来自于抗菌肽gydF4y2Ba木霉属gydF4y2BapermeabilisesgydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba根尖分生组织和表皮，但被纤维素酶诱导的对阿拉米辛的抗性拮抗gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

木霉属gydF4y2Ba真菌生活在土根际，对植物生长和病原体抗性有益。目前在全球范围内使用几种物种和菌株在共同培养中，作为一种替代化学农药的生物控制替代，尽管关于有益相互作用的确切机制很少。我们之前发现阿拉胺汀类药蛋白，一种分泌的肽抗生素gydF4y2Ba木霉属gydF4y2Ba，以有效渗透培养的烟草细胞。然而,预处理gydF4y2Ba木霉属gydF4y2Ba纤维素酶使细胞对后续的alamethicin产生抗性，提示了植物对alamethicin的潜在抗性机制gydF4y2Ba木霉属gydF4y2Ba这是互惠共生所必需的。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

我们在这里研究的是完整的无菌培养的gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba幼苗在水或生长介质中发芽。alamethicin可使其渗透，但纤维素酶不能使其渗透。利用膜不透的dna结合探针碘化丙啶的荧光，我们发现alamethicin主要能穿透根尖，特别是根尖分生组织和表皮细胞，而不是根冠、基部分生组织和皮层细胞。通过建立基于nadp -异柠檬酸脱氢酶可及性的定量原位分析，证实了Alamethicin的通透性和纤维素酶诱导的抗性。联合试验还表明，纤维素酶预处理后的高渗处理消除了诱导的纤维素酶抗性。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

在这里，我们得出结论：特异性细胞通透丙甲菌素，并把它的纤维素酶诱导的抗性的存在下，在根尖顶端分生组织和模式生物的表皮gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba．我们建议抵抗耐受抵抗力所需的血浆膜和细胞壁之间的接触。我们的结果表明植物的潜在模式，以避免胰岛素对植物生长和定位潜在损害和反应的影响。结果还开放用于鉴定植物遗传成分，以获得有益效应gydF4y2Ba木霉属gydF4y2Ba在植物上。gydF4y2Ba

许多农作物被病原微生物威胁要对其中有没有有效的化学剂，或者是因为病原体已产生耐药性或环境问题[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．因此，人们寻求生物防治的解决方案，特别是几种gydF4y2Ba木霉属gydF4y2Ba已被广泛应用。许多种类的gydF4y2Ba木霉属gydF4y2Ba生活在大量植物的根际，并且经常在一起，例如在番茄的同一根际发现5种不同的植物[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba木霉属gydF4y2Ba已知对植物有几种有益的影响。其中包括对病原体的直接拮抗作用，刺激病原体抗性的发展[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba那gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]以及直接促进植物生长[gydF4y2Ba4.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba5.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba6.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba7.gydF4y2Ba］．因此，作物与植物共栽培gydF4y2Ba木霉属gydF4y2Ba目前，这种病毒在世界范围内经常发生[gydF4y2Ba8.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba9gydF4y2Ba那gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

对植物产生有益影响的一种方式是gydF4y2Ba木霉属gydF4y2Ba分泌几丁质酶和葡聚糖酶等水解酶，攻击和降解病原体的细胞壁，[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba那gydF4y2Ba11gydF4y2Ba那gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba木霉属gydF4y2Ba也分泌被称为peptaibol的膜嵌入肽，协同作用于分泌的水解酶并诱导细胞裂解[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

Peptaibols是一种线性的，5-21个氨基酸长，非核糖体合成的多肽，富含α -氨基异丁酸，当从净正的一面接近时，插入有能量的膜。由。分泌的一种胃辅酶gydF4y2Ba木霉属gydF4y2Ba是20-残基alamethicin，它自我结合进入狭窄的电压依赖通道[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba那gydF4y2Ba13gydF4y2Ba那gydF4y2Ba14gydF4y2Ba那gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．Alamethicin已被广泛用作模型分子，用于研究界定的脂质环境中的膜通道行为[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]，亦涉及其对不同致病微生物的抗生素作用[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．天然和合成的肽现在筛选他们对病原微生物[抗菌特异性gydF4y2Ba17gydF4y2Ba那gydF4y2Ba18gydF4y2Ba那gydF4y2Ba19gydF4y2Ba那gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．肽-膜的相互作用很可能取决于膜的性质，如电荷和脂质组成[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba那gydF4y2Ba18gydF4y2Ba那gydF4y2Ba21.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba22.gydF4y2Ba］．因此，与其他抗生素不同，peptaibol具有相对普遍的作用模式[gydF4y2Ba23.gydF4y2Ba抑制病原菌产生耐药性。gydF4y2Ba

Alamethicin对植物细胞有多种作用，取决于浓度。浓度低于5 μg mlgydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}利马豆中茉莉酸盐和水杨酸盐的激发[gydF4y2Ba24.gydF4y2Ba),gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba根的生长受到抑制[gydF4y2Ba25.gydF4y2Ba］．浓度为5-20 μg mlgydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}在10分钟内诱导烟草细胞质膜的非致死渗透[gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba]，而较长时间的培养或较高的浓度则会导致细胞死亡[gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba27.gydF4y2Ba］．目前还不清楚小蝶子本身与植物的确切生物学关系，但人们相信小蝶子与植物的生长有关gydF4y2Ba木霉属gydF4y2Ba微生物的寄生[gydF4y2Ba28.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

我们早期的研究发现alamethicin能有效地渗透无菌培养的烟草细胞，反过来也能渗透质体和线粒体，但不能渗透液泡，这使得研究细胞内酶活性成为可能[gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba29.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba］．起初，这似乎与事实相矛盾gydF4y2Ba木霉属gydF4y2Ba物种通常对植物是仁慈的。然而，培养的植物细胞暴露于一种市售纤维素酶gydF4y2Ba木霉gydF4y2Ba(来自Serva的Onozuka RS)被发现对alamethicin的渗透具有抗性[gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba］．这种纤维素酶的制备相对粗糙[gydF4y2Ba33.gydF4y2Ba，但我们可以得出结论，纤维素降解是必需的，因为外聚糖/内聚糖酶活性的最终产物纤维素二糖可以抑制抗性的形成，而且煮沸的酶不会诱导抗性[gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba］．此外，果胶酶不能诱导抗性，木聚糖酶、elf18、flg22和壳聚糖也不能诱导抗性。此外，解偶联剂和环己亚胺没有抑制耐药性，排除了膜去极化和蛋白质合成的参与[gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba］．从抗性细胞分离出的质膜磷脂酰丝氨酸含量较低，甾醇与脂肪酸的比值也较低[gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba］．我们认为，这可能会影响alamethicin通道的形成，众所周知，这取决于膜的物理性质[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba那gydF4y2Ba22.gydF4y2Ba］．因此，这些培养的植物细胞显示了一个明确和独特的情况，真核细胞可以特异性地诱导对一种多肽抗生素的耐药性，尽管alamethicin通道形成的一般性质[gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

植物细胞培养物可能是相互作用的一个异系统的特性很重要，但调查细胞特异性和分子机制背后的纤维素酶诱导抗丙甲菌素（CIRA），需要用多种细胞类型和定义的基因组完整的植物。对于植物的成功与共生gydF4y2Ba木霉属gydF4y2Ba在根际，很明显，植物细胞需要一种保护来抵抗小白菜碱。基于现有的信息，我们假设植物的根中含有对petaibol(如alamethicin)敏感的细胞，它们检测到纤维素酶作为存在的标记gydF4y2Ba木霉属gydF4y2Ba，并且它们诱导对丙甲菌素保护。在这项工作中，我们表明，丙甲菌素通透化和CIRA可以在根尖表皮中的模型生物体被诱导gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba．这为利用现有的分子工具识别CIRA在植物-真菌相互作用中重要的关键成分提供了可能性gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

阿拉胺汀透明石gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba根，但纤维素酶诱导抗性gydF4y2Ba

答:芥gydF4y2Ba用荧光探针碘化丙啶(PrI)观察发现，阿拉米斯汀对幼苗有渗透作用。这种亲水染料在几分钟内无法通过正常细胞完整的质膜[gydF4y2Ba34.gydF4y2Ba，但质膜渗透后可与细胞核、核糖体和细胞器中的DNA和RNA结合。PrI也常用来染色植物细胞壁[gydF4y2Ba35.gydF4y2Ba然后使用比用于核酸染色的PrI浓度高十倍的PrI。对照苗在HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO和alamethicin处理后，PrI荧光在根的年轻部分可见，而在幼苗的其他部分不可见(图2)。gydF4y2Ba1AgydF4y2Ba）.相比之下，暴露在有限的4 h纤维素酶处理下的幼苗没有这种荧光(图。gydF4y2Ba1AgydF4y2Ba）.在½浓度的Murashige和Skoog (MS)培养基中萌发的幼苗也暴露于浓度不断增加的alamethin(图。gydF4y2Ba1B.gydF4y2Ba）.在没有alamethicin的情况下，无论是对照幼苗还是纤维素酶处理的幼苗都没有观察到荧光(图。gydF4y2Ba1B.gydF4y2Ba）.对照苗添加alamethicin (10-40 μg mlgydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba})导致PrI荧光在根尖最强烈(图。gydF4y2Ba1B.gydF4y2Ba)，但只有在纤维素酶预处理的幼苗中，在最高浓度的alamethicin时才发现荧光(图。gydF4y2Ba1B.gydF4y2Ba）.纤维素酶预处理也阻止了阿拉米辛在嫩根中的进一步渗透，即在早期根毛区。然而，通过渗透处理的对照幼苗在该区域的荧光较弱(图。gydF4y2Ba1AgydF4y2Ba；额外的文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1)，这可能是因为这里的细胞更空泡化。在蜡覆盖的下胚轴和子叶组织中未观察到PrI荧光。使用YO-PRO探针验证了这一点，该探针具有与PrI相似的属性，但发出绿色荧光，不受叶绿素干扰(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S2)。综上所述，我们的结果表明，在幼苗根尖有被阿拉米辛渗透的细胞，与使用的萌发培养基无关。这类似于培养的烟草细胞，已经证明，使用PrI作为探针，或使用酶或极谱分析渗透[gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba］．此外，用纤维素酶预处理可以抑制幼苗细胞的渗透性，就像之前在培养细胞中发现的那样[gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

Alamethicin的渗透作用在分生组织和早期延伸的表皮细胞中最为明显gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba根gydF4y2Ba

接下来，我们想要证明根尖细胞类型之间的渗透程度是否存在差异。为了做到这一点，根被置于共聚焦激光扫描显微镜下(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.在对照组(非纤维素酶处理)的幼苗中，在根尖分生组织和延伸区细胞核和细胞质中可以看到alamethicin依赖的PrI荧光，但在细胞壁中看不到，但在延伸区随着液泡大小的增加细胞染色进一步下降(图)。gydF4y2Ba2AgydF4y2Ba和gydF4y2BabgydF4y2Ba）.根冠未见染色(图。gydF4y2Ba2AgydF4y2Ba）.横切面显示，分生区大部分细胞显示荧光(图。gydF4y2Ba2B.gydF4y2Ba而在早期延伸区，只有表皮细胞有(图。gydF4y2Ba2B.gydF4y2Ba中间）。似乎在横截面中看到的血红素细胞比阿里氏细胞更染色（图。gydF4y2Ba2B.gydF4y2Ba中间)，纵断面(图。gydF4y2Ba2egydF4y2Ba）.有趣的是，位于顶端分生组织区和早期延伸区之间的基部分生组织区反复出现较少的渗透现象(图)。gydF4y2Ba2a，bgydF4y2Ba和gydF4y2BaegydF4y2Ba）.同样，在纤维素酶处理的材料中没有看到荧光(图。gydF4y2Ba2CgydF4y2Ba和gydF4y2BadgydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

Alamethicin在烟草细胞中的渗透作用可以用酶学方法测定gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba幼苗使用依赖于nadp的异柠檬酸脱氢酶gydF4y2Ba

用烟草细胞，已成功监测阿拉美霉素 - 渗透性和抗性作为PRI荧光，以及使用生化标记物[gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba］．因此我们寻找适合于幼苗的酶标记物，以获得定量数据来证实荧光结果。在这方面，依赖nadp的异柠檬酸脱氢酶(NADP-ICDH) [gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba37.gydF4y2Ba]似乎有希望的，因为活性是丰富的，完全依赖于镁的存在gydF4y2Ba^2+gydF4y2Ba，通过加入EDTA可以很容易地将其络合。此外，NADP- icdh可以很容易地作为NADP的还原用分光光度法测定gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba(在NADPH再氧化抑制剂存在的情况下)，并且在纯化过程中是稳定的。gydF4y2Ba

加入24 μg mlgydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}结果表明，alamethicin对烟草细胞有一定的抑制作用，在约1 min内检测到NADP-ICDH活性，而在12 μg ml中检测到NADP-ICDH活性gydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}Alamethicin给了大约5分钟的延迟期，然后观察到线性速率。该速率与0.1% Triton X-100引起的速率相当，并且通过添加过量的EDTA有效地停止了活性(图)。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba）.（EDTA添加后的吸光度下降可能反映了MG时诱导的散射变化gydF4y2Ba^2+gydF4y2Ba是由EDTA络合的，因为它是相似的所有曲线。)加入EDTA后，反应呈线性，曲线平坦，表明NADPH在实验中没有被降解。在没有NADP的情况下，没有alamethin诱导的吸光度变化gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba）.在线测试后，我们扩大了在微滴度板上使用的程序，其中活性在10分钟后用EDTA停止。alamethicin渗透后的活性是0.1% Triton X-100的70-90%(图)。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)，与在线测量结果一致(图。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)，以及对烟草细胞胞质酶的早期研究[gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba］．在10 ~ 12 μg ml浓度下，NADP-ICDH活性达到一半gydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}丙甲菌素以20mg细胞ml的细胞浓度gydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}(无花果。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

细胞在0.2%纤维素酶的作用下培养，3 h后产生alamethin抗性(图)。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba）.因此，似乎NADP-ICDH活性似乎是一种可靠的快速检测方法，可用于测量烟草细胞的渗透和纤维素酶诱导的对alamethicin的抗性。接下来我们测试了这是否也适用于gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba幼苗。gydF4y2Ba

NADP-ICDH具有明显的活性gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba在此之后，用阿拉米辛处理这些幼苗。在延长的检测时间内，活性是稳定的，至少60分钟，因此可以在少量幼苗中检测到，随着检测幼苗的数量(至少6个;无花果。gydF4y2Ba3 dgydF4y2Ba）.alamethicin依赖的模式与在细胞中获得的模式相似(对比图。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba和gydF4y2BaegydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

最初，我们不能用苗分析NADP-ICDH活动时检测CIRA。这是令人迷惑，因为它具有用于根荧光数据（图不同意。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，并观察到烟草细胞在PrI荧光和PrI荧光下均表现出对阿拉米稀的抗性[gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba]和NADP-ICDH活性作为渗透标志物(图。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba）.但是，用于NADP-ICDH测定的培养基比用于荧光测定的培养基复杂，不能排除在水中培养的幼苗比MS培养基+蔗糖培养的细胞对NADP-ICDH反应更强烈。因此，作为第一种方法，我们开始使用PrI荧光作为渗透标记，更详细地测试NADP-ICDH测定介质中的成分。事实上，在完全培养基中没有获得纤维素酶诱导的抗性，但在培养基中删除甘露醇时出现了抗性(图。gydF4y2Ba4.gydF4y2Ba）.然后，我们返回NADP-ICDH活性测定，发现用纤维素酶预处理导致阿拉美霉素阻力，条件是降低了随后的测定中的甘露醇浓度（图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba）.使用100 mM甘露醇，可以在幼苗中检测到alamethicin抗性，我们确定纤维素酶处理后需要两倍高的alamethicin浓度来进行渗透(图)。gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba）.综上所述，我们的结果表明，纤维素酶预处理可以诱导无菌培养的细胞型特异性CIRAgydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba幼苗。我们用两种不同的方法(荧光和酶活性)和两种生长条件(HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO和½MS)。CIRA的存在gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba开辟了可能性，调查参与网下CIRA的分子工具的机制的基因，常用的生防真菌之间的相互作用进一步了解gydF4y2Ba木霉属gydF4y2Ba和植物。gydF4y2Ba

木霉属gydF4y2Ba物种通过三种相互关联的方式来增加植物的健康。它们能直接促进生长[gydF4y2Ba4.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba5.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba6.gydF4y2Ba]，它们诱导植物发生系统性抗性[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba那gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba9gydF4y2Ba那gydF4y2Ba38.gydF4y2Ba]他们还分泌例如酶[gydF4y2Ba8.gydF4y2Ba和缩氨酸[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba它们分别直接作用于周围病原体的细胞壁和质膜，从而溶解它们的细胞。然而，据报道gydF4y2Ba木霉属gydF4y2Ba对植物生长的影响因植物和真菌的基因型而异，在某些情况下甚至导致生长抑制[gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba40gydF4y2Ba］．这表明,gydF4y2Ba木霉属gydF4y2Ba能破坏植物，如也由植物细胞的透化丙甲菌素（图表示。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba) ［gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba]，以及抑制植物根系生长[gydF4y2Ba25.gydF4y2Ba]的浓度为或低于抑制微生物的浓度[gydF4y2Ba41.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba42.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba43.gydF4y2Ba］．小丸子由不同的gydF4y2Ba木霉属gydF4y2BaSPP。与植物有相对一般的行动方式，如图所示gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba突变体gydF4y2Batkr1gydF4y2Ba，提供了对peptaibol trichokonin VI和alamethicin生长抑制的抗性[gydF4y2Ba25.gydF4y2Ba］．因此，植物细胞的Peptaibol裂解可以抵消的仁慈的性质gydF4y2Ba木霉属gydF4y2Ba真菌。然而，植物细胞的预处理用gydF4y2Ba木霉属gydF4y2Ba纤维素酶诱导血液抗性的血液抗性（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba) ［gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba］．纤维二糖，EXO /内切葡聚糖酶活性的最终产物，预防烟草细胞中的CIRA发育，表明活性葡糖酶是Onozuka RS酶制剂中的必需组分[gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba］．其他一些生物因子也被测试并发现是无效的，如果胶酶以及激发子如木聚糖酶，elf18, flg22和壳聚糖[gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba］．在CIRA诱导过程中，质膜脂的组成发生了变化，这表明这些膜特性与抑制alamethicin孔的形成有关[gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba］．可能的机制是源自动作的组件gydF4y2Ba木霉属gydF4y2Ba植物细胞壁上的纤维素酶，以某种方式导致细胞膜脂质的变化，使植物细胞对alamethicin耐受。这符合一个仁慈的角色gydF4y2Ba木霉属gydF4y2Ba对植物生长来说，至少只要在病原体中没有启动类似的防御反应。需要注意的是，使用纤维素酶处理只会引起植物细胞壁的轻微降解，这在显微镜下很难看到。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和gydF4y2Ba2gydF4y2Ba) ［gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba]。纤维素酶的浓度在组织渗透菌丝和完整的植物细胞壁之间的有限空间gydF4y2Ba木霉属gydF4y2Ba-root交互目前未知。然而,gydF4y2Ba木霉属gydF4y2Ba细胞壁降解酶基因，包括糖基水解酶，在植物根定殖和设置gydF4y2Ba木霉属液对gydF4y2Ba在玉米根的质外体空间中检测到分泌糖基水解酶基因产物[gydF4y2Ba44.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba45.gydF4y2Ba］．因此，CIRA过程可能是成功的植物-真菌共生所需的通讯途径之一。gydF4y2Ba

在本研究中，我们使用的幼苗gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba对于我们的通透和CIRA研究，以获得更接近一个完整的和自然的系统比在培养细胞是可能的。这种方法还使我们能够识别定义类型的细胞和组织，这东西不能用细胞培养来完成的通透处理的效果。gydF4y2Ba

Alamethicin渗透根细胞和纤维素酶诱导抗性(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，其浓度和条件与以前烟草细胞所需的浓度和条件相似[gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba］．有趣的是，阿拉米辛并不是对所有的组织和细胞都具有同样的渗透性。我们发现，特别是根尖被渗透了，这在各种生长和试验条件下都可以观察到(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，提示年轻且活跃扩张的细胞对alamethicin比分化细胞更敏感。更详细的根尖共聚焦显微镜分析显示，分生组织和延伸的表皮细胞被渗透。与此相反，延伸皮层细胞、根冠细胞和基部分生组织细胞均未被渗透。根冠的柱状细胞和基部分生组织的细胞已经停止分裂并开始液泡化，因此与顶端分生组织的细胞有很大的不同(关于根生长的空间调控的综述，见[gydF4y2Ba46.gydF4y2Ba])。这可能也涉及到脂质和蛋白质到质膜的运输。使用荧光探针，在di-4-ANEPPDHQ上gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba根，基生分生组织(根过渡区)的膜脂序高于根的其他部位[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．此外，皮质中的脂质顺序也高于表皮[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．因此，沿着根轴膜脂组成的差异可能解释了为什么阿拉米辛对不同部位的渗透性不同。这与CIRA与烟草细胞质膜脂组成变化相一致[gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba］．另一种可能的解释可能是在细胞壁/细胞外环境中，以及疏水alamethicin和亲水PrI如何容易地通过它运输。基生分生组织(过渡区)的细胞具有特定的果胶物质等特征[gydF4y2Ba47.gydF4y2Ba]和根冠分泌亲水性粘液，可能对阿拉米辛形成扩散屏障。gydF4y2Ba

表皮细胞通透，而深层组织中仅观察到少量PrI荧光，至少在这里使用的条件下(20 μg ml)gydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}阿拉米霉素15分钟）。PRI，至少在用于染色细胞壁的浓度为10倍的浓度下，可以通过运动骨质弥漫，直到内胚层屏障[gydF4y2Ba48.gydF4y2Ba］．这表明alamethicin不能有效地通过胞间连丝运输，而是诱导后者的胼胝质堵塞[gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba］．此外，alamethicin从质外体穿过顶质膜进入胞质时，从胞质膜净负侧接近表皮细胞时，不应能渗透表皮细胞的内基质膜[gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba］．此外，与毛细胞相比，成肌细胞的染色似乎更少(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.后一种差异是非定量的，应该谨慎解释，因为成纤维细胞比毛细胞更空泡化，细胞质(如细胞器核酸)相对较少，因此单位表面的最大荧光水平较低。gydF4y2Ba

在烟草细胞培养中，对几种酶进行了平行于PrI荧光对CIRA的研究，结果一致[gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba］．生化分析的优点是，它们提供了更多的定量数据，因此也可以用来发现渗透和CIRA的差异变化，而PrI染色主要是定性的。我们当时的问题是，是否可以将类似的生化方法用于种苗。我们选择跟踪胞质酶NADP-ICDH，并在微滴度板上这样做，以获得更高的吞吐量。NADP-ICDH是一种主要位于胞质位置的内保酶，它在植物的不同部位表现出高而恒定的活性，在纯化后活性很强[gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba37.gydF4y2Ba］．NADP-ICDH在细胞质中的活性远远高于alamethicin孔的运输通量，而alamethicin孔是细胞内核酸PrI标记所需要的。因此，转运事件将是测量到的NADPH形成速率的限制步骤，这也被alamethicin典型的s形浓度曲线所证实(图。gydF4y2Ba5.gydF4y2Ba）.使用基于NADP-ICDH的试验也可以发现CIRA诱导，尽管与培养细胞相比，在少数幼苗中检测NADP-ICDH需要更长的孵育时间。对于用幼苗进行酶学检测的CIRA，在测定过程中渗透压(甘露醇)的浓度必须低于在细胞上测量的浓度。这种差异可能反映了它们各自之前的生长条件，即细胞培养在含88 mM蔗糖的1xMS培养基中，幼苗培养在HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO.似乎NADP-ICDH测定期间的质子溶解抵消了先前的纤维素酶诱导的抗性，表明将质膜连接到细胞壁的组分对于循环至关重要。一种可能性是亚洲丙基甲蛋白质，其是细胞壁和质膜之间的锚，其中可以在血浆膜中发现GFP-ATAGP18融合蛋白以及在烟草亮黄色2细胞中等离子体溶液后的Hechti股中[gydF4y2Ba49.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

在这项研究中，我们发现阿拉米辛渗透和CIRA发生在gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba幼苗根技巧。渗透作用主要发生在根的顶端分生组织和延伸区表皮上，定位了阿拉米辛损伤的靶细胞。CIRA的质膜分解抑制表明CIRA依赖于质膜-细胞壁接触。在模型工厂中存在CIRA过程gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba也为确定阿拉霉素抗性背后的机械成分以及CIRA如何与通常有益的作用联系提供了可能性gydF4y2Ba木霉属gydF4y2Ba在农作物。gydF4y2Ba

细胞培养gydF4y2Ba

烟草gydF4y2Ba， L.，亮黄2细胞在MS基础培养基中培养[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba添加88 mM蔗糖，0.9 μM 2,4-二氯苯氧乙酸，3gydF4y2BaμgydF4y2BaM硫胺素，0.5毫米gydF4y2BamyogydF4y2Ba肌醇和2mM KHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba阿宝gydF4y2Ba_4.gydF4y2Ba如上所述[gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba］．培养基初始pH为5.0。细胞悬液每7天传代一次，细胞在指数生长期(350 - 450mg细胞(新鲜重量)ml)采集用于实验gydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}）.gydF4y2Ba

植物文化gydF4y2Ba

的种子gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Bacol0 (Lehle Seeds, Round Rock, TX, USA)表面消毒后转移到微离心管或3.5 cm培养皿中，在½MS基础培养基(pH 5.65)或HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO.在4℃下2-3天后，将幼苗转移到生长室（16小时光，24℃）。如传说中规定的那样，这些幼苗用于生长4-10天后的荧光显微镜测定。gydF4y2Ba

或者，按照上述方法对种子进行灭菌，然后用100 μl无菌H . l转移到96孔带盖的聚丙烯板(Greiner Bio-One, BioNordika, Stockholm, Sweden)gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba约5-10个种子/井。在4°C下放置2天后，将幼苗转移到生长室(光照16 h, 24°C)。这些幼苗生长5天后进行NADP-ICDH测定。gydF4y2Ba

荧光显微镜用gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba幼苗gydF4y2Ba

幼苗生长后，用等量的HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO (HgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba或0.35 M甘露醇(½ms生长的幼苗)，±1% (gydF4y2BawgydF4y2Ba/gydF4y2BavgydF4y2Ba）纤维素酶并在温和搅拌下孵育2-4小时。在此孵育后，0-40μgmlgydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}加入终浓度的alamethicin，孵育10-15 min，最后加入1.5 μM PrI孵育1-5 min，孵育结束后将幼苗清洗并转移到含有PrI而不含alamethicin的载玻片上(除非另有说明)。gydF4y2Ba

使用G-2A-滤波器（激发在510-560纳米，以上590nm发射），耦合到尼康OPTIPHOT-2显微镜（Nikon公司，东京，日本）进行荧光显微术。作为参考，亮场透射显微图像被注册。图像用奥林巴斯DP-70数码相机（奥林巴斯光学，东京，日本）收集。曝光时间从20处理的对照根选择微克/毫升丙甲菌素，并且其中核清楚地是可见的，但背景是暗越好，以使染色特异于透化细胞。然后，该曝光时间用于收集实验中的所有画面。gydF4y2Ba

可替代地，使用Olympus CZ-CTV解剖显微镜（奥林巴斯光学，东京，日本）进行荧光显微镜。甲UV反式照明器（UV Herolab UVT-20男滤波器312纳米，Herolab，威斯洛赫，德国）用作激发源和使用光红色滤光器（Red23A，蒂芬，了Hauppage，NY，USA）收集发射。gydF4y2Ba

共聚焦荧光显微镜分析在与上述类似的4-5天龄幼苗上进行。用Zeiss LSM 510共聚焦显微镜检测PRI染色，用Meta探测器（Zeiss公司，Oberkochen，德国），配备二极管泵浦固态561nm激光器，并设定为590nm散发和上述。在具有相同显微镜设置的1μm的交叉点中拍摄明场和荧光图像。通过imageJ 1.48V软件（NCBI）实现3D图像重建，Z-绘图投影和横向/横向光学部分的图像处理。调整包含所有荧光图像的一个合成图像，用于强度设定在背景和最高强度之间，以便在所有条件之间进行比较。将明场图像倒置为概述细胞以进行组织参考。gydF4y2Ba

烟草细胞NADP-ICDH测定gydF4y2Ba

用分光光度法在线测定活性，测量量为20 mg mlgydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}在反应培养基中(最终浓度:50 mM曲新/KOH, pH 8, 0.35 M甘露醇，3 mM氯化镁gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba、1 mM EGTA、1 mM KCN、100 μM没食子酸正丙酯、1 mM NADPgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba， 2 mM D, l -异柠檬酸)。信号稳定后，加入alamethicin, Triton-X-100和EDTA，如图。一个gydF4y2Ba_340gydF4y2Ba——一个gydF4y2Ba_465gydF4y2Ba采用amco -Olis DW2双波长分光光度计(Olis, Bogart, USA)测定。gydF4y2Ba

在微量滴定板中进行测定，将5日龄的细胞制成颗粒，用0.35 M甘露醇清洗并重悬。将50 μl细胞(6 mg鲜重)在0.35 M甘露醇中转移到96孔聚苯乙烯微滴定板(Greiner Bio-One, BioNordika, Stockholm, Sweden)上的孔中，加入100 μl 1.5 × Reaction培养基(最终alamethin浓度为0-20 μg ml)开始反应gydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}）.加入50 μl 100 mM Na 10 min后停止反应gydF4y2Ba_2gydF4y2BaEDTA，pH 8.0螯合MGgydF4y2Ba^2+gydF4y2Ba．一个gydF4y2Ba_340gydF4y2Ba——一个gydF4y2Ba_465gydF4y2Ba使用96孔板读数仪(Labsystems, Multiskan, Helsinki, Finland)对每口井进行测量。每个处理做4 - 5个技术重复，所提供的数据是2-4个生物重复的平均值。酶活计算采用NADPH消光系数6.2 mMgydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}厘米gydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

纤维素酶处理细胞:用新鲜或煮沸(5分钟，96℃)脱盐的纤维素酶(0.2%)孵育细胞gydF4y2BawgydF4y2Ba/gydF4y2BavgydF4y2Ba)在0.35 M甘露醇。用0.35 M甘露醇处理的细胞作为试管中的对照。在0-3 h后的不同时间点提取样品，转移到聚苯乙烯微滴定板上，与1.5 ×反应介质(含0.25 M甘露醇，最终浓度为12 μg ml)混合gydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}alamethicin)的NADP-ICDH活性测定方法如下。gydF4y2Ba

NADP-ICDH试验与gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba幼苗gydF4y2Ba

在100 μl HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO在96孔聚丙烯板中洗涤处理±1% (gydF4y2BawgydF4y2Ba/gydF4y2BavgydF4y2Ba用50 μl 0-400 mM甘露醇交换酶，再用100 μl 1.5 ×反应培养基(最终浓度以细胞为标准，但以0-400 mM甘露醇和0-40 μ ml交换酶)交换酶3 hgydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}alamethicin)。用50 μl 100 mM Na处理60 min后停止反应gydF4y2Ba_2gydF4y2BaEDTA。为避免光从幼苗处散射，将100-150 μl反应液从每个孔转移到聚苯乙烯板的相应孔中，然后测量吸光度。每个处理做4至8个重复，所提供的数据是4个独立试验的平均值。一个gydF4y2Ba_340gydF4y2Ba——一个gydF4y2Ba_465gydF4y2Ba在样品转移到聚苯乙烯板后，使用96孔板读数器(Multiskan GO, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)对每个孔进行测量。gydF4y2Ba

杂项gydF4y2Ba

t . viridegydF4y2Ba纤维素酶(16,420，' Onozuka ' cellulase RS)购自Serva (Heidelberg, Germany)。Alamethicin (a - 4665”gydF4y2Bat . viridegydF4y2Ba)来自Sigma(美国密苏里州圣路易斯)。用于阿拉米辛纯化的菌株(NRRL 3199)已被重新鉴定为gydF4y2Ba木霉属arundinaceumgydF4y2Ba［gydF4y2Ba51gydF4y2Ba，但仍然被命名gydF4y2Bat . viridegydF4y2Ba由生产商。根尖的渗透性经pri检测得到证实gydF4y2Bat . viridegydF4y2Baalamethicin来自其他两家供应商(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba：图S1）。gydF4y2Ba

使用Excel (Microsoft)中的学生双尾非配对t检验进行统计分析。gydF4y2Ba

CIRA:gydF4y2Ba

纤维素酶诱导对alamethicin的抗性gydF4y2Ba

女士:gydF4y2Ba

Murashige和Skoog中号gydF4y2Ba

NADP-ICDH:gydF4y2Ba

NADP-dependent异柠檬酸脱氢酶gydF4y2Ba

革命制度党:gydF4y2Ba

Propidium碘化gydF4y2Ba

我们感谢Chatarina Mattsson女士维持细胞培养和生长装置，并感谢本科生实习生在实验方面的帮助。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

这项工作得到了Carl Tryggers Stiftelse (SW)、Crafoordska Stiftelsen (AGR)和Erasmus Mundus Action 2 (DS)的资助。资助机构不再参与项目活动。gydF4y2Ba

数据和材料的可用性gydF4y2Ba

在当前的研究中使用和/或分析的数据集可从通信作者在合理的要求。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 隆德大学生物系Sölvegatan 35B, 223 62，隆德，瑞典gydF4y2Ba

   Bradley R. Dotson, Dia Soltan, John Schmidt, Mariam Areskoug, Kenny Rabe, Corné Swart, Susanne Widell & Allan G. RasmussongydF4y2Ba

2. 现住址:索哈格大学理学院植物系，索哈格，埃及，82524gydF4y2Ba

   Dia SoltangydF4y2Ba

3. 现住址:MariboHilleshög AB, Säbyholmsvägen 24, 261 91, Landskrona, SwedengydF4y2Ba

   约翰·施密特gydF4y2Ba

4. 目前地址:德国德累斯顿天然材料技术研究所，Technische Universität Dresden, Bergstraße 120,01069gydF4y2Ba

   肯尼·瑞芭gydF4y2Ba

5. 通讯地址:德国波茨坦马克斯普朗克分子植物生理学研究所，Am Mühlenberg 1,14476gydF4y2Ba

   科恩黑黝黝的gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

SW和AGR构思和设计研究，BRD、DS、JS、MA、KR、CS和SW进行实验，BRD、SW和AGR分析数据，SW、AGR和BRD撰写稿件，所有作者阅读并批准稿件最终版本。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba艾伦·g·RasmussongydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

这项工作开展符合机构，国家和国际准则。gydF4y2Ba

同意出版gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

利益争夺gydF4y2Ba

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。gydF4y2Ba

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再版和权限gydF4y2Ba