通过对NAC转录因子的综合分析，揭示了其在棉花纤维发育和胁迫应答中的作用

背景

转录因子是转录网络的重要开关，NAC (NAM, ATAF, CUC)转录因子是一个植物特异性家族，参与多种生物学过程。然而，该基因家族在棉花中尚未得到系统的鉴定。

结果

在这里，我们在四个棉花品种中鉴定了大量具有保守NAC结构域的基因，其中147个在棉花品种中被发现木本棉， 149英寸g . raimondii就， 267英寸g .取得283个g .分子．预测膜结合南汽基因也被鉴定出来。系统发育分析表明，棉花NAC蛋白聚为7个亚家族，同源蛋白对具有相似的特征。进化性质分析表明，纯化选择南汽基因在二倍体和多倍体棉花种间存在，变异分析结果表明GhNAC基因可能经历了选择和驯化。NAC蛋白表现出广泛的转活化，这依赖于c端。的启动子中富集了一些与发育和胁迫相关的顺式元素GhNAC基因。综合表达分析显示，38GhNAC基因是参与纤维发育的候选基因，120个参与应激反应。基因共表达网络分析揭示了纤维相关的关系南汽基因和次级细胞壁(SCW)生物合成基因。

结论

南汽在二倍体和四倍体棉花中鉴定了基因，揭示了它们的进化、变异和同源关系的新认识。转录组分析和共表达网络表明GhNAC与棉纤维发育和胁迫反应有关的基因，以及NAC基因可能在分子育种计划中有用。

南京汽车(N点,一个TAF和CUC蛋白是最大的植物特异性转录因子(TF)超家族之一，共有117个成员拟南芥，大米151种，大豆152种，柳枝稷251种[1，2，3.］．一般来说，NAC蛋白的结构可分为两个区域，保守的n端dna结合结构域(BD)和高发散的c端转录调控区域(TR) [4，5］．BD含有约150~ 160个氨基酸残基，可进一步分为5个亚域(A-E)，与DNA结合、同源二聚体或异源二聚体的形成和核定位有关。TRs是激活/抑制转录所必需的，家族成员之间的高度差异解释了NAC蛋白的不同功能[5］．一些NAC蛋白在c端具有跨膜(TM)基序，并在质膜或内质网显示亚细胞定位;这些蛋白可能在特定条件下受到翻译后调控[6，7，8］．一些物种具有膜结合的NAC转录因子，有13个拟南芥其中，番茄13株，大豆11株，水稻5株，多数为非生物胁迫诱导[1，9，10，11，12］．

先前的研究表明，NAC蛋白广泛参与与不同发育过程相关的转录重编程调控[13，14，15，16］．突变的不结盟运动，首先确定南汽基因，未能发育出茎尖分生组织(SAM)佩妮胚胎(17］．拟南芥CUC1和CUC2在SAM形成中发挥了相似的作用[18］．此外，NAC转录因子在植物次生细胞壁(secondary cell wall, SCW)生物合成中发挥重要作用[13，19，20.］．次生壁生物合成相关的NAC转录因子，包括血管相关的NAC结构域(VND)和NAC次生壁增厚促进因子1 (NST)是调节SCW生物合成的转录开关拟南芥［13］．七个盾基因(VND1-7)通过体外木质部导管元件诱导系统鉴定，微阵列和启动子分析显示，这些基因在体外木质部导管元件形成过程中上调，并在血管细胞中特异性表达[21］．Overexpressing盾基因上调副壁相关基因表达，副壁增厚[21，22］．的望远镜基因(NST1-3)优先在木素纤维和木外纤维中表达，并调节SCW的形成[13，23］．次要墙体的功能相关南汽在整个植物王国，基因可能都很保守[13，24，25］．

植物不断面临各种非生物胁迫，如干旱和高盐度，这些胁迫条件对植物生长产生不利影响，对农业生产力产生严重影响。迄今为止，大多数证据表明NAC蛋白在非生物应激反应中发挥作用。许多应激反应性NAC蛋白是非生物应激耐受性的正调节因子，但也有一些是负调节因子[5，16，26］．在拟南芥， AtRD26 (ANAC72)作为ABA介导的胁迫信号的转录激活因子[27］．转基因植物过度表达ANAC019，ANAC055或ANAC072通过诱导几种应力诱导基因显示增强的耐旱性[28］．然而，NAC016通过与水稻的结合负调控耐旱性nac016特异性结合基序（NAC16BM)在AREB1启动子和抑制的表达AtAREB1．与此同时，由NAC016靶基因编码的NAP与基因的启动子结合AREB1并抑制其转录[29］．一些与压力相关的南汽在水稻中已经发现了一些基因，这些基因具有提高抗逆性的潜力。水稻植株过度表达逆境应答母（SNAC1)的抗旱性和耐盐性均显著提高[30.］．一个逆境应答南汽的基因,SNAC3通过调节ROS稳态正向调节水稻的耐旱耐热性[31］．

棉花是最重要的经济作物之一，NAC蛋白在棉花纤维发育和抗逆性中发挥着重要作用。纤维的发育过程可分为四个连续的阶段:起始、伸长、次生细胞壁沉积和成熟[32］．棉花NAC转录因子，GhFSN1，最近被确定为纤维SCW形成的调节剂[25］．GhFSN1在SCW增厚阶段在纤维中表达，转基因实验表明GhFSN1正调节SCW厚度，负调节纤维长度。GhFSN1直接调控棉花次生细胞壁相关基因的表达。其他NAC基因也被鉴定为与棉花的耐受力有关。GhNAC79在子叶和纤维发育后期，转录本积累相对较高，过表达GhNAC79棉花和棉花的耐旱性均有所提高拟南芥［33］．一个NAC转录因子基因，GhATAF1已被报道在生物和非生物应激反应之间的串扰中发挥作用[34］．棉花植株过度表达GhATAF1表现出更好的耐盐性，但也增加了对真菌病原体的敏感性黄萎病dahliae而且葡萄孢菌．先前的基因研究证实了应激反应南汽棉花中的基因。GhNAC1-GhNAC6通过序列同源性鉴定，这些基因在非生物胁迫下受到差异调控[35］．七个GhNAC的基因,GhNAC7-GhNAC13,它们优先在根中表达，已被证明参与了应激反应[36］．60的表达模式GhNAC在胁迫和植物激素作用下分析位于D亚基因组的基因[37］．我们推测NAC蛋白在植物SCW的形成和胁迫响应中具有功能守恒。尽管有一些南汽棉花中涉及纤维发育和胁迫反应的基因已被鉴定南汽对基因的了解仍然很少。

全基因组分析南汽基因允许基因功能研究。两个二倍体棉花的基因组数据(g . arboreum，g . raimondii就)和两个四倍体品种(g .取得，g .分子)，以及公开的转录组数据集，使棉花基因家族的全基因组鉴定和分析成为可能[38，39，40，41，42］．然而,南汽基因家族特征不明显，尤其是在陆地棉(g .分子)，占全球种植棉花的90%以上;虽然这种分析已在二倍体棉花中进行过[43，44］．在本研究中南汽对4个棉花品种的基因家族进行了综合研究，揭示了系统发育关系、同源性、遗传变异、共表达网络、转活化和顺式元件分析。我们也链接了南汽纤维发育和应激反应的基因家族成员。

的全基因组鉴定南汽家族基因Gossypium spp

基于PlantTFDB数据库和多个序列比对分析，我们识别出多个非冗余和完整的序列南汽在四种棉花中发现了147个基因木本棉， 149英寸g . raimondii就， 267英寸g .取得283个g .分子(附加文件1:表S1)。分析了预测的棉花NAC蛋白序列长度、分子量和蛋白质等电点(pI)2:图S1，附加文件3.:表S2)。例如，GhNAC蛋白全长为168 ~ 1219个氨基酸，分子量为20.1 ~ 135.6 kDa，等电点为4.39 ~ 9.8。多重序列比对和保守基序分析表明，棉花NAC蛋白具有一个保守的NAC结构域，该结构域包括5个亚结构域(a - e)，并存在一些保守的氨基酸(图2)。1)．构建了一个系统发育树，以深入了解NAC蛋白之间的进化关系Gossypium．来自4个棉花品种的NAC蛋白分为7个亚家族(I-VII)，每个亚家族包含来自4个棉花品种的NAC蛋白(图2)。1 b)．

在4种棉花中分别鉴定出13、12、21和22个预测的膜结合NAC蛋白(红色见附加文件)1:表S1)。大多数预测的膜结合NAC蛋白在C端有一个TM，如GhNAC157(附加文件)4:图S2a)。GaNAC111在C端有两个预测的TM, 8个NAC蛋白(GaNAC68、GaNAC57、GrNAC79、GbNAC23、GbNAC104、GbNAC184、GhNAC258、GhNAC169)在保守的NAC结构域前有一个TM(附文件)4:图S2b, c)。预测的膜结合NAC蛋白主要分布在亚家族II和III(68个亚家族中有46个)，没有一个分布在亚家族VI拟南芥例如，番茄和水稻表明一些进化支基因存在于不同的物种中(附加文件)4:图S2d)。

基于外显子/内含子组织的基因结构分析是研究遗传进化的重要方法。大多数GhNAC基因有3个外显子(193/283,68.2%)(图;2)，虽然同源基因对GhNAC111而且GhNAC253只包含一个外显子，并且GhNAC4拥有最多的17个外显子。GhNAC同一亚家族的基因表现出保守的结构相似性，几乎所有最密切相关的基因对都具有相同的结构特征。

NAC基因的基因组同步性及变异分析

基因组同步性分析是破译基因组进化史的重要手段。我们检测了基因的分布和同源性南汽基因通过基因组同步性分析(附加文件5:图S3)。在基因位点分析中，我们发现所有染色体至少有一个南汽At (A亚基因组，小写“t”表示四倍体)和Dt中的基因。在g .分子,更多的南汽基因分布在A05、A11、D05和D11染色体上，而分布在其他染色体上的基因较少GhNAC基因没有明显的染色体位置，不能准确地绘制(附加文件6:表S3)。我们通过多重同源比较分析进一步检测了同源基因对，结果显示，从At到Dt、At到A2、Dt到D5分别鉴定出了114、138、136对同源基因对(附加文件7:表S4)。此外，我们发现不同棉花品种的同源基因具有密切的进化关系和基因特征，如基因结构和预测蛋白分子量。

非同义的(d_N)和同义词(d_年代)计算棉花种内和种间的替代率，以探索进化动力学和选择压力。大部分的d_N小于d_年代(d_N/ d_年代在基因组间(At和Dt)和基因组内(A2和At或D5和Dt)的比较中均< 1)，表明纯化选择南汽基因在二倍体和多倍体棉花种间均有发生(图2)。2 b)．

陆地棉是世界上主要的栽培棉，自然选择和人工驯化在其发展过程中发挥了重要作用。基因体中单核苷酸多态性(SNP)的密度，以及其上游2kb和下游2kb区域GhNAC利用31份野生棉花和321份陆地棉花驯化材料的基因组数据，对基因进行了分析。正如预期的那样，野生棉中这三个区域的SNP密度均高于栽培棉，说明栽培棉的进化经历了选择和驯化。此外，野生棉花A亚基因组的变异范围高于D亚基因组，而栽培棉花上游2 kb和下游2 kb区域D亚基因组的SNP密度高于A亚基因组(图1)。2摄氏度)．

的顺元分析南汽基因在g .分子

启动子分析是研究基因潜在转录调控的有效方法。的启动子区存在丰富的调控元件GhNAC这些基因被预测参与植物激素反应、发育和应激反应(图2)。3.，附加文件8:表S5)。5个最常见的顺式元件包括热应激反应元件(HSE, 283个中的221个，78.1%)，TC-rich重复序列(76.7%)，G-box (69.6%)， GT1-motif(68.9%)和circadian(68.6%)。HSE和TC-rich重复序列参与防御和应激反应，而昼夜节律和GT1-motif参与光反应和发育。我们的结果表明GhNAC基因可能在棉花胁迫反应和发育过程中发挥重要作用。

纤维相关NAC家族成员的鉴定g .分子

现有的和公开的转录组数据集使全面分析成为可能南汽棉花发育过程中表达的基因。我们收集了不同组织/器官的转录组数据集，包括根、茎、叶、花瓣、花药、柱头、胚珠、种子和纤维(附加文件)9:图S4a)，并识别出198 (70%)GhNAC有37个(13.1%)基因在所有组织中表达(FPKM≥1)。一些GhNAC在茎、胚珠和纤维中均有高表达(FPKM≥20)。4)．

棉纤维是世界上最重要的天然纺织材料。在纤维发育的4个发育阶段(5 DPA、10 DPA、20 DPA和25 DPA)中分析转录组数据。142人(50.2%)GhNAC在纤维发育过程中被确定表达的基因。所有的表达模式GhNAC在纤维发育过程中的基因被分为4个亚簇(簇I-IV)。4 b)．GhNAC属于I-III亚簇的基因在纤维发育过程中表达变化。类群I的基因在20和25 DPA时高表达，类群II的基因在发育早期低表达，在25 DPA时上调，类群III的基因在20 DPA时上调，在25 DPA时下调。来自簇IV的基因在10 DPA时表达量较高，随后表达量较低。

我们鉴定出38个高表达(FPKM≥20)GhNAC在纤维发育过程中表达变化明显的基因，这些基因均匀分布在A亚基因组和D亚基因组中(图;4摄氏度，附加文件10:表S6)。这些基因中有13个同源基因对，每个同源基因对中有两个基因表达趋势相似。我们发现了10个基因(GhNAC33，GhNAC39，GhNAC108，GhNAC125，GhNAC166，GhNAC193，GhNAC217，GhNAC251，GhNAC273，GhNAC280)，与其他组织或器官相比，它们在纤维中表现出优先表达。两个基因(GhNAC7，GhNAC151)在延伸期和SCW增厚期(10-25 DPA)均有高表达，12个基因(GhNAC33，GhNAC43，GhNAC74，GhNAC95，GhNAC106，GhNAC129，GhNAC188，GhNAC193，GhNAC217，GhNAC237，GhNAC249，GhNAC270)在过渡期和SCW增厚期(20-25 DPA)均高表达，8个基因(GhNAC42，GhNAC47，GhNAC56，GhNAC120，GhNAC173，GhNAC178，GhNAC195，GhNAC262)在SCW增厚期表现高表达(25 DPA)， 9个基因(GhNAC37，GhNAC108，GhNAC125，GhNAC133，GhNAC141，GhNAC182，GhNAC251，GhNAC273，GhNAC280)在过渡期表现出特异性高表达。三个基因(GhNAC125，GhNAC166，GhNAC273)具有高度同源性拟南芥NST1，可调节SCW的形成[20.］．

先前的报道显示，At和Dt亚基因组中的一些基因表现出偏倚表达模式。在38个基因中，我们发现了一些基因的表达GhNAC同源基因表现出偏倚表达模式。GhNAC39而且GhNAC125位于At亚基因组的，在纤维中优先表达，而Dt同源基因的表达水平几乎检测不到(图2)。4 d)．我们研究了这38例患者的同源基因表达模式GhNAC使用纤维发育的转录组数据集(10DPA和20DPA)(附加文件)9:图S4b)。大多数基因表达变化相似，提示其功能的保守性南汽二倍体与异体四倍体棉花纤维发育调控基因的研究。我们还鉴定出两对基因对(GhNAC32而且GbNAC188，GhNAC249而且GbNAC90)，在陆地棉间表现出显著差异g .分子还有超长棉g .取得(无花果。4 e)．

六个GhNAC选择基因，通过定量逆转录- pcr (qRT-PCR)方法验证纤维发育过程(0、5、10、20、25 DPA)的表达变化(图;5)．与转录组数据集相比，所有所选基因的表达变化几乎相似。五种高表达基因的表达(GhNAC37，GhNAC125，GhNAC193，GhNAC273，GhNAC280)，根据转录组数据集选择，在SCW增厚阶段表现出急剧增加。

四、纤维发展相关南汽基因(GhNAC33，GhNAC125，GhNAC193，GhNAC280)进行共表达分析。共鉴定出291个共表达基因，其中一些基因与这4个基因重叠(图2)。5 b，附加文件11:表S7)。共表达基因的基因本体分析表明，植物细胞壁生物发生是最丰富的功能项，我们鉴定出具有共表达关系的纤维素合成酶家族基因，如GhCESA7(Gh_D07G0380),GhCESA4(Gh_A07G1871),GhCESA8(Gh_D10G0333)。这表明南汽这些基因可能通过调节次生细胞壁的合成而参与纤维的发育。5度)．

与应力相关的识别南汽基因在g .分子

南汽基因作为各种应激信号通路的重要调控因子，受到广泛关注。我们使用了公开的转录组数据集g .分子用高温(热)、盐度、低温和聚乙二醇(PEG)处理，研究其表达模式GhNAC非生物胁迫下的基因(附加文件12:图S5a)。一百二十四(43.8%)GhNAC至少在一种胁迫(FPKM≥1)下表达的基因，120个(42.4%)在至少一种处理中与对照组相比表达差异两倍(图4)。6，附加文件10:表S6)。差异表达101、73、86、52个GhNAC分别在高温、盐度、低温和PEG胁迫处理下鉴定出基因。对比分析显示，29GhNAC基因在4种胁迫条件下均表现出重叠的差异表达(图;6 b)．热和冷的基因重叠最多(70个基因)，而冷和PEG胁迫的基因重叠最少(39个基因)。我们还发现了10种与压力相关的因素GhNAC基因(GhNAC9，GhNAC15，GhNAC34，GhNAC47，GhNAC56，GhNAC149，GhNAC158，GhNAC173，GhNAC192，GhNAC195)与应力相关的同源南汽基因在拟南芥还有大米等RD26，ANAC019，SNAC1而且SNAC2据报道，这涉及多种应激反应(附加文件12:图S5b)。表达模式与进化关系密切相关。我们的研究结果表明GhNAC基因可能在植物的胁迫反应中起保守作用。

四个压力相关GhNAC基因(GhNAC9，GhNAC34，GhNAC149，GhNAC192)进行共表达网络分析。共表达差异表达基因(DEGs)分别为58、207、22和227个GhNAC9，GhNAC34，GhNAC149而且GhNAC192，分别(图;6摄氏度，附加文件11:表S7)。一些共表达基因与胁迫应答相关，如胚胎发育晚期丰度蛋白基因(Gh_D10G0248、Gh_D11G0978、Gh_D11G2003)、热休克转录因子基因(Gh_D05G0228、Gh_D05G0307)、过氧化物酶超家族蛋白基因(Gh_D04G0130、Gh_A09G1575、Gh_A10G1317)和植物激素应答基因(Gh_A05G0278、Gh_A05G0782、Gh_A05G3589)。基于功能基因本体，利用KOBAS 3.0对267个特异性共表达基因进行了注释，并确定了一些主要的富集类别:对酸性化学反应、对内源性刺激反应、对水分剥夺反应(附加文件)12:图S5c)。

一些应力相关的表达谱GhNAC在模拟盐胁迫的200 mM NaCl条件下，采用qRT-PCR方法验证基因;和15% PEG，模拟渗透胁迫(图;6 d, e)．qRT-PCR结果与转录组数据集一致，表明所选GhNAC这两种胁迫显著地诱导了基因。不过，值得注意的是，这些都选定了南汽除了的基因外，ABA处理几乎没有诱导基因GhNAC164(附加文件13:图S6)。

ghhnac蛋白的转活化试验

转录激活是NAC转录因子的一个重要特征。为了研究NAC蛋白在棉花中的转活化能力，我们建立了基于GAL4 DNA结合域(GAL4DB)与GAL4(5X)-TATA-LUC结合位点相互作用的原生质体瞬时表达系统。所选的全长cDNAGhNAC基因(压力相关:GhNAC56，GhNAC149，GhNAC157，GhNAC158，GhNAC192；纤维发展相关:GhNAC37，GhNAC125，GhNAC193，GhNAC280)分别克隆到载体GAL4DB上。结果显示，在所有情况下，GAL4DB- ghnacs的荧光素酶(LUC)/Renilla LUC比值均高于对照GAL4DB，其中膜结合的NAC转录因子GhNAC157具有最强的转录活性(图4)。7一个)．我们还对酵母菌Y2H进行了转活化实验，用X-α-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基a- d -半乳糖苷)活性测定了转活化能力。几乎所有的NAC蛋白都具有转激活活性(蓝色菌落)，除了GhNAC280(图2)。7 b)．

此外，选择GhNAC157(带TM)和GhNAC158(不带TM)研究其转激活活性域。我们的结果显示，GhNAC157和GhNAC158的c端激活域(AD)具有转激活活性(图2)。7 c, d)，这与以往的研究结果一致。此外，我们发现GhNAC157在c端区域的TM结构域并不影响其激活能力(图2)。7 d)．

转录因子作为转录网络的重要开关，准确调控基因表达[45］．NAC的首字母缩写是由不结盟运动(无顶端分生组织)，ATAF1/2,CUC2(杯状子叶)，这三个基因最初被发现含有一个保守的NAC结构域[4，17，18］．在棉花中，我们发现C和D亚域具有高度保守和带正电荷的氨基酸残基，这两个亚域可能与DNA结合有关[5］．最近的研究表明南汽基因是最大的植物特异性转录因子家族之一，在陆生植物的进化过程中不断扩展，可能与使植物适应性最大化的复杂发育程序有关[46］．

在本研究中，我们利用了四个已测序棉花品种的基因组数据，并对其进行了分析南汽基因被确定分布在这些基因组中。与传统的识别方法不同，我们识别了保守的NAC结构域南汽以4种棉花全编码基因为基础的科系基因。结果表明，棉花基因组中约有0.35% ~ 0.4%的基因编码NAC转录因子南汽占全部转录因子基因的5.5% ~ 5.7%。的南汽本研究鉴定的基因数量与以往报道不同，可能是参考基因组不同，也可能是鉴定方法不同[36，43，44］．系统发育和基因同源性分析发现了4种棉花间的进化关系，且具有广泛的同源性南汽二倍体和四倍体棉花之间的基因与之前的一项研究一致，该研究表明四倍体棉花(AD)来自a基因组祖先物种之间的种间杂交，g . herbaceum(A1)或g . arboreum(A2)和原生d基因组物种，g . raimondii就(D5)或g . gossypioides(D6) [47］．然而，同源基因对数目的不一致表明了各个亚基因组对的独立进化。

基因长度、预测蛋白分子量和蛋白质等电点存在广泛的变化，而基因结构相对保守南汽基因家族，约占68.2%GhNAC有三个外显子的基因(图;2)．特别是，同源基因对之间的基因结构和预测的蛋白质性质具有高度的相似性。这一结果证明，来自祖细胞的重复基因可以以相同的速度独立进化，变化很少[48］．

膜结合转录因子(膜结合转录因子，膜结合转录因子)位于膜本身，在接收到特定信号时被激活，这种调控方式被认为是准确的，如膜释放[10］．膜结合NAC转录因子已被广泛鉴定，并参与不同植物的许多生物学过程[9，11，49，50］．在本研究中，我们首次在4个棉花品种中发现了68个预测的膜结合NAC转录因子，这些基因主要分布在同一亚家族中，这些基因在进化过程中表现出保守性。除了经典结构(一个α-螺旋型TM位于C端)外，还发现了一些发散形式，如两个基因拥有两个TM，并且TM位于NAC结构域之前。这些形式也在番茄中被发现，然而，这没有在拟南芥大米，推论是它们是发散的南汽基因进化出了功能特异性。系统发育分析显示部分演化支具有膜结合南汽来自所有单子叶植物(水稻)和双子叶植物(棉花、番茄和拟南芥)，这表明这些基因可能在单子叶和双子叶分化之前就有共同的祖先(附加文件)4:图S2d)。

陆地棉(g .分子)是研究多倍体作物驯化的模型。在本研究中，中存在较高的SNP密度GhNAC这表明陆地棉的进化伴随着选择和驯化(图2)。2摄氏度)．野生棉中a亚基因组的变异范围比D亚基因组的变异范围大，这与之前陆地棉中a和D亚基因组不对称进化的研究相一致[42］．在选择压力分析中，我们发现净化选择是棉花NAC基因进化的主要力量，因此它们可能保留了其祖先的功能[11］．

棉纤维是世界上最重要的天然纺织材料，提高纤维质量是棉花育种的主要目标。花后16 d, SCW开始增厚，纤维素合成迅速，是成熟纤维的主要成分(> 90%)[32］．之前的研究显示有24个和14个南汽在15个DPA纤维中表达较高的基因g . arboreum而且g . raimondii就，分别[44］．这里，我们确定了38个GhNAC基因在纤维发育过程中表现出高表达和差异表达，大多数基因优先表达于次级细胞壁沉积阶段南汽基因可能在这一过程中发挥重要作用(图。4摄氏度)．NAC转录因子参与SCW的形成已被广泛报道，并与SCW相关南汽不同植物的基因是保守的[13，19，23，51］．系统发育分析揭示了一些GhNAC基因表现出与SCW生物合成相关的同源性南汽基因NST1(ANAC043)拟南芥．结合以往的研究，我们认为南汽调控棉纤维发育的基因可能是通过调控次生细胞壁的形成来实现的。与我们的假设一致，最近的一项研究表明，棉花南汽的基因,GhFSN1，通过促进SCW生物合成调节纤维质量[25］．GhFSN1是纤维相关的候选基因(GhNAC125)在我们的书房里。我们的结果表明，存在共表达关系GhNAC125而涉及植物型次生细胞壁生物发生的基因，如GhCESA8(纤维素合成酶8,Gh_D10G0333)和GhCOBL4(COBRA-LIKE4, Gh_D03G0919)(附加文件11:表S7)。我们还发现同源基因GhFSN1（GhNAC125)，GhNAC267，在纤维中低表达，表明A亚基因组和D亚基因组同源基因对的功能分化(图;4 d)．综合分析南汽纤维发育中的基因将证明它们在这种发育背景下的功能有指导意义。

目前，棉花种植区越来越多地集中在边缘土地上，这些土地经常受到极端环境条件的威胁，这些压力不可避免地会影响棉花的生长、产量和纤维质量[52］．在过去的二十年中，人们开展了大量工作来揭示NAC转录因子在调节各种应激信号通路中的重要性[5，26，53］．研究棉花对非生物胁迫的响应机制是一项困难的工作，因此鉴定有价值的棉花分子育种基因是必要的。之前的基因组测序已经揭示了这一点南汽棉花耐非生物胁迫基因调控[42］．尽管一些南汽棉花胁迫反应相关基因已被发现，但对其生物学功能和机制的研究仍处于起步阶段[35，53，54］．有33个南汽对盐胁迫有反应的基因拟南芥，和40南汽干旱和盐胁迫下水稻基因发生显著变化[55，56］．在这里，我们鉴定了120种(42.4%)非生物应激反应GhNAC有29个基因在4种胁迫条件下表现出差异表达，这些基因可能参与了各种胁迫的调控(图2)。6)．大多数逆境应答GhNAC基因在热胁迫和冷胁迫下发生了显著变化，这表明它们可能在应对温度胁迫方面具有重要的生物学功能。值得注意的是，表达的一些GhNAC基因与应激反应紧密相关南汽基因的拟南芥我们推测这些基因可能在跨物种的应激反应中发挥保守的功能(附加文件)12:图S5b)。先前的研究在一定程度上证明了我们的结果的有效性。例如,GhATAF1（GhNAC173)受盐胁迫高度诱导，转基因棉花植株过度表达GhATAF1通过上调胁迫相关基因的表达，降低Na含量，表现出对盐胁迫的耐受性增强⁺嫩枝含量[34］．一些逆境应答GhNAC基因表现出ABA处理诱导的差异表达模式GhNAC基因可能通过aba依赖和aba不依赖途径调控。此外，常见27种GhNAC基因在胁迫响应和纤维发育过程中表现出差异表达，表明这些基因在棉花中可能发挥多种功能(图2)。8)．逆境应答的GhNAC本研究鉴定的基因可作为分子育种的候选基因，在逆境条件下培育出具有良好农艺性状的棉花新品种。

目前，提高纤维品质和抗逆性是棉花育种的主要目标。最大的植物特异性NAC tf因其在不同发育过程中的作用而闻名。我们已经全面确定了南汽四种棉花的基因。纤维的发育与应激反应有关GhNAC基因的表达模式，共表达网络和转激活被突出显示(图。8)这一结果将提供有用的见解南汽棉花进一步遗传改良的基因。然而，应该指出的是，目前的分析代表了功能研究的起点GhNAC基因对纤维发育和应激反应的影响，还需要进一步的实验研究来扩展所获得的结果，以明确强调的生物学功能和分子机制GhNAC基因。

植物NAC家族基因的鉴定及系统发育分析Gossypium spp

识别南汽我们从CottonFGD中下载了所有预测的蛋白序列(https://cottonfgd.org/about/download.html) [57］．南汽用PlantTFDB 4.0 (http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)。此外，使用ClustalX (ver.1.83)和MEME (http://meme-suite.org/index.html)，以发现NAC基因的保守基序，以符合我们的鉴定。利用ExPASy程序计算NAC蛋白的预测分子量和等电点(http://web.expasy.org/protparam/)．使用TMHMM服务器v.2.0识别膜结合的NAC成员(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)．

使用默认设置的ClustalX (ver.1.83)对蛋白质序列进行多个序列比对。NAC结构域的保守序列标志(A-E)使用MEME (http://meme-suite.org/index.html)．将预测的NAC蛋白全氨基酸序列用于系统发育分析。采用MEGA7软件，采用neighbor - joining方法构建系统发育树[58］．用泊松修正法计算进化距离，用bootstrap分析评估树的节点，重复1000次。

基因结构、启动子、基因组共时性及变异分析GhNAC基因

分析基因结构，编码和基因组序列GhNAC通过在线基因结构显示服务器(GSDS2.0)程序(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)。每个起始密码子上游约1.5 kb的区域GhNAC通过PlantCARE数据库(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)以揭示启动子顺式元件[59］．

基因组同步和变异分析如前所述[60］．用BLASTN得到At与Dt、At与A2、Dt与D5倒数对齐序列(e值<1e-05)。我们用Circos图来显示这些同源基因对。

对于分子进化特性，我们计算了非同义(d_N)和同义词(d_年代)棉花种内和种间的替代率，以探索进化动力和选择压力[61］．比率d_N/ d_年代> 1， = 1和< 1分别表示正向(或多样化)选择，中性进化和净化(或负向)选择。在分子进化特性分析中，采用最大似然(PAML) yn00程序，结合GMYN方法计算同源基因对的非同义与同义之比。

的变异分析南汽基因，我们之前从31个野生棉花和321个驯化陆地棉花的基因组数据用于计算SNP密度，如前所述[60，62］．

表达谱和共表达网络分析

与TM-1表达丰度相对应的转录组数据集(The allotetraploid cottong .分子l . acc。利用NCBI的Texas Marker-1)在不同组织和应力中分析GhNAC基因(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ sra/?term = PRJNA248163)和CottonFGD (https://cottonfgd.org/) (42，57］．基因表达模式通过热图显示，表达值经Genesis软件归一化[63］．的表达变化南汽利用Genesis K-means方法对纤维发育过程中的基因进行聚类[63］．

的共表达网络分析GhNACs参与纤维发育和应力响应的过程如前所述，略有修改[60］．采用Pearson相关系数(PCC)来衡量入选样本之间的共表达关系GhNAC基因和共表达基因。对于纤维分析，获得了14组已发表的RNA-Seq数据集，包括胚珠和纤维发育。加权基因共表达网络(WGCNA)分析如前所述[64］．以PCC基因(|PCC|≥0.8为应激基因，|PCC|≥0.9为纤维基因)构建共表达网络。所有共表达网络均采用Cytoscape软件(3.4.0)进行可视化。基于功能基因本体，利用KOBAS 3.0对共表达基因进行注释[65］．

植物材料及处理

陆地棉简历。YZ1在28°C的Hoagland溶液中培养，光照周期为16 h /暗周期为8 h。4周龄幼苗分别用含200 mM NaCl、15% PEG和0.5 μM ABA的Hoagland溶液处理。在不同的时间间隔收集叶片和根，立即浸泡在液氮中，然后在−80°C冷冻备用。为了测试所选基因在不同组织/器官中的表达，收集组织样本的方法如前所述[66］．

存在分析

qRT-PCR分析如前所述，进行少量修改[66］．按照制造商的说明，使用SuperScript III逆转录酶将高质量的RNA逆转录为cDNA。表达载体,no.18080 - 093)。qRT-PCR实验使用ABI Prism 7500系统(Applied Biosystems)和比较Ct (2^-△△Ct)方法计算基因表达水平。GhUBQ7(GenBank登录号:dq116441)作为内部控制。根据cDNA序列，使用Primer Premier 5.0软件设计qRT-PCR基因特异性引物，经商业合成(Genscript Bioscience)。用于qRT-PCR的引物列在附加文件中14:表S8。

转录激活分析

NAC蛋白的转活化活化能力由原生质体瞬时表达系统实现，如前所述[66］．报告构建物包含5个串联的GAL4结合位点副本和CaMV 35S启动子(荧光素酶萤火虫基因)的最小TATA区域。选择南汽将基因克隆到载体GAL4DB中，转化为大肠杆菌前10名。培养后，质粒提取，采用peg -钙转化法转移到棉花胚性愈伤组织原生质体中[67］．采用双荧光素酶法检测LUC和Renilla LUC (Promega, Cat。不。E1910)。

在酵母转激活实验中，诱饵蛋白融合到Gal4 dna结合结构域(DNA-BD)表达，基因编码序列分别克隆到pGBKT7载体中以实现这一目标。的全长编码序列GhNAC基因及截短型(GhNAC157-BD，GhNAC157-AD，GhNAC157△TM，GhNAC158-BD，GhNAC158-AD)分别克隆到pGBKT7载体上。将这些载体按照说明书(Cat。No.630489, Clontech)，通过在不添加色氨酸和添加X-α-Gal (SD-Trp + X-α-Gal)的SD培养基上生长来测定其转活化活性。孵育36 h后拍照。在转激活试验中使用的引物列在附加文件中14:表S8。

A2:

一个基因组物种

阿坝:

脱落酸

:

亚基因组，“t”表示四倍体

双相障碍:

dna结合域

D5:

D-genome物种

度:

差异表达基因

d_N：

非同义

分区:

花后天数

d_年代：

同义的

Dt:

D subgenome

HSE:

热应激反应元件

卢克:

荧光素酶

MTF:

膜结合转录因子

南京:

N点,一个TAF和C加州大学

挂钩:

聚乙二醇

标准铜线:

次级细胞壁

SNP:

单核苷酸多态性

TM:

跨膜图案

TR:

转录调节区

X -α加:

5-bromo-4-chloro-3-indoxyl a-D-galactoside

我们非常感谢Keith Lindsey(英国杜伦大学生物与生物医学科学学院整合细胞生物学实验室)对文章语言的修改。

资金

国家重点科研发展计划专项(2016YFD0101006)和中央高校基本科研业务费专项(2662016PY001)资助。

数据和材料的可用性

本文鉴定的基因核苷酸和蛋白序列可从棉花功能基因组数据库(CottonFGD)下载(https://cottonfgd.org/)。TM-1在不同组织和胁迫下的转录组数据集从NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ sra/?term = PRJNA248163)和CottonFGD。本研究中使用的数据集可根据合理要求从通讯作者处获得。

从属关系

1. 华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室，湖北武汉430070

   孙恒，胡美玲，李建英，陈林，李孟，张淑琴，张先龙，杨希燕

贡献

HS, XY和XZ构思并设计了实验。HS、MH、JL和LC进行了实验。SH、ML和SZ对文章内容进行了讨论和评论。这篇文章是HS写的。XY对文章进行监督和补充。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到龚喜颜杨．

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。

开放获取本文根据创作共用属性4.0国际许可协议(http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)，允许在任何媒介上不受限制地使用、分发和复制，前提是您对原作者和来源给予适当的赞扬，提供到创作共用许可证的链接，并注明是否进行了更改。创作共用公共领域奉献弃权书(http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/)除另有说明外，适用于本条所提供的资料。

转载及权限