栽培葡萄与野生葡萄遗传多样性分析(葡萄地中海盆地和中亚周围的地区

背景

高加索和中国之间的山区被认为是葡萄树的驯化中心。尽管中亚在葡萄种植历史的重要性，有关的程度和在该地区葡萄遗传变异的分布信息相比，来自地中海盆地周围的野生和栽培葡萄是有限的。这项工作的主要目标是调查野生和培养葡萄种质中的遗传多样性和关系来自高加索，中亚和地中海盆地，统称，了解基因流动，可能的驯化事件和适应性血液。

结果

在地中海盆地和中亚周围收集了1378件野生栽培的葡萄藤，并用一套20核证据标记进行了测试。分析遗传数据（聚类分析，主坐标分析和结构）来识别组，结果由Nei的遗传距离验证，成对F_圣分析和分配测试。所有这些分析鉴定了3个遗传类群:G1，来自克罗地亚、法国、意大利和西班牙的野生种质;G2:来自亚美尼亚、阿塞拜疆和格鲁吉亚的野生植物;G3为来自西班牙、法国、意大利、格鲁吉亚、伊朗、巴基斯坦和土库曼斯坦的栽培品种，其中包括一小群来自格鲁吉亚和克罗地亚的野生种质。佐治亚州野生葡萄与同一地区栽培葡萄(Pontres Pontica)，但也与西欧(模样occidentalis)，支持佐治亚州作为葡萄驯化的古老中心。此外，聚类分析表明，西欧野生葡萄与同一地区的栽培葡萄属于同一类群模样occidentalis更多地促进了从东欧的野生葡萄葡萄的早期发展。

结论

对测试基因型之间的遗传关系进行分析，为地中海盆地和中亚地区野生和栽培种质之间的遗传关系提供了证据。遗传结构表明存在大量的基因流动，限制了两个亚种之间的分化。结果还表明，杂交葡萄发生在野生葡萄被驯化的地区。

葡萄L.是世界上种植最广泛的果类植物之一。1］．它有西亚和欧洲起源的亚种，分布范围从中亚到地中海盆地[2］．在属内vitis.，V. Vinifera是全球葡萄酒行业使用的主要品种，2012年占地750万公顷，产量超过6700万吨(http://www.oiv.int/)．在这个物种中，已经描述了两个亚种，V. Vinifera亚普。Sylvestris.，包括野生种群，和V. Vinifera亚普。苜蓿，其中包括驯化野生亲缘种而产生的栽培品种[3.］．区分这些亚种的主要表型特征是:花性(野生居群是雌雄异株，栽培的葡萄是雌雄同体或很少是雌性);和种子形态(球形种子具小喙为Sylvestris.和梨状种子，有发达的喙为家养品种)[4，5］．这两个亚种在没有繁殖障碍的情况下形成了一个遗传和分类连续体，从而产生了自发的杂交，在这种情况下它们发生在同系或同系[6，7，8，9，10，11，12］．

尼格鲁尔的开拓性工作[13]将葡萄栽培品种分成三组或pross.：occidentalis，蓬泰和胶取决于地理分布、形态和生态差异。在从东格鲁吉亚、亚美尼亚、阿塞拜疆和中亚前苏联加盟共和国到近东的广阔地区发现的葡萄藤有明显的区别特征，被放置在模样胶．Negrul认可了两个子pross.在这个主要组内:盐穗木，由伊斯兰教出现之前(公元500-1100年)用于酿酒的古老藤蔓组成antasiatica包括桌子和葡萄葡萄品种更近期的起源。从格鲁吉亚发现到巴尔干的品种生态型被指定P. Pontica.subPromes Georgica和子-Promes Balkanica， 分别。

葡萄驯化发生在大约8000年前，在新石器时代的年龄，并且与北部北部北部近东和地区的葡萄酒厂的进步密切相关[14，15，16］．葡萄从最初的驯化中心传播到欧洲和北非的邻近地区遵循了三条主要途径，首先是往美索不达米亚，到达南巴尔干半岛和东地中海盆地(公元前五千年末)，然后向西西里传播到西欧，最后，驯化的葡萄在公元前一千年被引入中欧[16］．与此同时，在公元前4世纪，葡萄种植传到中亚，在公元前2世纪左右，驯化的葡萄传入中国和日本[14，15］．

种植葡萄V. Vinifera亚普。苜蓿在人类历史上，在世界各地发挥了重要的经济和文化作用。然而，它的祖先是欧洲野葡萄V. Vinifera亚普。Sylvestris.美国濒临灭绝。为了捕获和保持现有的遗传多样性，来自东欧和西欧国家的研究人员在成本行动FA1003(为探索葡萄多样性和为育种动员适应性性状的东西方合作)的框架下，发起了从广泛国家收集和保存种质的努力。包括未用遗传和地形学方法研究本地种质资源的地区[17，18］．

作物物种的野生近缘种作为育种计划中独特的遗传变异来源，对育种者来说非常重要[19］．野生葡萄通常在河岸沟壑中发现，他们可以进入水，可以爬入树木檐篷中。人口压力增加的一次影响是野生植物自然栖息地的破坏以及遗传多样性的快速侵蚀。目前迫切需要鉴定和保护这一宝贵的种质资源，为子孙后代，并设计战略，通过野生葡萄的广泛收集保存这个物种的迁地保护，捕捉存在于地中海盆地和中亚地区的遗传变异。对中亚集合的仔细分析显示，许多基因型抵抗真菌疾病，如霜霉病（霜霉），白粉病（白粉菌属necator）和黑色腐烂（Guignardia bidwellii.）;这些都是大约150年前从北美引进的[20.］．其他研究发现植物的V. Vinifera亚普。Sylvestris.位于西班牙重金属污染地区，对铜胁迫表现出很高的耐受性[21］．来自新病原体、害虫和气候变化的生物和非生物压力刺激了适应性更好的品种的产生。充分的遗传变异是培育能够抵御这些挑战的作物的关键。

分子分析为遗传多样性提供了见解V. Vinifera与野生亲缘物有关的品种和与选定性状相关的特定等位基因的系谱[15，22，23］．虽然中亚是葡萄品种多样性的中心之一，但关于该地区种质资源的大部分信息来自欧洲和美国种质库保存的材料[10，12，24］．两个大型葡萄储存库中广泛的葡萄栽培区域的野生栽培区域的基因分型提供了一个能够阐明全球水平的两个亚种内部和之间的关系的重要数据集[10，25］．这些研究结果表明，葡萄在第一次驯化过程后从东向西传播。该结果也提供了局部基因渗入的证据Sylvestris.具有培养的个人[25]以及对地理来源和人类使用有关的遗传结构的影响[10］．

以前葡萄遗传多样性检测的一个局限性是取样不平衡，导致种质收集集仅限于一个或多个国家，没有广泛的代表性。此外,Sylvestris.高加索山脉和中亚地区的野生种质很少，或未进行分析。尽管遗传学、考古学和语言学证据表明，南安纳托利亚是葡萄驯化的摇篮，外高加索仍然是一个严重的候选地，从阿塞拜疆和格鲁吉亚的新石器时代考古遗址发掘的古代葡萄遗迹证明了这一点[5］．因此，先前研究的结果可能不会在该地区的野生和培养的葡萄群系之间完整了解关系，以及与世界其他地区的关系。野生和驯化葡萄藤的第一次大规模表征是由Imazio等人完成的。［12利用佐治亚州382株野生葡萄和130株栽培葡萄的SSR (Simple Sequence Repeats)指纹数据。结果发现了4个遗传群体，2个为野生种质，2个为栽培基因型。格鲁吉亚种质被归入一个单独的分支，突出了格鲁吉亚种质的独特性。另外两项来自高加索地区的葡萄种质研究也发现，野生和栽培葡萄都具有高度的遗传和形态多样性[26，27］．

Bacilieri等人先前的研究[10]分析了2096年培养基因型的遗传多样性，维护了位于附庸的种质收集，并建议葡萄园驯化的原始中心延伸到许多中亚国家。一种综合研究，包括从东西梯度的相反侧面收集的野生和培养群体的样本，以及来自中亚国家的样本将更好地了解地理和人类选择对葡萄驯化和适应性血栓影响的影响。它将进一步允许我们确定驯化中心和野生祖细胞内的种质的整体关系。通过这些目标，从以前的六项研究汇集了数据{Laucou等。［7]，deAndrès等。［8]，imazio等。［12]，Riaz等人。［24， Biagini等人[28， Zdunić等[29为从克罗地亚，佐治亚州，亚美尼亚和阿塞拜疆收集的野生加入，为从克罗地亚，格鲁吉亚，亚美尼亚和阿塞拜疆的野生加入制作了新的数据，这些数据展开了一个均衡的集合，代表了亚种，并提供了关键地理区域的最大代表[地中海盆地和中亚（西班牙，法国西班牙，意大利，克罗地亚，格鲁吉亚，亚美尼亚，阿塞拜疆，伊朗，土库曼斯坦和巴基斯坦]。分析SSR数据以推断出野生葡萄种群中种群的遗传结构，并确定中亚葡萄种种质在栽培基因库的多样化中的作用。结果是重点讨论了耐受生物和非生物胁迫的野生种质及其在繁殖计划中的应用。

植物材料

共有1378只野生(V. Viniferaspp。Sylvestris.）栽培（V. Viniferaspp。苜蓿)的样本包括外高加索(亚美尼亚、阿塞拜疆和格鲁吉亚)、里海地区(土库曼斯坦和巴基斯坦)和欧洲(克罗地亚、法国、意大利和西班牙)。表格1和额外的文件1：表S1介绍了基于其地理原产地和栖息地的分析的附加的详细列表。此列表包括975个样本苜蓿和Sylvestris.来自法国的种质，Iberian半岛，格鲁吉亚，土库曼斯坦，巴基斯坦，意大利和克罗地亚在以前的研究中由Laucou等人进行了基因分为。［7]，deAndrès等。［8]，imazio等。［12]，Riaz等人。［24， Biagini等人[28Zdunić等[29］．在此工作中，新增403份V. Viniferaspp。Sylvestris.来自亚美尼亚、阿塞拜疆、格鲁吉亚和克罗地亚的人进行了基因分型。这些来自亚美尼亚、阿塞拜疆和格鲁吉亚的野生种质是在两次不同的采集旅行中收集到的雌性藤蔓的种子。共有17个种子批次的幼苗保存在美国农业部位于加州戴维斯的国家克隆种质资源库中。的Sylvestris.2013年，克罗地亚的样本是从主要位于克尔卡河和涅雷特瓦河沿岸的自然栖息地的植物中采集的。注意选择雌雄异株的植物，并记录了花的表型和叶的形态[29］．从自然栖息地收集的西班牙种质保存在“El Encín”种质库(西班牙马德里)。法国Sylvestris.这些品种保存在INRA的“Domaine de Vassal”种质资源库中，意大利[28和格鲁吉亚语[12]样本是在米兰大学的种质储存库中（意大利米兰）。

DNA提取和基因分型

用DNeasy Plant Mini Kits (Qiagen, Valencia, CA, USA)从幼叶中提取总基因组DNA。扩增20个核SSR位点进行基因分型:VMC1b11、VMC4f3.1、VVIb01、VVIh54、VVIn16、VVIn73、VVIp31、VVIp60、VVIq52、VVIv37、VVIv67、VVMD21、VVMD24、VVMD25、VVMD27、VVMD28、VVMD32、VVMD5、VVMD7、VVS2 [7］．按照[7］．使用ABI 3500自动遗传分析仪(应用生物系统公司，生命技术公司，福斯特市，美国CA)检测扩增位点。使用GeneMapper 4.0软件(Applied Biosystems, Life Technologies)对等位基因大小进行评分，并记录碱基对。

数据分析

花表型的测定

花表型V. Vinifera亚普。Sylvestris.从亚美尼亚，阿塞拜疆，格鲁吉亚和克罗地亚收集的样品是通过来自基因APT3（腺嘌呤磷酸溶胶转移酶）的专门设计的标记的组合来确定，该组合能够区分雌性植物或雌雄同体[24］．我们还利用了SSR标记VVIb23的一个特异等位基因，该等位基因与2号染色体上的性位点紧密相连，能够区分雌雄同体和雌雄同体植物。VVIb23位点多态性已在[30.］．使用这两个标记分析了403种载体以分配花表型。来自其他国家的额外野生加入的花表型是在收集时或维护种质存储库中维护的植物中的。

遗传多样性

为了将新基因型的指纹数据与先前的数据集合组合[7，8，12，24，28，29]，将8个参考品种(赤霞珠、霞多丽、杜乐多、黑皮诺、雷esling、Thompson无核、仙芳黛和桑娇维赛)的遗传图谱作为参考，以规范等位基因调用。

估计群体之间的遗传多样性。标准化的SSR基因分型数据用于确定不同等位基因（NA）的数量，有效数量的等位基因（NE），Shannon的信息指数（I），观察到的杂合性（HO）和预期的杂合性（他; [31])。参数由GenAlEx 6.5软件估算[32］．堰和公鸡的F统计（F_是F_它F_圣;［33)和F_是值分别通过FSTAT 2.9.3和Arlequin 3.5.2.2软件检测[34，35］P.-值被评估超过1000个排列。每个群体的等位基因丰富度(AR)和私人等位基因丰富度(PAR)使用稀疏法估计，该方法补偿了HP-Rare 1.1中实现的群体间样本量(即稀有等位基因丰富度)的差异[36］．利用Barton和Slatkin的私人等位基因方法估算了12个葡萄种群间和两个亚种间的每代有效迁移数量[37]（1986）使用Genepop 3.4软件[38］．

遗传关系和分化

Poppr.［39]在R 3.1软件中实现的包[40]用于设计具有Neighbor-Joining的系统发育树。中的距离矩阵Poppr.基于Nei的距离计算[41］．用R包绘制了无根树状图猿［42］．为了测量从树木图中的分层结构的程度表示实际距离，已经计算了在R软件中实现的COPEnenetic功能进​​行了良好的相关系数（CCC）。使用邻接附聚物方法使用Hclust R功能来加入分层聚类。为了阐明地理基团内部和在地理基团中的遗传关系中，在多点微卫星数据上进行主坐标分析（PCOA），然后使用包装排列成地理组adegenet在r [43］．采用两两Nei’s遗传距离进行聚类验证和多变量分析[44配对F_圣在Genalex 6.5软件中。最后，分子方差分析（Amova，[45)，利用Arlequin 3.5.2.2软件对观察到的居群间和居群内遗传变异进行划分。对1000多个排列进行显著性检验。

人口结构分析

微卫星数据使用结构2.0进行基于贝叶斯模型的群集分析[46来确定遗传支持的最佳分组数．结构将个体分配到许多群集中（K)独立于基于基因型数据的群体信息，以减少偏离Hardy-Weinberg和连锁平衡的偏差。该程序采用马尔可夫链蒙特卡罗(MCMC)方法估计P(X|K)，即数据符合假设的后验概率K集群。分析将个人分配给每个人K基于会员系数的集群（问- value），这与群集数量的统一（K）假设。结构被设定为忽略人口信息，并使用具有相关等位基因频率的混合物模型，因为它被认为是细微群体结构的最佳选择[47］．将允许从数据中推断出混合物。当大多数个人来自一个人口或其他人时，alpha接近于零，而alpha大于大多数个人被混合的人数[48］．等位基因频率参数(lambda)设置为1。在一项试点研究中，发现10万次重复运行的老化和MCMC (Markov Chain Monte Carlo)模拟长度最优，可以获得准确的参数估计。集群数量(K)的变化从2到10，并进行了20次重复试验，以量化每种可能性的变化K．的K提供最大可能性的值(LnP（D)的跨运行通常推断为最可能的集群数量。然而，解释K应小心处理，因为它仅提供了临时近似[46有时，结构可能会错过真正和精细的人口结构。因此，我们使用了临时统计数据ΔK选择最佳的集群数量（K）基于连续之间数据的日志概率的二阶变化率KEvanno等人提出的值。［48］．

野生加入中的花表型

花性表型和种子形态是区分亚种的主要标准。Sylvestris.(雌雄异株藤本，种子具短喙)从栽培苜蓿形态(主要雌雄同体的花，种子有较大的喙)。由于栽培基因型多为雌雄同体，因此野生种质的收集主要集中在雌雄异株。来自西班牙和意大利野生样本的花表型数据在野外记录，此前由Benito等人报道[49和Biagini等人[28，50］．的Sylvestris.从自然生境中采集法国、格鲁吉亚(米兰大学库)和克罗地亚的样品，根据采集时存在果实(雌性)和不存在果实(雄性)的花轴记录花的表型。只有满足野生葡萄雌雄异株表型和叶片形态的样本才被纳入研究。该亚属的花表型。Sylvestris.无法确定从亚美尼亚、阿塞拜疆和格鲁吉亚(美国农业部仓库)收集的植物，因为这些植物保存在小容器中。利用两种DNA标记对来自亚美尼亚、阿塞拜疆、格鲁吉亚和克罗地亚的403份材料的雄性、雌雄同体和雌性花表型进行了区分2:表S2)。对来自克罗地亚的38份材料的田间表型观察与DNA分析预测的花表型相符。利用基于dna的花性标记和野外表型对所有野生品种的花表型进行了评估V. Vinifera亚普。Sylvestris.在附加文件中呈现2：表S2。

遗传多样性苜蓿和Sylvestris.种质资源

来自20个SSR基因座的遗传数据和跨越1378种葡萄样品，源自亚洲至欧洲（表1）并代表两个亚种V. Vinifera（苜蓿和Sylvestris.)，用于本研究。额外的文件1：表S1提供了所有分析的样品的等位基因型材。对于VMC4F3.1的VVIQ52至38的等位基因数量为38，平均为20.95个等位基因/基因座。对于VVIP31的VVIN73至7.004，有效等位基因数量范围为2.192，平均为4.651。观察到的和预期的杂合子在基因座之间具有大大变化，并且具有大多数基因座的固定指数的结果表明高水平的近亲繁殖（表2)．He值范围为0.477 (VVIn73位点)~ 0.803 (vs2位点)，平均值为0.678。Ho值为0.535 (VVIn73) ~ 0.845 (VVIp31)，总体均值为0.742。F值最低的位点为VVIb01(0.021)，最高的位点为VVIq52(0.189)。数据集的F值均值为0.088。

利用等位基因谱计算统计指标，确定栽培和野生基因型的遗传多样性(表)3.)．每个位点的等位基因数(Na)为9.120苜蓿9.164,Sylvestris.样本。在栽培品种中，意大利品种Na值最低，为4.900，格鲁吉亚品种Na值最高，为12.600。每个位点的等位基因数在7.050(亚美尼亚)和12.850(格鲁吉亚)之间。整个数据集的Ne值为4.441。的苜蓿来自意大利的移民(3.688)和Sylvestris.法国(2.792)的Ne值最低。Ne值最高的是栽培材料(5.751)和野生个体(6.016)3.)从格鲁吉亚。在苜蓿在42个基因的最小样本量下，等位基因丰富度为6.200 ~ 9.330，平均为7.848个等位基因。在Sylvestris.亚美尼亚族等位基因丰富度为5.870，格鲁吉亚族等位基因丰富度为10.200，等位基因丰富度总体平均值为7.089。私人等位基因丰富苜蓿范围从西班牙和法国组的0.020到意大利和土库曼斯坦/巴基斯坦组的0.520，整个位点的等位基因总体平均频率为0.314。在Sylvestris，阿塞拜疆葡萄的丰富度为0.020，格鲁吉亚葡萄的丰富度为0.980，平均每个位点有0.344个私人等位基因。野生品种的Shannon信息指数(I)平均值略低于栽培品种(1.60 vs. 1.641)，总体值为1.619(表2)3.)．通常，除了来自法国的培养样品（0.765与0.708）和意大利（0.798 vs.0.682）外，HO值低于每组的值。ho值苜蓿高于Sylvestris.（0.754 vs. 0.649），而总体平均值（0.692）更类似于Sylvestris.价值比这一点苜蓿价值。他的价值苜蓿(0.735)高于Sylvestris.值(0.722)。

基于原点和亚种，以及F._是计算值（表3.)．取值范围为−0.166(意大利语)苜蓿样本)到0.138(格鲁吉亚语Sylvestris.样本）。的价值观Sylvestris.种群数量普遍高于苜蓿人口。在野生地上，格鲁吉亚和西班牙的人口最高_是值（0.138和0.131）。来自法国（0.057）和格鲁吉亚（0.066）的植物繁殖系数最高的栽培饲养群体。F_是所有基因座和人口的价值为0.151且苜蓿值比for低Sylvestris.（0.039与0.169）。大部分的f_是价值有A.P.-值小于0.1。

聚类分析

基于成对距离矩阵的邻域连接(NJ)聚类分析显示了两个亚种之间的明显差异(图2)。1)．与栽培样品聚集的许多野生个体，反之亦然。树枝图显示出三个主要群，具有0.75的核遗传相关系数（CCC）值（图。1)．的Sylvestris.资料分为两组和苜蓿加入形成了第三个主要组。第一组野生种质含有大部分的超殖民人员Sylvestris.来自亚美尼亚（＃1），阿塞拜疆（＃2）和乔治亚州（＃5）和第二组的加入包括来自克罗地亚（＃3），法国（＃4），意大利（＃6）和西班牙（＃7）。西班牙野生加入进一步分为两组，其中一个包括法国野生样品（＃4）。其中有两个子分组苜蓿一组包含法国(#8)、意大利(#10)、西班牙(#11)和土库曼斯坦-巴基斯坦样本(#12)，另一组包含一些格鲁吉亚样本(#9)。另外还发现了两个小簇，都含有格鲁吉亚的样本。其中一个包含野生样本(#5)，另一个包含野生和栽培样本(#5和#9)。后者也包含一小群意大利品种(#10)。

人口结构分析与分化

为了识别样品中群体的结构和样品之间的相关性，进行了两种不同的分析。PCOA基于SSR型材获得的遗传距离矩阵。PCOA的突起绘制在2尺寸散射图中（图。2)．前两个主轴的PCOA 2D投影占总分子变化的〜32％（图。2)．两个亚种与欧洲亚种和外高加索亚种之间的显著差异Sylvestris.观察到群体。的Sylvestris.来自亚美尼亚(第1位)、阿塞拜疆(第2位)和格鲁吉亚(第5位)的样本与其他国家的样本明显不同苜蓿和Sylvestris.组。欧洲Sylvestris.组（＃3，＃4，＃6和＃7）形成重叠的群集，以及来自亚美尼亚（＃1）和乔治亚州（＃5）的accedions。所有五组苜蓿欧洲国家(第8、10、11位)中，格鲁吉亚(第9位)、土库曼斯坦和巴基斯坦(第12位)关系密切。的苜蓿群体与Sylvestris.来自欧洲(#3，# 4，# 6，# 7)和外高加索(#1，# 5)的国家除外Sylvestris.阿塞拜疆加入(#2)。在每个组和亚种内都有很大的变异性。第二种用于评估基因型之间关系的方法是在STRUCTURE程序中实现的聚类算法。野生动物遗传结构贝叶斯分析结果(Sylvestris.）和栽培葡萄（苜蓿)与NJ聚类分析和PCoA结果大致相当，但STRUCTURE没有发现一些种群之间的微妙差异。不同K值的对数概率估计值[Ln Pr (X|K)]逐渐增加，在K = 3时达到最大值，重复运行之间的差异不显著，超过此值，连续运行之间的增长率降低，运行之间的方差增加(图3)。3.)．根据Evanno等人，绘制数据的对数概率(∆K)与聚类数量的二阶变化率，对比K预测真实的K。[48],这种分析产生一个清晰的峰值在K = 2,但可能性分布的二阶变化率显示速度的变化是K = 3和4之间的更大,因此,K = 3是最有可能的集群数量这些葡萄种群的遗传结构。在K = 3时，约84%的基因型被分配到一个聚类中，分配的百分比高于80%。混合基因型的比例约为16%3.:表S3)。绘制K = 3的Q矩阵值(每个K集群中每个个体的估计隶属系数)(图。3.），揭示了大致对应于内部两个主要群体的集群Sylvestris.一个来自高加索地区(亚美尼亚、阿塞拜疆和格鲁吉亚;另一个来自欧洲(克罗地亚、法国、意大利和西班牙;G3)，一组用法语、格鲁吉亚语、意大利语和西班牙语苜蓿加入（G1）。如在NJ集群分析和PCOA中观察到的，所有三组都有混合祖先的基因型。最高百分比的混合样本百分比为亚美尼亚（39％）和野生团体和法国（32％）的格鲁吉亚（32％）（额外文件）3.:表S3)。

12个试验种群之间的种群结构，不考虑亚种，总结了赖特的F统计(F_它F_圣和F._是)(额外的文件4:表S4)。F值在VVMD21位点最高_它F_圣和F._是（分别为0.380,0.235和0.189），而最低的f_它和F._是为VMC4F3.1基因座检测值（分别为0.095和0.005），并且VVMD25具有最低的F._圣值(0.056)。当样本被安排在12个种群时，经过样本量校正后的迁移人数(Nm)为1.33。当样本被安排在两个亚群(苜蓿和Sylvestris.)， Nm为4.88。

Nei的遗传距离和F_圣，以验证聚类分析和PCoA的结果。表中列出了12个地理组的成对值4．Nei的遗传距离范围很广，法国人和西班牙人的记录为0.116苜蓿样品，到0.830Sylvestris.来自格鲁吉亚和法国的样品。F_圣对于法国和西班牙语栽培的浇筑物，从0.021的低点变化为0.125Sylvestris.阿塞拜疆和法国的个人。Nei的遗传距离和F_圣值苜蓿和Sylvestris.组分别为0.159和0.023。

AMOVA分析在附加文件中5:表S5。对总遗传变异进行划分时，居群间差异占9.54%，居群内个体间差异占6.68%，居群内个体间差异占83.78%，超过1000个排列的显著性均小于0.05。F_圣F_是和F._它参数总体总轨和群体分别为0.095,0.073和0.162（P.≤0.05)。

这项研究的主要目的是分析来自地中海盆地和被认为是驯化中心的中亚地区的野生葡萄和栽培葡萄内部和之间的遗传多样性模式。我们收集了之前6项研究的信息，包括野生和栽培材料，并在20个微卫星位点上对来自高加索地区和克罗地亚的403份野生材料进行了基因分型。采用NJ聚类和贝叶斯方法对1378份野生葡萄群体的微卫星标记数据进行了聚类分析，并对驯化过程中发生的基因流动和频率变化进行了推测。

评估花生活内部Sylvestris.人口

两个亚种的分类学区别，Sylvestris.和苜蓿，是根据叶的形态和雌雄异株的野生形态。根据Antcliff的模型[51]，花的表型是由一个单一的主位点控制的，共有3个等位基因:雌雄同体(H)占优势的雄性(M)，雌雄同体(F)占优势的雌性(F)。在野外，没有雌雄同体栽培品种的基因流，只有雄性和雌性植株存在。然而，杂交和种子扩散的可能性增加了野生藤蔓接近栽培类型。早期研究中收集的野生材料仔细考虑了花的表型和叶的形态[7，8，12，28，29］．来自亚美尼亚，阿塞拜疆和格鲁吉亚的样本被收集为种子批次。基于联系标记的花表型分析发现，格鲁吉亚人群比男性葡萄园更加女性，而种子批次DVIT3357仅由雌性和雌雄同体葡萄藤组成，该葡萄藤表示从栽培到野生类型的基因流动（附加文件2:表S2)。然而，亚美尼亚和阿塞拜疆种群的雄性植株比例较高。在早期的西班牙语研究中也观察到植物的异质性性别分布Sylvestris.样品(49大多数植物是雄性的。

亚种内及亚种间遗传多样性分布格局

两个亚种V. Vinifera本研究中包含的含量高水平的多态性和杂合性，在亚种类内部和之间观察到的微卫星基因座的杂合子（表2和3.)．这一趋势在一个由亚种和两性品种组成的分化基因库中得到了预期，这些品种在驯化过程中经历了密集的人类选择．其他研究取得的数据[10，11]与我们的调查结果类似。由于有效数量的等位基因和等位基因丰富的亚种类的不同地理群内和不同地理群中的遗传多样性表明，亚种内部和之间存在显着多样性（表3.)．的苜蓿和Sylvestris.佐治亚地区的有效等位基因数和等位基因丰富度最高，表明该地区是植物多样性的中心V. Vinifera［2］．

总的来说，我们期望在Sylvestris.由于它与其驯化的同行相比它是普及的出交性质苜蓿．Ho的价值苜蓿集团出现略高于他的价值;虽然这一趋势是相反的Sylvestris.登记入册。这些差异对应于正面f_是值Sylvestris.，特别是在西班牙和格鲁吉亚的人群中，这表明来自同一野生种群的个体之间的高水平遗传关系（表3.)．这样的交配会影响个体和种群的动态，并增加近亲繁殖。然而,F_是在随机交配人群中，一些野生种群的值接近零（表3.)．这些相反的结果可能是由于样本量的原因，在亚群体中等位基因的随机遗传漂变。我们观察到的物种多样性的减少Sylvestris.其他研究亦注意到样本[10，11，12］．的Sylvestris.由于森林砍伐和城市化，世界上许多地方的野生动植物被认为是濒危的和支离破碎的。人为和自然的地理障碍也可能导致野生种群在其原栖息地的隔离，并可能导致显著的近亲繁殖，减少不同地理群体内部和之间的基因流动，从而降低杂合度。

F_是除意大利品种外，其余栽培品种均接近于零，表明是随机交配。- F_是值表明杂合子过多，但没有统计学意义(表3.)．大多数栽培类群均缺乏纯合子，这表明它们是由具有不同的人口统计学(奠基者效应、瓶颈、扩散)和选择历史的种质组成的。种质收集通常是基因型的混合。因此，这些集合中的地理群体表现出相对较高的分化水平，导致杂合度高于预期水平。这在多年生木本作物中很常见，这些作物的品种是根据其活力选择的，这间接地有利于高水平的杂合度[52，53，54］．

AMOVA和F-stat分析结果表明，居群内存在较高的遗传多样性水平，居群间存在较低的遗传多样性水平。这些结果与其他研究的结果一致[10，11，12］．

亚种内部和亚种之间的遗传结构和分化

通过聚类分析和PCoA (Figs。1和2)．这两种分析都发现了西欧野生葡萄和高加索野生葡萄的明显区别。法国和西班牙的野葡萄亲缘关系密切，遗传关系密切。这些结果与Arroyo等人一致[22他利用叶绿体标记发现这些种群具有相同的单倍型。西班牙野生葡萄藤表现出等级分化，表明相邻种群间的基因流动导致了种群结构的阶梯式模型。或者，等级分化可能是不同地理区域间气候差异的结果。克罗地亚Sylvestris.加入与欧洲人有关Sylvestris.个体和形成一个基生姐妹群表明一个共同的基因库。外高加索地区的野生葡萄，包括亚美尼亚、阿塞拜疆和格鲁吉亚，形成了一个独特的亚群，其中包含了几个阿塞拜疆野生葡萄的遗传。同样地，格鲁吉亚和亚美尼亚的野生葡萄也分成了两个亚群，但是它们拥有一个共同的外高加索基因库。的Sylvestris.Transcaucasia地区的葡萄藤在各种孤独的栖息地中，由较小的高加索山脉系统创造，在那里它们差异化适应当地环境[12，54］．某些Sylvestris.个体，无论是在高加索和欧洲种质，聚集与栽培样品。这些品种很可能是野生杂种苜蓿和Sylvestris.，可以用于育种计划或作为栽培选择(无花果1和2)．

在苜蓿，观察到格鲁吉亚的两种不同的品种群，一个人作为意大利，法国和西班牙品种的姐妹思工（图。1)，而另一组与意大利人关系密切苜蓿和格鲁吉亚Sylvestris.子组。这一结果可能表明，中亚和高加索的第一家驯养品种（Pontres Pontica)，在西欧留下了基因印记模样occidentalis登记入册。这种遗传亲属关系也可能是地中海地区早期繁殖计划的反映Sylvestris.或含有优越果实的杂交野葡萄葡萄族被驯化的驯化线。

PCoA描述的整体分化模式与NJ聚类分析非常相似(图)。1和2)．集群内Sylvestris.格鲁吉亚和亚美尼亚的加入重叠，与来自格鲁吉亚，巴基斯坦和土库曼斯坦的培养形式密切相关。格鲁吉亚野生葡萄与格鲁吉亚栽培加入的紧密协会强烈支持他们参与葡萄藤的初始驯化[55，56，57］．评估NJ集群分析和PCOA，表明当地欧洲人Sylvestris.在驯化过程的后期，西欧葡萄植株的基因选择和渗入可能起到了一定的作用。2)．贝叶斯结构分析仅支持主要群体之间的分化，而一些群体之间的微量分化，特别是具有混合血统的群体之间的微观分化并不明显（图。3.)．遗传结构的贝叶斯推断表明两个亚种之间有相当大的基因流动和适度的分化。这些结果表明，葡萄栽培和酿酒在葡萄历史的早期促进了野生葡萄的驯化、新品种的创造和种植技术的进步。在当地群落中，野生种质的进一步渗入和混合可能是造成混种比例高的原因。有趣的是，对被检测的西方品种的祖先价值的分析鉴定出一些在组3中具有较高的祖先价值(附加文件)3.:表S3)。这些葡萄园含有西班牙品种;albariño，caiñoblanco，ferrón，maturana，ondarrabi betlza和欧洲品种植物娇小，鸡油，chenin blanc，petit verdot。Pinot Meunier和Sauvignon Blanc。这些品种被描述为与野生加入更密切相关[8我们的研究结果支持了西方文化的渗透Sylvestris.变成了现在西欧的一些品种。

考虑到广阔的地理区域和在异质气候条件下往往支离破碎和孤立的种群，很难认为野生葡萄形成同质种群。然而，我们的研究结果表明，格鲁吉亚是葡萄驯化的古老中心，其野生葡萄与同一地区栽培的葡萄关系密切(Pontres Pontica)和西欧(模样occidentalis)．这一观察结果证实了早期的研究Pontres Pontica是随着人类向西欧迁移而逐渐传入的[10，25，58，59］．聚类分析表明，西欧野生葡萄与栽培葡萄之间存在一定的相关性模样occidentalis葡萄对葡萄酒的早期发展所起的作用要比来自东欧的野生葡萄多得多。以前使用snp标记的研究[25提出起源于近东酿酒用葡萄并提出了来自当地的迟滞的证据Sylvestris.随着葡萄进入欧洲，当地西欧野生的程度Sylvestris.遗传促进西欧酿酒用葡萄品种仍然是一个有争议的问题。我们的结果表明并支持至少两个独立的驯化事件，使栽培葡萄;一种来自外高加索野生葡萄，另一种来自西欧的野生葡萄。

对高度濒危的葡萄栽培祖先的科学兴趣，V. Vinifera无性系种群．Sylvestris.，以保护遗传学的问题为中心，深化了对培养作物的驯化史的理解[22］．然而，由于诸如高产、大浆果、高含糖量等驯化性状往往伴随着对非生物和生物胁迫的抗性丧失，因此在野生形式的作物祖先中寻找这些因素是有益的。事实上，在北非可以找到耐盐的葡萄品种Sylvestris.人口(60]，最近对来自德国、伊朗和格鲁吉亚的耐霉病野生和栽培种质的鉴定支持了这种野生祖先作为抗病育种遗传资源的潜力[24，61，62，63］．鉴于欧亚大陆和北非的野生动物V. Vinifera种质和亚洲人vitis.种质资源大部分未被开发，它们的鉴定，保存，生物和非生物抗性和浆果品质的特性[64，65品质对葡萄酒和葡萄产业的未来非常重要。

的两个亚种V. Vinifera无性系种群。苜蓿和无性系种群。Sylvestris.，基于SSR数据的分析是不同的，但在这些两个分类群接触的地区观察到广泛的基因流动。我们的研究结果表明，基于格鲁吉亚的野生加入与格鲁吉亚培养葡萄之间的遗传亲和力，格鲁吉亚是古老的葡萄驯化中心（蓬泰)及西欧(occidentalis)．结果还表明，西欧野生葡萄与栽培葡萄有亲缘关系Sylvestris.对西欧酿酒葡萄的发展做出了贡献。结果还支持至少两个独立的驯化事件，使栽培葡萄;一种来自外高加索野葡萄，另一种来自西欧的野葡萄。

最后，野生葡萄种质可以提供许多有用的性状，如抗破坏性病虫害，更好地适应气候变化。因此，我们必须加强努力，不仅收集、鉴别和保护西方和欧亚野生动物V. Vinifera种质，还有种质Sylvestris.北非和中亚的加入这些野生葡萄亲戚将在未来的葡萄和葡萄酒产业中发挥关键作用。

AMOVA:

分析分子方差

公元前:

在当前的时代之前

CE：

当今时代

F：

女

F：

近交系数

置:

固定索引

H:

雌雄同体

他：

预期的杂合性

何：

观察到的杂合性

M：

男性

n：

样本大小

不:

有效等位基因数量

PCOA：

主坐标分析

SNP：

单核苷酸多态性

苏维埃社会主义共和国:

简单序列重复

UMIL:

米兰大学

USDA：

美国农业部

我们感谢美国农业部位于美国加州戴维斯的国家克隆种质资源库提供了来自亚美尼亚、阿塞拜疆、格鲁吉亚和克罗地亚的材料。

伦理批准和同意参与

不适用

资金

本出版物得到了经济和竞争力部(西班牙)的赠款RTA2014-00016-C03-01和教育部(西班牙)的奖学金项目Salvador de Madariaga PRX12/00036的财政支持。参与发表成本行动FA1003“东西方葡萄多样性探索和育种适应性性状动员合作”。

数据和材料的可用性

在本研究中用于统计分析的所有基因型和SSR等位基因呼叫的表格被提交为额外文件1：表S1。

作者指出

1. Summaira Riaz和Gabriella de Lorenzis在这项工作中同样贡献。

隶属关系

1. 加州大学加利福尼亚大学，戴维斯，加利福尼亚州瓦葡萄栽培与蕴历，95616

   Summaira Riaz＆M. Andrew Walker

2. 农业和环境科学系，通过赛罗尼亚2,20133，米兰，意大利

   Gabriella de Lorenzis＆Osvaldo Failla

3. 植物科学部门，UC戴维斯，戴维斯，加州，95616，美国

   戴安•贝拉斯科

4. 美国农业部国家克隆种质资源库，加州大学戴维斯分校，加州95616

   Anne Koehmstedt, John E. Preece & Mallikarjuna Aradhya

5. 佐治亚州佐治亚州农业大学园艺，葡萄栽培和酿酒学院学院

   大卫Maghradze

6. 阿塞拜疆国家科学院遗传资源研究所水果作物系，AZ1106，阿塞拜疆巴库

   Zviad Bobokashvili＆Mirza Musayev

7. 克罗地亚斯普利特亚得里亚海作物和岩溶复垦研究所

   Goran Zdunic.

8. INRA, UMR AGAP, F-34060，法国蒙彼利埃

   瓦莱丽Laucou

9. Dpto。Biotecnología, CBGP-INIA, Campus de Montegancedo, Autovía M40 km 38, Pozuelo de Alarcón, 28223，马德里，西班牙

   Rosa Arroyo-Garcia

贡献

ra构思了研究的想法和设计并写了稿件;SR和GDL开发了指纹数据，进行了遗传人口分析，并协助起草稿件，AK辅助开发指纹型材;MA协助解释遗传多样性和人口分析，并参加了手稿的起草;GZ提供了克罗地亚葡萄种质指纹数据库，DM，ZB和MM提供了格鲁吉亚种质;MAW，jp的讨论和解释结果并监督最终草案和修订。所有作者都已经阅读并赞成最终的手稿。

通讯作者

对应于Rosa Arroyo-Garcia．

同意出版

不适用。

利益争夺

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

出版商的注意

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