橄榄中新型超氧化物歧化酶同工酶的鉴定(gydF4y2BaOlea EuropaeagydF4y2Bal .)花粉gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

在抗氧化剂酶中，超氧化物歧化酶（SOD）家族是催化超氧化物抑制的主要作用。除了其作为抗氧化剂的作用外，这些酶在细胞信号传导中具有作用，Cu，Zn-SOD蛋白也是主要的花粉过敏原。为了深化我们对橄榄花粉中存在的SOD同工酶的理解，并分析花粉铜，Zn-SOD家族的分子变异，我们对不同橄榄品种和其他过敏性物种进行了花粉谷物的生化，转录组和本地化研究．gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

橄榄花粉显示出所有品种测定的高分草皮活动率高，这与花粉活力无关。与活性测定和蛋白质印迹实验一起进行质谱分析，使我们能够鉴定新形式的Cu，Zn-SOD酶（包括叶绿体和过氧化物体形式）以及差异表达的Mn-，Fe-和Cu，Zn-SOD同工酶不同橄榄品种和过敏性物种的花粉。Cu，Zn-Sod的超微结构定位揭示了花粉晶粒中的体积素定位。我们还鉴定了缩短形式的细胞溶质Cu，Zn-SOD酶的发生，这可能是替代剪接的结果。与全长形式相比，该较短的酶显示出较低的SOD活性。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

橄榄树花粉中存在多种SOD同工酶，这可能与橄榄树花粉从成熟时的静止状态向萌发时的高度代谢活跃状态过渡过程中需要精细调节ROS代谢有关。gydF4y2Ba

大约1％的ogydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在不同的亚细胞位点产生活性氧[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．活性氧是一个包含羟基自由基(HO)的术语gydF4y2Ba^．gydF4y2Ba），过氧化氢（hgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)，超氧自由基(OgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba^{．-gydF4y2Ba}）和单线氧（gydF4y2Ba^1gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)．在植物王国中，虽然在生物和非生物胁迫条件下发生ROS生产和ROS诱导的损伤，但RO也与分子信号相关[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．在较高的植物中，增强的氧化也是用于对环境和发育提示的基因表达和细胞结构中适当调整的信号[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

活性氧(尤其是HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)和植物生殖生物学。花粉管生长需要高能量，活性氧来源于有氧代谢。此外，由于花粉和雌蕊组织之间的信号交换，花粉管的生长通过雌蕊被引导，ROS似乎作为信号参与了这个过程。活性氧，主要是HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba，并且当成熟的柱头接受花粉粒时，检测到高水平的过氧化物酶活性[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．它们在柱头中的积累与花粉粒中一氧化氮(NO)的产生有关[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]，这似乎是负面调节hgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba当花粉粒粘在柱头乳头上时[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．此外，在百合花粉管生长的振荡周期与ROS之间已经建立了明确的联系[gydF4y2Ba10.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

细胞内ROS的水平是由一个巨大的基因网络控制的[gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba］．这些ROS在代谢过程和应激条件下产生，并且它们通过宽抗氧化系统减少。抗氧化剂可以是非酶促的，包括抗坏血酸，生育酚，谷胱甘肽，黄酮类，生物碱和类胡萝卜素[gydF4y2Ba12.gydF4y2Ba］．酶促抗氧化系统由超氧化物歧化酶（SOD），过氧化氢酶（猫），过氧化物酶（POD）和抗坏血酸谷胱甘肽循环酶组成[gydF4y2Ba13.gydF4y2Ba]等等。gydF4y2Ba

SOD家族催化超氧化物的歧化（ogydF4y2Ba_2gydF4y2Ba^{· -gydF4y2Ba}）生物系统中的基团形成hgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和o.gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba［gydF4y2Ba14.gydF4y2Ba]，它在保护细胞免受不同细胞室中产生的超氧化物自由基的毒性作用起着重要作用。植物SOD是含有Fe，Mn或Cu / Zn作为假体的金属酶。SOD同工酶的数量，类型和分布可以根据物种，发育阶段和环境条件进行改变[gydF4y2Ba15.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

铁- sod，可能是最古老的一类sod [gydF4y2Ba18.gydF4y2Ba，是植物中普遍存在的酶[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]，被H灭活gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba但耐受kcn的抑制作用。第一组Fe-SODS由两种相同的20kDA亚单元形成的同型二聚体组成，活性中心中的一个或两个Fe原子形成。在大多数植物中发现的第二二氧化钠组是80-90kDa的四聚体，在活跃中心含有两到四个Fe原子[gydF4y2Ba18.gydF4y2Ba］．FE-SODS主要发现在叶绿体中[gydF4y2Ba21.gydF4y2Ba]，并且越来越少在线粒体和过氧化血症中[gydF4y2Ba22.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

锰SOD是由23 kda亚基组成的功能性同源物和同源异构体[gydF4y2Ba24.gydF4y2Ba］．它们不受氰化物或H抑制gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba，存在于线粒体和过氧化血症中[gydF4y2Ba16.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27.gydF4y2Ba］．Mn-SOD基因在所有细胞类型中都有表达，是唯一存在于血管组织中的SOD [gydF4y2Ba19.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

铜，锌-sods是普遍存在的，非常稳定的同源二聚体酶约为32kDa [gydF4y2Ba28.gydF4y2Ba］．每个亚基含有涉及歧化反应的Cu原子，抗酶的Zn原子以保持适当水平的催化活性并催化生理缓冲液中的SOD折叠[gydF4y2Ba28.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．这种酶可被氰化物和H可逆地抑制gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba浓度≥10μm[gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba］．铜/锌- sod位于细胞质、叶绿体、过氧化物酶体和质外体中[gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba］．叶绿体Cu，Zn-Sod序列含有153个氨基酸，末端是雷，ILE或VAL，而细胞溶质同工酶是152个氨基酸长，最后一个始终是一个含量的含量[gydF4y2Ba40.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

以前的工作报告最多四种Cu，Zn-Sod形式〜16 kda和pgydF4y2Ba我gydF4y2BaS从橄榄花粉中的5.1至6.5范围为5.1至6.5，该花粉中的植物和生成细胞的细胞质局限于[gydF4y2Ba41.gydF4y2Ba]在过氧化血症中[gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba］．Cu、Zn-SOD也是一种过敏原，在人群中发病率为35% [gydF4y2Ba42.gydF4y2Ba］．通过使用橄榄花粉转录组和进一步的PCR验证，通过生物信息学方法评估该过敏原的分子变异性，并进一步PCR验证[gydF4y2Ba43.gydF4y2Ba］．在本研究中，我们对橄榄花粉中存在的不同SOD同工酶有了更深入的了解，并揭示了新的SOD形式的存在。我们还分析了Cu、zn - sod在几个品种中的分子变异，并讨论了这种变异在生殖生物学和过敏反应中的重要性。gydF4y2Ba

橄榄花粉粒超氧化物歧化酶活性gydF4y2Ba

花粉中SOD活性高于橄榄叶片等其他组织，其蛋白含量为1.7 U/mg [gydF4y2Ba19.gydF4y2Ba］．橄榄花粉蛋白提取物根据品种（f = 26.648）显示出非常不同的SOD活性。gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.000)。因此，总SOD活性范围为3.9（CV。'BlanQueta'）至23.7（'Bella deEspaña'）U / Mg的总蛋白质（图。gydF4y2Ba1AgydF4y2Ba)．以Picual为参考品种，其他8个品种(Lechín、Verdial、Arbequina、Cornicabra、Blanqueta、Empeltre、Farga和Frantoio)的活性水平显著降低，而其余品种的检测结果相似(图1)。gydF4y2Ba1AgydF4y2Ba)．鉴于花粉活力可能会根据品种和环境条件而变化，我们还检测到品种中该参数的差异（F = 46.868，gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.000)。所有被分析的品种的活力值都低于‘Picual’(图。gydF4y2Ba1B.gydF4y2Ba)．但总SOD活性与花粉活力无相关性(gydF4y2BargydF4y2Ba= 0.177,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.228)。gydF4y2Ba

在本地凝胶中也观察到不同的SOD活动带型材，这取决于栽培品种（图。gydF4y2Ba2AgydF4y2Ba)．通过nanoLC-ESI-MS/MS分析从SOD活性凝胶(cv ' Picual ')中切除的条带，证实了Mn-SOD和Cu、Zn-SOD同工酶的存在。因此，I和III波段与Mn-SOD酶匹配，而Cu、zn - sod在II、IV和VII波段被识别(见附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba：表S1）。频段V和VI在MS / MS分析中没有给出任何正匹配。由于在橄榄花粉转录组中也鉴定出四种不同的胞质Cu，Zn-SOP的转录物，因此这些数据与我们的结果吻合良好。在橄榄花粉转录组中也鉴定出来（表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．MS波段分配也通过抑制试验进行评估(图。gydF4y2Ba2b，cgydF4y2Ba)．我们在所有供试品种的橄榄花粉提取物中鉴定了不同数量的Cu/Zn-， Mn-和fe - sodgydF4y2Ba．gydF4y2Ba有趣的是，在丙烯酰胺凝胶上发现Mn-SOD活性显著高于Cu、Zn-和Fe-SOD活性。多数品种均表现出7条带状分布。上面的条带(I)与Mn-SOD相对应，这在Bella de España中是没有的。条带II和III分别对应于Cu,Zn-和mn - sod，在所有品种中均存在。IV波段被认为是Cu,Zn-SOD，只出现在‘Picudo’和‘Picual’中。V波段在所有品种中均被鉴定为Fe-SOD。最后，VI和VII波段也与Cu、zn - sod对应，在不同品种间存在差异表达。因此，在cvs中显示了VI波段。' Verdial de Vélez Málaga '， ' Farga '和' Frantoio '，而VII级存在于所有品种，除了' Empeltre '和' Galega '。gydF4y2Ba

花粉铜，橄榄品种Zn-SOD酶变异性gydF4y2Ba

16个油橄榄品种的Coomassie-stained 1- d凝胶的花粉蛋白谱存在显著差异，主要与一个18 - 20kda的带簇有关，该带簇对应于主要的油橄榄花粉过敏原Ole e 1(图1)。gydF4y2Ba3AgydF4y2Ba)。用抗csd2抗体进行免疫印迹检测，发现所有提取物中多达6个不同的条带，分子量约为72.0,54.0,23.5,16.0,15.3和14.5 kDa(图)。gydF4y2Ba3B.gydF4y2Ba)．在其理论分子量的基础上，23.5和16.0kDa的带可能对应于Cu，Zn-SOD酶（分别与其比较后分别为OECSD2和OECSD3的过氧式体形式）对应的gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2BaTAIR数据库中描述的正轨：gydF4y2Bawww.arabidopsis.org.gydF4y2Ba)．此外，15.3 kda带可能会对细胞溶质OECSD1.1a，OECSD1.2和OECSD1.3的形式进行分组，而14.5kDa带可以与OECSD1.1b酶匹配（所有这些形式也根据该形式命名gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2BaTAIR数据库中存在的同系物)。gydF4y2Ba

与1D一样，从橄榄品种‘Picual’中提取的全蛋白的二维凝胶也显示了Ole e 1的良好斑点。用Cu、Zn-SOD抗体进行免疫印迹检测，分子量分别为15、22、32、40、60 KDa的不同位点对该抗体均有反应。凝胶免疫印迹图像的重叠使我们能够在火烈鸟染色后，在橄榄花粉提取物的二维凝胶中确定铜、锌- sod的位置。免疫反应点的分布表明，在整个膜上存在多个同工酶，Ips集中在整个膜上，根据适用于1-DE的相同标准，这些同工酶分别被认为是胞质、过氧化物酶体和质体单体Cu、Zn-SOD形式。其他几个交叉反应蛋白没有被分配(见附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba：图S1）。gydF4y2Ba

为了评估观察到的高分子量条带是否与Cu、Zn-SOD酶的多组分形式相对应，我们开发了一种新的检测方法，在SDS-PAGE和免疫印迹之前，将花粉提取物与一组还原和/或变性剂孵育。gydF4y2Ba4AgydF4y2Ba)．在1-D检测抗橄榄花粉Cu,Zn-SOD抗体时，获得了与抗csd2抗体相似的条带模式(图)。gydF4y2Ba4B.gydF4y2Ba)或2d(见附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S1)墨迹。此外，利用该抗橄榄花粉Cu、Zn SOD抗体，在免疫印迹上还发现了3种新的高分子量多肽，分别为~ 64.0、48.0和42.0 kDa。gydF4y2Ba4B.gydF4y2Ba)．对定制抗体反应的谱带的分布不受诸如尿素和硫脲等向潮剂处理花粉提取物的影响(数据未显示)。与非还原条件下的提取物相比，DTT有利于鉴定胞质(14.5-15.3 kDa)、过氧化物酶体(16.0 kDa)和叶绿体(23.5 kDa)单体Cu、Zn-SOD(图)。gydF4y2Ba4B.gydF4y2Ba)．然而，DTT并没有降低抗橄榄Cu,Zn-SOD Ab在42.0 - 72.0 kDa范围内对高分子量条带的结合能力，即使在高浓度下。当使用多达50 mM的还原剂三苯基膦(TBP)时，这些条带才从免疫印迹中消失(图)。gydF4y2Ba4B.gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

Pollen Cu，Zn-SOD酶在不同过敏植物种类中的变异性gydF4y2Ba

鉴于Cu的过敏性质，Zn-Sod（也称为Ole E 5 Allergen），我们评估了Cu，Zn-SOD的存在，在九种过敏性物种的花粉中对抗体反应。一维凝胶显示出高差异蛋白质分布图案（图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．利用抗橄榄Cu,Zn-SOD抗体，在不同的物种中检测到一个单一的交叉反应条带，其大小在~ 12.0 ~ 15.4 kDa之间。此外，还检测到分子量在~ 18.1 ~ 67.4 kDa之间的少量免疫反应条带gydF4y2BaPhleum Praatense.gydF4y2Ba．这些分子量可能表明该物种中存在多分子形式。的gydF4y2Ba藜gydF4y2Ba和gydF4y2BaDactylis glomeratagydF4y2Ba花粉提取物对抗体显示出非常微弱的反应性。gydF4y2Ba

橄榄花粉晶粒中Cu，Zn-SOD酶的TEM免疫烫化gydF4y2Ba

患有年轻和成熟花粉晶粒的切片受到免疫细胞化学分析。成熟花粉阶段的特征在于存在完全分化的花粉外来和完全吞噬生成细胞的营养细胞（图。gydF4y2Ba6AgydF4y2Ba)．在这个阶段，金标记主要检测到营养细胞的细胞质和花粉外壁(图。gydF4y2Ba6B.gydF4y2Ba-gydF4y2BacgydF4y2Ba）以及差异不良的细胞器，其可以对应于体积和过氧缺体（图。gydF4y2Ba6CgydF4y2Ba-gydF4y2BadgydF4y2Ba)．阴性对照没有显示任何标签（图。gydF4y2Ba6e.gydF4y2Ba)．幼花粉期由生殖细胞的横向位置决定。gydF4y2Ba6f.gydF4y2Ba-gydF4y2BaggydF4y2Ba)．在营养细胞的细胞质中检测到标记，并与细胞器相关，其中一些是由于淀粉颗粒存在而被鉴定为塑体（淀粉片组），有时在这些细胞器的区域中偏振（图。gydF4y2Ba6h.gydF4y2Ba-gydF4y2BajgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

描述的胞质gydF4y2BaRoecsd1.1a.gydF4y2Ba和gydF4y2BaRoecsd1.1b.gydF4y2Ba酶gydF4y2Ba

全长(OeCSD1.1A)和短(OeCSD1.1A)形式的重组胞质Cu,Zn-SOD的身份由MALDI-TOF/TOF确认(见附加文件)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba:表S2)。这些重组蛋白以His-tag融合蛋白表达，SDS-PAGE测定分子量分别约为22.1 kDa和21.3 kDa(图1)。gydF4y2Ba7AgydF4y2Ba)．氨基酸序列计算的理论分子量分别为15,306.90和14,521.15 Da。理论和经验的Mw值之间的差异可能是由于重组形式的his标签的存在。在非还原条件下，还观察到rOeCSD1.1A和OeCSD1.1B分别为~ 44.5和~ 42.8 kDa的额外条带(图)。gydF4y2Ba7AgydF4y2Ba，星号）。这些蛋白质带可能对应于二聚体形式，因为在DTT处理后它们从凝胶中除去。抗Cu / Zn-SOD抗体识别单体和二聚体形式（图。gydF4y2Ba7B.gydF4y2Ba），其在非还原条件下活跃（图。gydF4y2Ba7C.gydF4y2Ba)．但还原后，只有单体酶保持活性。对平行的天然丙烯酰胺凝胶(包括重组蛋白和花粉总蛋白提取液)进行SOD活性测定，并使用定制的抗橄榄铜、锌-SOD抗体进行天然免疫印迹分析(见附加文件)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba：图S2）。较短的酶显示出较低的活性水平，均可重组蛋白质是活性的。此外，观察到在数量和凝胶位置方面的活性和AB反应带之间的良好对应关系。gydF4y2Ba

花粉中的SOD活性高于植物组织中的活性，与活力无关gydF4y2Ba

花粉中的超氧化物歧化酶活性高度可变，依赖于品种测定，值范围为5至25u / mg蛋白。我们研究中的花粉样品在同一发展阶段收集，并在同一天收集，分析的所有品种树木彼此靠近。因此，我们不应该期望环境因素对SOD活动率的重大影响，并且由于其独特的遗传背景，品种之间的差异应该是相当的。活性氧物种稳态对于适当的花粉功能至关重要。因此，ROS，特别是HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_{2，gydF4y2Ba}作为不同的花粉裂解过程中的信号参与[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]如自我不相容[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45.gydF4y2Ba]以及在其顶端生长期间驱动花粉管极化的事件中[gydF4y2Ba45.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba46.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba47.gydF4y2Ba］．因此，观察到的SOD活性的高率可能有助于平衡花粉粒度在水合和发芽时的极高代谢速率。此外，先前的研究表明，在几种物种中，Cu，Zn-SOD活性和对干燥的耐受性之间的直接相关[gydF4y2Ba48.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba49.gydF4y2Ba］．这一事实表明，高水平的SOD活性也可能保护高度脱水的成熟花粉从开裂的花药到接受柱头的过程。这些品种花粉活力与SOD活性缺乏相关性可能有不同的解释。首先，基于fcr的活力检测是基于活性酯酶的存在，而不是基于sod的存在[gydF4y2Ba50.gydF4y2Ba］．其次，虽然SODS可以在成熟阶段之前积累，但在花粉水合和萌发和花粉管生长期间，它们的功能可能在更高的速率下进行。gydF4y2Ba

橄榄花粉颗粒含有全套Cu，Zn，Mn-和Fe-Sod同工酶gydF4y2Ba

在橄榄花粉中存在多达四种铜、锌- sod形式。' Picual ')，在等电聚焦实验之后[gydF4y2Ba41.gydF4y2Ba］．在与此处显示的转录组数据进行比较之后，在免疫印迹上观察到的〜15.3kDa带，并且最初分配为单个多肽，其实际上可能是三种不同的胞质Cu，Zn-SOD形式，即CSD1.1a，CSD1.2和CSD1。3.这些SOD形式显示出非常相似的理论分子量，范围为15.2-15.3kDa，因此在1-D电泳后不能区分它们（表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．然而，二维电泳分离允许我们根据它们不同的等电点来区分它们(见附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba：图S1）。还识别了八AA较短形式的〜14.5kDa，并在下面讨论。四个氨基酸序列显示出品种“皮革”和“Farga”中的100％同一性，这表明这些蛋白质可能在橄榄种质中受到高度保守。gydF4y2Ba

在该植物花粉粒中还鉴定了2种Fe-SOD和Mn-SOD同工酶。转录组数据也支持相应转录本的存在(表)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．以前的工作证明了玉米花粉粒度在极低水平下表达了Mn-SOD基因[gydF4y2Ba50.gydF4y2Ba］．然而，为了我们的知识，这是第一次清楚地证明了MN-SOD和Fe-SOD的第一次存在于雄性配子体中的蛋白质水平。铁SOD通常与叶绿体相关[gydF4y2Ba21.gydF4y2Ba]，而MN-SOD同工酶存在于线粒体和过氧缺血中[gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27.gydF4y2Ba］．有趣的是，营养细胞的细胞质，以及顶点后面的区域中的花粉管含有丰富的线粒体和塑性体，两者都涉及花粉成熟和花粉管生长期间的能量供应[gydF4y2Ba51.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba52.gydF4y2Ba］．这表明花粉中Mn-和Fe-SOD酶可能参与了这些细胞器中ROS的稳态。gydF4y2Ba

质量和过氧化铝铜，Zn-SOD酶存在于花粉粒中gydF4y2Ba

基于生化和转录组学数据，我们认为免疫印迹上观察到的16.0和23.5 kDa条带可能分别对应过氧化物酶体和叶绿体Cu、Zn-SOD蛋白的单体形式。通常，那些最初针对胞质Cu、zn - sod的定制抗体也可以识别其叶绿体[gydF4y2Ba53.gydF4y2Ba[过氧化碳[gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba，因为这两个序列之间具有高度的同源性。一些商业上可获得的胞质Cu、zn - sod抗体也被报道与它们的叶绿体和过氧化物酶体当量在一定程度上发生交叉反应，这在目前的工作中得到了明确的证实。翻译后修饰的存在可能解释了二维免疫印迹检测到的大量斑点(见附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S1)，尽管没有直接证据支持这一假设[gydF4y2Ba54.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba55.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba56.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

据报道叶状蛋白Cu，Zn-Sod存在于近距离Psi的基质面上的营养组织的类植物组织的囊体膜中存在[gydF4y2Ba57.gydF4y2Ba］．在成熟橄榄花粉中对SODS进行了先驱[gydF4y2Ba41.gydF4y2Ba]未能报告存在氯化氯，Zn-SOD形式。这可能是通过橄榄成熟花粉细胞器通常未分化的事实解释，除非使用了特定的制备方法或标记，否则在许多情况下，塑性化，线粒体和过氧缺体是难以区分的[gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba］．淀粉素的存在，一种负责合成和储存淀粉的塑体，以成熟的花粉颗粒已经通过[gydF4y2Ba58.gydF4y2Ba］．有人认为，质体糖酵解与线粒体呼吸、发酵和胞质糖酵解是花粉成熟和花粉管生长过程中代谢能量的一些途径[gydF4y2Ba52.gydF4y2Ba］．本文报道了一种Cu,Zn-SOD酶在成熟花粉粒中与质体相容的亚细胞结构中的定位。在较年轻的阶段，信号明显归因于淀粉体，这是很容易识别的淀粉含量。在橄榄(cv.)中鉴定出了叶绿体Cu、zn - sod的两个部分核苷酸序列。' Picual ')花粉转录组(见表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．这两个部分氨基酸序列重叠以产生与橄榄（CV.'Varga'）基因组中存在的氯贫吡啶Cu，Zn-Sod显示99.13％同一性的完整序列。gydF4y2Ba

营养细胞和花粉管的细胞质还含有过氧缺血剂[gydF4y2Ba59.gydF4y2Ba］．最近的工作明确证明了通过使用定制的抗Cu，Zn-SOD AB和对过氧化氢酶反应性的TEM的共定位实验，通过CEN的共定位实验证明了橄榄花粉过氧化合物中的Cu，Zn-SOD酶的存在。酶[gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba］．在本研究中，还通过转录组数据（表格）支持特异性过氧血清铜的存在，Zn-SOD转录物（表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．因此，完全氨基酸序列显示出99.35％的同一性与来自橄榄基因组的序列（表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．三分离分别在三分离分别进行橄榄花粉SOD的分子发育分析（图3）gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．在Cu,Zn-SOD分支，胞质，叶绿体和过氧化物体Cu中，Zn-SOD被放置在单独的分支中，每个分支与其他类似的植物Cu,Zn-SOD(图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

花粉中Cu、zn - sod可能形成多聚酶复合物gydF4y2Ba

免疫印迹观察到的高分子量SOD条带可能与这些酶的多组分形式相对应。事实上，高分子量SOD同工酶的存在能够抵抗还原剂(如DTT或β-巯基乙醇)的处理，这已被反复证明，尽管它经常被忽视[gydF4y2Ba55.gydF4y2Ba］．其他作者描述了Cu，Zn-SOD酶作为研究中的一些最稳定的球状蛋白质。它们在高温下保持稳定的天然二聚体结构，即使在还原条件下，由于疏水性界面，股线β - 桶支架的包装，含有链内二硫桥的存在和金属辅因子的稳定效果[gydF4y2Ba60.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

或者，除SOD以外的植物蛋白也可能催化O的疏忽gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba^{· -gydF4y2Ba}自由基。这是针蛋白的情况，含有含锰的蛋白质，结构等同于7S种子储存蛋白（Vicilins），具有双官能（草酸氧化酶和超氧化物歧化酶）特征[gydF4y2Ba61.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba62.gydF4y2Ba］．生长簇易于聚集形成五聚体，更频繁地，高分子量的六烷烃[gydF4y2Ba62.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba63.gydF4y2Ba]，并异常抵抗蛋白酶，洗涤剂和热量[gydF4y2Ba63.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba64.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba65.gydF4y2Ba］．橄榄花粉中鉴定了至少22种转录物（gydF4y2Bahttp://reprolive.eez.csic.es/gydF4y2Ba）与该蛋白质相关的同源性（数据未显示）。验证该酶在橄榄和其他物种中的表达和活性尚未进行。gydF4y2Ba

ole E 5样蛋白在过敏性物种的花粉粒中普遍存在gydF4y2Ba

据报道，铜，锌-sods和mn-sods是在包括昆虫（蟑螂）的各种来源中的过敏性蛋白质（蟑螂）gydF4y2Ba果蝇gydF4y2Ba)、真菌(gydF4y2Baalternaria.gydF4y2Ba，gydF4y2Baaspergillus.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba青霉素gydF4y2Ba，gydF4y2BaCochliobolus.gydF4y2Ba，gydF4y2BaMalassezia.gydF4y2Ba），草（gydF4y2BaPhleum Praatense.gydF4y2Ba)、番茄(gydF4y2BaLycopersicon esculentumgydF4y2Ba),橄榄(gydF4y2BaOlea EuropaeagydF4y2Ba）， 橡胶树 （gydF4y2Ba橡胶树brasilensisgydF4y2Ba),gydF4y2BaPistacia sps。gydF4y2Ba（gydF4y2Bawww.allergome.org/index.phpgydF4y2Ba和文学在其中)。在这项研究中，我们分析了Ole e 5-like (Cu,Zn-SOD)变应原在相对大量的物种的存在，根据它们产生引起过敏的花粉的能力。我们的结论是，它们都带有Ole e 5样形式，这是由抗橄榄铜，锌- sod抗体交叉识别。Ole e 5过敏原被认为是橄榄花粉的一个轻微过敏原，尽管它的发病率低，对这种花粉过敏的人群中，约35%的人会出现过敏症状和IgE和/或皮肤点刺试验(SPT)反应[gydF4y2Ba42.gydF4y2Ba］．物种之间过敏原的交叉反应尚未被广泛分析[gydF4y2Ba66.gydF4y2Ba］．然而，在本研究中获得的结果的基础上，Cu，Zn-Sods和其他SOD酶可能涉及我们分析的物种的复杂allergograge。为了支持这一假设，我们考虑了交叉反应带的类似分子量，酶在许多不同来源中的高保守水平及其在其他因素中的花粉粒度的快速和容易释放。所有这一切都需要使用特定技术进行进一步分析，例如SPT，ELISA和IMMUNOCAP技术。gydF4y2Ba

橄榄花粉含有一种新的较短的Cu,Zn-SOD形式，具有维持功能gydF4y2Ba

橄榄花粉转录组中鉴定的胞质Cu，Zn-SOD序列（OECSD1.1b）中的一种包括重要的24 nt间隙。在基因组中也鉴定了多种Cu，Zn-SOD的Cu，Zn-SOD序列gydF4y2BaO. EuropaeagydF4y2Ba简历。'Farga'，最近测序和注释[gydF4y2Ba67.gydF4y2Ba]以及从叶，根和水果组织产生的转录组中[gydF4y2Ba68.gydF4y2Ba］．我们建议，这更短的Cu，Zn-Sod形式可以是替代剪接事件的结果（图。gydF4y2Ba7D.gydF4y2Ba-gydF4y2BaegydF4y2Ba)．在进一步的硅结构分析中，我们能够预测得到的基因产物可能都是活性酶。因此，在NGS后组装的CSD1.1B序列和作者克隆的CSD1.1B序列的功能不太可能受到很大影响，因为既没有干扰阅读框，也没有干扰关键氨基酸的存在。因此，OeCSD1.1A和OeCSD1.1B酶的异体表达都导致了至少一定程度的适当折叠，尽管两种蛋白中都有一小部分是适当折叠的，这可以通过检测两种表达形式的SOD活性得到证实。值得注意的是，全长SOD酶的活性高于短全长SOD酶。因此，8-AA片段的去除可能不仅对蛋白质的分子量和等电点有轻微的影响，而且还可能导致其活性和/或动力学的细微变化。我们还观察到低量的重组蛋白二聚体形式的自发出现，很可能是通过分子间二硫化物桥的形成。有趣的是，单体酶和二聚酶在天然凝胶上都显示出活性。gydF4y2Ba

另一方面，重组酶的稳定性非常低。因此，在进行SOD活性的分光光度法测定（数据未显示）时，不会获得可重复的结果。诸如不稳定性和活性丧失的特征已被广泛用于单体形式[gydF4y2Ba69.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba70gydF4y2Ba，gydF4y2Ba71.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba72.gydF4y2Ba］．包括缺乏适当折叠所需的离子缺乏足够浓度的其他因素也可能导致蛋白质稳定性的丧失。因此，据报道，Zn原子通过修改其还原电位和几何形状来直接影响Cu位点[gydF4y2Ba29.gydF4y2Ba］．生理pH的负电荷也与Cu，Zn-SOD稳定性有关[gydF4y2Ba73.gydF4y2Ba］．这些蛋白质的产生的进一步改进应使得能够测试这些酶形式的差异性质。gydF4y2Ba

在蛋白质的较短形式中没有所描述的肽可能也可能影响其抗原性和过敏性质，因为已经预测短缺失序列是参与不同的T-和B-epitopes [gydF4y2Ba43.gydF4y2Ba］．由于该蛋白作为过敏原的相关特性(Ole e 5)，这还需要进一步研究。gydF4y2Ba

橄榄花粉颗粒含有一整套的SOD酶，包括细胞源，塑性和过氧甲基异甲酸甲基甲基甲磺酸，Zn-SOD形式以及Mn-和Fe-SOD同工酶。此外，我们鉴定了较少的8 AA-较短的Cu，Zn-Sod形式（可能是替代剪接事件的乘积），这是完全正常的。有趣的是，SOD活性水平依赖于品种，可能是由于橄榄树种质的内在遗传变异性。在花粉晶体中检测到这种通用的酶促电池和高水平的SOD活性，以及​​血清含有其他抗氧化酶和负责维持大分子和膜的结构的因素，这可能会赋予干燥和其他不良环境的抵抗力从后遗症时间到接受耻辱的旅程中的旅程中的因素，也可能还响应在伴随其萌发的高度活跃的新陈代谢期间细细调节ROS稳态的必要性。gydF4y2Ba

植物材料gydF4y2Ba

16种不同橄榄(gydF4y2BaOlea EuropaeagydF4y2BaL.)的品种是从C.I.F.A. Venta del Llano (Mengíbar, Jaén, Spain)的种质收集树中获得的。花粉样品在纸袋中，用力摇动橄榄花序，通过150和50 μm目的尼龙过滤器筛除碎屑，然后在−80°C保存。gydF4y2Ba

成熟花粉样本gydF4y2Ba菊苣、猪毛菜、羊茅、寻常蒿、大花蕙兰、藜、车前草、草原羊茅gydF4y2Ba和gydF4y2BaDactylis glomeratagydF4y2Ba由Inmunal Sau（西班牙马德里）提供。gydF4y2Ba

花粉活力测定gydF4y2Ba

使用荧光素二酸（Sigma，USA）测定花粉活力，如[gydF4y2Ba49.gydF4y2Ba］．观测是在Axioplan荧光显微镜(Zeiss，德国)下进行的，该显微镜配有progress C3 CCD相机，使用progress CapturePro 2.6软件(Jenoptik AG，德国)。每个品种至少有1000个花粉粒，对应3个独立的生物重复。gydF4y2Ba

蛋白质提取和量化gydF4y2Ba

通过在1.5ml萃取缓冲液[50mM磷酸盐缓冲液（pH7.8）和1mM苯基甲基磺酰基（PMSF）在4℃下搅拌0.1g材料，制备来自16个橄榄品种的花粉蛋白提取物。将样品在4℃下以12,000g离心20分钟，通过0.22μm过滤器（MillexGP，Millipore，USA）来筛分上清液并储存在-20℃直至使用。对于2-de，如前所述制备来自'picual'和'arbequina'花粉样品的蛋白质提取物[gydF4y2Ba74.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

通过在2.5ml萃取缓冲液中搅拌0.1g材料[40mM Tris-HCl（pH7.0），2％（gydF4y2BavgydF4y2Ba/ v）Triton X-100,60mM二硫代酚（DTT）和10μL蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Sigma）在4℃下为2小时。使用PD-10柱（GE Healthcare Biosciences Ab，Sweden）脱盐蛋白质提取物并浓缩20％（gydF4y2BawgydF4y2Ba/gydF4y2BavgydF4y2Ba）gydF4y2Ba三氯乙酸gydF4y2Ba（TCA）在冷冻丙酮中过夜。将样品在4℃下以10,000g离心30分钟，并将粒料重悬于40mM Tris-HCl（pH8.8）中。gydF4y2Ba

通过将花粉提取物与DTT（50-200mm）或三丁基膦（TBP）（5-50mm）孵育（3-50mm）和尿素（3.5μm）和/或硫脲来评估用于多聚体SOD的效果的评估在电泳之前，M）分别分别。根据制造商的说明，使用2D量子套件（Amersham Biosciences）定量所有蛋白质提取物。gydF4y2Ba

SOD活性gydF4y2Ba

体外测定蛋白提取物的总SOD活性，方法为[gydF4y2Ba14.gydF4y2Ba］．SOD活性的一个单位（U）定义为抑制细胞色素减少速率的酶量gydF4y2BacgydF4y2Ba在pH为7.8和25°C的耦合系统中，使用黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶。所有活性测定均在三个重复中进行。gydF4y2Ba

花粉SOD同工酶在15%聚丙烯酰胺凝胶上使用Hoefer电泳单元SE 600系列(Amersham Pharmacia Biotech, UK)通过天然PAGE分离，其活性如图[gydF4y2Ba75.gydF4y2Ba］．每巷加载约375μg的总蛋白。在反应缓冲液中也孵育并行本地页面凝胶[5mm HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在SOD活性检测之前，在黑暗之前，2 mm Kcn]在上述SOD活性检测前20分钟。这些实验一式两份完成。gydF4y2Ba

生产重组SOD蛋白gydF4y2Ba

两种橄榄花粉序列（eu250770.1和eu250769.1）分别代表全长和8 aa-shortoned1.1形式，用于产生重组蛋白质（参见附加文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba:图S3)。这两个序列被克隆到pKB6载体(Rekom Biotech SL, Spain)中，生成了SODc-pKB6和SODd-pKB6(见附加文件)gydF4y2Ba6gydF4y2Ba：图S4）。两种蛋白质都表达gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba（Rosetta Bl21帘布层菌株）在37℃下生长，在诱导1mM​​异丙醇-β-D-1-硫代甲酰胺（IPTG）后2小时。使用Ni Sepharose 6快速流动树脂（GE Healthcare Biosciences）通过亲和层析捕获重组SOD，与其标签融合到每种蛋白质的N-末端。通过阴离子交换色谱（Q Sepharose TM Fast Flow，GE Heathcare Biosciences）和Microfroctration使用Acrodisc®注射器过滤器0.2μmHTTuffryn®低蛋白质结合膜（USA，USA），通过阴离子交换色谱（Q Sepharose TM快速流动，GE Heathryn®低蛋白质结合膜（USA）进行浓缩的蛋白质溶液。使用理论消光系数在280nm处定量重组蛋白[gydF4y2Ba76.gydF4y2Ba]，并在20mM磷酸钠（pH8.0）和1M NaCl中储存在-80℃，直至使用。gydF4y2Ba

质谱法鉴定gydF4y2Ba

重组SOD酶的鉴定由López-Neyra寄生虫学和生物医学研究所(CSIC, Granada, Spain)蛋白质组学设施的MALDI-TOF/TOF质谱分析确认。简单地说，按照标准程序，蛋白质被还原、烷基化和酶消化。胰酶消化液(1 μl)与α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)基质溶液(1 μl)混合，应用于AnchorChip靶板(Bruker-Daltonics, Billerica, Massachusetts, USA)。使用Ultraflex Xtreme MALDI-TOF/TOF质谱仪(Bruker-Daltonics)，使用Flex Control v3.4软件(Bruker-Daltonics)获得质谱，使用ProteinScape v3.1.3软件(Bruker-Daltonics)进行处理。采用肽校准标准混合物(Bruker)对光谱仪进行外部校准。在ReprOlive数据库(21,607条序列，3,557,391个残基;［gydF4y2Ba68.gydF4y2Ba]使用吉祥物2.4.0软件（矩阵科学，英国）与Proteinscape软件（Bruker-Daltonics，德国）集成。耐受母离子质量小于50ppm的误差。设定了每种肽的错过裂解，并设定了作为固定变量和作为可变改性的固定变量和氧化的Cys氨基甲酰化。关于蛋白质mw和p没有约束gydF4y2Ba我gydF4y2Ba．噪声阈值比的信号被设定为3.在BP 0.05处设定了意义阈值。gydF4y2Ba

从SOD活性凝胶中的切除条带分析来自SOD活性凝胶的切除条带，达到四极性超谱仪（MAXIS; BRUKER DALTONICS）配备纳米电喷雾时的纳米型超高性能LC®系统（UPLC®）进行来源。使用本地吉祥物服务器（V2.4.0;矩阵谱）对viridiplantae数据库（分类ID 33090）进行搜查的质量数据。没有任何mw或p的搜索gydF4y2Ba我gydF4y2BaCys的限制和核苷酸和核酸氧化酶被设定为可变修改。分别设定了20ppm的前体和片段离子和0.07da的质量耐受。筛选吉祥物（.DAT）结果以评估错误的发现率[gydF4y2Ba77.gydF4y2Ba］．当至少有两个多肽具有高质量的MS/MS光谱(在95%置信水平下低于Mascot的身份阈值分数10分)时，蛋白质鉴定被确认。该阈值导致蛋白质鉴定的错误发现率小于1.5%。gydF4y2Ba

抗体生成gydF4y2Ba

用全重组OeCSD1.1免疫两种不同家兔，获得抗橄榄花粉铜、锌- sod多克隆抗体。B蛋白(加入号)。戴维生物技术公司(德国)的EU250769.1)。通过与抗csd2的反应性比较，进一步确定了该抗体的特异性(gydF4y2Ba拟南芥蒂利亚纳gydF4y2Ba叶绿体Cu，Zn-SOD;AT2G28190）抗体（Agrisera，瑞典）。gydF4y2Ba

西方墨点法gydF4y2Ba

根据制造商的说明，使用Bio-Rad免染色技术对蛋白质进行分离和电印迹。印迹后，聚偏氟乙烯(PVDF)膜用10% (gydF4y2BawgydF4y2Ba/gydF4y2BavgydF4y2Ba)脱脂牛奶1 h，与抗cu /Zn SOD抗体(稀释1/5000)在4℃下孵育12 h。免疫检测使用与Alexa Fluor 532 (Molecular Probes, UK)(稀释1/10,000)偶联的抗兔IgG抗体1小时进行。蛋白条带在Pharos FX系统(Bio-Rad，美国)中显示，分子量使用Quantity One软件v.4.6.2 (Bio-Rad)计算。所有实验都是重复进行的。gydF4y2Ba

二维电泳gydF4y2Ba

将11 cm IPG条(pH 3-10 NL, BioRad)复水过夜，包括样品(总蛋白200 μg)在复水缓冲液中。在20°C的Ettan IPGphor IEF设备(Amersham Biosciences)中进行等电聚焦(IEF)，如下:300 V聚焦1分钟，1000 V聚焦10分钟，8000 V聚焦90分钟，最后总共30 kVh。还原和烷基化步骤如前所述[gydF4y2Ba78.gydF4y2Ba］．第二维在Criterion™Cell (Bio-Rad)中进行，用考马斯亮蓝(CBB)染色。如上所述，免疫印迹同时进行。gydF4y2Ba

TEM免疫细胞化学样品的制备gydF4y2Ba

cv.的成熟花粉粒。' Picual '用4% (w/v)多聚甲醛和0.2% (gydF4y2BavgydF4y2Ba/ v）在4℃下为0.1M Cacofocylate缓冲液（pH7.2）中的戊二醛在0.1M下℃。在整个乙醇系列中脱水样品，并嵌入Unicryl树脂（Bbinternational，UK）中。使用Reichert-Jung Ultracut E Mictotome（Leica Microsystems，德国）获得超薄（70nm）部分，并安装在Formvar涂覆的200型网状镍网上。gydF4y2Ba

免疫定位，切片用1% (w/v)牛血清白蛋白(BSA)在PBS溶液中阻断1小时，然后用抗cu /Zn SOD抗体(稀释1/200)在4°C孵育过夜。PBS冲洗三次(每次5分钟)后，切片与抗兔IgG-30 nm金偶联抗体(BBInternational)(在含2% BSA的PBS中稀释1/50)孵育。最后，用5% (v/v)醋酸铀酰对切片进行对比20分钟，并在JEM-1011电子显微镜(日本JEOL)下检查。gydF4y2Ba

生物信息分析gydF4y2Ba

通过使用群集W软件进行核苷酸序列的对准（gydF4y2Bahttp://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/gydF4y2Ba)．来自橄榄花粉的所有SOD氨基酸序列的系统发育树和gydF4y2Ba拟南芥蒂利亚纳gydF4y2Ba通过最大可能性（ml）方法在Mega 7.0中构建[gydF4y2Ba79.gydF4y2Ba］．OECSD1.1的拼接A和B形式进行3D重建（gydF4y2Bahttp://swissmodel.expasy.org/workspace/gydF4y2Ba）[gydF4y2Ba80gydF4y2Ba通过使用可通过DeepView v3.7软件作为PDB获得的2q21模板(注释为二聚体)。使用BLAST工具进行橄榄SOD基因组序列的搜索，如[gydF4y2Ba67.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

Kolmogorov-Smirnov试验用于测试SOD活性和花粉活力数据的正常性。进行ANOVA分析，以评估品种中SOD活性和花粉活力的差异。使用“皮肤”作为参考品种，还将花粉草皮活性水平和活力进行比较。使用学生进行统计比较gydF4y2BatgydF4y2Ba在意义上进行测试gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.01．利用Levene的测试评估了差异的平等。进行了Pearson测试，以便确定SOD活性和花粉活力变量是否相关。使用SPSS V.23软件（IBM，USA）进行所有分析。gydF4y2Ba

不：gydF4y2Ba

一氧化氮gydF4y2Ba

ROS：gydF4y2Ba

反应性氧气gydF4y2Ba

SOD:gydF4y2Ba

超氧化物歧化酶gydF4y2Ba

作者要感谢Drs。Jose Manuel Palma，Javier Corpas和EduardoLópez-Huertas（EEZ-CSIC，格拉纳达，西班牙）为SOD活动表征提供支持和建议。迈克尔奥尔西亚纠正了英文文本。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

本研究由ERDF-COFUNDED项目支持BFU2011-22779，BFU2016-77243-P和2015-4181-2，RTC-2016-4824-2（Mineco），P2010-AGR-6274，P10-CVI-6075和P2011-CVI-7487（Junta deAndalucía）和201540E065,201840E055（CSIC）。AZ谢谢JAE-CSIC计划和国际卓越校园的农业烹饪校区，为赠送资金提供。通过其通过其信息资源（Urici）的信息资源单位，通过CSIC开放访问公开支持倡议承认对出版费的支持。gydF4y2Ba

数据和材料的可用性gydF4y2Ba

本研究报告的所有SOD序列都在Genbank数据库中提供（gydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

隶属关系gydF4y2Ba

1. 植物生殖生物学研究实验室，Estación实验DelZaidín，Consejo高级Investigaciones（Científicas（CSIC），生物化学系，细胞和分子生物学，Profesor Albareda 1,18008，格拉纳达，格拉纳达，西班牙gydF4y2Ba

   Adoración Zafra, Antonio Jesús Castro & Juan de Dios AlchégydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

AZ，JDA和AJC参与了实验的设计，解释了稿件的结果和重放。AZ执行了实验。所有作者都已读取和批准出版本手稿。gydF4y2Ba

通讯作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaJuan de diosAlchégydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

同意出版gydF4y2Ba

目前的稿件不包含潜在识别所需出版物所需的患者/参与者的信息。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

提交人声明他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

开放访问gydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba)，它允许在任何媒体上无限制地使用、分发和复制，前提是你给予原作者和来源适当的荣誉，提供一个到知识共享许可协议的链接，并指出是否作出了更改。创作共用及公共领域专用豁免书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba）除非另有说明，否则适用于本文中提供的数据。gydF4y2Ba

重印和权限gydF4y2Ba