茉莉酸促进生长素诱导的暗生长的不定根gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba幼苗和茎薄细胞层通过乙烯信号传递和木质素发生的调控gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

植物生存通常需要不定根（ARS），对成功的微扫描至关重要。在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba暗生长幼苗的ar形成发生于下胚轴，并通过吲哚-3-丁酸(IBA)和激动素(Kin)的联合应用而增强。同样的IBA + kin处理可诱导薄细胞层(TCLs)中ar的形成。生长素在许多物种和实验系统中是ar形成和木质素发生的主要诱导剂。在拟南芥的下胚轴和tcl中，木质部发生与ar的形成是竞争的。Jasmonates (JAs)对去黄化拟南芥幼苗ar的形成有负面影响，但对烟草暗生IBA + Kin TCLs ar的形成和木质素发生均有正面影响。在拟南芥中，JAs和生长素在ar形成和木质素发生中的相互作用需要研究。在去黄化的拟南芥幼苗中，生长素响应因子ARF6和ARF8正调控ar的形成，而ARF17负调控ar的形成，但它们在木质素发生中的作用尚不清楚。生长素和乙烯(ET)之间的交互作用也通过EIN3/EIL1信号通路在ar形成和木质素发生中起重要作用。EIN3/EIL1是JA和et信令的直接链路。本研究探讨了JA在拟南芥暗苗和tcl中ar形成和木质素发生中的作用，以及与ET和生长素的关系。 The JA-donor methyl-jasmonate (MeJA), and/or the ET precursor 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid were applied, and the response of mutants in JA-synthesis and -signalling, and ET-signalling investigated. Endogenous levels of auxin, JA and JA-related compounds, andARF6.gydF4y2Ba，gydF4y2BaARF8.gydF4y2Ba和gydF4y2BaARF17gydF4y2Ba表情都是被监控的。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

Meja，0.01μm，增强Ar形成，当与IBA + Kin结合时，以及早期JA-Biosynthesis突变体的响应gydF4y2Badde2-2gydF4y2Ba和Ja信号突变体gydF4y2Bacoi1-16gydF4y2Ba证实了这个结果gydF4y2Ba．gydF4y2BaJA水平在tll培养过程中发生早期变化，JA/JA- ile免疫定位于ar尖部和木本细胞。晚期ja生物合成突变体的高ar反应gydF4y2Baopr3gydF4y2Ba提示12-氧植物二烯酸对ar的形成也有积极作用gydF4y2Ba．gydF4y2Ba通过EIN3 / EIL1之间的JA和ET-信号之间的串扰对于Ar形成至关重要，并且涉及致致致致致致癌的竞争调节。通过MEJA浓度抑制ar形成，增强了Xylocaesis，并且与阳性有关gydF4y2BaARF17gydF4y2Ba表达式。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

JA浓度依赖于ar的形成和木质素的发生，以及与ET的互作为在抗性物种的快繁中应用开辟了道路。gydF4y2Ba

不定根是由各种气生器官形成的胚后根。在许多物种中，ARs有助于植物锚定和从土壤中吸收水分和矿质养分。ar形成也是重要作物品种营养繁殖的关键步骤[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．在切割中，切除迅速改变蟾蜍蛋白，主要的AR诱导剂的水平，并导致其他植物激素的生产，例如茉莉酸盐（Jas）和乙烯（ET）[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．在拟南芥幼苗中，连续的黑暗得到了低锁骨伸长和ar形成[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]，而ARs是由下胚轴中柱鞘的背斜分裂发起的[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．然而，取决于系统的AR不同成立组织使用的gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．杆内皮是在拟南芥中黑暗生长的薄电池层（TCL）的外植体与/敷设与吲哚-3-丁酸（IBA，在10μM）培养的[在0.1μM激动素（KIN）]成立组织而不细胞分裂素[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7GydF4y2Ba］．TCL是由花序茎维管系统外的组织形成的，在培养开始时不含任何生长素[gydF4y2Ba7GydF4y2Ba］．有趣的是，同样的IBA + Kin处理增强了拟南芥完整的深色下胚轴和tcl的ar形成[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]，其特征在于相同的基因表达和生长素累积阶段[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．IBA是吲哚-3-乙酸(IAA)的天然前体，在完整的下胚轴和tcl中都必须转化为IAA以促进ar的形成[gydF4y2Ba7GydF4y2Ba，gydF4y2Ba10.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

可能发生木质细胞的异位形成（Xylocyesis）gydF4y2Ba在足底gydF4y2Ba以及体外培养的外植体[gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12.gydF4y2Ba]，并且在这两种情况下都被外源生长素单独或与细胞分裂素结合增强[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14.gydF4y2Ba］．在许多物种和插枝中，木本发生是ar形成的一个竞争性程序[14，并在其中引用]，包括拟南芥暗生长下胚轴和TCLs [gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

茉莉酸盐影响很多形态形成过程[gydF4y2Ba15.gydF4y2Ba］．在外源施用时，茉莉酸甲酯(MeJA)优于茉莉酸甲酯，因为茉莉酸甲酯更易于细胞膜杂交，并能快速去甲基化产生游离茉莉酸甲酯[gydF4y2Ba16.gydF4y2Ba］．JA对Ar形成的影响是矛盾的。例如，在矮牵牛切割中降低了JA的水平及其生物活性偶联（+） - 7-gydF4y2BaisogydF4y2Ba-茉莉酰- l-异亮氨酸(JA-Ile)导致还原ar生成[gydF4y2Ba17.gydF4y2Ba］．此外，在烟草和拟南芥中，培养的TCLS，通过Meja的亚微粒摩尔浓度（分别为0.01μm），增加了ar-process的内源性Ja水平的形成[gydF4y2Ba7GydF4y2Ba，gydF4y2Ba16.gydF4y2Ba］．然而，JA对拟南芥去黄化完整下胚轴ar形成的负作用已被报道[gydF4y2Ba18.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

有关Xylocyesis的JA效应的信息有限。在拟南芥幼苗在轻的/暗状态下生长，JA在原代根本中诱导异位木耳形成，但这种促进由Cytokinin拮抗[gydF4y2Ba19.gydF4y2Ba］．在暗生烟草TCLs中，来自MeJA的JA可促进木质素发生，但这发生在IBA + Kin的存在下[gydF4y2Ba16.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

的拟南芥突变体gydF4y2Ba延迟dehiscence2-2gydF4y2Ba（gydF4y2BaDDE2-2）gydF4y2Ba［gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba),gydF4y2Baoxophytodienoate——reductase3gydF4y2Ba（gydF4y2Baopr3gydF4y2Ba）[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba在ja生物合成方面有缺陷。在gydF4y2Badde2-2gydF4y2Ba转座子的插入破坏了编码烯氧合酶的基因座，导致ja合成的早期停止。在gydF4y2Baopr3gydF4y2Ba， T-DNA的插入会破坏gydF4y2BaOPR3gydF4y2Ba该突变体在OPR3中存在缺陷，OPR3将12-氧植二烯酸(OPDA)转化为JA的第一前体。该突变体表现出少量JA，但大量OPDA [gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]，这可能导致与java无关的响应[gydF4y2Ba15.gydF4y2Ba］．的gydF4y2Ba冠菌素insensitive1-16gydF4y2Ba（gydF4y2Bacoi1-16gydF4y2Ba）突变体是JA不敏感的[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．JASMONATE ZIM-DOMAIN (JAZ)蛋白是COI1的靶标[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，支持COI1-JAZ是ja感知的共受体。gydF4y2Ba

在去硫酸化拟南芥幼苗中，疾病响应因子（ARFS）ARF6和ARF8在转录水平下介导毒素信号传导[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]，作为正ar调节因子，而ARF17作为负ar调节因子[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．ARF6和ARF8促进JA生产[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]而且浅点积极调节gydF4y2BaARF6 / ARF8.gydF4y2Ba表达和消极gydF4y2BaARF17gydF4y2Ba表达式[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba，而持续的黑暗对gydF4y2BaARFS.gydF4y2Ba是未知的。gydF4y2Ba

生长素- et串扰已被证明在主根和侧根发育中很重要[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba两种植物激素在合成、运输和信号转导水平上相互依赖。在拟南芥暗生幼苗中，ET的前体1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)在0.1 μM浓度下抑制ar的形成，而在10 μM浓度下抑制ar的形成。由于ACC提高内源性IAA水平，降低IBA水平，因此有人提出ET通过促进外源性IBA转化为IAA促进ar形成的作用gydF4y2Ba在足底gydF4y2Ba［gydF4y2Ba10.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

乙烯不敏感3 (EIN3)及其同源的EIN3- like 1 (EIL1)是控制大多数ET反应的中心转录因子[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．ACC和ET通过促进其蛋白质积累来激活EIN3 / EIL1 [gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．在暗生长的拟南芥幼苗中gydF4y2Baein3eil1gydF4y2Ba双突变体表明，ET通过EIN3/EIL1信号通路参与了IBA诱导的ar形成和木质素发生，但IBA如何与该网络相互作用尚需进一步研究[gydF4y2Ba10.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba］．EIN3/EIL1也是JA和et信号的直接链接，与至少三个JAZ成员进行物理交互[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．按照,gydF4y2Baein3eil1gydF4y2Ba在诱导病原菌应答基因表达和根毛发育过程中对JA和ET均不敏感[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

综上所述，本研究旨在探讨JA在暗生长拟南芥幼苗和tcl中ar形成和木质素发生中的作用，以及与ET和生长素的关系。为此，我们研究了完整幼苗和TCLs，以及JA合成和信号转导突变体对MeJA的响应，并进行了激素定量和组织学分析。为了阐明JA和ET之间可能的相互作用，我们将外源ACC加MeJA或不加MeJA的情况应用于JA突变体和ET突变体gydF4y2Baein3eil1gydF4y2Ba．通过ARF网络评价生长素信号可能参与ar形成和木质素发生，表达gydF4y2BaARF6.gydF4y2Ba，gydF4y2BaARF8.gydF4y2Ba,gydF4y2BaARF17gydF4y2Ba还在Meja的存在/缺席时审查。gydF4y2Ba

结果揭示了EIN3/EIL1在JA和ET信号之间的串扰在ar形成控制中的关键功能，包括木质素发生的竞争性调节。的表达gydF4y2BaARF17gydF4y2Ba与Xylocaesis呈正相关，通过抑制Ar形成的MejA浓度（10μm）增强。gydF4y2Ba

幼苗和成体植株的物质和生长条件gydF4y2Ba

拟南芥种子gydF4y2Badde2-2gydF4y2Ba［gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba(由瑞士苏黎世大学beatkeller提供)gydF4y2Baopr3gydF4y2Ba［gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]（由John Browse，华盛顿州立大学，美国提供）和gydF4y2Bacoi1-16gydF4y2Ba［gydF4y2Ba23gydF4y2Ba基于漂白剂（5.6 - ]，突变体和相应的野生型（WTS）（西，WS，上校，GL1，分别）在10％的商业次氯酸钠进行消毒（由约翰·G·特纳，东英吉利大学，英国提供）% active chlorine) for 10 min, washed three times in sterile distilled water and sown in square Petri dishes (12 × 12 cm; 15 seeds per dish) on full-strength MS [33gydF4y2Ba]培养基，含1% (gydF4y2BawgydF4y2Ba/gydF4y2BavgydF4y2Ba）蔗糖（Sigma-Aldrich），0.55mM肌醇（Fluka），0.1μM硫胺素-HCl（pH 5.7）（HF对照培养基）和Meja的缺失，在没有或存在的情况下浓度为0.01μm，0.1μm和10μm。或者，在用于薄细胞层（TCLS）培养物（参见下文）的MS“生根培养基”上播种相同线的种子，含有10μMIBA（MERCK）和0.1μmkin（Sigma-Aldrich）（IBA + Kin中等），以与上述相同的浓度添加或不添加Meja。种子gydF4y2Baein3eil1gydF4y2Ba突变体gydF4y2Ba31gydF4y2Ba] (provided by Hongwei Guo, Peking University, China), and of its WT Col-0 were sterilized as above, and sown in dishes containing IBA + Kin medium, adding or not ACC at 0.1 μM. The HF media were sterilized by autoclaving at 120 °C for 20 min. IBA and Kin were added to the media taking the appropriate volume from stock-solutions (10^{−3gydF4y2Ba}M和10.gydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}在高压灭菌之前，分别为m。Meja的无菌储物解决方案10gydF4y2Ba^{−3gydF4y2Ba}M和ACC 10gydF4y2Ba^{−3gydF4y2Ba}通过过滤（用0.22μm孔隙过滤器）制备M，并将适当的体积达到已经高压灭菌的培养基中达到最终浓度。在添加MEJA或ACC之前，允许介质的温度降至约45-50°C。gydF4y2Ba

经过3天的分层，在4°C的黑暗下[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]并且暴露于白光6小时以诱导发芽（萌发程序，根据[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]），将菜肴置于垂直位置，以便不断与琼脂培养基接触幼苗[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]，并在分层（分层DAS的天数）后22天暴露于连续黑暗，在22±2℃下。将幼苗固定在70％乙醇中直至在光学显微镜（LM）下观察。gydF4y2Ba

ARF6:格斯gydF4y2Ba，gydF4y2BaARF8::格斯,gydF4y2Ba和gydF4y2BaARF17:格斯gydF4y2Ba来自种子的转基因幼苗[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]（瑞典Umeå大学Catherine Bellini提供）在HF对照培养基上进行22 das，在黑暗中增加了0.01μmMeja的体外。播种和生长条件与上述相同。gydF4y2Ba

用作TCLs来源的植物，属于gydF4y2BaDde2-2, op3, coi1-16, ein3eil1gydF4y2Ba突变体和他们的WTS，以及gydF4y2BaARF6:格斯gydF4y2Ba，gydF4y2BaARF8:格斯gydF4y2Ba,gydF4y2BaARF17:格斯gydF4y2Ba转基因系，在生长室中的土壤中生长，长时间，在22±2°C，70％湿度和白光下（22 w / mgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba强度)，在种子萌发后40天[gydF4y2Ba7GydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

TCL文化gydF4y2Ba

TCL（约0.5×8毫米）的外植体，由表皮组成，三层皮质实质，内胚层和1-2层纤维[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，从每个基因型随机选取30株的花序茎节间无菌摘取。gydF4y2Badde2-2gydF4y2Ba，gydF4y2Baopr3gydF4y2Ba，gydF4y2Bacoi1-16gydF4y2Ba，gydF4y2Baein3eil1gydF4y2Ba突变体及其WTS）并置于表皮上，在含有0.55mM肌醇（Fluka），0.1μm硫胺素-HCl（Sigma-Aldrich）的全强度MS培养基中含有全强度MS培养基（10dcls），1％蔗糖，0.8％（gydF4y2BawgydF4y2Ba/gydF4y2BavgydF4y2Ba）琼脂，10μmIba加0.1μmkin（生根培养基; [gydF4y2Ba6gydF4y2Ba])。在蒸压前用1 M NaOH将pH调整到5.7。为gydF4y2Badde2-2gydF4y2Ba，gydF4y2Baopr3gydF4y2Ba，gydF4y2Bacoi1-16gydF4y2Ba(和他们的WTs) TCL文化,惩罚了IBA +亲属中为0.01μM, 0.1μM,或10μM,,gydF4y2Baein3eil1gydF4y2Ba（及其WT）TCL培养，其在只有0.01μM加入。一个CC一个t0.1 μM, alone or combined with 0.01 μM MeJA, was added to the IBA + Kin medium in TCL culture ofdde2-2gydF4y2Ba，gydF4y2Bacoi1-16gydF4y2Ba，gydF4y2Baein3eil1gydF4y2Ba突变体和他们的wt。IBA + Kin培养基(不含MeJA和/或ACC)始终作为对照。采用不含IBA和Kin，但含有上述所有浓度MeJA的培养基，初步检测所有基因型的tcl的反应。外植体在22±2℃连续黑暗下培养15天。培养结束时，在立体显微镜下观察每个基因型和处理的60个外植体进行根评分。三套完整的实验，每一套使用不同的植物在相同的条件下培养，得到了非常相似的结果。gydF4y2Ba

50-100毫克的钨和gydF4y2Baopr3gydF4y2Batcl /复制,培养有或没有0.01μM的法案,在天收获0,1、3和5的激素量化,和20毫克的tcl相同的基因型,培养有或没有0.01,0.1到10μM的法案,在天收获15 RT-qPCR分析,如下所述。最后，10个w和gydF4y2Baopr3gydF4y2Ba在第8和15天，用0.01μm或10μmmeja或没有化合物培养的Tcls，用于Ja / Ja-Ile免疫胶形化程序（见下文）。其他样品用于组织学分析（见下文）。gydF4y2Ba

三十tcl /gydF4y2BaARF6 :: GUS，ARF8 :: GUSgydF4y2Ba,gydF4y2BaARF17:格斯gydF4y2Ba在IBA + Kin培养基上在体外随机来自三种实验组转基因植物，补充或不含0.01μm，0.1μm或10μmmeja。gydF4y2Ba

根的评分和测量下胚轴的长度gydF4y2Ba

在22 DAS时，将拟南芥幼苗在70%乙醇中固定，整株安装在玻片上，在LM (ZEISS Axiolab HBO 50)下沿下胚轴计数不定根原基(ARPs)和ARs。通过LEICA IM1000图像管理软件，使用安装在显微镜上的LEICA DFC 320相机以数字形式获取图像。使用配备ZEISS AxioCam相机的LEICA MZ8立体显微镜，使用AxioVision Release 4.7.2软件，通过数字形式获取图像，测量下轴长度。gydF4y2Ba

在培养15天后，通过检查每种基因型，治疗和实验组的植物的60个外植体在立体作用中进行TCLS的根本生产率，并且以数字形式获得图像的图像为下胚轴。来自一个复制的数据显示在文本上。gydF4y2Ba

组织学分析gydF4y2Ba

每组实验10个样品gydF4y2Baopr3gydF4y2Ba以0.01 μM和10 μM MeJA培养的TCLs和0.1 μM ACC培养的Col-0 TCLs分别于第3、5、8天(Ws和10 μM MeJA)收获gydF4y2Baopr3gydF4y2Ba），在第15天（Col-0，WS和gydF4y2Baopr3gydF4y2Ba)，分级乙醇系列脱水，嵌入Technovit 7100(贺利氏古莎，德国)。用MICROM HM 350 SV切片机在6 μm处纵切，用0.05%甲苯胺蓝(gydF4y2BawgydF4y2Ba/gydF4y2BavgydF4y2Ba）对于LM观察。使用Leica IM1000 Image Manager软件使用Leica DC500相机在明亮场中获得TCL的组织学图像。gydF4y2Ba

GUS活性的组织化学分析gydF4y2Ba

报告基因的表达模式gydF4y2BauidAgydF4y2Ba在控制下gydF4y2BaARF6.gydF4y2Ba，gydF4y2BaARF8.gydF4y2Ba或者gydF4y2BaARF17gydF4y2Ba在转基因中检查了启动子gydF4y2BaARF6:格斯gydF4y2Ba，gydF4y2BaARF8:格斯gydF4y2Ba和gydF4y2BaARF17:格斯gydF4y2BaTCLs在IBA + Kin培养基上，在0.01 μM或0.1 μM MeJA存在/不存在的条件下，在黑暗条件下培养15 d。组织化学GUS检测根据[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]，微不足道的修改。将样品浸入丙酮80％已经冷（ - 20℃）中并在-20℃下置于20分钟，然后用蒸馏水洗涤三次，在组织化学过程之前。在黑暗中在37℃温育4小时后，除去GUS缓冲液并用乙醇替换为70％。然后在立体显微镜下观察到20种基因型，治疗和一组实验的样本。此外，将10个TCLS的每根转基因管线脱水并在树脂中掺杂，如上所述，以12μm的间隔纵向分开，具有自动切片机MICROM350 SV，并在LM下观察到。在体外生长的每种转基因系的每种转基因株的20种幼苗中，在0.01μmmeja的情况下，在22das的黑暗下，GUS测定也在体外生长20个幼苗。在LM下观察之前，将幼苗在乙醇中固定在70％。如前所述以数字形式获取转基因TCLS和全坐幼苗的图像。在每次重复的幼苗中，GUS表达模式非常相似，并且在不同重复的幼苗中。gydF4y2Ba

IAA，IBA和茉莉酸的定量gydF4y2Ba

对于IAA和IBA的测定，冷冻植物材料(50 - 100 mg)用10 ml甲醇均质，其中含有50 ng (gydF4y2Ba^13.gydF4y2BaCgydF4y2Ba_6gydF4y2Ba)剑桥同位素实验室及(gydF4y2Ba^13.gydF4y2BaCgydF4y2Ba_8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba^15.gydF4y2BaNgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba）IBA（由Minnesota大学J. Cohen，USA）提供内部标准。匀浆含有3mL DEAE-Sephadex A25（Amersham Pharmacia Biotech Ab，瑞典）的柱。用3ml甲醇洗涤柱，用3ml 0.1m甲醇洗涤。用制备型HPLC合并3mL 1M，3ml 1.5m和3ml 3m乙酸的馏分3m，3m乙酸（EuroSher 100-C18,5μm，250×4mm，knauer，德国）使用溶剂A（MeOH）和溶剂B（H中0.2％乙酸gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO)在40% a至100% a的梯度下gydF4y2Ba_tgydF4y2Ba收集8至10分钟，蒸发，甲基化，甲基化与醚珠甲烷甲基化，并按照[中的含量气相色谱 - 质谱（GC-MS）。[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba］．量化根据[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]使用碎片gydF4y2Bam / z.gydF4y2Ba136 (gydF4y2Ba^13.gydF4y2BaCgydF4y2Ba_6gydF4y2Ba) IAA-Me,gydF4y2Bam / z.gydF4y2Ba130 (IAA-Me),gydF4y2Bam / z.gydF4y2Ba139（gydF4y2Ba^13.gydF4y2BaCgydF4y2Ba_8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba^15.gydF4y2BaNgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba）IBA-ME和gydF4y2Bam / z.gydF4y2Ba130 1（IBA-ME）。gydF4y2Ba

采用基于标准超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)的方法对OPDA、JA和JA- ile的含量进行定量，方法参照[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba］．简而言之，用[gydF4y2Ba^2gydF4y2BaHgydF4y2Ba_5gydF4y2Ba] OPDA, [gydF4y2Ba^2gydF4y2BaHgydF4y2Ba_6gydF4y2Ba是的,和gydF4y2Ba^2gydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba] JA-ILE（每次50 ng）作为内部标准。离心后，用9体积的水稀释上清液，对HR-XC（Chromabond，Macherey-Nagel）柱进行固相萃取。用900μL乙腈洗脱。将十μl洗脱液进行UPLC-MS / MS根据[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba］．使用分析物和内标峰值高度的比率计算OPDA，Ja和Ja-Ile的含量。结果表达为来自三个生物重复的平均数据和相应的标准误差（SES）。gydF4y2Ba

JA/JA- ile在tcl中的免疫定位gydF4y2Ba

在第8和第15天，Ws和gydF4y2Baopr3gydF4y2BaTCLs在IBA + Kin培养基上培养，用0.01 μM MeJA处理或不处理，固定、脱水和浸润。gydF4y2Ba38gydF4y2Ba］．简言之，将样品固定在4％（gydF4y2BawgydF4y2Ba/gydF4y2BavgydF4y2Ba）1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基） - 在室温（RT）的PBS中盐酸盐（EDC，Merck），在梯级系列乙醇中脱水后，用聚乙二醇1500渗透（PEG 1500，Merck）在55°C时。将PEG嵌入式样品在室温下硬化，随后用MICROM HM 350 SV Mictotome（MicroM，Walldorf，Germany）纵向切割（5μm厚的部分）。gydF4y2Ba

免疫标记程序和抗体根据[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba］．切片用抗ja抗体(来自兔子)孵育过夜，用含5% (gydF4y2BawgydF4y2Ba/gydF4y2BavgydF4y2Ba) BSA和1%乙酰化BSA，在4°C。治疗主要的抗体后,部分是二次抗体孵育,山羊anti-rabbit-lgG coniugated与AlexaFluor488(英杰公司)在5% BSA / PBS稀释,在37°C 90分钟。绿色的荧光是指示性的JA和JA-Ile细胞,但不是惩罚或OPDA (gydF4y2Ba38gydF4y2Ba］．阳性对照是在没有MeJA的情况下，在4% (w/v) EDC的500 μM JA溶液中固定w外植体。在免疫定位过程中省略一抗作为阴性对照(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1a-b)。gydF4y2Ba

用徕卡DMRB荧光显微镜观察切片，并配备特定的滤光片(EF 450-490 nm, DM 510 nm, SF 515 nm)。采用徕卡DC500数码相机采集图像，采用IM1000图像分析软件(徕卡)进行分析。gydF4y2Ba

定量RT-PCR (RT-qPCR)实验gydF4y2Ba

RNA分离和cDNA合成gydF4y2Ba

Tcls都是gydF4y2Baopr3gydF4y2Ba将突变体和相应的WT (Ws)在根诱导激素条件下(10 μM IBA + 0.1 μM Kin)连续黑暗培养15天，分别添加或不添加浓度为0.01、0.1和10 μM的MeJA。每个基因型和处理在第15天收获约20 mg的tcl，在液氮中快速冷冻，研磨成粉末。样品从三个独立的生物学重复中制备。按照说明书使用RNAqueous Kit (Ambion)提取总RNA。用TURBO DNA-free™Kit (Ambion)处理dnase后，进行逆转录:2 μg RNA用10gydF4y2Ba^3.gydF4y2BaU/ml M-MuLV逆转录酶(Finnzymes)，含2.5 μg随机六聚体和500 ng寡聚物(dT)gydF4y2Ba_18.gydF4y2Ba适配器底漆的总体积为50μL，并在40℃下孵育60分钟。通过在70℃下孵育15分钟，终止反应15分钟。在RNASEH（Biolabs）处理之后，通过加入700μlDH稀释反应混合物gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO.利用内含子侧翼的特异性引物对所有cDNA样本进行PCR检测，以确定基因组DNA没有污染。gydF4y2Ba

定量RT-PCR实验设计gydF4y2Ba

的转录水平gydF4y2BaARF6.gydF4y2Ba/ AT1G30330，gydF4y2BaARF8.gydF4y2Ba/ AT5G37020和gydF4y2BaARF17gydF4y2Ba/ AT1G77850（附加文件中列出的底漆序列gydF4y2Ba2gydF4y2Ba采用RT-qPCR方法，对3个独立的生物重复进行了评估。重复反应混合物(最终体积，20 μl)包含5 μl cDNA, 0.5 μM正反引物和1× DyNAmo™Flash SYBR®Green qPCR mix (Finnzymes)。定量RT-PCR实验采用平衡随机区组设计，如前所述[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba］．甲的LightCycler？（Roche）的用于采集的CT值对于每个样品，即交叉的阈值，这是所累积的荧光信号所需要的PCR循环的次数跨过背景阈值以上[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba］．以下标准协议被应用于每个的扩增gydF4y2BaARF.gydF4y2BaCDNA：在95℃下10分钟的初始活化步骤，然后在95℃，在60℃下在95℃下为10 s的40个循环，在72℃下。首先测序每种扩增子以确保扩增序列的特异性，并且为了检查荧光信号在后续运行中从单个预期的扩增子衍生出来，将熔化曲线分析添加到每个PCR程序中。gydF4y2Ba

定量RT-PCR数据分析gydF4y2Ba

描述每个引物对的PCR效率（E）的相对标准曲线根据[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba］．使用参考基因​​（R），从选择对其执行定量RT-PCR的正常化[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]并根据[的实验材料验证gydF4y2Ba40gydF4y2Ba］．gydF4y2BaTIP41 /gydF4y2Ba在11个检测的基因中，At4g34270的表达最为稳定，因此将实时RT-PCR数据进行归一化。gydF4y2Ba

用公式E计算CT值和E值gydF4y2Ba_TgydF4y2Ba^(CTgydF4y2Ba_{一个gydF4y2Ba}^{- ctgydF4y2Ba}_BgydF4y2Ba^）gydF4y2Ba/ EgydF4y2Ba_RgydF4y2Ba^(CTgydF4y2Ba_{一个gydF4y2Ba}^{- ctgydF4y2Ba}_BgydF4y2Ba^）gydF4y2Ba，其中（t）是靶基因和（R）参考基因，（CT）是交叉阈值，（B）与cDNA有关gydF4y2Baopr3gydF4y2Ba不同浓度MeJA培养或不培养的突变或Ws tcl和(A)从校准器cDNA [gydF4y2Ba40gydF4y2Ba］．作为相对于Meja-未处理的WS呈现的数据，该WS是校准剂，并且基因表达比设定为1.所有结果显示为平均数据和相应的SE，从三个生物重复，每个都包括三种技术组成重复。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

数据以平均值(±SE)表示。在进行统计分析之前，使用GraphPad Instat 3进行正态检验(Kolmogorov-Smirnov)。平均数据采用Student 's进行分析gydF4y2BatgydF4y2Ba测试(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)比较两种不同基因型的影响，或通过单因素或双向方差分析(ANOVA，gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)以比较不同处理和/或基因型或不同处理和天数的效果。如果方差分析显示显著效应，则采用Tukey后测(GraphPad Prism 6.0)。用χgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba测试(gydF4y2BaPgydF4y2Ba<0.05）。每个实验的三种生物学复制表现出非常相似的结果。gydF4y2Ba

在IBA + kin培养的WT幼苗和ja突变体中，除coi1-16外，亚微摩尔浓度的MeJA降低了下胚轴的生长并增强了AR的形成gydF4y2Ba

外源Meja的突变体评价突变体（gydF4y2BaDDE2-2）gydF4y2Ba和后期gydF4y2Ba（opr3）gydF4y2BaJA-Biosynthesis的步骤，以及JA信号gydF4y2Ba（COI1-16）gydF4y2Ba在环境、激素和培养条件下生长，这些条件是在TCLs中生成ar所必需的。作为前提，我们评估了相同浓度的MeJA对种子萌发的影响。gydF4y2Ba

分层后的种子分别在10 μM IBA和0.1 μM Kin、0 μM MeJA (0 μM)和0.01 μM、0.1 μM和10 μM MeJA存在的连续黑暗条件下离体生长。与无激素(HF)处理相比，IBA和Kin的存在从未显著降低种子萌发(附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba:图S2a-b)。添加0.01 μM MeJA或0.1 μM MeJA(含或不含IBA和Kin)对各基因型的种子萌发无显著影响gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba:图S2a-b)。相比之下，在MeJA浓度最高(10 μM)的情况下，无论是否与IBA和Kin结合，所有基因型的萌发率都很低(0-17%)，且萌发时幼苗生长严重受阻，ar形成受到抑制，与基因型无关。gydF4y2Ba

在22 DAS，所有IBA + Kin-种植幼苗gydF4y2Badde2-2gydF4y2Ba，gydF4y2Baopr3gydF4y2Ba，gydF4y2Bacoi1-16gydF4y2Ba对应的WT基因型Col、Ws和Col-gl1沿下胚轴呈ARPs和ARs。因此，我们评估了下胚轴的平均长度和AR密度。gydF4y2Ba

除了gydF4y2Bacoi1-16gydF4y2Ba在其他基因型中，0.1 μM MeJA引起的下胚轴长度显著增加(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.0001)，但下胚轴长度仍低于20%(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.低10倍浓度的MeJA (0.01 μM)显示出类似但不那么明显的效应，在相同基因型内，相对于对照，只有两个WT基因型(Col和Col-gl1)具有统计学意义(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)gydF4y2Baopr3gydF4y2Ba（gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01)(图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

与hf培养的幼苗相比，IBA + kin处理的WT幼苗每cm下胚轴产生的平均ARPs/ARs (AR密度)显著增加，Col为8倍，Ws为4倍，Col-gl为11倍(图)。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba和附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba:图S2c)，证实了Col和Ws之前的结果[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．如图所示。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba， 除了gydF4y2Bacoi1-16,gydF4y2Ba其中MEJA没有引起ar形成的任何变化，两种亚微米摩尔MEJA浓度在增强AR反应方面有效，0.01μmMejA诱导所有其他基因型的显着增加（gydF4y2BaP 0.05对于WS和COL-GL1，gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001 for Col andopr3gydF4y2Ba，gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.0001gydF4y2Badde2-2gydF4y2Ba)，与对照处理比较。gydF4y2Ba

0.01 μM MeJA增强WT和ja突变体的TCLs中ar的形成，coi1-16除外gydF4y2Ba

为了深入了解JA对ar形成的影响，我们在相同的条件下研究了从所有基因型植物茎上切下的tcl对ar的响应。MeJA与IBA + Kin在0.01 μM、0.1 μM和10 μM时同时施用，因为后者在相同条件下对烟草TCLs产生一定的愈伤组织增殖[gydF4y2Ba16.gydF4y2Ba］．已知拟南芥（COL-0和WS基因型）在HF条件下无法产生ARS [gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．然而，为了验证MeJA本身是否能够诱导ar的形成，我们对tcl进行了不加激素的培养，但每一种MeJA浓度都进行了培养。ar和愈伤组织的形成都不是独立于基因型发生的。gydF4y2Ba

在IBA + Kin下培养15 d后，评估每个外植体具有ARPs/ARs的tcl百分比和宏观ARPs/ARs的平均数量。在没有MeJA的情况下，Ws的外植体生根率约为70%，gydF4y2Ba超载比gydF4y2Ba3坳gydF4y2Badde2-2,gydF4y2Ba和Col-GL1基因型gydF4y2Ba，gydF4y2Ba和40%gydF4y2Bacoi1-16gydF4y2Ba．两种MeJA亚微摩尔浓度的存在没有显著改变这些值。相比之下，10 μM MeJA使w中ar形成的TCLs的比例降低了约6倍，gydF4y2Baopr3gydF4y2Ba,gydF4y2Bacoi1-16gydF4y2Ba，并取消了在Col的ar反应，gydF4y2Badde2-2gydF4y2Ba和col-gl1 tcls。与文化发作相比，没有AR的外植体保持不变，或表现出一定的愈伤组织。在没有MejA的情况下，WT基因型中的AR平均数存在一些差异，并且在WS中的ar形成显着高于Col和Col-Gl1（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.所有基因型中，0.01 μM MeJA的存在显著提高了ar数(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05gydF4y2Badde2-2gydF4y2BaCol-gl1,gydF4y2BaPgydF4y2Ba<0.01对于Col，gydF4y2BaPgydF4y2BaWs < 0.001gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.0001gydF4y2Baopr3gydF4y2Ba）， 除了gydF4y2Bacoi1-16gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.在WT TCLS中，在WS中观察到最高的增加（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和gydF4y2Ba3A-B.gydF4y2Ba）.而0.1 μM MeJA与0 MeJA之间的ar数无显著差异(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，少数基因型中ar数量显著减少(Ws，gydF4y2Baopr3gydF4y2Ba，gydF4y2Bacoi1-16gydF4y2Ba）能够在10μmmeja下形成ars（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.在所有基因型中，带有ARs的tcl也显示了肉眼可见的愈伤组织形成(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

IBA + Kin和MeJA培养的ja突变体的TCLs中ar的形成。每切除TCL的平均ARP/AR数(±SE)gydF4y2Badde2-2gydF4y2Ba，gydF4y2Baopr3gydF4y2Ba，gydF4y2Bacoi1-16gydF4y2Ba植物，以及它们的WTS（COL，WS和COL-GL1），在不存在（0μmMeja）中或在0.01μm，0.1μm和10μmmeja的情况下进行15天培养。在相同基因型内的处理之间，或在相同处理下的每个突变体与WT之间，至少在gydF4y2BaPgydF4y2Ba<0.05级，由不同的字母表示。同一字母无统计学差异。进一步的统计细节将在文中描述。gydF4y2BaNgydF4y2Ba= 60（第一次重复）gydF4y2Ba

全尺寸图像gydF4y2Ba

来自JA-突变体的IBA + Kin培养的TCL中的宏观AR响应/不含0.01μmmeja。（gydF4y2Baa -gydF4y2Ba) WT Ws立体显微镜下的图像(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba-gydF4y2BabgydF4y2Ba），gydF4y2Baopr3gydF4y2Ba（gydF4y2BacgydF4y2Ba-gydF4y2BadgydF4y2Ba），gydF4y2Badde2-2gydF4y2Ba（gydF4y2BaegydF4y2Ba-gydF4y2BafgydF4y2Ba），gydF4y2Bacoi1-16gydF4y2Ba（gydF4y2BaggydF4y2Ba-gydF4y2BahgydF4y2Ba)体外培养结束时(第15天)的tcl (gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BaegydF4y2Ba，gydF4y2BaggydF4y2Ba）或在0.01μmmeja的存在（gydF4y2BabgydF4y2Ba，gydF4y2BadgydF4y2Ba，gydF4y2BafgydF4y2Ba，gydF4y2BahgydF4y2Ba）.（gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba) TCL有伸长的ARs(箭头)和愈伤组织。（gydF4y2BabgydF4y2Ba）TCL具有高于（gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba）.（gydF4y2BacgydF4y2Ba) TCL与带ARPs(箭头)和伸长的ARs的愈伤组织。（gydF4y2BadgydF4y2Ba)显示众多arp的TCL部分的细节。（gydF4y2BaegydF4y2BaTCL生产的ARs少于(gydF4y2BafgydF4y2Ba）.（gydF4y2Bag-hgydF4y2Ba)无(gydF4y2BaggydF4y2Ba）或（gydF4y2BahgydF4y2Ba）Meja。(图片来自第一个复制)。酒吧= 1毫米gydF4y2Ba

全尺寸图像gydF4y2Ba

独立于治疗之外，gydF4y2Baopr3gydF4y2BaTCLS显示与其WT WS类似的AR响应（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba），即使与WT不同，大部分根部仍处于ARP阶段（图。gydF4y2Ba3 c - dgydF4y2Ba）.不同于gydF4y2Baopr3gydF4y2Ba，gydF4y2Badde2-2gydF4y2BaTCLS显示AR生产（图。gydF4y2Ba3 e-fgydF4y2Ba)显著低于WT，即Ws和Col，即使在0.01 μM MeJA (gydF4y2BaPgydF4y2Ba0和0.01 μM MeJA均< 0.05;gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.考虑到OPDA存在于gydF4y2Baopr3gydF4y2Ba突变体而不是gydF4y2Badde2-2gydF4y2Ba突变体，结果表明JA之间的阳性相互作用来自外源Meja和内源OPDA在增强Ar形成时。相比之下，JA和OPDA对AR伸长率的影响需要进一步调查。gydF4y2Ba

不同于Col-GL1 TCLS，gydF4y2Bacoi1-16gydF4y2Ba当用亚微粒摩尔MEJA浓度治疗时，TCLS在AR生产中没有显着变化，并且AR反应低于WT（gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05和gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.0001，分别在0和0.01 μM MeJA下，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和gydF4y2Ba3G-H.gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

基于相似的趋势，ar的产量增加了Ws和gydF4y2Baopr3gydF4y2Ba与所有其他基因型相比，Tcls和即使在10μmmeja的情况下也存在Ar响应的存在（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba），通过组织学分析详细检查这些基因型的TCLS。对于0,0.01和0.1μmmeja，第一细胞分裂在结核病中发生在第3天，独立于基因型（图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)，第5天第1个分生组织细胞簇的形成(图。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba），以及由所述本体的天10和15之间的ARP / AR-形成（图gydF4y2Ba4 c - dgydF4y2Ba）.在同一时间间隔内，经10 μM MeJA处理的tcl的内皮层衍生物要么变得肥大，要么产生木质素元素(图2)。gydF4y2Ba4 e-fgydF4y2Ba)而不是arp。gydF4y2Ba

Ws和gydF4y2Baopr3gydF4y2BaIBA + KingydF4y2Ba-gydF4y2Ba含或不含MeJA培养的tcl。（gydF4y2BafgydF4y2Ba) Ws的纵向径向截面(gydF4y2Baa、cgydF4y2Ba，gydF4y2BaegydF4y2Ba),gydF4y2Baopr3gydF4y2Ba（gydF4y2BabgydF4y2Ba，gydF4y2BadgydF4y2Ba，gydF4y2BafgydF4y2Ba）在没有Meja的情况下培养的Tcls（gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，gydF4y2BabgydF4y2Ba）或在0.01μmmeja的存在下（gydF4y2Bac, dgydF4y2Ba）或10μmmeja（gydF4y2BaegydF4y2Ba，gydF4y2BafgydF4y2Ba）.（gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba细胞从茎内皮层开始分裂(第3天)gydF4y2BabgydF4y2Ba由内皮细胞衍生（第5天）组织）分生细胞簇。（gydF4y2BacgydF4y2Ba) ar从外植体上伸出(第15天)。（gydF4y2BadgydF4y2Ba）ARPS（在左侧，纵向剖视图）和第15天（右侧）（在右侧，转向视图上）。（gydF4y2BaegydF4y2Ba)与内胚层来源的细胞分化的木素成分(箭头)(第15天)。（gydF4y2BafgydF4y2Ba）肥大细胞和DE Novo形成围绕共源细胞簇（在插图中放大）的木质元素（箭头）（第15天）。用甲苯胺蓝染色的部分。(图片来自第一个复制)。条=50μm（gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，gydF4y2BabgydF4y2Ba，gydF4y2BaegydF4y2Ba和插入gydF4y2BafgydF4y2Ba），100微米（gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BadgydF4y2Ba，gydF4y2BafgydF4y2Ba）gydF4y2Ba

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WT和opr3 TCLs中JA、OPDA和IAA水平在培养第1天发生变化gydF4y2Ba

获得的类似结果gydF4y2Baopr3gydF4y2Ba和Ws TCLs在宏观和组织学分析下(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和gydF4y2Ba4gydF4y2Ba）促使我们探讨在相同基因型中的内源性和生长素的内源性水平，并且在最佳处理（0.01μmmeja）中进行Ar形成（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.w和w中均未检测到IBA和IAAgydF4y2Baopr3gydF4y2Ba根据先前的结果，在茎部切除后不久(即第0天)进行tcl [gydF4y2Ba7GydF4y2Ba］．相比之下，可能是由于切除引起的创伤反应，JA, OPDA和JA- ile都存在(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba）.野生型中JA和JA- ile的内源性水平显著高于突变型(在gydF4y2BaPgydF4y2Ba<0.001和gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)，而OPDA水平相近，分别是JA的2倍和17倍。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

在WS和WS和HAS的内源水平的Jasmonals和AuxinsgydF4y2Baopr3gydF4y2Ba切除后不久进行tcl。JA、OPDA、JA- ile、IBA和IAA的平均值(±SE)，在Ws和gydF4y2Baopr3gydF4y2Ba他们从茎上切除后不久（第0天）。*gydF4y2Ba^，gydF4y2BaPgydF4y2BaWT Ws的差异< 0.001;Arunachal Pradesh，gydF4y2Ba^，gydF4y2BaPgydF4y2Ba与野生型相比差异< 0.05。星号未显示两种基因型间的OPDA水平无显著差异。N = 3个生物复制gydF4y2Ba

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在WT tcl中，JA、JA- ile和OPDA的水平在培养第1天比培养第0天突然下降(图3)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba和gydF4y2Ba6gydF4y2Ba然而，然而，用0.01μmMeja的处理引起了Ja（图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)和JA-Ile(图。gydF4y2Ba6 bgydF4y2Ba)的含量显著高于未添加MeJA的(gydF4y2BaPgydF4y2Ba<0.0001对于JA，gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01的JA-Ile)。相比之下，OPDA水平显著(gydF4y2BaPgydF4y2Ba<0.001）低于没有MEJA的<0.001（图。gydF4y2Ba6摄氏度gydF4y2Ba）.在gydF4y2Baopr3gydF4y2BaMeja培养的TCLS，JA类似于WT与WT无关，没有MEJA（图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)， JA-Ile的水平与第0天相似(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba和gydF4y2Ba6 bgydF4y2Ba），由于化合物存在而没有显着的变化（图。gydF4y2Ba6 bgydF4y2Ba）。OPDA的水平gydF4y2Baopr3gydF4y2Ba与第0天相比，TCLs也显著降低。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba和gydF4y2Ba6摄氏度gydF4y2Ba），但在没有Meja的更高水平而不是与化合物（gydF4y2BaPgydF4y2Ba<0.01差异，图。gydF4y2Ba6摄氏度gydF4y2Ba）.在第3天，即当在两种基因型中发生第一分裂时（图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)，在WT中有/没有MeJA时JA水平进一步降低，但MeJA存在时仍然显著高于没有MeJA时(gydF4y2BaPgydF4y2Ba<0.05差异，图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）.在WT，在同一天，与Meja的治疗没有导致JA-ILE和OPDA水平的任何显着变化与0 Meja相比（图。gydF4y2Ba6 cgydF4y2Ba），即使与第1天相比，即使OPDA水平降低约4倍（图。gydF4y2Ba6摄氏度gydF4y2Ba）.在第3天，JA水平显著（gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01)gydF4y2Baopr3gydF4y2BaMeJA处理的tcl与未处理的tcl比较，与第1天观察到的趋势相同(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）.JA-Ile水平未发生变化，与当天WT相同(图3)。gydF4y2Ba6 bgydF4y2Ba)，但与WT不同的是，OPDA水平显著(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)随着MeJA的增加而增加，与无MeJA相比，达到显著升高(gydF4y2BaPgydF4y2Ba<0.001）比在相同处理条件下的WT（图gydF4y2Ba6摄氏度gydF4y2Ba）.第5天，即第一个细胞簇形成的时间(图。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba)，在WT TCLs中，JAlevel再次显著升高(gydF4y2BaPgydF4y2Ba<0.01）在MEJA的存在中而不是在缺失，并且类似于第1天的水平，而不会发生显着增加gydF4y2Baopr3gydF4y2Batcl(无花果。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）.JA-ILE和OPDA的水平不会受到基因型或治疗的显着影响（图。gydF4y2Ba6 cgydF4y2Ba）.在后期文化期间，WT和WT的JA / JA-ILE存在gydF4y2Baopr3gydF4y2Ba用0.01 μM MeJA处理或未处理的外植体进行免疫定位[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba］．在第8天，在没有Meja的情况下，在共给群细胞簇和夹层的细胞中检测到Ja / Ja-ile（图。gydF4y2Ba7一个gydF4y2Ba)，但在0.01 μM MeJA的存在下信号增强(图。gydF4y2Ba7 bgydF4y2Ba）.信号继续通过在ARP和AR的提示（15天）（图的所有单元中显示。gydF4y2Ba7 c - dgydF4y2Ba）.在ARPs中检测到微弱信号gydF4y2Baopr3gydF4y2Ba突变体TCLs，主要存在0.01 μM的MeJA(图2)。gydF4y2Ba7 e-fgydF4y2Ba箭头)。gydF4y2Ba

在早期文化期间的茉莉酸盐和IAA的内源性水平与/没有MEJAgydF4y2Baopr3gydF4y2BaIBA + KingydF4y2Ba-gydF4y2Ba培养的tcls。（gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba-gydF4y2BadgydF4y2Ba）内源性JA的平均值（±SE）（gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba），JA-ILE（gydF4y2BabgydF4y2Ba），和OPDA（gydF4y2BacgydF4y2Ba）和IAA（gydF4y2BadgydF4y2Ba)，在Ws和gydF4y2Baopr3gydF4y2Ba以0.01 μM MeJA或不加MeJA暗培养1、3和5 d后的TCLs。同一基因型在同一天内，或同一基因型在同一处理下，至少在gydF4y2BaP < 0.05水平gydF4y2Ba，gydF4y2Ba用不同的字母表示。无字母或相同字母表示同一天无统计学差异。进一步的统计细节将在文中描述。N = 3个生物复制gydF4y2Ba

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JA/JA- ile在Ws和gydF4y2Baopr3gydF4y2BaIBA +亲缘培养的tcl。（gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba-gydF4y2BahgydF4y2Ba) Ws中JA/JA- ile的免疫细胞化学检测(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba-gydF4y2BadgydF4y2Ba，gydF4y2BaggydF4y2Ba-gydF4y2BahgydF4y2Ba）和JA-缺陷突变gydF4y2Baopr3gydF4y2Ba（gydF4y2BaegydF4y2Ba-gydF4y2BafgydF4y2Ba) TCLs的纵向径向切片，在黑暗下培养第8天和第15天(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，gydF4y2BaegydF4y2Ba）或在0.01μmmeja的存在（gydF4y2BabgydF4y2Ba-gydF4y2BadgydF4y2Ba，gydF4y2BafgydF4y2Ba）或10μmmeja（gydF4y2BaggydF4y2Ba-gydF4y2BahgydF4y2Ba）.（gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)分生组织细胞显示绿色JA/JA- ile免疫荧光信号(第8天)(gydF4y2BabgydF4y2Ba）专业丛的细胞显示出杂荧光信号比（gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba(第8天)gydF4y2BacgydF4y2Ba) AR顶端的细节(纵切面)，显示顶端细胞与信号(第15天)。（gydF4y2BadgydF4y2Ba）AR尖端（视图在横视中的视图）显示具有信号的细胞（第15天）。（gydF4y2BaegydF4y2Ba）gydF4y2Baopr3gydF4y2Ba无信号的ARP细胞(箭头)在无外源MeJA培养的TCL中培养(第15天)。（gydF4y2BafgydF4y2Ba）微弱的信号gydF4y2Baopr3gydF4y2BaTCL的ARP（箭头）用0.01μmmeja（第15天）培养。（gydF4y2BaggydF4y2Ba)分化木质素团细胞内微弱信号(箭头)(第15天)。（gydF4y2BahgydF4y2Ba)未成熟新生木质细胞(第15天)内微弱信号(箭头)。(图片来自第一个复制)。柱= 20 μm (gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，gydF4y2BabgydF4y2Ba，gydF4y2BaggydF4y2Ba，gydF4y2BahgydF4y2Ba)， 40 μm (gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BadgydF4y2Ba)， 60 μm (gydF4y2BaegydF4y2Ba，gydF4y2BafgydF4y2Ba）gydF4y2Ba

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在10 μM MeJA培养15天的WT tcl中，JA/JA- ile的免疫定位显示木基团块中存在信号(图)。gydF4y2Ba7GgydF4y2Ba）和在单一的硅藻土中（图。gydF4y2Ba7h.gydF4y2Ba）gydF4y2Ba新创gydF4y2Ba特别是在这个浓度下形成。直到第5天，野生型和野生型的茉莉酸浓度均为0.01 μMgydF4y2Baopr3gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)，建议我们评估前5天外植体中IAA水平。如图所示。gydF4y2Ba6 dgydF4y2Ba在WT和gydF4y2Baopr3gydF4y2Ba在无MeJA培养的tcl中，IAA在第1天在外植体中检测到，但其水平到第3天没有显著变化，而是显著增加(gydF4y2BaPgydF4y2Ba<0.05对于wt和gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01gydF4y2Baopr3gydF4y2Ba）在第5天。IAA趋势在0.01μmmeja处理的wt和gydF4y2Baopr3gydF4y2Ba然而，tcl在第5天有较高的增加(gydF4y2BaPgydF4y2Ba<0.001对于wt，和gydF4y2BaPgydF4y2Ba<0.0001 for.gydF4y2Baopr3gydF4y2Ba）与茉莉酸甲酯未处理外植体（图比较。gydF4y2Ba6 dgydF4y2Ba）.一个td一个y 1, IBA was detected at higher amounts than IAA, both in WT (1970 ± 160 ng/g FW without MeJA and 1777 ± 390 ng/g FW with MeJA), andopr3gydF4y2Ba外植体(1313±240和1266±320 ng/g FW)gydF4y2Ba，gydF4y2Ba按照外源性IBA供应gydF4y2Ba．gydF4y2Ba到第5天，IBA的趋势与IAA的趋势相似。第5天，添加0.01 μM MeJA的Ws IBA值上升到3284±470 ng/g FW，未添加MeJA的Ws IBA值上升到3052±390 ng/g FW，两者与突变体的相应值无显著差异(未显示)。gydF4y2Ba

在MeJA诱导的ar形成过程中，ARF6和ARF8基因的表达没有发生改变，而ARF17基因在10 μM MeJA诱导下表达增强，并定位于木本细胞gydF4y2Ba

已知在拟南芥中，ARF6和ARF8是轻生长幼苗下胚轴ar形成所必需的，而ARF17是相同条件下ar形成的抑制剂[gydF4y2Ba18.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．由于这些原因，他们的启动子的活性在黑暗中生长的苗和TCLs通过使用监控gydF4y2BaARF6:格斯gydF4y2Ba，gydF4y2BaARF8:格斯gydF4y2Ba,gydF4y2BaARF17:格斯gydF4y2Ba转基因素。gydF4y2Ba

22 das的转基因深种幼苗的观察显示出表达的存在gydF4y2BaARF6.gydF4y2Ba和gydF4y2BaARF8.gydF4y2Ba，而不是gydF4y2BaARF17gydF4y2Ba，在ARP/AR提示(附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba:图S3a-f)，带或不带0.01 μM MeJA。相比之下,gydF4y2BaARF17gydF4y2Ba在下胚轴、侧根(LRs)和ARs的维管系统中均有表达，在有和没有MeJA的情况下同样有表达(附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba:图S3g-i)。在0.01 μM和0.1 μM MeJA条件下培养15 d，观察到GUS信号存在于细胞的arp尖gydF4y2BaARF6::gydF4y2Ba格斯和gydF4y2BaARF8 ::gydF4y2BaGUS TCLs，具有相似的表达模式，举例说明于gydF4y2BaARF6.gydF4y2Ba图中有/没有0.01 μM MeJA。gydF4y2Ba8个模拟gydF4y2Ba．与他们背景的tcl相同(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，转基因株系的外植体在10 μM MeJA下无法生长并形成ARs(数据未显示)，因此未对这些外植体进行GUS检测。的表达gydF4y2BaARF17gydF4y2Ba在ARPs/ARs中不存在，但在外植体的愈伤组织中存在，与MeJA浓度无关(图2)。gydF4y2Ba8E-F.gydF4y2Ba）.组织学分析证实了宏观观察结果gydF4y2BaARF17gydF4y2Ba表达定位于木原细胞(图。gydF4y2Ba8G-H.gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

ARF6:格斯gydF4y2Ba和gydF4y2BaARF17:格斯gydF4y2BaIBA + Kin-Tcls中的表达模式或没有MEJA培养。（gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba-gydF4y2BahgydF4y2Ba)定位GUS信号在gydF4y2BaARF6:格斯gydF4y2Ba（gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba-gydF4y2BadgydF4y2Ba),gydF4y2BaARF17:格斯gydF4y2Batcl (gydF4y2BaegydF4y2Ba-gydF4y2BahgydF4y2Ba）在黑暗中培养在没有Meja（0μmmeja）的情况下15天（gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，gydF4y2BacgydF4y2Ba)和0.01 μM MeJA (gydF4y2BabgydF4y2Ba，gydF4y2BadgydF4y2Ba-gydF4y2BaegydF4y2Ba，gydF4y2BaggydF4y2Ba)或0.1 μM MeJA (gydF4y2BafgydF4y2Ba，gydF4y2BahgydF4y2Ba）.（gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba）ARP中的GUS信号以及细长AR的顶点。（gydF4y2BabgydF4y2BaTCL也显示了同样的情况gydF4y2BaARF6:格斯gydF4y2Ba表达式如(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba）.信号的高存在与ARPs/ARs在(gydF4y2BabgydF4y2Ba)比(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba）.（gydF4y2BacgydF4y2Ba-gydF4y2BadgydF4y2Ba) GUS信号在ARPs顶端的定位。（gydF4y2BaE-F.gydF4y2Ba）gydF4y2BaARF17:格斯gydF4y2Ba表达缺失，但沿外植体存在。（gydF4y2BaggydF4y2Ba）gydF4y2BaARF17:格斯gydF4y2Ba在细胞中定位的表达分化为木质元素，如插图中的放大。（gydF4y2BahgydF4y2Ba）gydF4y2BaARF17gydF4y2Ba存在于细胞链中的GUS信号区分为木质元素，但在ARPS中不存在。（gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba-gydF4y2BabgydF4y2Ba，gydF4y2BaegydF4y2Ba-gydF4y2BafgydF4y2Ba)立体显微镜图像，(gydF4y2BacgydF4y2Ba-gydF4y2BadgydF4y2Ba，gydF4y2BaggydF4y2Ba-gydF4y2BahgydF4y2Ba) LM下观察的TCLs纵向径向切片。(图片来自第一个复制)。柱= 50 μm(插入gydF4y2BaggydF4y2Ba），100微米（gydF4y2BadgydF4y2Ba)， 200 μm (gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BafgydF4y2Ba-gydF4y2BahgydF4y2Ba)、500 μm (gydF4y2BaegydF4y2Ba)、1毫米(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，gydF4y2BabgydF4y2Ba）gydF4y2Ba

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因为众所周知，这三个基因的转录本的稳定性是在特定的mirna的控制下，至少在光下[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]，它们的表达也通过定量RT-PCR（RT-qPCR的）监控。转录水平在WS TCLs和这些的分析gydF4y2Baopr3gydF4y2Ba所有的茉莉酸甲酯浓度因为高能力，下突变体，以形成这些TCLs的ARS，和AR-响应甚至用10μM茉莉酸甲酯（图的存在。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.rt - qpcr分析表明，在无MeJA(对照tcl)培养的Ws外植体中，各基因的表达量均为1gydF4y2BaARF8.gydF4y2Ba与对照tcl相比，MeJA处理没有显著变化(图2)。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba）.同样发生了gydF4y2BaARF6.gydF4y2Ba除了表达gydF4y2Baopr3gydF4y2Ba用最高Meja浓度治疗的TCLS，与对照相比，转录物水平几乎降低了一半（gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01)。不同,gydF4y2BaARF17gydF4y2Ba表达类似于在0.1和0.01μmMeja的情况下的控制，而重要（gydF4y2BaPgydF4y2Ba<0.01）基因的上调（超过两倍）在10μmMeja处理的外植体中明显明显，独立于基因型（图。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba）.这种表达的增加与在这些外植体中观察到的ARS的形成时偶联的表达偶联（图。gydF4y2Ba4 e-fgydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

ARF6.gydF4y2Ba，gydF4y2BaARF8.gydF4y2Ba和gydF4y2BaARF17gydF4y2BaWS和WS的表达分析gydF4y2Baopr3gydF4y2BaRT-qPCR检测tcl。RT-qPCR定量gydF4y2BaARF6.gydF4y2Ba，gydF4y2BaARF8.gydF4y2Ba，gydF4y2BaARF17gydF4y2Ba转录水平在WS和gydF4y2Baopr3gydF4y2BaTCLS在IBA + Kin培养基上培养，没有（0μmmeja）或0.01,0.1和10μmmeja，在黑暗下为15天。每个基因的表达值相对于在不存在MEJA（校准剂）的WT WS TCL中的表达，该值设定为1.每个基因的转录水平被标准化为表达gydF4y2BaTIP41。gydF4y2Ba星号表示基因表达有显著差异(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01)，与未加MeJA的相同基因型相比gydF4y2Ba．gydF4y2Ba文中还描述了进一步的统计细节。平均数据和SE是从三个生物复制中获得的，每个都是三种技术复制gydF4y2Ba

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乙烯前体ACC增强了IBA + kin培养的幼苗下胚轴中ar的形成，但降低了tcl中的ar形成，而ein3eil1突变体在植物和离体培养中均不敏感gydF4y2Ba

基于众多反应中的ET和JA之间的已知相互作用[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba， et前体ACC在0.1 μM浓度下被应用于幼苗和TCLs，因为它已经被证明在单独IBA存在的黑暗下生长的拟南芥幼苗中增强ar的形成[gydF4y2Ba10.gydF4y2Ba］．如图所示。gydF4y2Ba10AgydF4y2Ba， ACC与IBA和Kin的存在显著增强了下胚轴ar的形成，但这在下胚轴中没有发生gydF4y2Baein3eil1gydF4y2Ba双突变体，根据其et不敏感[gydF4y2Ba10.gydF4y2Ba］．相比之下，ACC的应用导致了显著的(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01)，但双突变体同样不敏感(图。gydF4y2Ba10B.gydF4y2Ba）.组织学分析显示，虽然ACC处理的WT tcl中ar的形成减少，但与不含ACC的外植体相比，木原性反应增强(图3)。gydF4y2Ba10 c - dgydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

IBA + Kin成长的ar形成gydF4y2Baein3eil1gydF4y2Ba苗和TCLs，和JA-突变体TCLs，有/无ACC处理。（gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba平均AR密度，即每cm下胚轴的AR/ARP数(±SE)，在Col-0 (WT)和gydF4y2Baein3eil1gydF4y2Ba在22 DAS下，在0.1 μM ACC存在/不存在的黑暗条件下生长的幼苗。（gydF4y2BabgydF4y2Ba）在从中切除的TCLS中每次外部植物（±SE）的平均ar / arp编号gydF4y2Baein3eil1gydF4y2Ba，gydF4y2Badde2-2gydF4y2Ba，gydF4y2Bacoi1-16gydF4y2Ba在0.1 μM ACC存在或不存在的情况下，培养15 d后，突变体植株及其wt(分别为Col-0、Col和Col-gl1)。（gydF4y2Bac - dgydF4y2Ba）Col-0 Tcls的组织学图像在没有ACC的情况下培养（gydF4y2BacgydF4y2Ba）和0.1μm的ACC（gydF4y2BadgydF4y2Ba)，第15天。（gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba-gydF4y2BabgydF4y2Ba)在相同基因型内的处理，或在相同处理下的每个突变体与其WT之间的显著差异，至少在gydF4y2BaP 0.05水平gydF4y2Ba，gydF4y2Ba用不同的字母表示。相同基因型中的相同字母，每个突变体和其WT之间表现出没有显着差异。进一步的统计细节将在文中描述。gydF4y2BaNgydF4y2Ba= 30 (gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba），gydF4y2BaNgydF4y2Ba= 60（gydF4y2BabgydF4y2Ba)(第一次复制)。（gydF4y2BacgydF4y2Ba）TCL的截面面积显示众多AR和在外植体中形成有限数量的DE NOVO形成的木质细胞。（gydF4y2BadgydF4y2Ba）ACC培养的TCL细节显示单一的分化，或者在块状或链中分组，木质细胞（由箭头所示）。请注意，番木槽壁是蓝绿色。甲苯胺蓝染色。(图片来自第一个复制)。条=200μmgydF4y2Ba

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tcl的响应来自于gydF4y2Badde2-2gydF4y2Ba和gydF4y2Bacoi1-16gydF4y2Ba还在ACC（0.1μm）存在下分析突变体，以研究JA（生物合成和感知）与β中的ET-信号之间的相互作用。我们决定排除gydF4y2Baopr3gydF4y2Ba从分析来看，因为该突变体的响应表明OPDA本身对ar形成有影响(图。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba和gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.与wt不同的是，ar反应gydF4y2Badde2-2gydF4y2Ba和gydF4y2Bacoi1-16gydF4y2BaTCLS没有受到ACC的显着影响gydF4y2Baein3eil1gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba10B.gydF4y2Ba)，提示内源性JA和et信号转导相互作用。为了验证这种可能性，gydF4y2Baein3eil1gydF4y2Ba采用IBA + Kin + 0.01 μM MeJA培养tcl，并与WT (Col-0)进行比较。MeJA的存在增强了Col-0中ar的形成，与其他WT基因型一样(图3)。gydF4y2Ba11个gydF4y2Ba和2，在比较)，但ar生产gydF4y2Baein3eil1gydF4y2BaTCLs仍然低于WT，且不受MeJA的显著影响(图。gydF4y2Ba11个gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

AR-formation在gydF4y2Baein3eil1gydF4y2BaMeja治疗的Tcls和gydF4y2Baein3eil1gydF4y2Ba和ACC + MeJA处理的ja突变型tcl。gydF4y2Ba(一)gydF4y2Ba从COL-0和Col-0和Col-0切除的TCL中的每种外植体（±SE）的平均值/ ARP编号gydF4y2Baein3eil1gydF4y2Ba在IBA + Kin-培养基的黑暗中在体外培养15天后，在存在/不存在0.01μmMeja的情况下植物。（gydF4y2BabgydF4y2Ba）在从中切除的TCLS中每次外部植物（±SE）的平均ar / arp编号gydF4y2Baein3eil1gydF4y2Ba，gydF4y2Badde2-2gydF4y2Ba，gydF4y2Bacoi1-16gydF4y2Ba在IBA + kin -培养基上，0.1 μM ACC + 0.01 μM MeJA，暗培养15 d后，突变体植株及其WTs分别为Col-0、Col和Col-gl1。在相同基因型内的处理之间，或在相同处理下的每个突变体与WT之间，至少在gydF4y2BaP < 0.05水平gydF4y2Ba，gydF4y2Ba用不同的字母表示。在相同基因型中以及每个突变体和其WT之间的相同字母显示没有统计差异。n = 60（第一次复制）（gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，gydF4y2BabgydF4y2Ba）gydF4y2Ba

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为了更好地理解JA和ET之间的相互作用，在ACC（0.1μm）和Meja（0.01μm）的存在下，在IBA + Kin下培养TCL。有趣的是，两种激素造成的补偿效果，因为在任何基因型中的缺失相比，AR-生产在ACC和MEJA的结合存在下没有显着变化（图。gydF4y2Ba11 bgydF4y2Ba）.gydF4y2Ba