减少摄取韧皮部Myzus persicae对蚜虫抗性辣椒加入

背景

绿桃蚜(GPA)Myzus persicae，在经济上是在辣椒种植，这不仅会造成直接损害最有威胁的害虫之一，但也传送许多病毒。选育抗蚜辣椒品种是一种很有前途和环境友好的方法在该领域，并在温室控制蚜虫。到现在为止，对GPA阻力没有很强的来源已经确定。因此，本研究的主要目的是确定辣椒材料一起GPA性的一个良好的水平，并探讨可能的耐药机制。

结果

对来自不同地理区域的74份辣椒材料进行了抗性筛选m . persicae．经过四轮的评价，我们确定一个辣椒baccatumaccession (PB2013071)高度抗m . persicae，虽然附加PB2013062和PB2012022显示出中间电阻。与易受敏感的加入相比，PB2013071的电阻导致韧皮柱的摄取量减少，通过电气渗透图（EPG）研究确定。喂养m . persicae诱导胼胝质合酶基因的表达，导致抗性植株筛元中胼胝质沉积，而感病植株中则没有。

结论

鉴定出3份辣椒抗蚜材料，对今后辣椒品种的选育具有重要意义。抗性最强的品种PB2013071表现出韧皮部对蚜虫侵害的抗性。

胡椒(辣椒属于茄科是一种经济上最重要和广泛种植的蔬菜作物。辣椒的全球年产量和产量分别为370万公顷和3700万吨(FAOSTAT, 2015)。属辣椒源自中南美洲，现时已报告有25种不同的品种[1]，其中五种是家养的:c .建立那C.楸那c . frutescens那C. Bacadatum.,c下毛竹[2］．

蚜虫(蚜科）是最广泛的传播害虫。超过100种蚜虫被报告为经济重要害虫和大多数作物从一个或多个物种[吃亏3.］．绿桃蚜(GPA)Myzus persicae是胡椒和其他作物中最具威胁的害虫之一。它是一种多面手，可对辣椒造成多种损害，包括褪绿、坏死、萎蔫、落叶、花果流产等。它在取食植物时产生蜜露，通过刺激霉菌的生长，影响果实的品质并降低光合能力。然而，最严重的损害是由GPA可能载体的病毒间接造成的，包括马铃薯Y病毒、辣椒斑驳病毒、辣椒严重花叶病毒、辣椒黄色花叶病毒和秘鲁番茄花叶病毒[4.］．

作为以韧皮部为食的昆虫，蚜虫利用它们特殊的口器，即茎鞘，穿透植物组织，在不造成严重损害的情况下吸收营养。5.那6.］．为了研究蚜虫的探食和取食行为，可以使用电贯入图(EPG)技术[7.］．在EPG技术中，一只蚜虫和一株植物被连接到一个电路中，蚜虫在植物上的活动被记录为波形，这些波形对于不同的探测和喂养活动是特定的[8.那9.］．EPG技术可以应用于探索抗敏感植物蚜虫行为的差异的性质，例如，以确定蚜虫在蚜虫遇到特定植物电阻因子的位置5.那10.那11.那12.］．

在几种情况下，已经观察到蚜虫在抗易感植物上显示出在抗性抗性饲料的显着较短时期[11.那12.］．一种可能的解释是韧皮部血管的闭塞是对进食的反应[13.那14.]，可能是由胼shiposition引起的[13.那15.］．胼胝质，ß-1,3-葡聚糖，是机械伤害、病原体感染和虫害防御反应的重要组成部分[16.那17.那18.］．在拟南芥诱导胼胝质沉积，增强相关合酶基因的表达，以响应白蝇的侵扰[19.］．在水稻中，胼胝质沉积被认为是抵抗褐飞虱的一个重要因素[15.］．

调用由调用合成酶（CAL）产生，由胼synthase基因的家族编码。鉴定并表征了十二个，十，六个，九和八个合成酶基因A. Thaliana.[20.那21.]， 白饭 [22.],大麦[23.)、小麦(24.]和葡萄藤[25.),分别。这些基因在A. Thaliana.．这CalS7据报道基因特异性在韧皮血管中表达，并负责通过机械伤害引起的胼舌沉积[26.］．这CALS12主要被证明是应对病原体攻击的伤口和乳头状胼胝形成所必需的[27.那28.]和蚜虫饲养[29.］．的表达CalS1被蚜虫和粉虱侵染后，该基因的表达上调[19.那30.］．除了胼胝质的形成和沉积在植物抗性中的作用外，胼胝质的分解可能是另一个因素。由一些ß-1,3-葡聚糖酶控制的胼胝质降解被证明在褐飞虱和水稻之间的相互作用中导致了敏感性[15.以及鸟类樱桃燕麦蚜虫和大麦之间的相互作用[31.］．

由于蚜虫对作物产量和品质的严重影响，化学农药已广泛应用于防治蚜虫。然而，随着越来越多的关于蚜虫对杀虫剂产生抗药性的报道[32.那33.由于人们日益关注杀虫剂对环境的影响，培育抗蚜辣椒品种是一种可取的选择，这将成为害虫综合治理不可或缺的一部分。植物对包括蚜虫在内的昆虫的抗性机制分为抗异种、抗生和耐受性[34.那35.那36.那37.］．抗锯齿或非偏好，影响昆虫沉淀或通过排斥或威慑喂养[38.］．基于抗生素的抗性损害昆虫的生存、生长、发育和繁殖力，这是由植物的化学或形态适应性引起的[36.那39.那40］．尽管昆虫的种群密度与易感植物相似，但耐受性可减少昆虫取食后对植物的损害[34.那40］．已经在农作物中发现了一些对蚜虫具有抗性的基因，其中包括小麦[41.,大豆42.)、生菜(43.]和豇豆[44.］．然而，只有两个基因被克隆出来，那就是番茄mi - 1.2基因其赋予对马铃薯蚜电阻Macrosiphum euphorbiae，对粉虱说烟以及三种根结线虫[45.那46.那47.]和甜瓜增值税抗棉蚜基因蚜虫棉，以及对非持久性病毒时矢量棉蚜[48.］．这两个基因都是NBS-LRR型[45.那48.]和工作根据基因对基因原理，这意味着R.植物中的基因识别蚜虫分泌的效应器，并激活蚜虫特有的防御反应[35.］．到目前为止，只有少数关于确定可能用于胡椒育种的抗性基因捐赠者的研究发表了[49.那50.］．一c下毛竹植物对GPA表现出抗xenosis而不是抗生抗性[49.]，但未提供该加入的详细信息，也未发现两者之间的杂交c下毛竹和c .建立目前尚无报道。弗朗茨et al。在选择试验中发现50个辣椒品种的GPA存在显著差异，但没有发现强烈的抗性[50.］．德哥斯达黎加等．鉴定了一个抗紫穗病的辣椒品种棉蚜，但尚不清楚它是否也会抵抗GPA [51.］．因此，仍然迫切需要抗GPA的辣椒品种。

本研究旨在鉴定对GPA具有良好抗性的供试材料，并探讨其可能的抗性机制。我们评估了一组c .建立那C.楸那c . frutescens和C. Bacadatum.研究了GPA抗性的来源和鉴定的抗性来源c . baccatum。这种抗性主要影响蚜虫的繁殖，很可能是以韧皮部为基础并伴有胼胝质的沉积。

抗GPA辣椒品种的选择

评估50个项目，代表4辣椒物种，用于GPA电阻显示出大而且非常显着差异（附加文件1所采用的两个抗性参数:原始若虫的存活率和产生下一代若虫的数量。存活率范围从6到97%,而新产生的仙女住的平均数成人期间感染不同从0到0.8。

把GPA从大白菜转移到c .建立入世CGN19226，十个选定的入世(附加文件1:表S1与图1)用已适应辣椒的GPA菌落重新测试。在第一个实验中，有7个品种的蚜虫存活率低，第二代若虫的产量也低。登记入册的c .建立CGN19226和c . frutescens由于PB2012045来自不同的物种和来源，因此被选为敏感标准。加入c .建立结果表明，CGN19194上未产生第二代若虫，但成虫存活数较高，表明该增种可能具有仅影响繁殖的抗性机制。在第二个实验中，这两个易感标准仍然是完全易感的。Accession CGN19194也是高度易感;在第一个试验中观察到的繁殖减少在第二个试验中没有得到证实。在第一次试验中筛选出的7份抗性材料中，5份抗性材料均为抗性材料C.楸根据两个试验的两个阻力参数，分别表现出不同程度的阻力(t检验，P.< 0.01)。然而，这两个C. Bacadatum.种质（PB2012022和PB2012024）继续呈现在第二个实验中，这是相同的，在第一个实验中受损的再现。

根据初步筛选的结果，我们决定将进一步的工作重点放在筛选上C. Bacadatum.登记入册(附加文件2:表S2)。在第三个实验中c .建立CGN19226用作易感标准。的38个种质评价表明对蚜虫存活和蚜虫繁殖力显著变化：从0.49变化到0.98原始若虫的生存和产生每蚜范围从0到0.89新的若虫数目。该种质PB2013071，PB2013062和CGN23260是属于最耐虽然他们不是从其他一些显著不同，基于对蚜虫的生存和生产的新一代若虫。加入PB2012022呈稍高若虫生存，但没有下一代若虫，证实了先前的结果。在加入C. Bacadatum.PB2013046与易感标准一样易感c .建立入世CGN19226。因此，我们将GPA转移到PB2013046，并使用在该易感品种上饲养的GPA对8份材料进行抗性复测C. Bacadatum.加入(附加文件2:表S2与图2）.在第四次实验中，我们将PB2013071、PB2013062、CGN23260(无繁殖，存活率较低:< 0.7)与PB2012022、CGN22834(同样无繁殖，存活率较高:> 0.7)为抗性材料，CGN22858(部分繁殖，低存活)为中抗性材料，PB2013046与CGN19226(高繁殖，高存活)为敏感材料。在本实验中，加入C. Bacadatum.PB2013071同样是最具抗性的，因为它继续显示最低的存活率和没有繁殖。在加入C. Bacadatum.PB2013046同样易感c .建立入世CGN19226。由此产生的新若虫人数之间的相关系数c .建立和C. Bacadatum.3、4次试验对8个群体的适应性为0.83。

GPA人口发展选定的入学

三种选择抗性C. Bacadatum.附加（PB2013071，PB2013062和PB2012022），易感C. Bacadatum.接入(PB2013046)和易感者c .建立利用群体发展试验进一步证实了该病毒的抗药性和易感性。结果如表所示1．结果表明，PB2013046是一种易感突变体，在该突变体上蚜虫表现出较高的存活率和较强的繁殖力，甚至高于该突变体c .建立敏感的标准(CGN19226)。添加品种PB2013071抗性水平最高，添加品种PB2013062和PB2012022抗性水平中等。

对PB2013071和PB2013046进行EPG分析

从EPG记录中提取的参数结果如表所示2．抗性品种PB2013071与敏感品种PB2013046在未探测、途径期、茎突脱轨力学和木质部期等相关参数上无显著差异。然而，韧皮部E1期(唾液进入韧皮部)和E2期(韧皮部汁液摄入)有显著差异(t检验，P.< 0.05)。PB2013071上E1的总时长是PB2013046的2倍以上，而PB2013071上E2的总时长仅为PB2013046的1 / 8左右。而成功摄取韧皮部E2的蚜虫数量差异不显著:PB2013046为75%，PB2013071为47% (Fisher精确检验，P. = 0.101). The total number of individual cell punctures (potential drops) and average number of potential drops per minute of pathway phase were both more on PB2013071 than PB2013046 (T-test,P.< 0.01)。

胼胝质沉积

胼胝质沉积被认为对植物抵抗病原体和昆虫很重要[15.那52.］．我们在GPA喂养后研究了抗性和易感植物中的胼ins。脱离的叶子用GPA感染24小时，之后为调用沉积研究制备三个或四个叶片。代表性结果如图2所示。3.和其他图像可以在附加文件中找到3.:图S1。在未被蚜虫侵染的加入物PB2013071中，ca2 +处理的加入物PB2013046和未被蚜虫侵染的加入物PB2013046的维管组织中均检测不到胼胝质信号。

胼胝质相关基因的鉴定与表达

九个假定的胼胝质合成酶（CalS)基因在c .建立序列和命名参照最同源的基因拟南芥那Cacals1.那Cacals3.那Cacals5.那Cacals7.那Cacals8.那cacals9.那CaCalS10那CaCalS11和CaCalS12．辣椒基因组序列的开放阅读框(orf)长度和基因id列在附加文件中4.:表S3。辣椒间的CalS蛋白质邻居连接树拟南芥和葡萄藤显示在附加文件5.:图S2。

为了阐明胼胝质沉积的调控，我们比较了胼胝质合成酶基因(CAL家族基因)和基本ß3-glucanase基因（BGLU)与未受gpa侵染的叶片相比。九个假定的CALreal-time PCR分析家族基因。在这九个基因中，只有CalS1（图。4A),CalS7（图。4 b)表现出明显的转录本积累变化。在被GPA侵染的PB2013071叶片中，两种基因在侵染1.5 h后表达量无差异，但在侵染开始后6 h和24 h与空笼相比表达量显著上调(t检验，P.< 0.05)。表达水平CalS1增加了5.6倍(t检验,P.= 0.0004)和CalS7增加了3.9倍(t检验,P. = 0.0088) 24 h post-infestation compared to empty cages. In the leaves of PB2013046 infested with GPA, expression of theCalS1和CalS7基因在24小时内保持稳定，除了CalS7处理1.5 h后，GPA侵染叶片的表达水平显著低于GPA游离叶片(t检验，P.= 0.0017)。的表达式CalS1和CalS7空白夹笼处理1.5 h、6 h和24 h后，两种材料叶片中基因表达量不变(方差分析，P.> 0.05)。

这BGLU与空笼相比，在蚜虫侵扰的24小时内，基因在PB2013071中升高于PB2013071中（图。5.）（t检验，P.< 0.05)。有蚜虫侵害和没有蚜虫侵害的转录本比率在1.5 h增加到2.3 (t检验，P.= 0.0070)， 6 h至3.9 (t检验，P.= 0.0062)，在24 h时达到6.4 (t检验，P.= 0.0141)。相比之下，在表达上无显著性差异BGLU在同一时间点，GPA处理1.5 h、6 h和24 h的植株与空笼处理植株之间存在PB2013046基因的表达。在树叶中，收到了空夹笼的表情BGLU基因在1.5小时，6小时，24小时，两种过程中增加（ANOVA，P.< 0.05)。

培养经历对GPA成绩评价的重要性

当使用在卷心菜或辣椒上饲养的GPA进行初始评估时，蚜虫存活率存在很大差异:使用卷心菜饲养GPA时，GPA存活率相对较低，而使用辣椒饲养GPA时，GPA存活率较高。平均绩点培养历史的影响存在差异辣椒登记入册。几乎没有什么效果c .建立登记入册,而在C.楸饲育效果显著。在此之前已有报道，蚜虫群体的寄主植物可以影响蚜虫的性能。例如，蚜虫Sitobion avenae用小麦饲养的鸡脚表现不如用小麦饲养的鸡脚[53.]， 和棉蚜适应于棉花或黄瓜的昆虫在相互寄主转移后不能存活和繁殖[54.］．

关于我们测试系统中的主机适应背景我们只能推测。（1）由于卷心菜和胡椒之间的代谢物含量差异，蚜虫可能不得不开发/调整其排毒系统以适应宿主植物，这可能需要几代人。例如，据报道，酶解毒系统是一种谷胱甘肽S-转移酶的系列，参与GPA对含有不同葡萄糖蛋白酶的不同物种[55.］．（2）另一个假设涉及从一种植物物种转移到另一个植物物种后的内氨苄二硫酮组合物的变化。互化的共生在植物 - 昆虫互动中发挥乐器作用[56.］．豌豆蚜寄主植物专化Acyrthosiphon pisum均受兼性豌豆蚜u型共生体(PAUS)的影响[57.］．此外，丰富的Buchnera aphidicola， GPA的主要内共生细菌，被发现影响GPA的宿主接受和导管在宿主植物上的穿透[58.］．在我们的例子中，在饲养上c .建立可能已经改变了蚜虫的新陈代谢，引入了一个新的内共生体物种或增加了一个已经存在的共生体物种的丰度，提高了它们的表现C.楸．基于所取得的观察结果，强烈建议使用适应物种的昆虫种群进行种质的评估，或者通过适应的蚜虫进行再试，以确认电阻筛查结果，特别是当蚜虫饲养在进化上时遥远的植物材料，如大白菜在我们的情况下。

在GPA的抵抗方面有很大的差异辣椒登记入册

蚜虫的高繁殖率使它们成为许多作物的害虫。59.］．即使在天敌(捕食者和寄生蜂)存在的情况下，通常也很难控制蚜虫种群的增长。对蚜虫高度或部分抗性的品种，可以通过降低蚜虫的繁殖率，从而使天敌有更多的机会控制它们[60］．为了开发这类品种，需要在可杂交品种中鉴定抗性来源，本文介绍了抗性来源的鉴定方法。来自四个互交的材料辣椒物种对GPA的抗性评估，并观察到相当大的差异。经过四轮评估，我们确定了一些C. Bacadatum.蚜虫抗性相对较高且稳定的品种。通过对5个供试材料的GPA种群发展试验，证实了它们的抗性。抗性似乎主要影响下一代若虫的产生，对蚜虫本身的生存影响较小。加入C. Bacadatum.PB2013046表现为易感性，GPA存活率和繁殖力最高C. Bacadatum.PB2013071表现出最强的抗性，其GPA生存率显著低于易感添加时，且群体发育严重受损。登记入册C. Bacadatum.PB2013062和C. Bacadatum.PB2012022显示出中间水平的抗性。这三个加入是第一个C. Bacadatum.对GPA具有抗性的供试材料，可用于其他地区的抗病品种的选育辣椒品种为好。物种C. Bacadatum.已被用作辣椒育种的炭疽病供体[61那62]及抗白粉病能力[63］．关于抗虫性，有两个C. Bacadatum.种质报告为一个很好的来源蓟马（蓟马parvispinus和Frankliniella occidentallis.)电阻(64)和三个C. Bacadatum.供试材料对棉蚜(棉蚜）[50.］．据我们所知，这是第一个对GPA的强抗生素型耐药性的报道辣椒．

在加入抗韧皮部受损摄取

电穿透图(EPG)技术可深入研究刺吸昆虫的进食行为[7.]，并能够揭示这些昆虫在试图以植物为食时可能遇到的限制[5.那9.］．EPG分析揭示了与抗易感辣椒加入的GPA饲喂的GPA韧皮肌阶段相关的显着差异。与敏感的加入PB2013046相比，在抗性PB2013071上，韧皮盐活化期更长，更频繁，并且验素摄取周期要短得多，表明抗性很可能位于韧皮柱中。换句话说，饲喂抗性加入PB2013071的蚜虫难以启动和维持Phloem SAP摄取。饲喂含有韧皮肌的抗性的饲料的蚜虫可能会慢慢生长，具有较低的繁殖力，并且由于占用足够的营养而经历的问题，更可能会死亡。这符合我们的观察。除了控制蚜虫种群的可能性外，基于验证的电阻可能会降低持续病毒的传播，因为通常蚜虫在短时喂食过程中不能获得持久性病毒[65］．当携带病毒的蚜虫数量较低时，受持续病毒感染的植物的百分比可能也会减少[66］．

韧皮部前期除电位下降的数量外，无显著差异。潜在的液滴表明，蚜虫的茎突沿着通往韧皮部的路径刺穿细胞[67］．潜在的滴数是在抗加入PB2013071远高于对易感加入PB2013046。大豆蚜的一个生物型（大豆）在抗抗性基因型上喂养时，还显示出更高数量的潜在液滴而不是易感基因型[11.］．据报道，潜在的下降与蚜虫传播非持续性传播病毒有关[68那69］．然而，尚不清楚它们是否指示了一种特定的植物抗性成分。尽管电位下降的数量不同，但两种通路阶段的总持续时间没有差异。我们观察了两种植物表皮和韧皮部之间的细胞层数，这可能与穿过韧皮部时被刺穿的细胞数有关;然而，在这方面，我们没有观察到两种加入之间的差异(结果未显示)。因此，尚不清楚在抗性植株上大量潜在的下降是否对抗性具有重要意义。

诱导耐腐蚀的胼舌

韧皮部抵抗的一个可能机制可能是韧皮部血管在蚜虫取食时的阻塞，这可能是胼胝质沉积的结果。胼胝质的诱导和形成是对韧皮部吞噬害虫的一种防御反应，这些害虫堵塞筛子以阻碍摄食[15.那30.那70那71那72］．我们的数据清楚地显示，抗性品种PB2013071离体叶片上的胼胝质沉积开始后24小时，而敏感品种PB2013046和未侵染品种的叶片上没有胼胝质沉积。这表明胼胝质沉积可能是韧皮部抵抗背后的机制之一。事实上，胼胝质沉积是在离体叶片上而不是在完整植株上研究的，这可能导致了较弱的胼胝质反应。我们没有对离体叶片的抗性进行评估，而是用蚜虫对生菜进行了研究Nasonovia Ribisnigri.[73表明与完整植株相比，离体叶片的抗性表达可能部分降低。有报道称，在相互作用过程中，在表皮和叶肉细胞壁中观察到胼胝质沉积棉蚜甜瓜植株携带抗性基因增值税[74］．

作为强的胼胝质信号被馈送GPA而不是在易感植物后在抗性辣椒植物的叶脉发现，我们的假设是一个或几个CAL家族的基因或3-glucanaseß1日基因(s)可能与GPA侵染后抗性和敏感植物之间的差异有关。我们进行了实时荧光定量PCR检测胼胝质沉积是否可能是由于增加CAL蚜虫攻击时的基因表达。9个假定的CAL家庭的基因,CalS1结果表明，在pag侵染后6 h和24 h, PB2013071叶片中基因表达显著上调，而在侵染初期24 h, PB2013046叶片中基因转录水平保持不变。这CalS1吉恩已经在拟南芥被粉虱及蚜虫侵扰后积聚[19.那30.］．除了CalS1基因，我们检测到CalS7在耐加入PB2013071的感染的叶子也显著相比未感染的叶子6小时和24小时后增加了，但小于的转录CalS1．这CalS7基因是唯一的韧皮部特异性的胼胝质合成酶基因，它在发育筛元素中负责胼胝质生物合成，以及成熟韧皮部机械损伤后胼胝质沉积[26.］．在这里，我们第一次报道了一个归纳CalS7用植物喂养昆虫侵染的转录。两者的表达CAL蚜虫侵染后抗性品种叶片中基因含量增加，而感感性品种叶片中基因含量没有增加。我们推测CalS1和/或CalS7基因负责在GPA馈送后的耐加入PB2013071叶胼胝质沉积。作为答:芥CalS1也可以被其他以韧皮部为食的昆虫诱发，比如粉虱烟粉虱[19.和甘蓝蚜虫Brevicoryne brassicae[30.),CalS1基因可能在韧皮部取食者诱导的胼胝质沉积中起共同作用。随着CalS7基因特别在韧皮部导管中表达[75]，实时PCR对整个叶盘取样而不仅仅是叶脉取样可能会低估昆虫刺破韧皮部的诱导水平。这两个人的作用CAL胼胝质沉积的基因有待进一步研究。由于胡椒的转变是困难的[76，要做到这一点，让两人保持沉默可能不那么容易CAL基因。更有效的方法可能是进行基因(精细)定位研究，以确定与抗性有关的基因。

BGLU蛋白，又称致病相关(pathogenesrelated, PR)蛋白2，负责水解胼胝质(ß-1,3-葡聚糖)，以破坏病原体细胞壁的稳定，并激活一些免疫激发子，刺激对病原体攻击的防御反应[77］．在辣椒植株BGLU有报道对病原体[防御过程中发挥重要作用78那79那80］．Bglu蛋白或BGLU基因转录本也被发现在小麦叶片中积累[81),拟南芥[82蚜虫侵袭后。这BGLU基因被认为是植物水杨酸(SA)依赖防御反应的标记[83那84］．此外，与BGLU相同的家族的一些ß-1,3-葡聚糖酶被提出作为棕色植物料斗和稻米相互作用的敏感因素[15.]，以及小鸟樱桃燕麦蚜虫和大麦之间。31.］．研究认为，在易感植物中，胼胝质沉积对昆虫的摄食屏障可以通过积累而减弱3-glucanaseß1日，当表达时，呼应沉积可以保持在抗性植物中3-glucanaseß1日基因很低。然而，与这个假设相反，我们发现BGLUGPA馈送的在耐加入PB2013071的叶子上的24小时过程中增加的基因，但不是在易感加入PB2013046的叶子。有可能是胼胝质合成的表达水平之间和胼胝质降解的基因的微妙平衡。这BGLU积累可能是由于植物需要在韧皮部降解胼胝质，因为胼胝质沉积可能影响同化物的运输。事实上，空夹笼子下的表情也一样BGLU基因增加可能与参与BGLU一般防御反应中的基因[85那86那87］．把夹笼放在叶子上可能会造成这样的反应。

积累CalS1和CalS7基因转录似乎与EPG记录的韧皮部摄取受损不一致。侵染6h后基因表达增加，而在此之前蚜虫已表现出韧皮部取食困难。一种可能的解释是，在防御反应的早期阶段，胼胝质沉积受蛋白质水平的调控。在大豆中，损伤后5-10分钟内可通过激活蛋白酶诱导产生胼胝质[28.］．结果表明，蚜虫在抗性植株和感病植株上的韧皮部探针启动时间分别为1.5 h和1.5 h (EPG参数:到第一次E1的时间)。但在蚜虫开始侵染1.5 h后，未检测到胼胝质沉积(结果未显示)，说明PB2013071对蚜虫摄食的早期反应与胼胝质沉积无关。韧皮部导管堵塞的另一种可能机制是韧皮部蛋白(p -蛋白)的堵塞，它能迅速堵塞高等植物的筛管[88那89那90那91那92］．基于p蛋白的阻断被认为是比胼胝质沉积更快更早的反应[90］．可以推测，在抗性侵染过程中，特异性的p蛋白参与了对蚜虫的早期反应，而诱导胼胝质沉积是为了防止蚜虫以更稳定和持久的方式取食。

最后，我们确定了三个C. Bacadatum.对绿桃蚜具有抗性的种质C. Bacadatum.入世是易受影响的。登录号PB2013071表现出最高的抗蚜能力，根据EPG记录，这可能与韧皮部有关。这种阻力伴随着筛元内的胼胝质沉积，这可能至少是部分原因。的上调表达CalS1和CalS7抗性突变的基因与这一观察结果一致。

植物材料及生长条件

所使用的植物材料包括c .建立那C.楸那c . frutescens和C. Bacadatum.这些基因是从荷兰遗传资源中心(CGN)和瓦赫宁根大学和研究中心收集的。根据对大约50份加入的初步评估结果，来自C. Bacadatum.进行了筛选。在加入代码，名称和使用的所有材料的种类可以在其他文件中找到1:表S1和附加文件2S2:表。

播种两周后，将植株移栽到14厘米的盆栽花盆中，并在标准温室中生长，温度为19-21°C，相对湿度为60-70%，光照周期为16-8小时，位于美国瓦赫宁根州瓦赫宁根大学研究中心。植株每隔一天浇水一次，生长和试验期间不进行防蚜处理。

蚜虫种群

GPA（m . persicae)所使用的人口源自[93］．最初是用大白菜(b·拉伯)的简历。Granaat;后来将饲育转移到c .建立加入CGN19226，其后为C. Bacadatum.入世PB2013046。在与辣椒植株相同的条件下，在标准温室中饲养蚜虫。

评价辣椒在夹笼测试中GPA电阻的附件

所有的评估都是在荷兰瓦赫宁根瓦赫宁根大学研究中心的温室中进行的，并在夏季和秋季进行了四个实验。第一个实验，包括50个附件(附加文件1:表S1)，在植株8周龄时进行。植物采用完全区组设计，在同一温室隔间中设置4个区组，每个区组1株，2个夹笼，每个笼包含10只1日龄的GPA若虫，这些若虫是从大白菜上饲养获得的。夹笼放置在植株顶部两个完全展开的叶片的背面。7天后，统计每个夹笼中存活和死亡的蚜虫数量以及新孵化的若虫数量。第二个实验与第一个实验相似，有以下变化。从第一个实验的50个样本中选择了10个样本1:表S1)。他们在一个完整的区组设计中重新测试，当他们7周大的时候，10个区组，每个区加入一株植物，同样每株有两个夹住的笼子，里面有10个1天大的若虫，来自于饲养c .建立入世CGN19226。

在第三个实验中C. Bacadatum.对供试材料进行了评价c .建立CGN19226易感控制(附加文件2：表S2）以类似于在前两个实验的条件下，完全区组设计，四个块。它们与单株两个夹子保持架，含有每从上CGN19226一个饲养，当植株7周龄得到保持架5 1日龄GPA若虫进行评价。在第四个实验中，从第三实验8个选择种质（包括易感c .建立CGN19226)在一个完整的区块设计中重新测试，包含五个区块(附加文件)2:表S2)。与第三个试验植物相似，用两个夹笼对5只1日龄的GPA若虫进行评价，这些若虫是在敏感品系上饲养的C. Bacadatum.当植株7周龄时，加入PB2013046。8天后观察所有夹笼。

为了进行统计分析，将每株2个夹笼的观察结果结合起来。存活率是用活的蚜虫数量除以夹笼内的总蚜虫数量(死的和活的)来确定的。新成若虫数除以平均活蚜虫数，计算为(2*活蚜虫+死蚜虫)/2。此外，用于方差分析的数据被转换，以获得或多或少不变的残差方差:生存为arcsin(√(x))，若虫为√(x)。均数差异的显著性采用LSD检验(P.< 0.05)。

人口发展

利用群体发育试验进一步验证了材料的抗性/易感性。每个选定的入户材料随机取10株，放在一个温室室中。播种后约40天，每株植株均有5只无翅GPA成虫和10只若虫寄生在防蚜套内。19 d后，按目视标度(0 =无，1 =少(< 50)，2 =多(> 50))计算成蚜数和若虫数。对于方差分析，每株成虫数转化为对数(x)。平均数差异的显著性采用LSD检验(P.< 0.05)。

电气渗透图

电穿透图(EPG)技术用于监测GPA探测和对最耐药(PB2013071)和易感(PB2013046)的摄食行为。C. Bacadatum.加入。对每一株添加10株7周龄植株，将2只成虫放置在植株顶部完全展开的叶片的背面。实验装置如[94］．在恒定光下录制持续六小时，在20±2°C下。EPG模式使用Stylet +软件版本1.20转换为波形（http://www.epgsystems.eu/）.利用EPG-Calc 6.1.3从波形中提取电阻参数[95］．T检验用于确定各种EPG参数的差异之间的意义。Fisher精确测试用于确定六小时记录中达到E2的蚜虫百分比差异的重要性。

胼胝质沉积

组织学分析原位胼胝质沉积基本上是按照[96抗性(PB2013071)和敏感(PB2013046)C. Bacadatum.加入。与叶柄第二完全展开的叶子切成与来自每个植物剪刀，并立即放入用1.5％水琼脂培养基一厘米直径的6培养皿。二十随机选择的无翅蚜虫放入轻轻放入陪替氏培养皿，将其通过封口膜M（比米斯NA，USA）密封。四株植物/用于每个治疗或控制重复。24小时后，将含有蚜虫的数量最多三到四个叶盘（直径1.3厘米）从分离叶的取样，并直接放置在96％乙醇与他们的背轴面朝上，以除去叶绿素。在0.07微米ķ洗涤后₂HPO._4.(pH = 9)，叶盘在0.1% (W./V.）苯胺蓝色为0.07 m k₂HPO._4.（pH = 9）在室温下。随后将样品安装在具有70％甘油的玻璃载玻片上。在UV光下定性地观察给予荧光，并且使用Zeiss Axiophoto数字成像显微镜（德国Carl Zeiss AG）进行照片。没有蚜虫的控制叶样品以相同的方式处理;叶片磁盘从与来自侵染叶子所取的区域相当的区域取得。在24小时治疗后，观察到加入PB2013071和第14页的加入PB2013046中的12个叶片;为换档都观察到12个叶片作为控制。

基因表达分析

胼胝质的相关基因的表达水平进行实时定量PCR分析。七周龄的植物接收到包含每笼15只随机选择的无翅蚜虫3个夹笼中。叶圆片从夹子笼区域1.5，图6和蚜虫侵染开始后24小时收集。After gently brushing aphids away, disks were flash-frozen in liquid nitrogen and stored at − 80 °C until use. Leaf disks under an empty clip cage were also collected after 1.5, 6 and 24 h and used as reference. Additionally, leaf disks without clip cage and aphid infestation were collected just before the infestation stated (time point 0 h). Four biological replicates were used per treatment with aphid infestation and three per treatment with empty clip cages. For the reference without clip cages (time point 0 h) also three biological replicates were used. In all cases, two plants were pooled together as one biological replicate.

的序列CAL家族基因是从辣椒基因组平台（获得http://peppergenome.snu.ac.kr/）[97]及胡椒基因组数据库(http://peppersequence.genomics.cn/page/species/index.jsp）[98]通过BlastP查询[99]参照从序列拟南芥（https://www.arabidopsis.org/index.jsp）.根据其系统发育树进行基因鉴定和命名CAL家庭之间的基因拟南芥，葡萄藤和胡椒，由MEGA5 [One hundred.］．除了CAL家庭的基因,基本ß3-glucanase基因(CA03g30020,BGLU）从辣椒基因组平台获得（http://peppergenome.snu.ac.kr/）.胡椒肌动蛋白基因（CA12g08730）作为用于基因表达的正常化的内部参考[101］．利用Primer3Plus (www.bioinformatics.nl目录/ primer3plus / primer3plus.cgi)，并在附加文件中列出6.:表S4。

根据供应商的建议，用RNeasy植物迷你试剂盒(Qiagen, USA)分离总RNA。用DNase I (Invitrogen，美国)处理后，1 μg RNA模板用iScript™cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad，美国)反转录成cDNA。采用iQ™SYBR Green Supermix (Bio-Rad，美国)和CFX96 Touch™real-time系统(Bio-Rad，美国)进行实时定量PCR。

PCR混合物含有5μL2×IQ™SYBR绿色超纤维，0.3μL正向引物（10μm），0.3μl反向引物（10μm）和2μLcDNA模板，10次稀释成10μl的最终体积。使用以下程序重复进行定量RT-PCR：95℃，3分钟，然后是40个95℃的循环，60℃，60℃，1分钟。由于引物被设计在基因序列上c .建立，对QPCR产物进行测序，验证其扩增区域C. Bacadatum.．用2-计算相对表达式^ΔΔCt方法(102］．采用对数变换数据的独立样本t检验，确定GPA感染后与无GPA感染后某些时间点差异的显著性(P.< 0.05)。

我们要感谢Freddy Tjallingii博士对EPG数据的宝贵讨论，感谢Sean Geurts和Maarten Peters对植物的照顾。

资金

该项目的资金由荷兰经济部以及荷兰荷兰和拜耳作物科学B.V.的繁殖公司以及荷兰和拜耳作物科学B.V.抵抗评估也由荷兰，荷兰和RIJK Zwaan Zaadteelt Zaadhandel B.v.的enza Zaden Research＆Development B.v.。来自中国奖学金委员会的批准者支持MS。

可用性数据和材料

支持本文结论的数据集包括在本文(及其附加文件）.所用的种质可从遗传资源中心荷兰或瓦格宁根大学研究用于非商业应用的MTA之下。

从属关系

1. 荷兰瓦赫宁根大学植物育种研究所，邮编386,6700，瓦赫宁根AJ，荷兰

   孙孟静，Roeland E. Voorrips，欢迎Steenhuis-Broers, Wendy van 't Westende & Ben Vosman

贡献

抗性评价由GS和WvW进行。EPG实验由WvW进行。采用MS、MS、RV和BV进行胼胝质沉积和实时荧光定量PCR实验，进行数据分析并起草手稿。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到本Vosman．

伦理批准和同意参与

不适用。

利益争夺

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

出版商的注意

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。

开放访问本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议(http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)，它允许在任何媒体上无限制地使用、分发和复制，前提是你给予原作者和来源适当的荣誉，提供一个到知识共享许可协议的链接，并指出是否作出了更改。创作共用及公共领域专用豁免书(http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/)适用于本条提供的数据，除非另有说明。

再版和权限