不同类型的标记，用于珍珠小米中的遗传映射和/或分集评估，包括限制性片段长度多态性标记物（RFLP），扩增的片段长度多态性标记物（AFLP），简单的序列重复标记（SSRS），多样性阵列技术标记（DART™S）和单核苷酸多态性（SNPS）。通过增加标记密度和覆盖率来提高遗传地图的质量，但由于Peri - 焦化区域中的标记聚类和Peri端极端区内的重组率极高，许多基于RFLPS，AFL​​P和SSR的地图仍然不令人满意导致差距大于20厘米[18.,19.,20.,21.]．

SNP标记，其整个基因组是丰富的，是现在常用的许多作物使用。高通量测序方法成本低有利于高密度联动的发展映射基于SNP标记。基因分型的分测序（GBS）是一个测序技术，其是能够产生这样的全基因组SNP数据集[22.]．在GBS方法的第一步中，使用限制酶减少基因组复杂性，其选择性地切割基因组DNA。在下一步骤中，将“条形码”DNA适配器连接到每个片段中，以使许多样品排序在一个测序通道中。GBS已经证明其在玉米，大麦，高粱和葡萄等作品中取得了成功。[22.,23.]．Moumouni等人[24.]和punnuri等。[25.已经表明，GBS可以在珍珠米中培养合理均匀和致密的遗传联系地图。这种遗传图可以用于结合或联系研究以识别QTL，偶尔SNPS [26.]，控制感兴趣的特征。

本研究的目的是：（1）以基于GBS衍生的SNP标记在珍珠粟F A的全基因组图谱₂映射人口，和（2）映射一个或多个专业RF.在A中控制男性生育恢复和男性无菌维护的基因座₄珍珠粟的CMS系统。

定位群体的表型变异

所有F.₁由ICMA 02777和ICMR 08888杂交产生的杂种个体具有完全的雄性可育性，ICMB 02777和ICMR 08888的自交后代也是如此。在杂交中使用的亲本ICMA 02777是完全雄性不育的，当它与保持系ICMB 02777杂交时，后代也是完全雄性不育的。观察到所有F₁植物是完全雄性的肥沃，表明珍珠小米中男性生育恢复的显性遗传₄CMS系统。的F总共138种植物的₂人口产生的花粉（并且因此是男性肥沃）和50株植物没有生产花粉（雄性无菌）（图。1），其非常适合的3：单显性基因的1偏析比（χ²= 0.26,P. = 0.614). The distribution of phenotypes for selfed seed set percentage also revealed two major classes (no seed set and medium to good seed set) plus an additional low-frequency intermediate class with low to medium seed set (Fig.1）.株高基本呈正态分布，变异程度高₂居群，株高38 ~ 270厘米，平均株高163厘米。株高的高变异及其轻微的双峰型分布表明，F₂人口分离对于隐性矮秆基因，以及理事这一特点影响小许多位点。

基于多态标记的遗传图谱构建

共449500000读取通过测序的196个样本生成;2个样品随后排除由于低测序质量。对平均2310000 194高质量样本读取每个样品（范围0.33-6.81元）。亲本系ICMB 02777的两个样品具有总共4990691读取和ICMR0888的四个样品具有共14680021读取。

使用珍珠谷子参考基因组1.1版本序列共调用16万个原始SNPs [27.]（珍珠小米基因组测序结社会提供。高质量多态性SNP的滤波减少了SNP的数量至2416，其在地图结构的第一步中使用。MSTMAP算法在7个连锁组（LGS）中分组了所有SNP，除了73个偏远的SNP，其中被排除在外。LGS的分组同意参考基因组序列的分组。2343 SNP包括许多滤波的冗余标记。最终的遗传图谱基于460个SNP，总长度为462.2厘米。标记均匀分布（图。2，附加文件1：表S1），平均标记间距为1.0厘米，最大间距为11.1厘米（表1）.LGS的长度从39.7厘米（LG 4）至90.4厘米（LG 5）范围内。虽然这手稿审查，最终珍珠粟参考基因组发表[27.]（物理位置和在该地图中的所有SNP的遗传背景的被包括在其他文件2）.

鉴定男性生育恢复和植物高度QTLS

基于SNP的遗传联系地图用于多元回归分析，以确定用于雄性生育恢复的QTL（由花粉生产和自带种子组确定）和植物高度。LG 2上的一个标记间隔与花粉生产和自带种子集显着相关。对于花粉生产，QTL解释了观察到的表型方差的14.5％，而其仅解释了自行种子集的观察到的表型差异的9.9％（表2）.株高在lg4上鉴定了1个QTL，解释了24.5%的表型变异。

所述QTL频率分析表明，花粉生产QTL位置在交叉验证运行的97％被发现，且QTL在运行的38％检测到用于自交种子集。对LG 4株高QTL在运行的69％被发现。我们与R中实现的单个标记回归模型验证QTL分析/ QTL确认内PLABMQTL使用的多重回归模型。这两种算法确定在同一位置上的QTL，并且有表型非常相似比例的差异解释。

将侧翼SNP转化为kasp测定

为了使QTL的两个侧翼SNP标记可用于应用标记辅助选择，将它们转化为单一标记测定。为了使廉价，快速和高通量的筛选，我们选择将它们转换为基于等等位基因特异性PCR（KASP）标记。对于SNP（S2_110825781和S2_195649011），KASP测定成功并显示三种基因型类（图。4A）.有两种单倍型的可育个体出现的频率非常高，而一种单倍型的可育和不育个体出现的频率大致相同(图。4B.，附加文件3.:表S2)。我们对F的所有成员进行了基因分型₂人口并验证了检测到的QTL的功能，并获得了非常相似的r²根据原始基因型数据观察。

与基于GBS和其他标记的现有遗传联系地图的比较

高通量测序技术和用户友好型测序分析软件包的开发极大地促进了标记检测的选择。基于snp的连锁图谱已经在许多作物中使用，特别是在那些有参考基因组序列的作物中。在pearl millet中，最近出版了两份基于gbs的链接图。Moumouni等人[24.出版了一幅基于小写F的地图₂人口，不使用参考序列（使用UneAdpile [28.在流苏中），而Punnuri等人。[25.]使用了基于我们在我们的研究中使用（最终珍珠粟参照基因组发表重组近交系（RIL）用相同的附图草案基因组序列作图群体[27.虽然这份手稿正在审查。）。）。Moumouni等人的总图长度。[24.]和punnuri等。[25.]为717 cM和641厘米，分别既比我们的地图（462厘米）明显更长。Sehgal的等。[29.[基于基于基于基于基因的SNP，Cisps和EST-SSRS，发布了共识函数图，即815.3厘米。然而，与我们的地图长度相比，还有先前的遗传映射，与我们的地图长度相比：QI等人。[30.]出版了一幅473厘米长的地图₂珍珠小米人口和242个SSR和RFLP标记，以及Liu等人的原始珍珠米。[31.跨度只有303厘米。连锁图谱的总长度受作图群体重组率和亲本亲缘关系等因素的影响。因此，不同研究的地图长度的精确比较没有意义，因为长地图长度是在相同的近似范围内，就像我们的地图一样。

无论我们的分析和Punnuri等。[25.]根据拉贾拉姆等人的共识图对LGs进行了编号。[20.]．然而，我们的地图中LG的相对长度与Punnuri等人报告的那些相对不同。[25.]．尤其是LG 3和LG 6，这是相对短的在我们的地图（54.2 cM和39.7厘米，分别地），是相当长在Punnuri等人的地图。[25.]（175厘米和112厘米）。基于珍珠米基因组序列中给出的碱基对，LG3是七个LG的最长，LG 6的长度为4。长度差异的一个可能的原因可以留在所选择的用于GBS的使用限制酶中。我们使用了酶太平洋标准时间l虽然punnuri等。[25.] 用猿Rajaram等人的共识图中LGs的相对长度[20.]与我们地图的LGS相对长度更接近我们的地图上的LGS。[25.]．

基于GBS的两个基于GBS的链接映射与基于其他标记类型的先前地图具有更高的标记密度。Punnuri等人的地图。[25.]显示比我们的地图更高的密度，这反过来比Moumouni等人的地图更密集。[24.]．较高密度报道Punnuri等。[25.，因为他们使用了RIL标记群体，这种群体的重组率更高(实际上是F的两倍)₂相似的大小和血统）的人口。但是，我们仍然可以归类我们的地图为大部分密集，uniformly-和良好的饱和，因为只有一个间隙与相邻标记间10多厘米。The integrated EST-SSR + DArT marker-based pearl millet linkage map reported by Ambawat et al. [21.]截止了740厘米（卤代），平均相邻标记距离为2.7厘米。这张地图已经使用了140个人的RIL群体，来自近交线的十字线，预计不仅可以隔离d2侏儒基因，也适用于男性 - 生育恢复和雄性不育维护₁和一个₄CMS珍珠米体系。试验到ISO核种子父母81A的人口₁和81a₄将允许我们对搜索结果的一个独立确认₄，并证明了这两种商业化开发的珍珠谷子CMS系统的育性恢复/不育维持位点之间的关系(如果有的话)。ambaawat等人图谱的优良基因组覆盖[21.大多数连锁群在周边地区的端粒也可能有助于发现任何重大的育性恢复/不育维护座的改性剂这两种CMS系统的检测。使用检测到的核不标记物的效用太平洋标准时间ambaWat等人证明了用于确保这些区域中的标记覆盖的内核酸酶。[21.当他们能够定位一个以前被证明是“不可定位”的抗锈病主基因时，因为它的位置比lg1顶部的任何RFLP或SSR标记都远。

男性生育力恢复的遗传

在种子或果实包括经济收获的作物中，在f中恢复雄性肥力₁杂交种通常是经济上可行的杂交品种的重要前提，这些杂交品种在开花之前收获（例如甜菜，胡萝卜，韭菜和洋葱），其中杂种品种不需要恢复为单性arpic黄瓜的男性生育率。同样，许多饲料和大多数饰品都不需要恢复男性生育，因为种子集不是在农业中使用所必需的。

Gupta等。[16.]显示雄性生育恢复在A中₄珍珠谷子的CMS系统遵循单基因显性遗传模式，使用的表型程序与我们所使用的相似。我们的观察结果与这一结果一致，因为我们还发现在F₂人口。然而，基于表型数据的单基因控制假设似乎还不确定，因为我们的图谱研究结果表明，也可能有小基因。

前人对A₄珍珠小米中的CMS系统已经证明了其稳定的雄性不育性和印度环境中可靠的男性生育恢复。基于a的许多种子父对（男性无菌A线及其异核B线维护者）₄CMS系统现已用于南亚和撒哈拉以南非洲的珍珠小米饲养员，以及美洲。我们的表型数据表明，这种稳定性的大部分可能是由于该系统中雄性不育维持和男性生育恢复的简单遗传（与1-，2-和3-基因的男性生育率修复相比₁;CT哈希未发布）。在这种情况下，可以合理地期望西非环境中无菌和恢复的相似稳定性。

雄性不育恢复和株高基因座检测

本研究通过QTL分析，鉴定出一个主要的育性恢复/不育维持位点₄LG 2上的CMS系统。假设是单基因控制，我们期望该位点能解释相对较高比例的观察到的表型变异。然而，估计的R²_adj.花粉生产和自带种子集的价值仅为14.5％和9.9％，这显着低于我们的预期。这种差异可能受到一些未成年人或修改的影响R_F在该QTL分析中无法检测到的基因。通过观察到的频率分布支持修饰基因的假设（图。1B.），并通过对自交种子组（图1中的LOD得分曲线。3B.），后者显示一些刚刚在LOD阈值以下的峰（例如，在LG 1，LG 5和LG 6上）。这种非重要基因座可能与未成年人相关联R_F虽然特别是在LG 5上检测到的基因，但是尤其可能与常环周期或颗粒接收有关，因为仅针对自带种子组而不是花粉生产而检测到它们。

交叉验证强化了该专业高准确性的证据R_F基因位置，作为交叉验证运行，鉴定了花粉生产和自行式种子的QTL分别获得97％和38％的时间。较低的R.²_adj.自交结实率相对于花粉产量的QTL频率可能是由低至中等(5-50%)结实率的植株引起的。可育植株结实率低可能由以下几个因素引起:部分雄性可育性、柱头接受能力短而雌蕊期长(第一次柱头出现到同一穗上开花开始的时间)、热应激(因为我们在炎热的季节进行了筛选)和/或昆虫喂养对柱头的损害。由于自交袋基部闭合不良，自交袋内的花粉污染，携带花粉的昆虫进入袋内，或在喷灌或降雨时自交袋开口的胶角，雄性不育植株的结实率会高于预期。相比之下，花药的不育性和可育性的分类更加明显，因此，我们可以假设与自交结实率相比，花粉产生的错误率更小。

基于花粉产量检测到的QTL的KASP标记，我们发现可育个体可以以合理的准确性预测，而不育基因型则不能很好地预测(图2)。4B.）.这表明在这个阶段，我们的KASP标记适合于选择恢复系类型，而不适用于保持系。这一发现肯定与相对较低的R值有关²价值，并应在未来的研究中验证，开发适合选择维护线的Kasp标记。

株高分析作为参考特质，因为我们的定位群体中分离出了一个矮秆基因（D.₂）;通过Azhaguvel等人预先将该基因映射到LG 4。[32.]和Parvathaneni等。[33.]．在lg4 (R²_adj.= 24.5%)，我们可以假设该轨迹与D._2。在同一联动组上发现此QTL被用作交叉检查对我们的其他QTL分析的正确性。但是，Azhaguvel等人。[32.]估计D.₂LG4基因座解释了64%的表型变异，远高于R²Adj.我们估计的价值(24.54%)。最可能的原因是Azhaguvel等人使用的人口[32.]是由两个非等位半矮化株系杂交而来，因此高株的比例比我们的F₂人口。此外，他们发现LG 1的轨迹D.₁矮秆基因。在我们的株高LOD曲线上有LG1（图一个峰值。3C）仅在LOD阈值以下，这可能与之相关D.₁原始的基因座由Azhaguvel等人映射。[32.]．

对未来育种计划的重要性

我们和Punnuri等人的研究[25.研究表明，基于gbs - snp的连锁图谱基于F₂或Ril映射群体，由于高标记饱和度，适用于珍珠米中的QTL检测。GBS是目前最具信息丰富且经济高效的标记类型，但应该注意，GBS实现的高标记号不能完全被剥削₂与RILs相比，它的重组率更低(因此标记冗余度更高)。为了进一步验证A4细胞质中修改育性恢复的小基因的存在，需要使用RIL群体验证我们的结果。

本研究鉴定了一个主要的雄性不育恢复/雄性不育维持基因₄珍珠小米CMS系统,这是理解这种经济上重要特征的遗传基础的关键步骤。了解基因位置将提供珍珠小米育种者更有效的策略，以开发携带专业的男性父母RF.等位基因。通过整合常规和标记辅助选择恢复等位基因的迟滞速度将节省时间，而基于纯粹表型选择。然后可以使用使用综合方法保存的资源来开发较高数量的强恢复混合男性父母₄CMS系统或分配到其他部分的育种计划。特别是在西非，杂交育种刚刚开始，恢复基因型在当地地方品种和改进的开放授粉基因型中相对少见[17.]，恢复基因的更有效的基因渗入将大有益处。

同样，这项研究是迈向主要A的高效迟钝的第一步₄维护等位基因（RF.）成种子亲基因库。高效的基因渗入将使珍珠粟杂种优势池独立的特定种质的维护者/恢复特性建立起来，从而使饲养者把重点放在遗传多样性，结合能力，农业形态特征。

这项研究的表型数据以及Gupta等人。[16.]表示A的单基因遗传₄男性生育恢复/男性无菌维护。这种遗传是在混合育种中的遗传，因为它相对简单到渗目，通常受环境的影响很小。然而，我们的映射QTL解释的意外的低方差表明存在次要或修改基因。未来采用RIL人口的研究应该调查是否是a的生育恢复₄根据父母的遗传背景，系统受几种主要基因的仅受到几种主要基因的影响，或通过多种主要基因影响。这可以解释在本研究中QTL解释的观察到的表型方差的相对较低的部分。除此验证外，开发的kasp标记可用于应用珍珠小米杂交繁殖中所需的HaploOck的高通量筛选，从而促进珍珠米杂交父母的发展。

植物材料

F₂190个厂的作图群体为这个研究开发。植株分离对于A₄以雄性不育恢复为主要目标性状D.₂矮化植物高度作为次要目标特质。这个f.₂人口地图是在尼日尔尼亚美的ICRISAT萨赫勒中心通过F₁由自交系ICMA 02777 × ICMR 08888单株×单株杂交获得。190株植物由70华氏度的3个亚居群进化而来₂植物每一个，通过自行一个f来源的子群₁植物。播种种子的一部分没有建立工厂，因此不能进行表型。A.₄-Cytoplasm雄性无菌线ICMA 02777通过将其核基因组回交至81A来源于ICMB 02777₄细胞质来源和是纯合子的半矮株高度在D.₂矮化基因座。ICMB 02777的血统是HHVBC-II HS-9-1-1-2-7-1，其中HHVBC-II是ICRISAT-PATUNCHORU繁殖的第二高头体积B-复合物，其实质性遗传背景衍生自Iniadi来自多哥的地方种种质。在ICRISAT-Patancheru上通过自交育种，选育出了恢复系ICMR 08888D.₂轨迹。ICMR 08888 has the pedigree ICMS 7704-S1–52–3-1-2-1-2-1-6-B-B, indicating that this inbred is derived from the 52nd S1 progeny of ICMS 7704 that was evaluated, and that seven generations of single-plant selection with selfing were followed by two generations of advance of bulks of seed from two or more selfed plants. Seed parent pair ICMA 02777/ICMB 02777 and restorer line ICMR 08888 were both developed at ICRISAT-Patancheru. Although they are relatively long-duration for Indian dryland conditions, their lifecycles are generally too short for most pearl millet producing regions in West and Central Africa.

表现型

F.₂190家工厂的人口加上他们的父母线在尼日尔·纳伯德·纳伯德·纳伯特的ICRISAT研究站的灌溉条件下提出，曾在2014年3月16日耕作。由于推荐施肥，该作物是每山的单一植物种植．在五叶阶段，将单叶从每个植物收集到标记的咖啡过滤器中，用套装和标记的咖啡滤光器放置在含有硅胶干燥剂的拉链锁塑料袋中，然后在塑料袋中储存在额外的干燥剂中空调种子储存，直到它们可以为DNA分离和基因分型运送。在靴叶阶段，每植物的两个新出现的胶质袋用半透明羊皮纸袋封闭，用纸夹封闭，以实施自我授粉，随后出现的圆锥形露出，以便于观察花盆结构，花粉棚，和开放式授粉的种子集。在花粉脱落期间，植物的花药被归类为雄性肥沃（轴承花粉生产的花药）或男性无菌（轴承仅缩小的花粉）。此后，这种特性将被称为花粉生产。它可以在188 f上得分₂植物。

成熟时，每个F₂将植株自交结实作为附加表型进行评分，以评估目标性状雄性不育恢复;2 = 5 ~ 50%的自交结实率(部分雄性可育);3 = 50%以上自交结实率(雄性可育)。由于强风导致部分植株自交袋损失，自交结实率达到181株。

F.₂人口被隔离D.₂在以前的研究中已经映射的矮化基因[32.,33.，并作为一个参考性状，以验证我们的连锁图谱和F₂人口。我们记录了190华氏度上的株高(厘米)₂植物。

在花粉产生方面，我们用χ²-测试。

DNA提取，基因分型，通过测序和SNP主叫

从干嫩叶中提取基因组DNA₂植物和使用DNeasy Plant Mini试剂盒（QIAGEN公司，瓦伦西亚，CA）它们的亲本系。使用进行提取的DNA的质量和数量检查后III消化和凝胶分析。每196个DNA样品的50个微升等分试样（190°F₂个体和6个亲本)，含> 10 ng μL^{- 1}每个样本被放入三个96深井板，送到位于纽约伊萨卡的康奈尔大学基因组多样性设施进行GBS分析。盘子中剩余的空间被我们项目中更多的珍珠小米样品填满。每个96孔板包含一个随机定位的空白。

根据Elshire等人的说法，康奈尔大学的基因组多样性设施准备和分析了GBS文库。[22.]，利用限制性内切酶太平洋标准时间I和在上Illumina公司HiSeq2000与单端96重级测序读测序。

原始的GBS数据文件(FASTQ)使用Tassel 5(版本5.2.28)的GBS版本2管道处理到SNP调用[34.]．测序标签与珠光米基因组测序联盟提供的珍珠米参考基因组序列对齐[27.]，使用Burrows轮车对齐工具（BWA）[35.]．

质量检查和基因图谱构建

使用Tassel 5.呼叫高质量的SNP 5. SNP缺少20％以上的数据，低于40％以下的次要等位基因频率，或者在一个或两个父母中杂合的那些。出现> 50％缺失数据的基因型（植物）被除去数据。在此过滤后，使用FSFHAP算法省去剩余的2445个SNP [36.在TASSEL 5中实现。

在每个标记上进行Chi-Square测试1：2：1（a：h：b）预期基因型分离比率，以评估分离扭曲的量。在多次测试的Bonferroni校正后，仅29个SNP在5％水平上显示出显着的分离失真。丢弃这些SNP。

遗传图谱采用MSTmap算法构建[37.]在R包ASMAP中实现[38.,39.]．将总共​​73个SNP标记物指定为远离链接基团（LG），SNP数量非常低，被丢弃。LG的编号基于基因组序列，其对应于Rajaram等人发布的共识图的编号。[20.]．使用软件包R / QTL中的着陆绿色算法重新估计地图长度，并选择Haldane函数。具有其2343标记的遗传图含有许多冗余标记（由共分离引起的），其被排除在外，因此最终的联系地图基于460标记。

QTL作图

使用软件PLABMQTL进行QTL分析[40.使用基于多重回归]复合区间作图[41.]．QTL定位模型包括加性效应和显性效应，采用逐步回归方法选择辅助因子。

根据Churchill和Doerge凭经验确定了赔率（LOD）分数的关键对数[42.， α = 0.05。花粉产量的LOD阈值为4.02，自交结实率为4.01，株高为3.83。个体QTL (R²_adj.)计算。为了评估QTL检测结果的质量，通过进行1000次5倍交叉验证，确定了1-LOD支持区间内QTL的发生(QTL频率)[40.]．由于表型的非正常分布，我们还使用R中的GLM（）函数对数据进行了逻辑回归。结果几乎与原始结果几乎相同，因此他们没有进一步考虑。

KASP-marker发展

上LG 2的主效QTL的两个侧翼的SNP被转换成KASP测定。SNP S2_11085781 was converted into KASP assay PM_S2_11085781, which comprised the two allele specific primers PM_S2_11085781_T (5’-FAM-TailSeqGGAACCATCGCAACATCGTAAGA-3′) and PM_S2_11085781_G (5’-HEX-TailSeq-GGAACCATCGCAACATCGTAAGC-3′) and the common primer PM_S2_11085781_Com (5’-GGGTTGAAGACCAGAGGATAGTCTGC-3′). SNP S2_19564901 was converted into KASP assay PM_S2_19564901, which comprised the two allele specific primers PM_S2_19564901_G (5′- FAM-TailSeqCTCGTTGGTCAGAATGGACATCAG-3′) and PM_S2_19564901_A (5’-HEX-TailSeq-CTCGTTGGTCAGAATGGACATCAA-3′) and the common primer PM_S2_19564901_Com (5′- ACGCAACATTCCCTAAGCGAAGTT-3′). For both KASP assays the FAM-allele corresponds to the sterile parent and the HEX allele to the fertile parent. Both assays were run as 6 μl PCR reactions, with a standard KASP 61–55 °C touchdown PCR program (http://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/kasp-technical-resources/）在RocheLightCycler®480ii仪器上。

CMS:

细胞质雄性不育

GBS:

基因分型逐序列

LG：

连锁群

LOD:

对数的赔率

QTL：

定量特质基因座

SNP:

单核苷酸多态性

此外，我们感谢H. F.伍兹和H. P.莫尔的有益的讨论和支持，R. K. Varshney和S.芥兰为我们提供了珍珠粟参考基因组的当前版本。我们承认，在早期版本的手稿四个匿名评审的批评意见。

资金

德国经济合作与发展部（BMZ）支持这里提出的实地研究（Giz项目编号13.1432.7-001.00），麦克奈基金会协作作物研究计划为B.I.G提供了酌情研究资金。Haussmann，曾经支持A. Pucher。J. Wallace由格鲁吉亚大学支持。

可用性数据和材料

在当前研究期间生成或分析的数据集可从相应的作者获得合理的请求。

从属关系

1. Hohenheim，21，D-70599，Stuttgart，德国植物育种研究所，种子科学与群体遗传学研究所，SEY SENCEST TERS TEANTING

   Anna Pucher，Sen Han＆Bettina I. G. Haussmann

2. ICRISAT萨赫勒中心，12404，尼亚美，BP，尼日尔

   C.汤姆哈希

3. 佐治亚大学作物与土壤学系，30602，美国佐治亚州雅典

   杰森·g·华莱士

4. Hohenheim大学，Fruwirthstr，21，D-70599，斯图加特，德国州植物养殖学院

   Willmar l .花环

贡献

所有作者都确认了他们的贡献，阅读，评论和批准了这份手稿。AP、CTH和big构思并设计了实验。AP、CTH和WL进行实验。AP、JGW、WL和SH对数据进行了分析。AP和CTH撰写了手稿的初稿

相应的作者

对应于Bettina I. G. Haussmann．

伦理批准和同意参与

不适用

同意出版物

不适用

相互竞争的利益

提交人声明他们没有竞争利益。

出版商的注意

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再版和权限