毛竹的转录组特征(gydF4y2Ba植被类型gydF4y2Ba）苗响应于外源赤霉素应用gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

毛竹竹(gydF4y2Ba植被类型gydF4y2Ba)是一种在纺织工业中具有高经济价值的知名竹种，由于其快速增长。植物激素是植物生长发育的主要调控因子，是重要的内源信号。然而，植物激素调控毛竹生长的机制至今仍不清楚。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

在这里，我们报道了外源赤霉素（GA）的应用产生了显著增加节间长度和木质素凝结。转录组测序揭示光合作用有关的基因在GA-压抑基因类，这与在叶片的叶绿素浓度的降低和光合作用的以下GA治疗较低速率一致的富集。苗木外源性GA应用相对容易执行，所以我们用竹子的GA-处理，然后进行高通量测序4周龄全苗。在这项研究中，我们发现932gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba-自然反义转录本(gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba- nat)和22196个可变剪接(AS)事件。其中,42gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba-自然反义转录本(gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba- 在暴露于外源GA时，当事件差异表达时，必须表达442gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba，提示转录后调控可能也参与了GAgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba响应。差异表达的目标gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba- 没有包括激素受体，光合作用和细胞壁生物发生的基因。例如,gydF4y2BaLAC4.gydF4y2Ba与其相应的gydF4y2BaCIS.gydF4y2Banats在乔治亚州gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba，并可能参与木质素的积累，从而影响细胞壁组成。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

本研究为阐明赤霉素如何改变转录后调控提供了新的见解，并将阐明赤霉素调控毛竹生长的潜在机制。gydF4y2Ba

赤霉素(Gibberellins, GA)是一类重要的植物促生长激素，在植物生长发育的许多方面发挥着重要的作用，特别是在促进生长和诱导花等方面[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．通过抑制一组Della核力压抑蛋白来调节增长[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]，并与其他激素信号通路(包括生长素和油菜素内酯(BR))表现出广泛的串音[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．毛竹，原产于中国大陆和台湾，现在全世界种植用于商业得益于其增长非常快的目的[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．毛竹枝条的转录组分析显示，激素相关基因与两个生长方向有关，即高度和厚度[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10.gydF4y2Ba］．后来的一项蛋白质组学研究显示，在茎叶发育过程中，有7个蛋白质点参与激素生物合成[gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba］．内源性GA浓度gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba，赤霉酸最常见的生物活性形式之一[gydF4y2Ba12.gydF4y2Ba，当毛竹的地上高度从0.05 m增加到12 m时，表现出双峰变化[gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14.gydF4y2Ba］．Moso Bamboo Cell壁的可扩展性是Moso Bumbb的增长的关键因素，因为由于竹墙，纤维素和木质素的两个主要成分，它们允许增长到高度。gydF4y2Ba15.gydF4y2Ba］．木质素是生物燃料的一种主要资源，它的功能是充当运输容器，以维持整个工厂的结构和机械完整性[gydF4y2Ba16.gydF4y2Ba］．纤维素原纤维的纵向弹性最大，而木质化主要增加原纤维的横向刚性[gydF4y2Ba17.gydF4y2Ba，提供整体的结构支撑。据报道，细胞壁生物合成的蛋白质与快速伸长的竹子竿有关[gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba］．虽然内源性激素的研究已经在毛竹的嫩枝上进行了[gydF4y2Ba18.gydF4y2Ba，激素活动和转录后调节之间的直接联系仍然未知。除了选择性剪接(AS)的转录后调控外，自然反义转录本(NATs)也发挥着重要作用。NATs通过部分或完全补充其他转录本参与转录后调控[gydF4y2Ba19.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba- 没有完全互补的完美互补性地调节相同的基因组基因座，可以将其分为三种类型：头部到头，尾巴尾，完全重叠[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．小鼠，人，米和稻瘟病的基因组鉴定NATgydF4y2Ba拟南芥蒂利亚纳gydF4y2Ba揭示了自然反义转录是一种广泛存在的现象[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．在这项研究中，我们提供了全基因组分析gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba利用PacBio单分子实时测序技术(SMRT)研究毛竹中的nats [gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．在本研究中结合RNA-Seq，我们发现了差异gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba这为毛竹GA介导的转录后调控提供了新的思路。gydF4y2Ba

施用外源赤霉素可增加毛竹节间伸长gydF4y2Ba

为了确定赤霉素是否参与竹子的生长，我们每天用赤霉素处理2周龄的竹子幼苗gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba或多效唑(PAC, GA生物合成抑制剂的特异性抑制剂)处理2周，观察其对毛竹生长的影响(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．外源GA处理后毛竹节间和茎长显著增加gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba应用程序。相比之下，如前从许多其他物种报告的PAC显着延迟了莫斯竹子的杆伸长率[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba和外源性GAgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba可以逆转PAC（图的抑制。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)．叶宽也对Ga敏感gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba而根长则不受GA的影响gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba应用程序。结果表明，GAgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba主要通过影响节间伸长来促进竹子茎的生长。gydF4y2Ba

ga应答基因的转录组规模分析gydF4y2Ba

为了更好地了解潜在的分子机制，我们使用RNA-SEQ来简要概述GA处理和未处理的摩擦竹的转录组。总共获得了130,988,922和153,580,552和153,580,552，分别具有来自GA治疗和未处理的对照文库的三种生物重复。每个图书馆的映射率高于88％。我们获得了47,927,346和56,985,350唯一映射的读取，以进一步分析（附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S2)。通过对比分析，我们鉴定出5148个显著差异表达基因(DEGs)，其中3025个是ga诱导的，2123个是ga抑制的(图)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:表S3)。为了验证RNA-Seq结果，我们选择了14个基因进行qRT-PCR进一步验证，其中10个基因的表达谱与RNA-Seq结果一致，包括6个ga诱导基因和4个ga抑制基因，说明RNA-Seq数据是可靠的(图)。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba，附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba:表S1)。基因本体(GO)分析表明，这些DEGs参与光合作用、木质素代谢过程、对化学刺激的响应等(图)。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

外源GA的反应和生物合成基因gydF4y2Ba

通过氧化石墨烯富集分析，61个上调的DEGs被分配到“激素介导的信号通路”和“激素刺激的细胞反应”的功能(附加文件)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba:表S4)。共28个参与“赤霉素生物合成过程”和“赤霉素反应”的基因在外源赤霉素的作用下发生了显著变化(图2)。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)．例如，的表达gydF4y2BaGA20OX1,gydF4y2Baga -生物合成基因[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]，在莫斯竹子中的外源GA治疗后降低。另外，GA受体gydF4y2Bagid1a.gydF4y2Ba和gydF4y2BaGID1B.gydF4y2BaGA抑制基因gydF4y2BaSLR1，SLN1，gydF4y2Ba和gydF4y2Ba时至今日gydF4y2Ba上调。由于在我们的研究中饱和外源Ga的浓度，因此观察到的Ga生物合成和信号传导基因的抑制可能是由于内源Ga生物合成的负反馈调节响应于高浓度的外源Ga（图。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

外源GA应用的其他激素相关信号通路gydF4y2Ba

有趣的是，与其他激素信号通路相关的基因在GA中也显著超标gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba治疗(图。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba，附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba:表S4)。例如，还富集了与对蟾蜍素的反应相关的术语。这些结果支持与植物素信号通路的GA信号通路串扰，这与其他先前研究的植物物种一致[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．在Moso Bamboo中，从寻找同源物的搜索中确定了883个与激素相关的基因gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Bahorone数据库(gydF4y2Ba35gydF4y2Ba］．其中，188年显着表达，它们主要涉及八个主要类植物激素：脱落酸（ABA），助药，BR，细胞酮（CK），乙烯，GA，茉莉酸盐（JA）和水杨酸（SA））（图。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba，附加文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba:表S5)。本研究表明，至少在毛竹中，外源GA的施用可以影响其他激素相关途径，这与之前的研究一致[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

外源GA处理影响光合作用gydF4y2Ba

在已鉴定的ga抑制基因中，与光合作用相关的功能最为丰富(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba表S4)，提示我们推测赤霉素处理可能影响赤霉素的光合作用gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba治疗的竹子。为此，测定了赤霉素叶片叶绿素含量gydF4y2Ba_3.gydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba啊,这两个遗传算法gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba和PAC和PAC处理的幼苗（图。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba)．结果表明，PAC处理提高了叶绿素含量，而外源GA处理降低了叶绿素含量gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba治疗，提供额外的证据gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba会影响光合能力。gydF4y2Ba

为了进一步加强GA与光合作用之间的联系，还对叶片的光合速率进行了测定，结果表明外源GA对叶片光合作用的影响最大gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba与HgydF4y2Ba_2gydF4y2Bao治疗的幼苗（图。gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba)．PAC降低了光合速率，随后的外源GAgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba治疗部分逆转了pac诱导的抑制。这些结果表明，外源GA处理可能通过影响光合作用的调节来调节碳循环以适应幼苗的发育。gydF4y2Ba

参与细胞壁形成的基因gydF4y2Ba

从第一个伸长的茎节间横切面上看，应用生物活性GA后，血管和纤维染色更强烈gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba，从而表明增加了瘫痪。相比之下，PAC治疗显着减少了瘫痪（图。gydF4y2Ba5AgydF4y2Ba)．此外，外源GAgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba- 治疗救出了PAC的影响。通过木质素含量测定进一步证实这些组织学观察（图。gydF4y2Ba5B.gydF4y2Ba)．综上所述，GA处理显著增加了茎的木质化(gydF4y2BaPgydF4y2Ba < 0.001), similarly to findings with winter wheat, dwarf pea and tobacco [38gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

鉴于细胞壁结构是植物生长的一个关键因素，我们针对66细胞壁相关基因，其中聚为三组：纤维素合成酶基因（gydF4y2BaCes上一个gydF4y2Ba)、纤维素合成酶样基因(gydF4y2BaCslgydF4y2Ba）和木质素生物合成相关基因[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．其中，我们确定了12次。两个成员gydF4y2Ba中国极限运动协会gydF4y2Ba基因家族，gydF4y2BaCESA6gydF4y2Ba和gydF4y2BaCESA7,gydF4y2Ba在GA处理后显著上调(图。gydF4y2Ba5CgydF4y2Ba)．gydF4y2BaCSLF8，CSLG1，CSLA1gydF4y2Ba和gydF4y2BaCSLF2.gydF4y2Ba在响应GA应用时受到抑制gydF4y2Ba，gydF4y2Ba尽管gydF4y2BaCSLE1gydF4y2Ba是GA-induced(无花果。gydF4y2Ba5CgydF4y2Ba)．肉桂酰辅酶a还原酶(cinnamyl - coa reductase, CCR)催化单酚生物合成途径的第一步，较高浓度的CCR蛋白对应于木质素化的增加[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba］．在莫斯竹子，遗传般的竹子gydF4y2BaCCR.gydF4y2Ba基因提示它们可能参与了木质化生物发生的调控。考虑到的显著上调gydF4y2BaCCR.gydF4y2Ba，我们建议在GA后的木质素积累gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba处理的结果可能是木质素生物合成相关基因的转录激活。gydF4y2Ba

GA对AS的影响gydF4y2Ba

在竹笋生长过程中，60%的基因表现出交替剪接的亚型[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba］．根据cufflink汇编器，我们识别出233,495个内含子的独特坐标，这些坐标代表剪接区域。在这些剪接连接位点中，我们利用RNA-Seq鉴定了22196个AS事件。其中，有442个不同的AS事件，可分为四种不同类型:113个内含子保留(IR)， 120个外显子跳跃(ES)， 135个替代受体(AltA)， 74个替代供体(AltD)gydF4y2Ba6gydF4y2Ba:表S6)。例如,gydF4y2BaRCA.gydF4y2Ba（PH01003146G0230），参与响应光刺激[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba，被AltD发现产生不同的亚型。RT-PCR和qRT-PCR结合亚型特异性引物进一步验证了几个选定的AS事件，如PH01000276G0360gydF4y2Ba， atad3, pae9, rab6agydF4y2Ba和gydF4y2BaNOT2AgydF4y2Ba，进一步表明RNA-Seq是可靠的(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba:表S1)。更长的异构体gydF4y2BaATAD3，PAE9.gydF4y2Ba和gydF4y2Barab6a.gydF4y2Ba有差异,gydF4y2BaNOT2AgydF4y2Ba在外源ga后受到了下调gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba治疗(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．gydF4y2Baatad3，gydF4y2Ba线粒体膜ATP酶gydF4y2Ba，gydF4y2Ba从人类到植物都高度保存[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba，gydF4y2Ba47gydF4y2Ba］．gydF4y2BaATAD3.gydF4y2Ba产生了两种不同的外显子跳变亚型，GA处理抑制了外显子跳变并产生了更长的亚型(图)。gydF4y2Ba6B.gydF4y2Ba)．通过同源性搜索，附加外显子在线圈区编码了一个潜在的39aagydF4y2BaC.elegansgydF4y2Ba(UniProt Q20748)。外显子是否跳过的研究还需要进一步的实验gydF4y2BaATAD3.gydF4y2Ba影响其亚细胞定位或功能。gydF4y2Ba

总共有19个具有GA-encooctive接头同种型的基因与激素信号传导途径有关（附加文件gydF4y2Ba7gydF4y2Ba：表S7）。例如,gydF4y2BaPIF1gydF4y2Ba(IR, PH01001389G0560)参与GA信号通路，直接调控gydF4y2Ba德拉gydF4y2Ba（gydF4y2Ba时至今日gydF4y2Ba和gydF4y2BaRGAgydF4y2Ba）（附加文件gydF4y2Ba7gydF4y2Ba：表S7）[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba］．此外,gydF4y2BaGRF1gydF4y2Ba（1R，PH01001291G0040）参与赤霉素信号转导途径;据报道与茎的伸长水稻关联[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba]和UV-B抑制在玉米[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba］．此外，我们还鉴定了9个编码剪接因子的基因，在GA处理后产生了不同的亚型gydF4y2Ba7gydF4y2Ba：表S7）。值得注意的是，两个拼接因子基因，gydF4y2BaRNP_N1gydF4y2Ba(PH01000290G0450: ES),gydF4y2BaRSP40 / RSP35gydF4y2Ba(PH01000347G1190:ES)也与激素有关[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba，并有差异表达AS事件。总的来说，这些结果强烈地表明AS适应GAgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba毛竹行动。gydF4y2Ba

遗嘱影响了natsgydF4y2Ba

CIS.gydF4y2Ba-NATs以完全互补的方式调控来自相同基因组位点的转录本。利用PacBio全长转录本，我们发现了全基因组的nat，并鉴定出932个gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba- 载入三种类型：头部到头（5'-5'），尾巴（3'-3'）和完全重叠（附加文件gydF4y2Ba8gydF4y2Ba：表S8）。全基因组分析显示，大多数的NAT是从在两种哺乳动物长非编码RNA（lncRNA）产生gydF4y2Ba52gydF4y2Ba]和植物[gydF4y2Ba53gydF4y2Ba］．在932gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba-在毛竹里，有492对gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba-NATs包括长非编码rna，代表长非编码自然反义转录本(lncnat)。总共有42个差异表达gydF4y2BaCIS.gydF4y2Banats(附加文件gydF4y2Ba9gydF4y2Ba：表S9）。我们选择6对gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba- 通过RT-PCR进一步验证，所有这些都可以用预期的带扩增（图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba），展示使用PACBIO全长转录物鉴定NAT的优点。其中，在硅分析中，4对的变化显然是相同的，而另一两个通过RT-PCR不明显。这种差异可能是由于琼脂糖凝胶电泳的灵敏度有限，因此进行实时PCR。QRT-PCR结果表明表达谱与RNA-SEQ结果一致，除了一对gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba- nats（图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)，表明GA具有调节NATs的能力。gydF4y2Ba

总共有3个和21gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba- 靶向基因涉及“激素代谢过程”和“对内源刺激的反应”。四个基因是“细胞壁生物发生”的一部分，并分配了43个基因的“氧化还原”的功能（附加文件gydF4y2Ba10.gydF4y2Ba:表S10)。在这项研究中，我们揭示了这一点gydF4y2Ba一间酒吧gydF4y2Ba(PH01000056G0440)和gydF4y2BaAMY1gydF4y2Ba(PH01001272G0030)对毛竹进行了调控gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba-NAT PH01000056G0430和PH01001272G0020（图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)，据报道gydF4y2Ba一间酒吧gydF4y2Ba和gydF4y2BaAMY1gydF4y2Ba与激素受体相关联gydF4y2Ba54gydF4y2Ba]和赤霉素[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba］．我们的数据显示激酶基因gydF4y2BaSTN8gydF4y2Ba(PH01003235G0120)参与光系统II核心蛋白的磷酸化，可被gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba-NATs，其位于内含子gydF4y2BaSTN8gydF4y2Ba．转录丰度gydF4y2BaSTN8gydF4y2Ba在ga诱导下显著下调(图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．这些结果表明gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba-NATs可能参与减少光合能力响应GAgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba治疗。gydF4y2BaLAC4.gydF4y2Ba参与茎的结构性木质素化与gydF4y2BaLAD17.gydF4y2Ba［gydF4y2Ba56gydF4y2Ba］．需要指出的是，在竹子中，ga诱导gydF4y2BaLAC4.gydF4y2Ba(PH01001798G0410)及其相应的顺式- nats都是ga诱导的，并影响细胞壁生物发生(图。gydF4y2Ba7AgydF4y2Ba)．数据显示gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba-NATs可能是GA处理后调控毛竹生长的另一种方法。gydF4y2Ba

转录因子的转录后调控gydF4y2Ba

先前的研究表明，GA信号调节PIF 3和HY5的TFS的活性和蛋白质稳定性[gydF4y2Ba57gydF4y2Ba］．gydF4y2BaHY5gydF4y2Ba作为光源和多种激素信号通路的汇聚点[gydF4y2Ba58gydF4y2Ba，gydF4y2Ba59gydF4y2Ba，gydF4y2Ba60gydF4y2Ba］．通过同源性搜索，我们鉴定出678个TFs。其中，有132个TFs为deg，包括gydF4y2BaHY5gydF4y2Ba(PH01000075G0960)， bZIP转录因子(图1)。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba和额外的文件gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba:表S11)。转录因子通过影响RNA聚合酶II的转录延伸率来影响AS [gydF4y2Ba61.gydF4y2Ba］．同样，AS也影响tf的拼接，678个tf中有13个具有不同的AS事件(附加文件)gydF4y2Ba12.gydF4y2Ba：表S12）。例如,gydF4y2BaPIF1gydF4y2Ba（PH01001389G0560），在这两种GA和光信号传导途径[重要枢纽基因gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]，受IR调控(图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．此外，gydF4y2BaILR3gydF4y2Ba(PH01000773G0410)和gydF4y2BaBIM1gydF4y2Ba(PH01004969G0010)具有互补位点gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba-NATs，这意味着tf也可能受NATs的监管(图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)，尽管需要更多的证据来阐明这一点。gydF4y2Ba

赤霉素影响光合作用gydF4y2Ba

早期公布的研究揭示了GA和光合作用之间的矛盾关系[gydF4y2Ba62.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba63.gydF4y2Ba］．有研究报道GA的光合作用产生积极的影响[gydF4y2Ba64.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba65.gydF4y2Ba]，而其他植物在施用外源GA后，光合速率下降[gydF4y2Ba66.gydF4y2Ba，而一项研究报告称没有差异[gydF4y2Ba67.gydF4y2Ba］．本研究揭示外源性GAgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba显着降低叶绿素含量，同意光合速率降低，这与具有生长缓慢近交线的调查结果相似gydF4y2BaPlantago主要gydF4y2BaL. [gydF4y2Ba66.gydF4y2Ba］．一项研究gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba表明，GA相同的浓度gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba在调节光合作用中发挥积极作用[gydF4y2Ba68.gydF4y2Ba］．这种差异可能是由于不同的治疗条件或不同的发育阶段造成的。本研究使用GAgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba每天治疗两周大的幼苗，持续两周。然而，这项研究gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba使用一年的植物，每周GA治疗一个月[gydF4y2Ba68.gydF4y2Ba］．目前，PAC对光合效率的影响也不清楚。据报道，PAC具有不同的效果，包括对“美味”苹果的光合速率没有影响[gydF4y2Ba69.gydF4y2Ba]，对小麦和甜橙的负面影响[gydF4y2Ba70gydF4y2Ba，gydF4y2Ba71.gydF4y2Ba]，萝卜和阳性效果gydF4y2BaCatharanthus roseus也叫gydF4y2Ba［gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba72.gydF4y2Ba］．在本研究中，PAC略微降低了光合净速率，这可能是PAC浓度稍高导致植物毒性反应的结果。为了弄清赤霉素、主成分分析法和光合作用之间的确切关系，需要进行一系列不同浓度、不同时间进程的处理。gydF4y2Ba

赤霉素影响木质化gydF4y2Ba

在这项研究中，我们发现GAgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba处理增加了木质化，这与之前对其他植物的研究一致[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba］．目前，我们只研究了GA的短期效应gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba对木质化的治疗。将来，观察GA的长期影响将会有趣gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba关于木质化的生物合成途径，已有报道与短期效应不同[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

更高的表达gydF4y2BaLAC4.gydF4y2Ba导致木质素的积累，这也在gydF4y2BaC.sinensisgydF4y2Ba［gydF4y2Ba73.gydF4y2Ba］．正如刚才提到的，gydF4y2BaLAC4.gydF4y2Ba是ga诱导的木化相关基因，在毛竹中被发现受顺式- nats的调控。也有报道称它受转录因子调控，例如MYB58和MYB63 [gydF4y2Ba74.gydF4y2Ba］．在毛竹，gydF4y2BaMYB58gydF4y2Ba(PH01000386G0660)受ga抑制gydF4y2BaMYB63gydF4y2Ba(PH01000030G0050)为GA诱导。此外，microrna也可能参与调控的表达gydF4y2BaLAC4。gydF4y2Ba例如，miR397被预测靶向于的第5外显子gydF4y2BaLAC4.gydF4y2Ba作为漆酶转录本的负调控因子[gydF4y2Ba75.gydF4y2Ba］．最近的研究表明，MiR397a和mir397b通过调节漆酶基因来调节木质素含量，例如gydF4y2BaLAC4.gydF4y2Ba［gydF4y2Ba73.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba76.gydF4y2Ba］．因此，我们提出了上调的gydF4y2BaLAC4.gydF4y2Ba结果表明，GA处理后木质素的调控网络存在多样性。gydF4y2Ba

吉布林素会影响原因gydF4y2Ba

虽然以前的研究表明gydF4y2BaHAB1.gydF4y2Ba产生两个拼接同种型，gydF4y2Bahab1.1.gydF4y2Ba和gydF4y2Bahab1.2gydF4y2Ba，在ABA敏感性中起相反的调节作用[gydF4y2Ba77.gydF4y2Ba，目前缺乏对激素治疗后AS的全基因组分析。通过比较模拟和GA处理样本之间的AS变化，我们可以识别数百个不同的AS事件。在这项研究中，我们确定了442个不同的AS事件。实验验证表明，与RT-PCR相比，采用同型特异性引物的qRT-PCR对定量同型表达更敏感。在这项研究中，较长的亚型gydF4y2BaATAD3.gydF4y2Ba被GA诱导（图gydF4y2Ba6B.gydF4y2Ba)．对公共数据库的搜索显示gydF4y2BaATAD3.gydF4y2Ba相对保守gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba，gydF4y2Ba奥雅萨苜蓿gydF4y2Ba和gydF4y2BaBrachypodium distachyongydF4y2Ba，但在其他植物中还没有很好地研究。进一步的生物信息学分析表明，卷绕线圈区域内的跳过的外显子于39AA编码，这表明外显子跳过与合作伙伴相互作用的功能[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba］．更多的实验需要研究GA-受影响的外显子是否跳过gydF4y2BaATAD3.gydF4y2Ba影响其亚细胞定位或功能。gydF4y2BaATAD3.gydF4y2Ba可能是一个很好的案例研究，以研究不同亚型以及不同功能之间的联系，并提供更好的理解GA-AS诱发如何影响毛竹的生长和发育。gydF4y2Ba

赤霉素影响NATsgydF4y2Ba

在这项研究中，我们利用PACBIO测序的全长转录物到概况932gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba-NATs，它避免了可能包含错误的转录组组装。GA在整个植物生命周期中调节生长。因此，数量gydF4y2BaCIS.gydF4y2Banats被低估了，差别更大gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba使用更多的时间点和组织来显示nat在本研究中，我们研究了932gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba- 使用特定股线图书馆，并透露部分差异gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba-NATs，采用RT-PCR和qRT-PCR实验验证。一个定义明确的天然反义基因对是gydF4y2BaP5CDHgydF4y2Ba和gydF4y2BaSRO5gydF4y2Ba，通过尾对尾模型相互重叠，产生与盐胁迫相关的内源性nat-siRNA [gydF4y2Ba78.gydF4y2Ba］．我们的数据透露，Moso Bamboo的许多GA响应基因，如gydF4y2Ba一间酒吧gydF4y2Ba，gydF4y2BaAMY1, STN8gydF4y2Ba和gydF4y2BaLAC4，gydF4y2Ba可能会受到监管gydF4y2BaCIS.gydF4y2Banat。然而，没有足够的实验证据表明它们是否产生差异的nat- sirna。在未来，来自重叠转录本互补区域的nat-siRNA可以通过小RNA测序的方法进行研究，从而优化识别潜在的机制gydF4y2BaCIS.gydF4y2Banats。除NAT-siRNA外，反义RNA的表达诱导相应基因的沉默和甲基化[gydF4y2Ba79.gydF4y2Ba］gydF4y2Ba．gydF4y2Ba未来揭示nat介导的DNA甲基化在GA反应中的作用将是一件有趣的事情。gydF4y2Ba

FLC（FLOWERING LOCUS C）作为开花，这是lncNATs充分表征的例子的阻遏。的反义转录gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba被寒冷诱发，非编码转录物行为沉默gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba暂时转录[gydF4y2Ba80gydF4y2Ba］．在这项研究中，我们发现超过50％的成对gydF4y2BaCIS.gydF4y2Banats包括lncNATs。然而，在毛竹中lncnat的作用机制尚不清楚。目前，毛竹还缺乏再生改造的方法。在原生质体中过表达反义转录本可能揭示了lncnat在相应意义转录中的阶段依赖调节。gydF4y2Ba

为了揭示赤霉素是如何调控毛竹生长的，我们应用了外源赤霉素(GAgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba)，显著增加毛竹幼苗节间长度。叶绿素含量和光合速率的测定表明，赤霉素对毛竹的光合活性有负面影响。此外，木质素可视化显示，木质素积累增加响应赤霉素处理，表明赤霉素通过影响细胞壁组成在竹子的生长中发挥功能。我们充分利用PacBio单分子实时测序(SMRT)，首次提供了全基因组分析gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba-毛竹里的nats。结合链特异性RNA-Seq，我们发现了差异gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba-NATS以及GA诱导的事件，这进一步表明转录后调节也参与了MOSO竹中的GA反应。本研究为GA介导的转录后的转录后调节性和摩梭竹的发育术后规律提供了新的洞察。gydF4y2Ba

植物材料gydF4y2Ba

对于RNA测序，4周龄全苗3个生物学重复长日照条件下（16小时光照/ 8小时黑暗）从MS（Murashige和Skoog）收集介质下生长被用H处理后gydF4y2Ba_2gydF4y2Bao或gagydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba（100μm）4小时。将植物材料在液氮中冷冻并储存在-80℃下，用于总RNA提取和图书馆构建。在制造商的协议之后，用RNAPREP纯植物套件（Tiangen，Cat。＃DP441，China）分离出总RNA。使用琼脂糖凝胶和Nanodrop 2000c UV-Vis分光光度计（USA）评估RNA质量。使用Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies，Santa Clara，Ca，USA）进一步评估RNA样品的完整性。用h喷洒两周的竹幼苗gydF4y2Ba_2gydF4y2Bao或gagydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba（100μm），pac（200μm）每周七次七次，并记录其表型特征。用上述处理材料分析叶绿素含量，光合速率和木质素含量。gydF4y2Ba

叶绿素和光合速率的测定gydF4y2Ba

为了测定叶绿素含量，将~ 0.1 g新鲜叶材料切成块，加入10 ml乙醇、丙酮和蒸馏水(4.5:4.5:1，gydF4y2BavgydF4y2Ba/v/v)混合物提取叶绿素。然后将15ml离心管用铝箔包裹，置于黑暗中3天，直到样品变白。最后，从管中取出每种叶绿素溶液3毫升，加入到10毫米比色皿中，用Thermo Fisher Multiskan™FC微孔板光度计在645 nm和663 nm处测量光密度。实验至少进行6个重复，然后用Arnon’s方程计算叶绿素含量[gydF4y2Ba81.gydF4y2Ba]：gydF4y2Ba

采用LI-6400XT便携式光合系统(LI-COR corporation, USA)计算竹子幼苗正常生长条件下的净光合速率。每个处理用30多片首次完全展开的不同幼苗的叶片。对每个叶片进行5次重复测量，以获得平均值。用Microtek ScanMaker i800 plus系统(WSeen，杭州，中国)对这些叶片进行标记和扫描。利用ImageJ精确计算叶片面积。最后，利用CO .公式计算光合速率gydF4y2Ba_2gydF4y2BaR-COgydF4y2Ba_2gydF4y2Bas *（1000-hgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba或)/ (1000 - hgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOS)) * fda,有限公司gydF4y2Ba_2gydF4y2Bar和co.gydF4y2Ba_2gydF4y2BaS是COgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba浓度分别来自参比和样品细胞。HgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba或者和HgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba操作系统是HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO的浓度。Fda参照叶片流量/面积。gydF4y2Ba

木质素可视化与木质素含量测定的手切切片gydF4y2Ba

对于木质素可视化，获得了4周龄幼苗第一个第一个专属的释放部分。然后用甘油蛋白醇-HCl（6mol / L HCl中的1％（重量/体积）甘油蛋白醇染色70μm，然后在光学显微镜下观察。gydF4y2Ba

采用改进的乙酰溴分光光度法定量测定了茎第一个伸长节间的木质素[gydF4y2Ba82.gydF4y2Ba］．将样品磨成粉末，立即加入95%乙醇，在2600 g离心5分钟。然后用95%乙醇洗涤两次，再用乙醇-正己烷(1:2,v:v)漂洗两次。风干后，用25%溴乙酰乙酸溶解微丸，70℃孵育30 min。0.18 mL NaOH, 0.02 mL 7.5 mol/L盐酸羟胺，加入冰醋酸，最终体积为3 ml。1000 g离心7 min后收集上清液，在280 nm处读取吸光度值，估算木质素含量。gydF4y2Ba

RNA测序的图书馆施工gydF4y2Ba

HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO和遗传算法gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba处理过的样品根据制造商说明书(Illumina, San Diego, CA, USA)使用dUTP方法构建，如我们之前的研究中所述[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．使用Illumina Hiseq™2500（Illumina，San Diego，CA）测序配对末端读取（读取长度= 125bp * 2）。所有RNA-SEQ RAW数据已在加入号GSE104596下上传到NCBI。gydF4y2Ba

差异表达分析gydF4y2Ba

TopHat2被选定为映射工具映射这些读取到毛竹参照基因组[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba83.gydF4y2Ba锚固长度超过8-NT的拼接对准。只保留了唯一映射的读取以进行后续分析。Bigwig文件已上传到我们的网站：gydF4y2Bahttp://www.forestrylab.org/pub/ga.gydF4y2Ba．用于基因模型中的标准表达水平测量为每映射转录物的千碱基片段每百万读取（FPKM）gydF4y2Ba84.gydF4y2Ba］．使用Edger包计算假发现速率（FDR）[gydF4y2Ba85.gydF4y2Ba］．使用折叠变化鉴定差异基因表达> 1.5和FDR <0.01。gydF4y2Ba

识别差异作为事件gydF4y2Ba

毛竹的基因组序列是可用的。因此可选剪接的识别类似于基于参考的方法[gydF4y2Ba86.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba87.gydF4y2Ba］．所有125 bp mapping RNA-Seq配对端reads使用Cufflinks v2.1.1组装[gydF4y2Ba88.gydF4y2Ba]使用下列选项：-F 0.05 -A 0.01 -I 100000 --min内含子长度30，以产生所有可能的转录物包括在本研究中的所有外显子。然后，所有上述同种型组合成在使用袖扣2.1.1包使用下列选项内的Cuffmerge效用GTF格式转录物的一个注解：--min同种型的馏分0.01。上述组装同种型和映射从用于h读取gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO和遗传算法gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba处理后的样品装入rmats。3.2.2 [gydF4y2Ba89.gydF4y2Ba使用以下参数识别差异作为事件：-T成对-LEN 125 -A 8 -C 0.0001 - 分析U. RMATS输出包括所有作为事件，包括内含子保留，外显子跳跃，替代受体和替代捐赠者。总共，作为事件gydF4y2BaPgydF4y2Ba < 0.05 were regarded as the differential AS events.

去富集分析gydF4y2Ba

Blast2GO优化BLAST算法，识别同源序列，然后在非模型物种中分配未特征的新序列，并进行功能注释，通过GO词汇表表示[gydF4y2Ba90.gydF4y2Ba］．在这项研究中，毛竹中每个基因的GO项使用BLAST2GO和默认选项进行分配[gydF4y2Ba90.gydF4y2Ba]通过宾果插件评估GO术语的丰富[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba]为Cytoscape [gydF4y2Ba54gydF4y2Ba，采用超几何检验进行统计分析。为gydF4y2BaPgydF4y2Ba-值校正时，我们选择FDR校正方法。经修正的GO术语gydF4y2BaPgydF4y2Ba≤0.05被认为显著过代表，并在富集网络中显示为有色节点。gydF4y2Ba

使用PacBio SMRT鉴定NATsgydF4y2Ba

PacBio SMRT DataSet来自我们以前的研究[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]以我们以参考为基础的方法，用以识别先天免疫缺陷综合症[gydF4y2Ba91.gydF4y2Ba］．首先，将PacBio SMRT测序得到的与参考基因组坐标重叠的全长转录本聚类成转录本单元。然后根据重叠坐标对相对定向的全长转录本进行配对比较，识别出3种类型的nat(头对头、尾对尾和完全重叠)。使用链特异性RNA-Seq库计算每个nat的读计数。磨边机(gydF4y2Ba85.gydF4y2Ba用来计算罗斯福总统。使用FDR小于0.01的方法鉴别差异NATs。使用带有默认选项的编码-非编码索引(CNCI)预测lncNATs [gydF4y2Ba92.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

寻找激素相关和转录因子gydF4y2Ba

InParanoid算法使用NCBI-Blast作为同源性检测工具计算两两相似度评分[gydF4y2Ba93.gydF4y2Ba］．因此，我们搜查了同源物gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2BaInParanoid (version 3.0)使用默认选项获取毛竹中所有同源基因[gydF4y2Ba93.gydF4y2Ba］．我们总共获得了1,4139个成对同源物。所有的激素相关基因和转录因子(TFs)gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba从已下载gydF4y2Bahttp://ahd.cbi.pku.edu.cngydF4y2Ba［gydF4y2Ba35gydF4y2Ba和Steve A. Kay的研究。[gydF4y2Ba94.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

使用实时定量PCR实验验证gydF4y2Ba

引物由premier 5 (premier Biosoft International, Palo Alto, CA, USA)设计，并在BGI-Tech (Shenzhen, China)合成。每个引物对的所有信息都可以在附加文件中找到gydF4y2Ba3.gydF4y2BaS1:表。RNA-Seq结果，包括差异表达和NATs，通过SYBR®Premix Ex Taq™II (TaKaRa, Cat。# RR820A，日本)应用生物系统QuantStudio™6 Flex实时PCR系统(ThermoFisher，美国)。对于每一个实验,gydF4y2BaNTB.gydF4y2Ba要么gydF4y2BaUBQgydF4y2Ba作为阳性对照分析3个重复[gydF4y2Ba95.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

半定量RT-PCR实验验证gydF4y2Ba

用GDNA橡皮擦（Takara，Cat＃RR047A）用Primescript TM RT试剂盒用于CDNA合成的cDNA合成，PCR用预混物Taq（Takara Taq版本2.0加染料，猫#RR901A）进行总计30μL反应卷gydF4y2BaUBQgydF4y2Ba作为阳性控制。所有的AS和NAT产品用1％琼脂糖凝胶电泳验证。gydF4y2Ba

阿巴：gydF4y2Ba

脱落酸gydF4y2Ba

阿尔塔：gydF4y2Ba

替代受体gydF4y2Ba

AltD:gydF4y2Ba

替代供体gydF4y2Ba

为:gydF4y2Ba

替代拼接gydF4y2Ba

CCR:gydF4y2Ba

肉桂 - CoA还原酶gydF4y2Ba

Ces答:gydF4y2Ba

纤维素合成酶基因gydF4y2Ba

CIS.gydF4y2Ba- 没有：gydF4y2Ba

CIS.gydF4y2Ba- 生日反义抄本gydF4y2Ba

CK:gydF4y2Ba

cytokinins.gydF4y2Ba

CNCI:gydF4y2Ba

编码 - 非编码索引gydF4y2Ba

Csl:gydF4y2Ba

纤维素synthase-like基因gydF4y2Ba

度:gydF4y2Ba

差异表达基因gydF4y2Ba

es：gydF4y2Ba

外显子跳跃gydF4y2Ba

罗斯福:gydF4y2Ba

错误发现率gydF4y2Ba

方法:gydF4y2Ba

开花基因座C.gydF4y2Ba

FPKM：gydF4y2Ba

每百万百万映射的成绩单每千碱基映射的碎片gydF4y2Ba

遗传算法:gydF4y2Ba

吉布林斯gydF4y2Ba

去：gydF4y2Ba

基因本体论gydF4y2Ba

红外：gydF4y2Ba

基因内区保留gydF4y2Ba

JA：gydF4y2Ba

茉莉酸盐gydF4y2Ba

lncNATs:gydF4y2Ba

长非编码自然反义转录本gydF4y2Ba

NAT-siRNA：gydF4y2Ba

CIS.gydF4y2Ba-NAT-derived siRNAsgydF4y2Ba

山:gydF4y2Ba

水杨酸gydF4y2Ba

SMRT:gydF4y2Ba

单分子实时测序gydF4y2Ba

TFS：gydF4y2Ba

转录因素gydF4y2Ba

我们感谢陈博士在福建省农业和林业大学学院检测叶绿素和光合速率。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

中国重点研究和发展方案（2018YFD0600101和2016YD0600106）是中国自然科学基金（福建省福建省自然科学基金（Grant No.31570674）的支持，这项工作得到了支持），福建种质资源创新中心和木质工厂的培养中心（125 / KLA15001E），以及福建农业和林业大学的国际科技合作和交流基金（KXGH1701）。gydF4y2Ba

数据和材料的可用性gydF4y2Ba

所有RNA-Seq原始数据可在NCBI获得，登录号为GSE104596。Bigwig文件已上传到我们的网站：gydF4y2Bahttp://www.forestrylab.org/pub/ga.gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

1. 杭宗张，惠辉王和强朱同样为这项工作进行了贡献。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 福建省省普瑞亚省普瑞安省重点实验室基础林业和蛋白质组学研究中心，福建省农业林大学，福州，福州，福州，350002gydF4y2Ba

   张航晓，王慧慧，朱强，高玉邦，王慧媛，赵良珍，王永生，席飞虎，王文飞，杨艳秋，林辰涛，顾连峰gydF4y2Ba

2. 福建农林大学生命科学学院，福建福州350002gydF4y2Ba

   高玉邦，王永生，席飞虎，杨艳秋gydF4y2Ba

3. 加州大学分子、细胞与发育生物学系，洛杉矶CA90095gydF4y2Ba

   Chentao林gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

CTL，QZ，WFW，HXZ和LFG构思了这项研究。HXZ，HHW，LZZ和YQY进行了实验。HXZ，YBG，HyW，YSW和FHX分析了高吞吐量排序数据。LFG和HXZ设计了这项研究并写了稿件。所有作者都读过并批准了最终版本。gydF4y2Ba

通讯作者gydF4y2Ba

对应于gydF4y2Ba联峰古gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

利益争夺gydF4y2Ba

提交人声明他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

出版商的注意事项gydF4y2Ba

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文根据创意公约署署署的条款分发了4.0国际许可证（gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba)，它允许在任何媒体上无限制地使用、分发和复制，前提是你给予原作者和来源适当的荣誉，提供一个到知识共享许可协议的链接，并指出是否作出了更改。创作共用及公共领域专用豁免书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba）除非另有说明，否则适用于本文中提供的数据。gydF4y2Ba

再版和权限gydF4y2Ba